Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Тренажер для рыбок данио-рерио, вызванный плаванием, для универсальных подходов к тренировкам

2.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66382

⸱

18 октября 2024 г.

 ,  ,  , 
1Exercise Genetics and Metabolism Laboratory, Molecular Biology Program, Department of Biophysics, Federal University of São Paulo, 2Exercise Genetics and Metabolism Laboratory, Nephrology Program, Department of Biophysics, University Federal of Sao Paulo

В этой статье

Краткое содержание

Тренажеры, предназначенные для менее удачливых рыб, облегчают выполнение различных протоколов упражнений с различной интенсивностью, манипулируя скоростью потока воды, достижимой с помощью реотаксиса.

Аннотация

Чтобы всесторонне исследовать влияние физических упражнений на здоровье и болезни, животные модели играют ключевую роль. Рыбки данио, широко используемые позвоночные модельные организмы, предлагают уникальную платформу для таких исследований. Это исследование положило начало разработке экономически эффективного аппарата, предназначенного для исследований упражнений рыбок данио-рерио с использованием легкодоступных материалов. Устройство основано на принципах плавательного туннеля и включает в себя сеть труб и клапанов, соединенных с погружным насосом. Расход воды тщательно контролируется датчиком и регулируется с помощью клапанов. Для оценки эффективности аппарата были реализованы два протокола тренировок: непрерывная тренировка умеренной интенсивности (MICT) и высокоинтенсивная интервальная тренировка (HIIT). Рыбы тренировались коллективно, а их плавательные способности оценивались с помощью теста на выносливость. Оба протокола тренировок привели к улучшению результатов плавания после 30 дней тренировок и вызвали изменения в молекулярном ответе на упражнения по сравнению с контрольной группой, ведущей сидячий образ жизни. Примечательно, что HIIT продемонстрировал более высокую эффективность по сравнению с MICT. Система дрессировки рыбок данио оказалась ценным инструментом для исследований в области физиологии упражнений и еще больше расширяет возможности модели рыбок данио в этой области.

Введение

Физические упражнения включают в себя любые движения тела, выполняемые скелетными мышцами, которые приводят к увеличению расхода энергии, при этом упражнения являются структурированным и повторяющимся подмножеством физических упражнений1. Физические упражнения, многофакторная и экономически эффективная деятельность, вовлекающая весь организм, приносят множество преимуществ для здоровья, таких как профилактика метаболического синдрома и саркопении. Следовательно, область физиологии упражнений представляет значительный интерес, поскольку она стремится выяснить, как организм адаптируется к острому стрессу от физических упражнений, хроническому стрессу от физических упражнений и общему влиянию физических упражненийна здоровье.

Проведение исследований физиологии упражнений на людях может быть как дорогостоящим, так и трудоемким из-за сложностей в планировании экспериментов и мониторинге участников3. Поэтому использование животных моделей в лабораторных условиях было настоятельно рекомендовано из-за их генетического и физиологического единообразия. Более того, в контролируемых лабораторных условиях животные, как правило, ведут сидячий образ жизни и регулируют потребление пищи4. Среди животных моделей грызуны были наиболее широко задействованы в исследованиях, связанных сфизическими упражнениями. Тем не менее, данио рерио (Danio rerio; Hamilton, 1822) является дополнительной моделью для мышей и других видов для исследований физических упражнений 5,6,7,8.

В исследованиях рыбок данио физические упражнения могут проводиться с использованием коммерчески доступных или специально построенных плавательных туннелей. Среди коммерчески доступных вариантовнаиболее часто используется тоннель типа Blazka, разработанный компанией Loligo System. 7,9,10. Эта система вызывает принудительное плавание через гребной винт, соединенный с электродвигателем, создавая непрерывный поток воды в туннеле. Эта способность к плаванию коренится в принципе реотаксиса, врожденном поведении рыб, которое заставляет их плыть против водных течений и сохранятьсвое положение. Реотаксис позволяет измерять критическую скорость плавания (Ucrit), представляющую собой максимальную скорость, которую рыба может поддерживать в течение определенного периода времени. Тем не менее, стоит отметить, что это оборудование, хотя и ценно для оценки поведения при плавании и потребления кислорода, имеет значительную стоимость.

Исследователи разработали альтернативные приспособления для упражнений рыбок данио, часто основанные на механизме типа Блашки 10,13,14 или более простых механизмах 8,15,16. Тем не менее, эти методы могут быть ограничены техническими требованиями протокола, включая увеличенную продолжительность, значительные затраты на оборудование и ограничения пропускной способности и точности. Следовательно, основной целью исследования была разработка доступной и удобной для пользователя системы упражнений для рыбок данио-рерио с использованием легкодоступных материалов, обеспечивая новый альтернативный снаряд для физических упражнений у рыб. Вторичной целью было внедрение как аэробных, так и анаэробных режимов упражнений у рыбок данио, что еще больше способствовало использованию модели рыбок данио в качестве стратегии вмешательства в исследования упражнений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Процедуры получили предварительное одобрение Комитета по этике использования животных Федерального университета Сан-Паулу (CEUA/UNIFESP No 9206260521). В исследовании принимали участие только взрослые самки дикого типа Danio rerio в возрасте 6 месяцев и весом 2,5-3 г. Оборудование и реактивы, необходимые для проведения исследования, перечислены в Таблице материалов.

1. Изготовленный на заказ тренажер для рыбок данио-рерио

ПРИМЕЧАНИЕ: Тренажер был изготовлен по индивидуальному заказу. Для получения подробной информации см. Рисунок 1, Дополнительную таблицу 1, Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2.

  1. Поместите погружной насос (N) в резервуар для воды (O) (≥30 л). Убедитесь, что вода соответствует следующим условиям: pH 7,2 ± 0,5 и 400 ± 50 μS, 28 ± 1 °C.
  2. Текучий дополнительный стол 1 и рисунок 1, соедините трубу (I) с точечной тройником (B) и прикрепите маленькую трубу (G) к боковой стороне B. От G установите соединения к шаровому клапану (F), затем к другому G, и последовательно к колену трубы (A) и I, тем самым завершив сегмент, отвечающий за регулирование давления воды в системе. Это регулирование достигается за счет обратного потока в резервуар для воды (О).
  3. В альтернативной части B соедините его с трубой (J), а затем соедините с A и G. Используйте фитинг для трубной раструбы (D) для подключения задвижки водяной задвижки (E) к G.
  4. Интегрируйте в систему входной порт для рыбы, подключив B к G на одном конце и присоединив другой G на противоположном конце. Затем подсоедините фитинг раструбной трубы (C) к этому второму G, установив последовательность, которая соединяется с акриловой трубой (K), что имеет решающее значение для визуализации поведения при плавании.
    1. Чтобы соединить K с датчиком расхода воды (M), используйте трубки C, G и D. Перейдите к соединению M к G с помощью D, а затем интегрируйте A, G и H, чтобы облегчить возврат воды в резервуар.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вставьте москитную сетку в короткий сегмент трубы между затвором и шаровым клапаном (F2), чтобы предотвратить доступ рыбы к другим секциям устройства. Шаровой клапан (F) выполняет двойную функцию. Первый шаровой клапан (F1) контролирует поток воды, возвращающийся в резервуар перед поступлением в остальную часть аппарата, действуя как клапан регулирования давления в системе. Шаровой клапан (F2) является точкой входа и выхода для рыбок данио в системе.
  5. Прикрепите датчик расхода воды после акриловой трубы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Датчик расхода должен быть подключен к ЖК-дисплею и запрограммирован с помощью Arduino (Рисунок 1). Подробная информация о настройке Arduino представлена в дополнительном файле 2.

2. Работа аппарата

  1. Чтобы безопасно ввести рыбу в систему, важно прервать поток воды. Для этого закройте задвижку (E), держа шаровой клапан (F1) открытым. Затем откройте шаровой клапан (F2), который служит входом в систему, аккуратно введите рыбу и быстро закройте клапан F2. Наконец, откройте клапан E, чтобы наполнить зону упражнений водой.
  2. Используйте шаровой клапан для управления скоростью потока, отводя воду обратно в резервуар при необходимости.
  3. Используйте задвижку (F2) для точной регулировки потока и управления доступом рыбы.
  4. Чтобы удалить рыбу в конце испытания, закройте клапан (E) при соблюдении критериев разряжения. Затем откройте клапан F и поверните его на 180° относительно оси акриловой трубки; Это облегчит дренаж воды, уносящей с собой истощенную рыбу.
  5. Выполнение мониторинга потока.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо контролировать скорость потока воды через систему, которая включает в себя Arduino Nano, ЖК-экран 16 x 2, резистор через отверстие 10 кОм, 0,25 Вт и потенциометр 10 кОм. Датчик расхода непрерывно контролирует скорость потока воды на основе технологии Холла17. Каждый импульс тока соответствует одному обороту флоппера датчика, в результате чего частота (Гц) составляет 6,6 x Q (расход в л/мин).
    1. Подсоедините соответствующие провода датчика расхода к контактам 5 В, GND и D2 Arduino Nano (дополнительная таблица 1). Загрузите предоставленный эскиз (дополнительный файл 1) в Arduino с помощью Arduino IDE. Питание системы осуществляется через USB-порт Arduino.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения расхода отображаются на ЖК-экране с разрешением 16 x 2. Калибровка датчика расхода воды показана на рисунке 2. Схемы подключений Arduino к ЖК-дисплею показаны на рисунке 3.

3. Испытание на выносливость

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе описывается процедура испытания на выносливость для определения максимальной скорости плавания (Umax) рыбок данио.

  1. Во-первых, дайте рыбе в течение 60 минут в день адаптироваться к низкой скорости течения воды (0,06 м/с) внутри плавательного туннеля в течение двух недель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После 24-часового периода предварительной подготовки отдельные рыбки данио проходят продолжительное испытание на плавательные характеристики. Цель этого теста – установить Umax каждой рыбы.
  2. Поместите рыбок данио по отдельности в аппарат.
  3. Условия испытания: Расположите рыбу против течения воды с начальной скоростью 0,06 м/с в течение 10 минут.
  4. Приращения скорости: Увеличивайте расход воды дискретными этапами, с шагом 0,02 м/с, происходящим каждую минуту в течение 40-50 минут.
  5. Определение Umax: Установите максимальную скорость плавания (Umax), когда рыба соответствует критериям истощения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Истощение определяется при первой из следующих ситуаций: (1) неспособность удерживать свое положение против потока воды более трех раз, или (2) неспособность удерживать свое положение более 5 с.
  6. Закройте клапан (E) при соблюдении критериев разрядки. Затем откройте клапан F и поверните его на 180° относительно оси акриловой трубки. Это облегчит сток воды, вынося истощенных рыб.

4. Группы упражнений и порядок действий

ПРИМЕЧАНИЕ: Для создания четких протоколов упражнений важно включить сидячую группу, которая подвергалась воздействию идентичных экспериментальных условий, чтобы сравнить эффекты протоколов упражнений, хотя и без высокоинтенсивных упражнений. Также важно установить Umax, потому что дроби значения Umax необходимы для определения интенсивности протоколов упражнений.

  1. Сидячая группа: Подвергайте рыбу принудительному плаванию против течения воды со скоростью 0,06 м/с в течение 60 минут.
    Примечание: Аппарат генерирует непрерывный поток воды, заставляя рыб плыть против этого течения на основе принципа реотаксиса11.
  2. Группа непрерывной тренировки умеренной интенсивности (MICT): Подвергайте рыбу принудительному плаванию против течения воды при температуре 60% Umax, как определено в тесте на максимальную мощность, в течение 35 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был адаптирован из Húngaro et al.18. В течение первых 10 минут рыба акклиматизировалась до той же скорости, что и сидячая группа (0,05 м/с).
  3. Группа высокоинтенсивных интервальных тренировок (HIIT): Подвергайте рыб принудительному плаванию, чередуя скорости плавания: 2 минуты при 90% Umax, затем 2 минуты при 30% Umax, повторяя в течение 18 минут (9 циклов). Этот протокол был адаптирован из Marcinko et al.19.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение первых 10 минут периода упражнений необходимо акклиматизировать рыб с той же скоростью, что и сидячая группа (0,06 м/с).
  4. Выполняйте все протоколы упражнений в течение 5 дней в неделю в течение четырехнедельного периода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рыб следует содержать в аквариумах, обеспечивающих подходящие условия, и их следует вводить в тренажеры только в специально отведенные для этого периоды. Рыбы должны быть обеспечены кормом из тропических рыб хлопьями три раза в день, а вода в аквариумах технического обслуживания должна подвергаться частичной подмене каждые 2 дня.
  5. Повторяйте тест на выносливость в конце каждой недели, используя данные о задержке и скорости в точке усталости в качестве индикаторов параметров физической подготовки.
  6. Чтобы вызвать эффект перетренированности, увеличивайте скорость потока воды еженедельно на основе результатов теста на выносливость, проводимого после каждого 4-дневного цикла тренировок. Продолжительность тренировок должна быть скорректирована с учетом пройденного расстояния (скорость × время), и эта продолжительность должна оставаться одинаковой между тренирующимися группами.
  7. Корректируйте время плавания в зависимости от увеличения потока воды, тем самым стандартизируя тренировочную нагрузку в тренируемых группах.

5. Замеры тела

  1. Обезболивайте рыб 0,0075% трикаином (w/v) путем погружения для проведения измерений тела (вес и размер)20.
  2. Сфотографируйте и взвесьте рыб, чтобы определить размеры тела с помощью программного обеспечения ImageJ.
  3. Выразите данные в терминах индексов упитанности (вес [г]/стандартная длина [мм]2; ИМТ) и оценка упитанности (BCS)20.
  4. Чтобы исключить вариации размеров и веса, вызванные образованием яиц, подвергните рыб стандартному разведению20 с последующими измерениями и взвешиванием.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Тренажер продемонстрировал замечательную эффективность в регулировании скорости потока. Для постепенного увеличения скорости плавания поток воды постепенно увеличивался еженедельно для всех групп, за исключением группы СЭД, которая поддерживалась при постоянной скорости течения 0,06 м/с. Примечательно, что аппарат обеспечил замечательный уровень точности, достигнув регулировки скорости потока до 0,001 м/с. Тем не менее, частота ошибок составляла 30% при низких скоростях, таких как 0,06 м/с. При высоких скоростях, таких к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании была разработана инновационная, экономически эффективная система упражнений, вдохновленная респирометром для плавательного туннеля от Loligo Systems21 и системой лотка22 для всестороннего изучения плавательных способностей рыбок данио. Umax определяли путем систематического увеличения потока воды дискретными стадиями, с увеличением скорости через короткие промежутки времени (20-30 мин) до тех пор, пока рыба не достигала ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Важно уточнить, что нет никаких конкурирующих финансовых интересов, связанных с исследованием, представленным в данной рукописи. Не было установлено никаких финансовых партнерств или аффилированных лиц с организациями или юридическими лицами, которые могли бы потенциально повлиять на результаты этой работы или повлиять на них. Это заявление служит гарантией того, что процесс исследования был прямым и честным, без финансовых конфликтов, влияющих на результаты. Презентация этой работы продиктована искренней страстью к предмету, движимой исключительно любовью к академическим кругам и стремлением к научным знаниям.

Благодарности

Выражаем благодарность доктору Омару Мертинсу за великодушное предоставление доступа в лабораторию для содержания рыб и проведения тестов. Кроме того, выражается благодарность FAPESP, CNPq и CAPES за присуждение стипендий для поддержки этого исследования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Колено из ХПВХ женское 90-градусное для сантехникиTigre221502603/4 дюйма 
24AWG WireSky Cablo StoreСоединение между компонентами в перфорированной печатной плате (1м)
Акриловая трубаМагазин прозрачного пластика411384083/4-дюймовых 
Аквариумный погружной аквариумAqua Tank300 Вт
Труба из ХПВХ Tigre101217873/4-дюймовый 
Водяной клапан с внутренней резьбойTigre279503103/4-дюймовый 
Внутренний резьбовой водяной клапанTigre279405103/4-дюймовый 
резистор с отверстиемBXV10 kΩ, 0,25 Вт t
Лабораторная опорная стойка с зажимом с 30-дюймовым стержнем Масие ЛабсRSC0001Поддержка горизонтальных труб
ЖК-экрана Eichip16 x 2, модель JHD162A
Наружная x Наружная резьба Dupont JumpersChyanСоединение между arduino и датчиком расхода (30 см)
Перфорированная печатная плата односторонняяKY WIN ROBOT5 x 10 см
ПотенциометрLUSYADL-ALPSA0110kΩ
Рулон водоблокирующей лентыOne World5603131000Для предотвращения протечек
Силиконовый шлангTigre142112502 см внутренний
Паяльная станцияQHTITECEU/US ЗаглушкаАрдуиновая система сварки 
Катушка с проволокой для пайкиBEEYIHFI001-A001-SetСистема сварки Arduine 
Резьбовое гнездо с наружной резьбой и без резьбы с внутренней резьбой Фитинг для труб из ХПВХTIgre354478493/4-дюймовый 
Трикейн (MS-222)Sigma-AldrichE10521Обезболивающее
средство UNO-R3 плата UNO R3 CH340G+MEGA328P Чип 16Mhz FSXSEMIдля платы разработки Arduino UNO R3
Фитинг для тройника без резьбы CPVC, внутренняя22200267 Tigre3/4-дюймовый 
Фитинг для труб с внутренней резьбой из ХПВХTigre221702603/4 дюйма 
Датчик расхода воды  модель YF-B5 Siqma RoboticsSQ86591-25 л/мин
 SunsunМодель HJ-2041, 3000 л/ч, 65 Вт
Резервуар для водыCustom30 л
Водяной насос

Ссылки

  1. Seo, D. Y., et al. Humanized animal exercise model for clinical implication. Pflugers Arch Eur. J Physiol. 466 (9), 1673-1687 (2014).
  2. Nylén, E. S., Gandhi, S. M., Lakshman, R. Cardiorespiratory fitness, physical activity, and metabolic syndrome. Cardiorespiratory Fitness in Cardiometabolic Diseases: Prev. & Manag. in Clin. Pract. , Springer. 207-215 (2019).
  3. Cholewa, J., et al. Basic models modeling resistance training: an update for basic scientists interested in study skeletal muscle hypertrophy. J Cell Physiol. 229 (9), 1148-1156 (2014).
  4. Martin, B., Ji, S., Maudsley, S., Mattson, M. P. 34;Control" laboratory rodents are metabolically morbid: Why it matters. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (14), 6127-6133 (2010).
  5. Palstra, A. P., et al. Swimming-induced exercise promotes hypertrophy and vascularization of fast skeletal muscle fibres and activation of myogenic and angiogenic transcriptional programs in adult zebrafish. BMC Genomics. 15 (1), 1-20 (2014).
  6. Blazina, A. R., Vianna, M. R., Lara, D. R. The spinning task: A new protocol to easily assess motor coordination and resistance in zebrafish. Zebrafish. 10 (4), 480-485 (2013).
  7. Gilbert, M. J. H., Zerulla, T. C., Tierney, K. B. Zebrafish (Danio rerio) as a model for the study of aging and exercise: Physical ability and trainability decrease with age. Exp Gerontol. 50, 106-113 (2014).
  8. Usui, T., et al. The French press: A repeatable and high-throughput approach to exercising zebrafish (Danio rerio). Peer J. 2018 (1), 1-12 (2018).
  9. Tierney, K. B. Swimming performance assessment in fishes. J. Vis. Exp. (51), e2572(2011).
  10. Palstra, A. P., et al. Establishing zebrafish as a novel exercise model: Swimming economy, swimming-enhanced growth and muscle growth marker gene expression. PLoS One. 5 (12), e0014483(2010).
  11. Arnold, G. P. Rheotropism in fishes. Biol Rev Camb Philos Soc. 49 (4), 515-576 (1974).
  12. Messerli, M., et al. Adaptation mechanism of the adult zebrafish respiratory organ to endurance training. PLoS One. 15 (2), 1-20 (2020).
  13. Bek, J. W., De Clercq, A., Coucke, P. J., Willaert, A. The ZE-tunnel: An affordable, easy-to-assemble, and user-friendly benchtop zebrafish swim tunnel. Zebrafish. 18 (1), 29-41 (2021).
  14. Lucon-Xiccato, T., et al. An automated low-cost swim tunnel for measuring swimming performance in fish. Zebrafish. 18 (3), 231-234 (2021).
  15. Blazina, A. R., Vianna, M. R., Lara, D. R. The spinning task: A new protocol to easily assess motor coordination and resistance in zebrafish. Zebrafish. 10 (4), 480-485 (2013).
  16. Depasquale, C., Leri, J. The influence of exercise on anxiety-like behavior in zebrafish (Danio rerio). Behav Processes. 157, 638-644 (2018).
  17. Karsenty, A. A comprehensive review of integrated hall effects in macro-, micro-, nanoscales, and quantum devices. Sensors. 20 (15), Basel, Switzerland. 4163(2020).
  18. Húngaro, T. G. R., et al. Physical exercise exacerbates acute kidney injury induced by LPS via toll-like receptor 4. Front Physiol. 11, 1-13 (2020).
  19. Marcinko, K., et al. High intensity interval training improves liver and adipose tissue insulin sensitivity. Mol Metab. 4 (12), 903-915 (2015).
  20. Chen, W., Ge, W. Gonad differentiation and puberty onset in the zebrafish: Evidence for the dependence of puberty onset on body growth but not age in females. Mol Reprod Develop. 80 (5), 384-392 (2013).
  21. Conradsen, C., Walker, J. A., Perna, C., McGuigan, K. Repeatability of locomotor performance and morphology-locomotor performance relationships. J Exp Biol. 219 (18), 2888-2897 (2016).
  22. Widrick, J. J., et al. An open source microcontroller based flume for evaluating swimming performance of larval, juvenile, and adult zebrafish. PLoS ONE. 13 (6), 1-14 (2018).
  23. Gilbert, M. J. H., Zerulla, T. C., Tierney, K. B. Zebrafish (Danio rerio) as a model for the study of aging and exercise: Physical ability and trainability decrease with age. Exp Gerontol. 50 (1), 106-113 (2013).
  24. Hammer, C. Fatigue and exercise tests with fish. Exp Gerontol. 112 (1), 1-20 (1995).
  25. Takahiro Hasumura, S. M. Exercise quantity-dependent muscle hypertrophy in adult zebrafish (Danio rerio). J Comp Physiol B. 186, 603-614 (2016).
  26. Wang, L., et al. Effect of aerobic exercise as a treatment on type 2 diabetes mellitus with depression-like behavior zebrafish. Life Sciences. 300, 120578(2022).
  27. Conradsen, C., McGuigan, K. Sexually dimorphic morphology and swimming performance relationships in wild-type zebrafish Danio rerio. J Fish Bio. 87 (5), 1219-1233 (2015).
  28. Hughes, D. C., Ellefsen, S., Baar, K. Adaptations to endurance and strength training. Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (6), 1-18 (2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Туннель для плаваниявысокоинтенсивный интервальный тренингнепрерывный тренинг умеренной интенсивностипоказатели плаванияфизиология упражненийрегулирование потока водытест на выносливостьпротоколы физических тренировокмодель животного
Тренажер для рыбок данио-рерио, вызванный плаванием, для универсальных подходов к тренировкам
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.