Методическая статья

Рабочий процесс количественной оценки эндофитных и эпифитных бактериальных микробиомов коры Populus trichocarpa

DOI:

10.3791/66318

⸱

27 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, 2College of Life Science, Northeast Forestry University, 3College of Forestry, Northeast Forestry University, 4Forest Biotechnology Group, Department of Forestry and Environmental Resources, North Carolina State University, 5Institute of Economic Forest of Xinjiang Academy of Forestry Sciences

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет собой надежный и эффективный рабочий процесс от сбора образцов до анализа данных для профилирования эндофитных и эпифитных бактериальных микробиомов, присутствующих в коре Populus trichocarpa.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроорганизмы, колонизирующие поверхности растений и внутренние ткани, могут выполнять полезные функции, способствуя росту и здоровью растений. Тем не менее, информация о микробиоме тканей коры древесных растений остается ограниченной, особенно в отношении эндофитной и эпифитной бактериальной микробиоты коры Populus. Чтобы преодолеть это ограничение, мы разработали рабочий процесс для количественной оценки состава и разнообразия эндофитной и эпифитной бактериальной микробиоты, колонизирующей кору Populus trichocarpa. Вкратце, эпидермис стебля P. trichocarpa многократно протирали ватным тампоном, смоченным в 0,1% Tween 20, для получения образцов эпифитных бактерий. Очищенный эпидермис стерилизовали, а затем многократно замораживали и измельчали с использованием жидкого азота и бисера соответственно для сбора образцов эндофитных бактерий. Геномную ДНК экстрагировали из эпифитных бактериальных сообществ, сцепленных с хлопком, и измельченной коры P. trichocarpa и подвергали амплификации методом плеймеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, нацеленными на гипервариабельные участки V5-V7 и V4 бактериального гена 16S рРНК. Три реплики полученных продуктов ПЦР каждого эндофитного или эпифитного образца смешивали в равных концентрациях для построения библиотеки ампликонов, которая затем секвенировалась. Полученные последовательности были проанализированы с помощью сплайсинга последовательностей, качественной фильтрации, удаления химер и таксономических аннотаций. Таким образом, мы создали надежный и эффективный рабочий процесс от сбора образцов до анализа данных для определения эндофитных и эпифитных бактериальных микробиомов коры P. trichocarpa с помощью профилирования гена 16S рРНК. Вместе с методами изучения микробиоты, колонизирующей кору, разработанными в предыдущем исследовании, наша методология может послужить основой для разработки протоколов исследования микробиома коры других древесных видов растений, особенно экономически значимых деревьев лесов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кора — это самый наружный слой стеблей древесных растений, относящийся ко всем тканям за пределами сосудистого камбия, включая флоэму и перидерму 1,2. Обширные исследования показали, что кора играет ключевую роль в перемещении воды и углеводов, защите деревьев от пожаров и механических повреждений3 и адаптации к абиотическим4и биотическим стрессам5. Что еще более важно, в качестве связующего звена между деревом и окружающим воздухом кора также служит уникальной средой обитания для микроорганизмов. В частности, было подтверждено, что микробы, связанные с корой, обладают функциями стимулирования роста хозяина7, помощи деревьям в усвоении питательных веществ8, усиления синтеза растительных гормонов9 и защиты хозяев от инфекции фитопатогенов5. Тем не менее, гораздо меньше внимания уделялось микробным сообществам, колонизирующим кору, по сравнению с филлосферой и микробиотой ризопсеров10,11. Существуют ограниченные знания о биологических особенностях микробиома коры деревьев. Целью данной методологической работы является предоставление исследователям набора протоколов для описания разнообразия и состава эндофитного и эпифитного бактериального микробиома древесной коры растений.

На основе опубликованных в данной работе методов исследования микробиоты коры12,13 мы разработали и протестировали сложный рабочий процесс, основанный на анализе секвенирования ампликонов гена 16S рРНК, для изучения бактериального микробиома, поселяющегося во внутренних тканях или на поверхности коры стебля Populus trichocarpa, важного модельного организма, используемого в биологии древесных растений14. P. trichocarpa обладает характеристиками быстрого роста15, относительной простоты экспериментальных манипуляций16 и легкой генетической трансформации, а также известна своим широким применением в производстве древесины17. В частности, метод, предложенный в данной работе, начинается с подробного описания отбора проб эндофитной и эпифитной микробиоты коры стебля P. trichocarpa. С включением этапа поверхностной стерилизации коры спиртом и гипохлоритом натрия после сбора микробиома, колонизирующего поверхность, в данном исследовании была установлена процедура одновременного и раздельного сбора микроорганизмов, проживающих во внутренней структуре коры (эндофиты) и обитающих на внешней поверхности коры (эпифиты). Насколько нам известно, среди опубликованных исследований микробиома коры древесных растений не было проведено ни одного анализа эндофитных и эпифитных микробных сообществ, собранных из одного и того же образца коры на основе четкого различия между внутренними и внешними нишами коры 18,19,20. Таким образом, метод, разработанный в данном исследовании, позволит исследователям точно и всесторонне изучить разнообразие и состав бактериальных сообществ, населяющих кору. Кроме того, в данном исследовании подробно описаны процедуры экстракции геномной ДНК, амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР), подготовки библиотеки секвенирования гена ампликона 16S рРНК21 и анализа данных секвенирования. В частности, в этом исследовании использовалась пара праймеров, нацеленных на гипервариабельные V5-V7 гена бактериальной 16S рРНК для снижения неспецифической амплификации митохондриальных и хлоропластных последовательностей растений-хозяев22, что позволило получить несмещенные профили микробиома, связанного с корой. Разнообразие α оценивали с помощью индекса Шеннона23, популярного индекса разнообразия, широко используемого в исследованиях экологии, а таксономический состав на уровне типа рассчитывали и визуализировали в Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) 24и Rsoftware 25. Вместе с методами изучения микробиоты, колонизирующей кору, разработанными в предыдущем исследовании 1,6, наша методология может служить основой для разработки протоколов изучения микробиома коры других древесных видов растений, особенно экономически значимых деревьев леса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Сбор образцов

  1. Вырастите 3-месячного . Саженцы трихокарпы в камере роста (21–25°C; 16-часовой свет/8-часовой темный цикл с дополнительным светом около 300 μEm−2 с−1 от трехполосной линейной люминесцентной лампы [T5 28 Вт 6400 K]; и влажностью 60–80%)26.
  2. Отрежьте отрезки стебля длиной 10 см от P. трихокарпы от 2–12 см над стерилизованной поверхностью почвы (рис. 1А) с помощью стерилизованного секатора. Поместите сегменты стебля в стерилизованную квадратную чашку Петри (13 см х 13 см).
    Примечание: Для этого исследования были выбраны шесть деревьев одинакового размера, из которых три были использованы для амплификации ПЦР с каждым набором праймеров.

2. Обработка образцов

  1. Многократно протрите эпидермис стебля на стерилизованной квадратной чашке Петри стерильным ватным тампоном, смоченным в 0,1% Tween 20, чтобы более эффективно собрать микроорганизмы, колонизирующие поверхности коры (рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Субгумидная стерильная вата используется для сбора микроорганизмов, прилипших к поверхности стебля. Не используйте слишком сухую или слишком влажную вату при протирании поверхности стебля. Tween 20 представляет собой поверхностно-активное вещество, способное снижать поверхностное натяжение, что является полезным свойством для получения большего количества микробных образцов с поверхности растений27,28.
  2. Отрежьте ватный наконечник от тампона с помощью стерильного лезвия и поместите каждый ватный наконечник, содержащий образцы эпифитных микроорганизмов, в стерильную центрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Храните образцы при температуре −80 °C.
  3. Протерев поверхность стебля, с помощью стерильного скальпеля разрежьте кору, из которой были взяты образцы эпифитных микроорганизмов, снимите кору и поместите ее в квадратную чашку Петри.
  4. Стерильным скальпелем разрежьте очищенную от стебля кору на отрезки примерно по 1 см (рис. 1В).
  5. Стерилизуйте сегменты, замочив их в 70% (v/v) спирте на 2 минуты. Затем замочите сегменты в гипохлорите натрия (2,5% эффективного содержания хлора) с добавлением 0,1% Tween 80 на 5 минут.
  6. Полученные на шаге 2,5 сегменты стерилизовать в течение 30 с в 70% (v/v) спирте29. Затем трижды промойте все образцы стерильной дистиллированной водой и поместите их на чистую скамейку для сушки на воздухе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы коры перемешиваются взад и вперед с помощью стерильного пинцета для обеспечения достаточной стерилизации поверхности.
  7. Храните каждый стерилизованный на поверхности сегмент коры стебля (эндофитные образцы) в стерильной центрифужной пробирке объемом 2 мл при температуре −80 °C.

3. Экстракция геномной ДНК

  1. Выполните следующие шаги для предварительной обработки образцов для экстракции ДНК.
    1. Стерилизованные на поверхности сегменты коры стебля, полученные на шаге 2.7, поместите в стерильные твердые пробирки объемом 5 мл и добавьте в каждую пробирку три стерилизованных стальных бусины (4 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте этот шаг на чистом столе, чтобы предотвратить микробное загрязнение. Ватные шарики, приготовленные на шаге 2.2 (эпифитные образцы), не нуждаются в предварительной обработке и непосредственно используются для экстракции геномной ДНК.
    2. Заморозьте жесткие пробирки с образцами в жидком азоте на 10 минут.
    3. Измельчите образцы коры в течение 5 минут с помощью бисерной молотки. Затем снова заморозьте жесткую пробирку в жидком азоте на 1 минуту и повторяйте этап взбивания бусин в течение 5 минут.
  2. Извлечение геномной ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте коммерческий набор для экстракции ДНК для выделения геномной ДНК из эндофитных и эпифитных образцов.
    1. Добавьте измельченный стебель коры. Трихокарпы и эпифитные бактериальные сообщества с хлопком (по 0,25 г каждое) к каждой из трубок-шариков. Затем добавьте 60 μL раствора C1, поставляемого в коммерческом наборе, и аккуратно перемешайте путем инверсии.
    2. Затем гомогенизируйте эндофитные и эпифитные образцы с помощью бисерной машины в четыре прохода по 1 минуте. После каждого прогона помещайте образцы на лед на 30 с.
    3. Центрифугируйте пробирки при давлении 10 000 x g в течение 1 минуты.
    4. Извлеките эндофитные и эпифитные образцы с помощью набора (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
    5. Добавьте 30 μL раствора C6 в центр белой фильтрующей мембраны и инкубируйте при 25 °C в течение 5 минут.
    6. Центрифуга при 10 000 x g при комнатной температуре в течение 1 мин.

4. ПЦР-амплификация

  1. Стандартизируйте концентрацию экстрагированной ДНК.
    1. Измерьте концентрации геномной ДНК, выделенной из эпифитных и эндофитных образцов, с помощью микрообъемного спектрофотометра.
    2. Разбавьте каждый образец ДНК стерильным ddH от2O до 2 нг/л для получения матрицы ДНК для амплификации ПЦР.
  2. Амплифицируйте эти образцы ДНК.
    1. Амплифицируйте V5–V7 бактериального гена 16S рРНК с помощью прямого праймера 799F (5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3') и обратного праймера 1193R (5'-ACGTCATCCCCCCTTCC-3') 10. Амплифицируйте V4-область бактериального гена 16S рРНК с помощью прямого праймера 515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') и обратного праймера 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') 30.
      Примечание: Геномная ДНК, выделенная из каждого образца, используется в качестве матрицы для каждой из реакций тройной амплификации ПЦР, а дополнительная реакция, не содержащая ДНК, устанавливается в качестве отрицательного контроля. Для каждого образца объем реакционной смеси ПЦР составляет 25 мкл. Для пары праймеров 799F/1193R каждая реакция содержит 12 μL воды для ПЦР, 1 μL каждого из F/R праймеров (10 μM), 1 μL матрицы ДНК и 10 μL раствора смеси. Для пары праймеров 515F/806R каждая реакция содержит 12 мкл воды для ПЦР, 1 мкл каждого из праймеров F/R (10 мкМ), 1 мкл матрицы ДНК и 10 мкл раствора смеси. Реакции ПЦР с парой праймеров 799F/1193R проводят при следующих условиях цикла: начальная денатурация при 98 °С в течение 5 мин, 25 циклов при 98 °С в течение 30 с, 53 °С в течение 30 с, 72 °С в течение 45 с, и окончательное удлинение при 72 °С в течение 5 мин. Реакции ПЦР с парой праймеров 515F/806R проводят при следующих условиях цикла: начальная денатурация при 94 °C в течение 3 мин, 35 циклов при 94 °C в течение 45 с, 50 °C в течение 60 с и 72 °C в течение 90 с, а также окончательное удлинение в течение 10 мин при 72 °C.
    2. Тщательно перемешайте каждый образец и центрифугируйте для удаления пузырьков.
    3. Выполните амплификацию V5–V7 или V4 бактериальных генов 16S рРНК на термоциклере.
  3. Обнаружение усиленных продуктов.
    1. Загрузите по 5 мкл каждого ампликона в 1% агарозный гель и проведите электрофорез при напряжении 120 В в течение 30 мин.
    2. Рассмотрите гель под ультрафиолетовым светом, чтобы убедиться в успешности амплификации ПЦР. Размеры продуктов ПЦР, полученных с парами праймеров 799F/1193R и 515F/806R, должны составлять приблизительно 430.о. и 400.о. соответственно.

5. Подготовка библиотеки ампликонного секвенирования

  1. Смешайте амплифицированные продукты и определите их концентрацию.
    1. Смешайте продукты, полученные из трех реплик ПЦР-амплификации, для каждого образца в пробирке для ПЦР.
    2. Добавьте 5 мкл ПЦР-продуктов и 195 мкл рабочего раствора в лунку 96-луночного микропланшета в соответствии с инструкцией производителя к набору (см. Таблицу материалов). Далее в лунку того же микропланшета добавляют 10 мкл стандартной ДНК (реагенты ДНК с концентрациями 0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 и 100 нг/мкл) и 190 мкл рабочего раствора. Следуя этому шагу, определите интенсивность флуоресценции продуктов ПЦР и стандартной ДНК.
    3. Измерьте флуоресценцию с помощью считывателя микропланшетов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возбуждение/излучение стандартных длин волн флуоресцеина установлены на уровне 480/530 нм для измерения количества двухцепочечной ДНК в каждом образце.
    4. Установите стандартную кривую концентраций ДНК и интенсивностей флуоресценции с использованием стандартных концентраций ДНК стандартных растворов ДНК (0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 и 100 нг/л) и интенсивности флуоресценции каждого из стандартных растворов ДНК. Подставьте значение интенсивности флуоресценции каждого из продуктов ПЦР в стандартную кривую, чтобы рассчитать концентрации ДНК продуктов ПЦР.
  2. Создание библиотек последовательности ампликонов.
    1. В соответствии с концентрациями, обнаруженными на шаге 5.1.4, смешайте оставшиеся продукты ПЦР, амплифицированные той же парой праймеров, в равных концентрациях для создания библиотеки секвенирования ампликонов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Доля продуктов ПЦР каждого образца, используемого для количественного определения концентрации двухцепочечной ДНК путем измерения интенсивности флуоресценции, не включена в библиотеку ампликонного секвенирования, которая построена из остальных продуктов ПЦР того же образца.
  3. Провести экстракцию гелем.
    1. Проводят электрофорез в агарозном геле с помощью аппарата для электрофореза. Кратко приготовьте 1,3% агарозный гель (т.е. 1,3 г порошка агарозы в 100 мл 1 x TAE буфера).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо следить за тем, чтобы количество лунок в геле было достаточным для удержания каждого продукта ПЦР и лестницы ДНК; В данном исследовании 1,3% агарозный гель получают путем растворения 1,3 г агарозного порошка в 100 мл 1 x TAE буфера.
    2. Снимите расчески после застывания геля и поместите гель в резервуар для электрофореза с 1 x буфером TAE. Затем добавьте 1 объемную единицу из 6 оранжевых загрузочных буферов к 5 объемным единицам каждого продукта ПЦР, при этом 100 мкл последнего загружено в каждую лунку. Добавьте 30 мкл лестницы ДНК в одну лунку. После подключения положительного и отрицательного проводов проведите электрофорез при напряжении 80 В в течение 50 мин.
      Примечание: В данном исследовании гелевая экстракция используется для очистки библиотеки ампликонного секвенирования, представленной полосой 400.о. или 430.н., амплифицированной парой праймеров 515F/806R или 799F/1193R, соответственно.
    3. Вырезайте фрагменты ДНК из агарозного геля с помощью чистого острого скальпеля.
    4. Взвесьте гелевый ломтик и переложите его в бесцветную пробирку. Добавьте буфер для погружения в гелевый ломтик.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальное количество геля на спин-колонку составляет 400 мг. К одной единице объема данного слайса геля добавляются три объемные единицы буфера.
    5. Выполняйте экстракцию геля с помощью набора для экстракции геля (см. Таблицу материалов), следуя инструкциям производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью этого метода получена библиотека ампликонов, сконструированная из продуктов ПЦР, нацеленной на бактериальный ген 16S рРНК, используемый для секвенирования эндофитных и эпифитных бактериальных сообществ.
  4. Убедитесь в качестве библиотеки секвенирования очищенных ампликонов.
    1. Определить концентрацию двухцепочечной ДНК в очищенной библиотеке секвенирования ампликонов, полученной на шаге 5.3.5, с помощью флуориметра с использованием коммерческого набора (см. Таблицу материалов) в соответствии с протоколом производителя (рисунок 2).
    2. Определить размер целевого фрагмента ДНК библиотеки ампликон-секвенирования, полученной на шаге 5.3.5, с помощью системы анализа контроля качества нуклеиновых кислот с коммерческими чипами и наборами (см. Таблицу материалов) в соответствии с протоколом производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что размер фрагмента находится в пределах ожидаемого диапазона и в библиотеке ампликонного секвенирования отсутствуют димеры праймеров.
    3. Определить эффективную концентрацию библиотеки секвенирования, полученной на шаге 5.3.5, с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR) с коммерческим набором (см. Таблицу материалов) в соответствии с протоколом производителя.
    4. Разбавьте библиотеку ампликонного секвенирования в соответствии с концентрацией нагрузки, рекомендованной для платформы секвенирования.

6. Обработка последовательностей и статистический анализ

  1. После секвенирования библиотека ампликонов, полученная на шаге 5.4.4 с использованием платформы секвенирования (см. Таблицу материалов)31. Создайте папку с именем emp-paired-end-sequences в рабочем каталоге, а затем сохраните сжатый файл секвенирования в формате fastq в этой папке. Затем откройте Ubuntu и активируйте среду conda и Quantitative Insights into Microbial Ecology 2 (QIIME2)(v2021.2)32.
  2. Запишите файл сопоставления и сохраните его в виде текстового файла. Содержимое файла показано в таблице 2.
  3. Разделите данные секвенирования, полученные с помощью библиотеки секвенирования ампликонов, и удалите праймеры из данных секвенирования с помощью файла сопоставления.
    1. Используйте следующую команду для разделения данных секвенирования: time qiime demux emp-paired --m-barcodes-file Mapping_file.txt --m-barcodes-column BarcodeSequence --p-rev-comp-mapping-barcodes --i-seqs emp-paired-end-sequences.qza --o-per-sample-sequences demux.qza --o-error-correction-details demux-details.qza
    2. Используйте следующую команду для удаления праймеров: time qiime cutadapt trim-paired --i-demultiplexed-sequences paired-demux.qza --p-front-f 799F или 515F --p-front-r 1193R или 806R --o-trimmed-sequences paired-end-demux.qza
  4. Отсейте и удалите любую химеру с помощью конвейера DADA233. Кластеризуйте отфильтрованные последовательности в варианты ампликоновых последовательностей (ASV) с 99% сходством.
    1. Используйте следующую команду для отсеивания и удаления химеры и кластерных последовательностей в ASV: time qiime dada2 denoise-paired --i-demultiplexed-seqs paired-end-demux.qza --p-trim-left-f 0 --p-trim-left-r 0 --p-trunc-len-f 220 --p-trunc-len-r 220 --o-table table.qza -o-representative-sequences rep-seqs.qza --o-denoising-stats denoising-stats.qza --p-n-threads 0
  5. Создание таксономических аннотаций с использованием базы данных SILVA (v138) на основе ссылочных последовательностей34.
    1. Используйте следующую команду для аннотирования ASV, полученных на шаге 6.4: time qiime feature-classifier classify-sklearn --i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza --i-reads rep-seqs.qza --o-classification taxonomy.qza
  6. Создайте таблицу ASV в QIIME2 (v2021.2) с помощью следующих команд:
    Инструменты QIIME export --input-path table.qza --output-path exported-feature-table
    Инструменты qiime export --input-path taxonomy.qza --output-path exported-feature_table
    biom add-metadata -i feature-table.biom -o table.womd.biom --observation-metadata-fp taxonomy.tsv --observation-header OTUID, таксономия --sc-разделенная таксономия
    biom convert -i table.womd.biom -o ASV-table.txt --to-tsv --header-key таксономия
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти команды генерируют таблицу, содержащую количество прочтений всех ASV для каждого образца.
  7. Рассчитайте количество ASV и прочтений эндофитных и эпифитных бактериальных сообществ, сгенерированных парами праймеров 799F/1193R и 515F/806R соответственно.
    1. Вычислите общее количество ASV, имеющих ≥ 1 прочтения на уровнях типа, класса, отряда, семейства и рода, соответственно, в каждой выборке в таблице ASV, полученной на шаге 6.6 путем подсчета.
    2. Вычислите общее количество прочтений в каждой выборке на основе суммы чисел прочтений всех ASV в таблице ASV, полученной на шаге 6.6 путем подсчета.
    3. Рассчитайте количество прочтений растений в каждом образце, используя количество прочтений ASV, аннотированных как хлоропласты или митохондрии в таблице ASV, полученной на шаге 6.6 путем подсчета.
    4. Рассчитайте количество бактериальных прочтений в каждом образце по следующей формуле:
      Количество бактериальных прочтений = Количество общих прочтений − Количество прочтений растений.
    5. Рассчитайте и визуализируйте среднее количество ASV (на уровнях типа, класса, порядка, семейства и рода соответственно) или прочтений (в целом или растений и бактерий соответственно) эндофитных и эпифитных бактериальных сообществ, созданных парами праймеров 799F/1193R и 515F/806R с помощью программного обеспечения Excel (2019) и Prism (v8.0).
    6. Оцените значимость различий между числом ASV (на уровнях типа, класса, порядка, семейства и рода, соответственно) или прочтений (в целом или растений и бактерий соответственно), сгенерированных с помощью пар праймеров 799F/1193R и 515F/806R с помощью t-критерия Стьюдента в программном обеспечении Prism (v8.0).
  8. Отфильтруйте чтения, аннотированные как хлоропласты и митохондрии, с помощью следующей команды: time qiime taxa filter-table --i-table table.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --p-exclude mitochondria, chloroplast --o-filtered-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza
  9. Создайте филогенетическое дерево с помощью следующей команды: time qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree --i-sequences rep-seqs.qza --o-alignment aligned-rep-seqs.qza --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza --o-tree unrooted-tree.qza --o-rooted-tree rooted-tree.qza
  10. Рассчитайте и визуализируйте альфа-разнообразие, представленное индексом Шеннона эндофитных и эпифитных бактериальных сообществ, с помощью QIIME2 (v2021.2) и пакета 'ggplot2' в R (v4.0.5)35.
    1. Используйте следующую команду для вычисления альфа-разнообразия: time qiime diversity core-metrics-phylogenetic --i-phylogeny rooted-tree.qza --i-table ASV-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --p-sampling-depth наименьшее значение чтения среди всех образцов --m-metadata-file Mapping_file.txt --output-dir core-metrics-result
  11. Рассчитайте относительную численность популяций на типологическом уровне эндофитных и эпифитных бактериальных сообществ. Сгенерируйте файл в формате qzv с именем "taxa-bar-plots" с помощью следующей команды QIIME2 (v2021.2): time qiime taxa barplot --i-table ASVs-table-no-mitochondria-no-chlorplast.qza --i-taxonomy taxonomy.qza --m-metadata-file Mapping_file.txt --o-visualization taxa-bar-plots.qzv
    1. Откройте файл taxa-bar-plots.qzv онлайн по адресу https://view.qiime2.org/. Скачайте и сохраните только что сгенерированный файл с level2. Рассчитайте относительную численность по следующей формуле с R (v4.0.5):
      Относительная распространенность каждого типа бактерий (%) = (количество прочтений каждого типа бактерий в каждом образце / общее количество прочтений каждого образца) x 100 %.
      Визуализируйте данные с помощью пакетов ggplot2, RColorBrewer, reshape и ggalluvial в R (версия 4.0.5).
  12. Проанализируйте значимость разницы между относительной численностью каждого из доминирующих типов (определяемых как тип, обладающий относительным обилием > 0,5%) в эндофитных и эпифитных бактериальных сообществах, секвенированных с парой праймеров 799F/1193R, с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с апостериорным тестом Тьюки на уровне значимости 0,05 в программном обеспечении STAMP36.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высококачественная геномная ДНК эндофитных и эпифитных бактериальных микробиомов коры P. трихокарпу получали по оптимизированному протоколу (табл. 1). Амплификация ПЦР всех 12 образцов дала одиночные сильные полосы с правильным размером (рис. 3). Обе пары праймеров 799F/1193R и 515F/806R успешно амплифицировали целевые продукты из образцов эндофитной или эпифитной коры в дозе около 400 и 430.о. соответственно. В дальнейшем библиот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Предложенный нами рабочий процесс, разработанный на основе опубликованной методологии исследования микробиоты коры 7,18, обеспечивает общее руководство по выявлению и характеристике эндофитных и эпифитных микробиомов коры древесных растений. Этот метод включает в себя протоколы сбора и обработки образцов, экстракцию геномной ДНК, амплификацию ПЦР, подготовку библиотек секвенирования ампликонов и анализ данных секвенирования, что ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим г-на Дэвида Энтони Атертона за предоставленное видеоповествование и сотрудников лаборатории B.N. за ценные советы. Эта работа была поддержана Национальным научным фондом Китая (грант No 32071741 [BN]), Проектами Плана ключевых исследований и разработок в Синьцзян-Уйгурском автономном районе (номер гранта 2022B02014), Планом внедрения «Таланты Тяньчи» (в BN), Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (номер гранта 2021YFD2200203 [в GQ]) и Инновационным проектом Государственной ключевой лаборатории генетики и селекции деревьев (Северо-восточный университет лесного хозяйства) (номер гранта 2019A01 [в BN]).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Оборудование:
Бисерная машинаDHS Life Science401265
Центрифуга для пробирок объемом 1,5 млThermo Scientific75002440
Центрифуга для пробирок ПЦР Считыватель
микропланшетовBioTek8040528
NanodropDHS Life Science & Технология Ко., Лтд.2010/2020 микрообъемный спектрофотометр
Флуориметр Qubit 3.0 invitrogenQ33216 
Холодильник(-80)Panasonic Healthcare Co., Ltd17060107
Термоамплификатор T100Bio-Rad1861096термоамплификатор
Tanon EPS-600 ТанонА-179047-2313Для электрофореза
LabChip GX Touch HTPerkinElmerCLS138625Библиотека распределения фрагментов ДНК, контроль качества анализа нуклеиновых кислот
Прикладные биосистемы QuantStudio 12KПрикладные биосистемы4485694Библиотека количественного определения
Illumina Novaseq6000Illumina Материалы для секвенирования библиотеки
:
ПерчаткиЛюбой
10 μ LAxygenTF-300-R-S
аэрозольный барьерный наконечник 20μ LAxygenTF-20-R-S
аэрозольный барьерный наконечник 200μ LAxygenTF-200-R-S
аэрозольный барьерный самосвал 1000μ LAxygenTF-1000-R-S
центрифужная трубка 1,5 млAxygenMCT-150-C
Corning 96-луночный черный/прозрачный плоский дно МикропластинаCorning3631
хлопчатобумажная палочкаZHENDE MEDICAL76606
DNeasy PowerSoil KitQIAGEN 12888-100Для экстракции ДНК
бесферментная центрифужная пробирка 1,5 млСША SCIENTIFIC1415-2600
этанолTianjin Yongda Chemical Reagent Company Limited64-17-5
жесткие пробирки (5 мл)DHS Life Science0401261-17
Hot Master Mix Quanta Bio2200400
микроцентрифужная пробирка 2,0 млAxygenMCT-200-C-S
PCR ВодаQIAGEN 17000-10
QIAquick Набор для экстракции геля QIAGEN28704Для экстракции геля
Quant-iT dsDNA Assay Kits,Широкий ассортиментInvitrogenQ33130Для определения концентрации амплифицированных продуктов и очищенных библиотек ампликонов
квадратная чашка ПетриChangde Bkman Biotechnology Co., Ltd110301014
стальных бусинShangyu Yixin Ball Industry Co., Ltd.
раствор гипохлорита натрияTianjin Beilian Fine Chemicals Development Co., Ltd 7681-52-9
Tween 20Nachuan Biotechnology Studio9005-64-5
Набор высокочувствительных реагентов ДНК с двойным протоколомPerkinElmerCLS760672Обнаружение библиотеки ДНК
VAHTS Набор для количественной оценки библиотеки IlluminaVazyme Biotech Co., LtdNQ104Библиотека количественной оценки
Флуориметр наконечник для аэрозольного барьера NA YXB36985

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aguirre-Von-Wobeser, E., Alonso-Sanchez, A., Mendez-Bravo, A., Villanueva Espino, L. A., Reverchon, F. Barks from avocado trees of different geographic locations have consistent microbial communities. Archs Microbiol. 203 (7), 4593-4607 (2021).
  2. Konopka, B., Pajtik, J., Seben, V., Merganicova, K. Modeling bark thickness and bark biomass on stems of four broadleaved tree species. Plants (Basel). 11 (9), 1148(2022).
  3. Rosell, J. A. Bark in woody plants: Understanding the diversity of a multifunctional structure. Integr Comp Biol. 59 (3), 535-547 (2019).
  4. Kobayashi, K., Aoyagi, H. Microbial community structure analysis inacer palmatumbark and isolation of novel bacteria IAD-21 of the candidate division FBP. PeerJ. 7, e7876(2019).
  5. Pellitier, P. T., Zak, D. R., Salley, S. O. Environmental filtering structures fungal endophyte communities in tree bark. Mol Ecol. 28 (23), 5188-5198 (2019).
  6. Dreyling, L., Schmitt, I., Dal Grande, F. Tree size drives diversity and community structure of microbial communities on the bark of beech (fagus sylvatica). Front For Glob Change. 5, 858382(2022).
  7. Jo, Y., et al. Changes in microbial community structure in response to gummosis in peach tree bark. Plants (Basel). 11 (21), 2834(2022).
  8. Dong, C., et al. core microbiota, and function of the rhizosphere soil and bark microbiota in Eucommia ulmoides. Front Microbiol. 13, 855317(2022).
  9. Bodenhausen, N., Bortfeld-Miller, M., Ackermann, M., Vorholt, J. A. A synthetic community approach reveals plant genotypes affecting the phyllosphere microbiota. PLoS Genet. 10 (4), e1004283(2014).
  10. Bodenhausen, N., Horton, M. W., Bergelson, J. Bacterial communities associated with the leaves and the roots of Arabidopsis thaliana. PLoS One. 8 (2), e52369(2013).
  11. Stone, B. W. G., Weingarten, E. A., Jackson, C. R. The Role of the phyllosphere microbiome in plant health and function. Annual plant reviews. 1, 1-24 (2018).
  12. Lambais, M. R., Lucheta, A. R., Crowley, D. E. Bacterial community assemblages associated with the phyllosphere, dermosphere, and rhizosphere of tree species of the atlantic forest are host taxon dependent. Microb. Ecol. 68 (3), 567-574 (2014).
  13. Arrigoni, E., Antonielli, L., Pindo, M., Pertot, I., Perazzolli, M. Tissue age and plant genotype affect the microbiota of apple and pear bark. Microbiol Res. 211, 57-68 (2018).
  14. Germain, H., Séguin, A. Innate immunity: Has poplar made its bed. New Phytol. 189 (3), 678-687 (2011).
  15. Varnagirytė-Kabašinskienė, I., et al. Evaluation of shoot collection timing and hormonal treatment on seedling rooting and growth in four poplar genomic groups. Forests. 15 (9), (2024).
  16. Lu, S., et al. Ptr-mir397a is a negative regulator of laccase genes affecting lignin content in Populus trichocarpa. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (26), 10848-10853 (2013).
  17. Krabel, D., et al. Early root and aboveground biomass development of hybrid poplars (populus spp.) under drought conditions. Can J For Res. 45 (10), 1289-1298 (2015).
  18. Vitulo, N., et al. Bark and grape microbiome of vitis vinifera: Influence of geographic patterns and agronomic management on bacterial diversity. Front Microbiol. 9, 3203(2018).
  19. Aschenbrenner, I. A., Cernava, T., Erlacher, A., Berg, G., Grube, M. Differential sharing and distinct co-occurrence networks among spatially close bacterial microbiota of bark, mosses and lichens. Mol Ecol. 26 (10), 2826-2838 (2017).
  20. Liang, X., Wan, D., Tan, L., Liu, H. Dynamic changes of endophytic bacteria in the bark and leaves of medicinal plant eucommia ulmoides in different seasons. Microbiol Res. 280, 127567(2024).
  21. De Muinck, E. J., Trosvik, P., Gilfillan, G. D., Hov, J. R., Sundaram, A. Y. M. A novel ultra high-throughput 16s rRNA gene amplicon sequencing library preparation method for the illumina Hiseq platform. Microbiome. 5 (1), 68(2017).
  22. Anguita-Maeso, M., Haro, C., Navas-Cortes, J. A., Landa, B. B. Primer choice and xylem-microbiome-extraction method are important determinants in assessing xylem bacterial community in olive trees. Plants (Basel). 11 (10), 1320(2022).
  23. Wang, C., Liu, D. W., Bai, E. Decreasing soil microbial diversity is associated with decreasing microbial biomass under nitrogen addition. Soil Biol Biochem. 120, 126-133 (2018).
  24. Almeida, A., Mitchell, A. L., Tarkowska, A., Finn, R. D. Benchmarking taxonomic assignments based on 16s rRNA gene profiling of the microbiota from commonly sampled environments. GigaScience. 7 (5), giy54(2018).
  25. Liland, K. H., Vinje, H., Snipen, L. Microclass: An R-package for 16s taxonomy classification. BMC Bioinform. 18 (1), 172(2017).
  26. Li, S., et al. The AREb1 transcription factor influences histone acetylation to regulate drought responses and tolerance in Populus trichocarpa. Plant Cell. 31 (3), 663-686 (2019).
  27. Cregger, M. A., et al. The Populus holobiont: Dissecting the effects of plant niches and genotype on the microbiome. Microbiome. 6 (1), 31(2018).
  28. Maria Rodríguez, J. O., Ziani, K., Maté, J. I. Combined effect of plasticizers and surfactants on the physical properties of starch based edible films. Food Res Int. 39 (8), 840-846 (2006).
  29. Beckers, B., De Beeck, M. O., Weyens, N., Boerjan, W., Vangronsveld, J. Structural variability and niche differentiation in the rhizosphere and endosphere bacterial microbiome of field-grown poplar trees. Microbiome. 5 (1), 25(2017).
  30. Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16s rrna diversity at a depth of millions of sequences per sample. Proc Natl Acad Sci USA. 108, 4516-4522 (2011).
  31. Mcpherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass experiments. J Vis Exp. 24 (137), e57932(2018).
  32. Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods. 7 (5), 335-336 (2010).
  33. Callahan, B. J., et al. Dada2: High-resolution sample inference from illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  34. Pruesse, E., et al. A comprehensive online resource for quality checked and aligned ribosomal RNA sequence data compatible with ARB. Nucleic Acids Res. 35 (21), 7188-7196 (2007).
  35. Ginestet, C. Ggplot2: Elegant graphics for data analysis. J R Stat Soc Ser A Stat Soc. 174, 245-245 (2011).
  36. Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. Stamp: Statistical analysis of taxonomic and functional profiles. Bioinform. 30 (21), 3123-3124 (2014).
  37. Holmes, S. P., McMurdie, P. J., Callahan, B. J. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. 11, 2639-2643 (2017).
  38. Chernov, T. I., Tkhakakhova, A. K., Kutovaya, O. V. Assessment of diversity indices for the characterization of the soil prokaryotic community by metagenomic analysis. Eurasian Soil Sci. 48 (4), 410-415 (2015).
  39. Li Yu, X., Hu, X. Y., Wang, X. X., Zhang, X. Y., Du, K. B. A protocol specialized for microbial DNA extraction from living poplar wood. Not Bot Horti Agrobot Cluj Napoca. 50 (4), (2022).
  40. Jeffrey, L. C., et al. Bark-dwelling methanotrophic bacteria decrease methane emissions from trees. Nat Commun. 12 (1), 2127(2021).
  41. Chelius, M. K., Triplett, E. W. The diversity of archaea and bacteria in association with the roots of zea mays l. Microb Ecol. 41 (3), 252-263 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

16S

Похожие статьи