В данной статье представлена уникальная методика закрытой грудной клетки для индуцирования ишемии-реперфузионного повреждения миокарда (ИРИ) у мышей. Представленный метод позволяет мышам дышать спонтанно, дистанционно индуцируя ишемию миокарда. Это обеспечивает доступ к животному для изучения динамических процессов ишемии и реперфузии in situ и в режиме реального времени с помощью неинвазивной визуализации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Дистанционно инициируемая окклюзия ПМЖ с помощью баллонного катетера у спонтанно дышащих мышей
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Острый инфаркт миокарда (ОИМ) является распространенным сердечно-сосудистым заболеванием с высокой смертностью. Несмотря на достижения в стратегиях реваскуляризации при ОИМ, он часто приводит к ишемии-реперфузионному повреждению миокарда (ИРИ), усиливая повреждение сердца. Мышиные модели служат жизненно важными инструментами для исследования как острой травмы, так и хронического ремоделирования миокарда in vivo. В этом исследовании представлена уникальная техника закрытой грудной клетки для дистанционного индуцирования ИРИ миокарда у мышей, позволяющая исследовать очень раннюю фазу окклюзии и реперфузии с помощью визуализации in vivo, такой как МРТ или ПЭТ. В протоколе используется метод удаленной окклюзии, позволяющий точно контролировать начало ишемии после закрытия грудной клетки. Это снижает операционную травму, обеспечивает спонтанное дыхание и повышает стабильность эксперимента. Что отличает этот метод, так это его потенциал для одновременной неинвазивной визуализации, включая ультразвук и магнитно-резонансную томографию (МРТ), во время окклюзии и реперфузии. Он предлагает уникальную возможность анализировать реакцию тканей практически в режиме реального времени, предоставляя критически важную информацию о процессах во время ишемии и реперфузии. Было проведено обширное систематическое тестирование этого инновационного подхода, измеряя маркеры некроза сердца на инфаркт, оценивая зону риска с помощью МРТ с контрастным усилением и окрашивая инфаркты на стадии созревания рубца. В ходе этих исследований был сделан акцент на ценности предложенного инструмента для продвижения подходов к исследованиям ишемии-реперфузионного повреждения миокарда и ускорения разработки целевых вмешательств. В статье представлены предварительные результаты, демонстрирующие возможность сочетания предложенного инновационного экспериментального протокола с неинвазивными методами визуализации. Эти первоначальные результаты подчеркивают преимущества использования специально созданной колыбели для животных для дистанционного индуцирования ишемии миокарда при одновременном проведении МРТ.
Введение
Острый инфаркт миокарда (ОИМ), распространенное глобальное сердечно-сосудистое заболевание, связано с высокими показателями смертности и заболеваемости1. Несмотря на технологические достижения, которые позволили разработать ранние и эффективные стратегии реваскуляризации у пациентов с ОИМ, пациенты по-прежнему испытывают ишемическое поражение миокарда (ИРИ) после этих вмешательств2. Поэтому понимание фундаментальных механизмов и формулирование подходов к смягчению последствий ИРИ имеет решающее значение. ИРИ представляет собой сложное патофизиологическое состояние, включающее множество сложных биологических процессов. Они включают в себя регулируемую гибель клеток, реакции на окислительный стресс, воспаление, заживление ран, фиброз и ремоделирование желудочков. Животные модели, такие как мыши, имеют большое значение для исследований IRI и широко используются благодаря их экономической эффективности, быстрому размножению и богатству механистической информации из трансгенныхмоделей.
Этот протокол представляет собой инновационную методику дистанционного индуцирования ИРИ у спонтанно дышащих мышей с закрытой грудной клеткой, более точно имитируя патологию человека. Дистанционная окклюзия достигалась с помощью баллонного катетера, расположенного на расстоянии от миокарда для окклюзии левой передней нисходящей артерии (ПМЖ). Этот подход обеспечивает непрерывный доступ к работающему сердцу в точные моменты окклюзии и реперфузии, облегчая одновременные методы визуализации, включая ультразвук или магнитно-резонансную томографию (МРТ). Эти неинвазивные методы могут дать решающее представление о реакциях тканей до, во время и после окклюзии и реперфузии.
Существуют различные хирургические методы индуцирования ИРИ у мышиных моделей. Хирургическая травма, полученная в результате торакотомии на открытых моделях коронарного лигирования грудных артерий, вызывает иммунный ответ, влияющий на различные механизмы, связанные с ишемией и реперфузией. Активация врожденной иммунной системы потенциально может влиять на степень инфаркта миокарда4. Предложенная адаптированная методика обеспечивает потенциальный подход к изучению пре- и посткондиционирования миокарда и, возможно, снижению влияния врожденного иммунного ответа на хирургическую травму в исследованиях IRI мышей за счет минимизации временных рамок открытой грудной клетки максимум до 5 минут. Кроме того, недавно разработанная методика может также способствовать уменьшению провоспалительных последствий, вызванных повреждением легких, вызванным искусственной вентиляцией легких5. Тем не менее, комбинированные эффекты этого нового метода закрытой грудной клетки потребуют дальнейшего углубленного исследования.
Тщательная валидация предложенной методики была проведена путем сравнения ее с традиционным методом, который предполагает обнажение ПМЖ через хирургическую диссекцию грудной клетки и лигатурно-индуцированную окклюзию в течение 30 минут. Сравнивались результаты обоих методов, которые включали измерения тропонина, отражающие размер инфаркта миокарда, оценку области риска с помощью МРТ с усилением контраста гадолиния, гистологическое окрашивание трифенилтетразолия хлорида (TTC) и определение окончательных размеров рубцов с помощью окрашивания Sirius Red (SR). Полученные результаты демонстрируют надежность и эффективность предложенного подхода к изучению ишемии-реперфузионного повреждения на мышиных моделях.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол для животных был одобрен и соответствует руководящим принципам и правилам, изложенным Этическим комитетом по экспериментам на животных (ECD) в Католическом университете Лёвена. Все политики, разработанные местным ECD, соответствуют правилам Европейского Союза в отношении благополучия лабораторных животных, заявленным в Директиве 2010/63/ЕС. Все описанные ниже тесты были проведены на мышах C57BL/6 в возрасте 8-12 недель (масса тела = 20-23 г). В острых экспериментах представлены животные, которые были принесены в жертву сразу после операции. Эксперименты по выживанию представляли собой четырехнедельное наблюдение, включая измерение тропонина, МРТ и окрашивание SR.
1. Анестезия и эндотрахеальная интубация
- Введение препарата перед анестезией с использованием смеси кетамина (7,5 мг/кг; Ниматек 100 мг/мл), ксилазин (1 мг/кг; ромпун, 20 мг/мл) и ацепромазин (0,1 мг/кг; Плацивет, 10 мг/мл) (KXA) (см. Таблицу материалов) с 0,9 % физиологическим раствором внутрибрюшинно. Это обеспечивает более плавную и менее инвазивную интубацию.
- Поместите мышь в индукционную камеру (см. Таблицу материалов) и вызовите анестезию с использованием 2,5% изофлурана в чистом кислороде со скоростью потока 1 л/мин до потери рефлекса выпрямления и защемления пальцев ног.
- Переложите животное на подогретую подушку (±38 °C) и расположите его на спине головой к хирургу. Зафиксируйте хвост и передние лапы скотчем на подушечке. Следите за тем, чтобы передние конечности не были чрезмерно растянуты, так как это может нарушить дыхание.
- Наложите шелковый шов 2-0 (см. Таблицу материалов) вокруг верхних резцов и наложите шов на край подушечки, чтобы натянуть мышь. При необходимости прикрепите иглодержатель для удержания натяжения шва. Поддерживайте животное под наркозом, используя 2% изофлуран в 100% кислороде с потоком 1 л/мин с помощью носового обтекателя.
- Поместите источник света прямо в ростраль грудины, снимите носовой конус и поместите источник изофлурана на аппарат искусственной вентиляции легких. Интубируйте мышь с помощью щипцов, подняв язык вверх и держа самодельный ларингоскоп, чтобы поднять базальную часть языка дальше и визуализировать голосовые связки.
- Поместите самодельную трахеальную трубку с помощью катетера 18 G на тупую иглу между голосовыми связками. Поднимите катетер, извлеките тупую иглу и подсоедините трубку к аппарату искусственной вентиляции легких мыши (см. Таблицу материалов).
- Используйте модифицированный Y-образный соединитель (см. Таблицу материалов) для подключения интубационной трубки к аппарату ИВЛ. Правильное расположение трахеальной трубки можно подтвердить, оценив симметричное расширение грудной клетки.
- Установите дыхательный объем (мл) на уровне массы тела (BW) (г) x 7 и скорость вентиляции на уровне 53,5 x (BW (g)-0,26) ходов в минуту и при необходимости отрегулируйте его в соответствии с массой тела конкретной мыши6 (например, для мыши весом 25 г дыхательный объем составляет 175 мл при 140 ударах в минуту).
- Уменьшите содержание изофлурана до 1% в 100% кислороде, так как животное будет находиться под наркозом из-за премедикации. Тем не менее, регулярно оценивайте глубину анестезии, выполняя защемление пальца ноги. Корректируйте концентрацию изофлурана в зависимости от глубины анестезии.
- Нанесите каплю офтальмологической мази, чтобы предотвратить сухость во время пребывания под анестезией.
2. Установка инструмента IRI
ПРИМЕЧАНИЕ: Снимите всю ленту и поместите животное на опорную плиту специального инструмента IRI. Подробная информация о свойствах инструмента IRI приведена в Дополнительном файле 1.
- Зафиксируйте опорную пластину специально разработанного инструмента с дистанционным ИРИ в боковом положении перед хирургом. Зафиксируйте хвост и лапы с помощью скотча. Зафиксируйте головку с помощью шелкового шва 2-0 вокруг верхних резцов, чтобы предотвратить случайное движение (Рисунок 1).
- Вставьте ректальный термозонд (см. Таблицу материалов) для контроля температуры тела и используйте инфракрасную нагревательную лампу над животным для поддержания температуры около 37 °C. Обратите внимание на достаточное расстояние между животным и лампой, чтобы избежать перегрева.
- Расположите игольчатые электроды ЭКГ во всех четырех лапах, чтобы наблюдать и записывать частоту сердечных сокращений и форму волны ЭКГ. Закрепите ректальный зонд и электроды ЭКГ на платформе с помощью ленты.
- Нанесите крем для удаления волос на левую сторону грудной клетки, чтобы удалить волосы и создать чистое хирургическое поле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничьте время нанесения и обратите внимание на полное удаление крема, чтобы предотвратить химические ожоги.
3. Торакотомия
- Проведите асептическую подготовку кожи с использованием раствора бетадина, после чего наложите хирургическую простыню на левую грудную клетку, чтобы обеспечить стерильную среду. Для выполнения процедуры используйте стерилизованное оборудование. Сделайте вертикальный разрез кожи в средней части грудной мышцы длиной примерно 1 см и на расстоянии 2 мм от левой границы грудины.
- Сплевывайте грудную мышцу, чтобы обнажить ребра под ней. Избегайте случайных травм судна. Если произошло кровотечение, используйте ватные аппликаторы, чтобы остановить кровотечение.
- Визуализируйте ребра и определите межреберные пространства, наблюдая за надувающимся легким через тонкую полупрозрачную стенку грудной клетки. Вскройте грудную полость с помощью хирургических ножниц, сделав разрез 6-8 мм в третьем межреберье. Убедитесь, что разрез находится на расстоянии не менее 2 мм от границы грудины, где расположена внутренняя грудная артерия.
- Вставьте небольшое зеркало в виде крысиного глаза (см. Таблицу материалов) в межреберье. Он будет функционировать как втягивающее ребро (Рисунок 1A).
- Аккуратно приподнимите перикард изогнутыми щипцами и раздвиньте его.
- Положите небольшой кусочек ваты поверх легкого и осторожно надавите вниз.
4. Подготовка ПМЖ
- ПМЖ выглядит ярко-красным и проходит от аорты под левым ушным раковином к вершине. Идеальное положение для лигатуры – примерно на 2 мм ниже кончика левого ушного раковины. Используйте легочный ствол в качестве маркера, чтобы помочь определить левое ушное предсердие и оптимизировать визуализацию ПМЖ с помощью притока света (Рисунок 2).
- С помощью конической иглы проведите полипропиленовый шов 7-0 вокруг LAD. Не размещайте иглу слишком глубоко, так как она может войти в левый желудочек, и не слишком глубоко, так как это может повредить ПМЖ.
- Удалите небольшой кусочек ваты и проверьте, не вентилируется ли левое легкое.
- Снимите втягивающее ребро.
- Убедитесь, что минимальная длина шва составляет 15 см с обоих концов. Срезаем иголку.
- Поместите кусок трубки PE-50 диаметром 1 мм на кусок трубки PE-10 диаметром 15 мм (см. Таблицу материалов). Проведите оба конца шва через трубку PE-10 и сдвиньте полиэтиленовую трубку более толстым концом к сердцу.
5. Закрытие и экстубация грудной клетки
- Нанесите немного геля фузидиевой кислоты на открытое межреберье и осторожно дайте оставшемуся внутригрудному воздуху выйти, кратковременно препятствуя оттоку аппарата искусственной вентиляции легких. Дополнительный гель фузидиевой кислоты может быть добавлен во внешнюю часть полиэтиленовой трубки для предотвращения попадания воздуха в грудную клетку.
- Закройте грудную мышцу полипропиленовым X-образным стежком 5-0 выше и ниже уровня полиэтиленовой трубки и убедитесь, что утолщенная часть полиэтиленовой трубки находится ниже уровня мышцы.
- Закройте кожу двумя полипропиленовыми Х-образными швами 5-0 сверху и двумя ниже полиэтиленовой трубки (Рисунок 1B и Рисунок 3).
- При закрытой грудной клетке животное снова может самопроизвольно дышать. Отлучите животное от аппарата искусственной вентиляции легких, медленно уменьшая дыхательный объем и частоту дыхания. Когда животное начнет дышать, самопроизвольно осторожно отсоедините трубку аппарата ИВЛ, но удерживайте ее на месте до тех пор, пока не будет наблюдаться устойчивая картина дыхания.
- Соедините запас изофлурана с носовым конусом, который помещается над носом животного и фиксируется на опорной пластине.
6. Сборка удаленного ИК-инструмента
- Поместите вертикальную боковую часть в опорную плиту, вставив ее в щели.
- С помощью тонкого крючка вытащите два конца швов и протяните их через центральное отверстие в боковой части позади баллона (см. Таблицу материалов).
- Проведите один из концов швов над и вокруг баллона. Проведите по другому концу шва под и вокруг баллона. Нанесите гель фузидиевой кислоты для более гладкого направления шва.
- Проведите концы швов через прорези сверху боковой части. На дистальную часть шва нанесите груз массой 2,1 г, чтобы удерживать каждый конец шва на месте (Рисунок 1C и Рисунок 4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Конфигурация соответствующих грузов может быть изменена и должна быть предварительно проверена. Дополнительные сведения см. на Дополнительном рисунке 1 и Дополнительном файле 1 . Проектирование инструмента удаленного IRI представлено на дополнительном рисунке 2.
7. Индукция ишемии и реперфузии
- Вызвать ишемию можно путем своевременного надувания баллона с помощью сосудистого баллонного насоса до 2 бар. Заблокируйте насос. Визуально проверьте, надут ли воздушный шар и подняты ли грузы (рисунок 4).
- Подтвердите ишемию, наблюдая за изменением следа ЭКГ.
- Оставьте баллон надутым на установленное время в соответствии с конкретным протоколом исследования (30 минут в представленных экспериментах).
- Остановите окклюзию, просто разблокировав помпу. Осторожно сдуйте баллон. Визуально проверьте, не спущен ли баллон и не опущены ли грузы.
8. Разборка удаленного ИК-инструмента
- Разрежьте шов и трубку между животным и боковой частью и аккуратно снимите боковую часть.
- Нанесите гель фузидиевой кислоты в месте введения трубки в грудную клетку. С помощью изогнутых щипцов аккуратно прижмите кожу к трубке, а с помощью других щипцов извлеките трубку. Разрежьте остатки швов близко к коже.
- Наложите дополнительный шов из полипропилена 5-0, чтобы закрыть место выхода трубки и свести к минимуму риск попадания воздуха в грудную клетку.
9. Окончание наркоза и выздоровление
- Прекратите подачу изофлурана и дайте животному проснуться в тихой, теплой и богатой кислородом среде.
- Убедитесь, что мышь не испытывает респираторного дистресса, наблюдая за ней до полного выздоровления. Введите 0,3 мл стерильного физиологического раствора (при температуре тела) путем внутрибрюшинной инъекции для предотвращения обезвоживания.
- Для послеоперационной анальгезии введите опиоидный анальгетик (бупренорфин, 0,1 мг/кг) подкожно до того, как животное начнет передвижение. Проверяйте мышей каждые 4-6 часов в течение следующих 24-48 часов, когда вводится бупренорфин, чтобы убедиться, что мыши реагируют на обезболивающие препараты, и определить, необходимы ли дополнительные обезболивающие препараты. Дополнительная поддержка должна включать стандартный рекомендуемый гель для поддерживающей диеты или мешанку, помещенную на пол клетки после операции.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Проверка способности индуцировать ишемию была проведена с помощью четырех тестов: окрашивание трифенилтетразолия хлорида (TTC) и Sirius Red (SR), измерение сердечного тропонина I и МР-томография с поздним усилением гадолиния (LGE). Статистическая значимость оценивалась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни с учетом ограниченных размеров выборки. Статистическая значимость была отнесена к p < 0,05.
Острые эксперименты (окрашивание ТТС, n = 15) не имели технических сбоев, ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Новая техника дистанционной окклюзии, представленная в этом исследовании, предлагает уникальную платформу для продвижения исследований в области моделирования ишемии-реперфузионного повреждения, избегая необходимости прямых манипуляций с сосудами во время первоначальной операции и позволяя проводить одновременную мультимодальную визуализацию раннего реперфузного миокарда. Всесторонняя характеристика, включающая измерения тропонина-I, контрастную МРТ ЛГЭ, ТТК и окрашивание SR, показывает,...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарности
Эксперименты проводились на базовом объекте Лёвенского католического университета «Центр молекулярной визуализации мелких животных» (MoSAIC). Авторы хотели бы выразить свою благодарность Катажине Блажейчик за техническую помощь. Исследование было поддержано исследовательскими грантами от Лёвенского католического университета (C14/20/095) и Исследовательского фонда Фландрии (FWO G0A7722N). M. Algoet поддерживается Исследовательским фондом - Flanders Fellowship Grant (FWO 11A2423N).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 2-0 шелковый шовный материал | Sharpoint Products | DC-2515N | |
| 5-0 полипропиленовый шовный материал | Ethicon | 8710H | |
| 7-0 полипропиленовый шовный материал | Ethicon | 8206H | |
| ACCLARENT Устройство для надувания баллонов Johnson | & Johnson MedTech | BID30 | |
| Acepromazine | Kela | ||
| BD Vialon 18 G | BD | 381347 | |
| BD Vialon 20 G | BD | 381334 | |
| раствор бетадина | Purdue Pharma | 25655-41-8 | |
| Бупренорфин (Buprenex Injectionable) | Reckitt Benkiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | |
| Carp Zoom Styl Knijplood 2,1 г (свинцовые рыболовные грузы) | Visdeal.nl | ||
| Dumont #3 Щипцы | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Щипцы | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Тонкие ножницы | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Фуцидиновый гель | Leo Pharma | ||
| Isoflurane | Abbott | NDC 5260-04-05 | |
| KD Зеркало мыши/крысиного глаза | World Precision Instruments | 501897 | |
| KD Зеркало мыши/крысиного глаза | World Precision Instruments | 501897 | |
| Кетаминовый | дехра | ||
| Источник света | Zeiss | KL 1500 ЖК-система | |
| МРТ | Bruker BioSpin, Эттлинген, Германия | BioSpec 70/30 | |
| Хлорид натрия 0,9% | Baxter | ||
| Zoo Med Laboratories, Inc. | Программное обеспечение RS-75 | ||
| ParaVision | Bruker BioSpin | версия 6.0.1 | |
| полиэтиленовые трубки PE-10 | SAI Инфузионные технологии | PE-10 | |
| Полиэтиленовые трубки PE-50 | SAI Инфузионные технологии | PE-50 | |
| дистанционный инструмент IRI (PMMA) | самодельный | ||
| хирургический монитор для грызунов | Indus instruments | ||
| Сегмент v4.0 | Medviso, segment.heiberg.se | R12067 | |
| Последовательность градиентного эха с самостробированием | Bruker BioSpin, Эттлинген, Германия | IntraGate, ParaVision 6.0.1 | |
| Тонкий удлиненный иглодержатель | Fine Science Tools | 12005-15 | |
| Индукционная камера для мышей/крыс Sure-Seal | World Precision Instruments | EZ-178 | |
| Соединительные трубки, поли, Y-образная форма | Westlab | 072025-0001 | |
| Катетер для дилатации Ultraverse 035 PTA: 5 мм x 40 мм, баллон RBP 17 ATM на катетере длиной 130 см | Bard Peripheral Vascular, Inc. | ||
| Veet (крем для депиляции) | Аппарат искусственной вентиляции легких для медицинского обслуживания | ||
| , MiniVent Модель 845 | Hugo Sachs | 73-0043 | |
| Vidisic | BAUSCH & ЛОМБ ФАРМА | 685313 | |
| Ксилазин | Байер |
Ссылки
- Bryda, E. C. The mighty mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Mo Med. 110 (3), 207-211 (2013).
- Fishbein, M. C., et al. Early phase acute myocardial infarct size quantification: Validation of the triphenyl tetrazolium chloride tissue enzyme staining technique. Am Heart J. 101 (5), 593-600 (1981).
- Ibáñez, B., et al. Evolving therapies for myocardial ischemia/reperfusion injury. J Am Coll Cardiol. 65 (14), 1454-1471 (2015).
- Dąbrowska, A. M., et al. The immune response to surgery and infection. Cent Eur J Immunol. 39 (4), 532-537 (2014).
- Muthuramu, I., et al. Permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice: a model of post-myocardial infarction remodelling and heart failure. J Vis Exp. (94), e52206(2014).
- Nickles, H. T., et al. Mechanical ventilation causes airway distension with proinflammatory sequelae in mice. Am J Physiol-Lung C. 307 (1), L27-L37 (2014).
- Reed, G. W., et al. Acute myocardial infarction. Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).
- Rittié, L. Method for picrosirius red-polarization detection of collagen fibers in tissue sections. Methods Mol Biol. 1627, 395-407 (2017).
- Schwarte, L. A., et al. Mechanical ventilation of mice. Basic Res Cardiol. 95 (6), 510-520 (2000).
- Vaneker, M., et al. Mechanical ventilation induces a Toll/Interleukin-1 receptor domain-containing adapter-inducing interferon β-dependent inflammatory response in healthy mice. Anesthesiology. 111, 836-843 (2009).
- Van Allen, N. R., et al. The role of volatile anesthetics in cardioprotection: A systematic review. Med Gas Res. 2, 22(2012).
- Kumar, D., et al. Distinct mouse coronary anatomy and myocardial infarction consequent to ligation. Coron Artery Dis. 16 (1), 41-44 (2005).
- Bayat, H., et al. Progressive heart failure after myocardial infarction in mice. Basic Res Cardiol. 97 (3), 206-213 (2002).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
