Методическая статья

Научно-исследовательское применение лазерно-индуцированной ударной волны для изучения взрывоиндуцированного повреждения улитки

DOI:

10.3791/66396

⸱

1 марта 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, National Defense Medical College, 2Division of Bioinformation and Therapeutic Systems, National Defense Medical College, 3Department of Biochemistry, National Defense Medical College

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье мы описываем экспериментальные протоколы создания животной модели взрывоиндуцированного повреждения улитки с использованием лазерно-индуцированной ударной волны (LISW). Воздействие LISW на височную кость позволяет воспроизвести бласт-индуцированную патофизиологию улитки. Эта животная модель может стать платформой для выяснения патологии улитки и изучения потенциальных методов лечения взрывных травм.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ухо является органом, наиболее восприимчивым к избыточному давлению при взрыве, и травмы улитки часто возникают после воздействия взрыва. Взрывное воздействие может привести к сенсоневральной тугоухости (SNHL), которая представляет собой необратимую потерю слуха, негативно влияющую на качество жизни. Ранее были задокументированы детальные бласт-индуцированные кохлеарные патологии, такие как потеря волосковых клеток, спиральных ганглиозных нейронов, синапсов улитки и нарушение стереоцилии. Тем не менее, определение ухудшения состояния кохлеарной сенсоневральной оболочки после взрывной травмы является сложной задачей, поскольку у животных, подвергшихся воздействию избыточного давления взрывной волны, обычно наблюдается перфорация барабанной перепонки (TMP), которая вызывает сопутствующую кондуктивную тугоухость. Чтобы оценить чисто сенсоневральную кохлеарную дисфункцию, мы разработали экспериментальную модель травмы улитки, вызванной взрывом, на животных с использованием ударной волны, вызванной лазером. Этот метод позволяет избежать ТМП и сопутствующих системных повреждений и воспроизводит функциональное снижение компонента SNHL энергетически зависимым образом после воздействия LISW. Эта животная модель может стать платформой для выяснения патологических механизмов и изучения потенциальных методов лечения взрывной дисфункции улитки.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Потеря слуха и шум в ушах являются одними из наиболее распространенных видов инвалидности, о которых сообщается у 62% ветеранов1. Сообщалось о нескольких слуховых осложнениях, вызванных взрывом, включая сенсоневральную тугоухость (SNHL) и перфорацию барабанной перепонки (TMP), у лиц, подвергшихся воздействию взрывного избыточного давления2. Более того, исследования на людях, подвергшихся воздействию взрывной волны, показывают, что воздействие взрыва часто приводит к дефектам слухового временного разрешения, даже когда пороги слышимости находятся в пределах нормы, что известно как «скрытая потеря слуха (HHL)»3. Хорошо известно, что при бласт-ассоциированной патологии улитки происходит значительная потеря кохлеарных синапсов между внутренними волосковыми клетками (ИГХ) и слуховыми нейронами (АН)4. Синаптическая дегенерация приводит к нарушению слуховой обработки и является основным фактором, способствующим развитию HHL5. Таким образом, органы слуха являются хрупкими компонентами, содержащими сложные и высокоорганизованные структуры. Однако точный механизм, с помощью которого взрывные волны воздействуют на внутреннее ухо на клеточном уровне, остается неясным. Это связано с трудностями в воспроизведении точных клинических и механических сложностей взрывных травм в лабораторных условиях, а также со сложностью кохлеарных патологий, вызванных взрывом.

Основным компонентом взрывной травмы является ударная волна (SW), характеризующаяся быстрым и высоким повышением пиковогодавления6. Сложность взрывных травм была подробно изучена в многочисленных ретроспективных исследованиях 7,8,9. Существуют различные устройства для генерации взрыва, такие как сжатый газ10, ударные трубки11 и маломощные взрывчатые вещества12, при различных уровнях давления. Форма волны давления ПО, генерируемая недавно разработанными устройствами, очень напоминала форму реального взрыва. Важной концепцией в создании модели сенсоневральной тугоухости у животных является минимизация сопутствующих травм, отличных от повреждения слуха, для снижения смертности животных. Таким образом, были разработаны исследования взрывных травм, в которых ударные трубки были миниатюризированы, а выходная мощность может быть точно контролирована, чтобы животные, подвергшиеся воздействию, редко умирали. Однако, несмотря на то, что у этих животных моделей обычно развиваются осложнения, такие как ТМП, оценка функции улитки затруднена из-за сопутствующей кондуктивной тугоухости2. Ранее мы провели исследование травм от взрыва с использованием берушей на животных с использованием защитных ушей и не обнаружили случаев TMP13. Беруши могут частично ослаблять серьезное повреждение улитки, но не центральную слуховую нейродегенерацию или развитие тиннитуса. Таким образом, беруши защищают улитки, а также барабанную перепонку. Тем не менее, для изучения патофизиологии улитки, вызванной взрывными повреждениями, вызванными взрывными травмами, требуется животная модель чистого повреждения улитки без ТМП.

Ранее мы разработали модель топического взрывного повреждения внутреннего уха у крыс и мышей с использованием лазерно-индуцированной ударной волны (LISW)14,15. Этот метод может быть безопасно и легко выполнен на стандартном лабораторном уровне и использовался для создания моделей взрывных травм легких и головы16,17. Энергию LISW можно регулировать, изменяя тип и мощность лазера, что позволяет контролировать степень повреждения улитки. Модель LISW-индуцированной травмы улитки представляет ценность для изучения механизмов SNHL, вызванных взрывными травмами, и для изучения потенциальных методов лечения. В этом исследовании мы описываем подробные экспериментальные протоколы для создания мышиной модели бласт-индуцированного повреждения улитки с использованием LISW и демонстрируем дегенерацию улитки, включая потерю волосковых клеток (ГК), синапсов улитки и спиральных ганглиозных нейронов (SGN), энергетически зависимым образом у мышей после воздействия LISW.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинского колледжа национальной обороны (одобрение #18050) и выполнены в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения и Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии. Были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму количество животных и их страдания.

1. Животные

  1. Используйте 8-недельных самцов мышей CBA/J для соблюдения этого протокола. Перед экспериментом подвергните мышей тесту функции слуха и эндоскопическому наблюдению за барабанной перепонкой, чтобы убедиться в нормальном состоянии.
  2. Разделите 27 мышей CBA/J на три группы: (1) группа с дозой 2,0 Дж/см2 (n = 9 мышей); (2) 2,25 Дж/см2 облученная группа (n = 9 мышей); и (3) 2,5 Дж/см2 группы, подвергшейся воздействию (n = 9 мышей). Удалите все уши для оценки через 1 месяц после воздействия LISW.

2. Экспериментальные настройки экспозиции LISW

  1. Лазерная мишень представляет собой черный диск из натурального каучука диаметром 10 мм и толщиной 0,5 мм. Чтобы увеличить импульс LISW, используйте клей для сварки акриловой смолой, чтобы приклеить прозрачный лист полиэтилентерефталата (ПЭТ) толщиной 1,0 мм к верхней части целевой области. Облучите лазер Nd:YAG с модуляцией добротности 532 нм для генерации LISW позади цели (рис. 1A).
  2. Сфокусируйте лазерный импульс с помощью плоско-выпуклой линзы в пятно диаметром 3,0 мм на лазерной мишени.
  3. Используйте облучение LISW для генерации плазмы на поверхности соединения двух материалов и испарения резины (плазменно-опосредованная абляция), оставляя испарившуюся резину в полости.
  4. Используйте гидрофон для измерения волны давления LISW на глубине 1,0 мм под водой, а не в живых тканях. Поместите оптоволоконный гидрофон диаметром 0,25 мм под черную резину на глубине 1,0 мм ниже поверхности воды, чтобы записать формы волны давления LISW и измерить их с помощью цифрового осциллографа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Формы волн давления показали стабильные характеристики при одинаковых максимальных давлении и импульсах, как показано на рисунке 1B.
  5. Выполнять все процедуры на животных под общей анестезией с использованием внутрибрюшинных инъекций 1 мг/кг медетомидина гидрохлорида и 75 мг/кг кетамина. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза мыши, чтобы предотвратить высыхание и обеспечить тепловую поддержку.
  6. Тщательно брейте заушные области, чтобы избежать задержки воздуха в шерсти. Зафиксируйте мышей на пластине и расположите постаурикулярные области в фокальной области LISW в вертикальном направлении вверх.
  7. Приложите черную резиновую мишень чрескожно к заушной области уха мыши. Чтобы обеспечить согласование акустического импеданса, используйте ультразвуковой проводящий гель между лазерной мишенью и поверхностью кожи.
  8. Подайте один импульс LISW на улитку через височную кость. Установите выходы лазерных импульсов на три плотности энергии: 2,0 Дж/см2 , 2,25 Дж/см2 и 2,5 Дж/см2.

3. Тест кохлеарной функции

ПРИМЕЧАНИЕ: Тесты на слуховую реакцию ствола мозга (АБР) были выполнены, как сообщалось ранее14,15.

  1. Выполните измерение ABR за 1 день до и через 1 день и 1 месяц после воздействия LISW.
  2. ABR — это слуховой вызванный потенциал в ответ на слуховые стимулы и обычно используется для оценки порогов слышимости на четырех частотах (12,0 кГц, 16,0 кГц, 20,0 кГц и 24,0 кГц).
  3. Подайте стимулирующий звук через небольшой наушник и измерьте уровень звукового давления возле барабанной перепонки мыши с помощью небольшого микрофона, расположенного рядом с наушником. Выводите импульсные стимулы от генератора звука со скоростью 37 циклов/с и усиливайте звуковое давление с уровня звукового давления (SPL) 20 дБ до 80 дБ SPL с шагом 5 дБ SPL.
  4. Вставьте игольчатый электрод из нержавеющей стали для записи электроэнцефалограммы под слуховой проход и лобную область уха и вставьте заземляющий электрод под каудальную область хвоста.
  5. Оцените функции улитки, измерив амплитуду пика ABR I (P1). Автоматический анализ осциллограмм ABR в отношении порогов слышимости и амплитуды ABR P1 с помощью программного обеспечения для анализа пиков ABR, как сообщалось ранее18.
  6. Рассчитайте сдвиги пороговых значений ABR путем вычитания пороговых значений, полученных до воздействия. Сравните сдвиги пороговых значений ABR в трех облученных группах с таковыми в необнаженных контралатеральных ушах (контроль). Измерение амплитуд ABR с помощью формы сигнала ABR во время стимуляции звуковым уровнем 80 дБ.

4. Гистологическое исследование

ПРИМЕЧАНИЕ: Гистологическое исследование проводили, как описано ранее14,15.

  1. ГЦ и кохлеарный синапс
    1. Патологоанатомическое исследование улитки проводят через 1 месяц после воздействия LISW.
    2. Подтвердите глубину анестезии с помощью щипки пальца ноги перед перфузией. После гемоперфузии с раствором лактата Рингера проводят транскардиальную перфузию с 1 мл/г 4% параформальдегида (ПФА). После обезглавливания удалите улитку и перфузируйте непосредственно 4% PFA, с последующей фиксацией при 4 °C на ночь.
    3. После фиксации декальцифицируйте улитку, встряхивая в 0,5 моль/л растворе этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в течение 2 дней.
    4. Разделите деминерализованную улитку на четыре части. После замораживания каждого кусочка улитки на сухом льду в течение 10 мин проведите блокирование при комнатной температуре в течение 1 ч в 5% нормальной лошадиной сыворотке, просто конъюгированной с 0,3% Triton X для пермеабилизации.
    5. Используйте анти-миозин 7a (Myo7A), анти-C-концевой связывающий белок (CtBP2) и антитела против нейрофиламентов (NF) в качестве первичных антител и инкубируйте при 37 °C в течение ночи. Используйте антитела Myo7A, CtBP2 и NF для оценки HC, пресинаптических лент и волокон кохлеарного нерва соответственно.
    6. Смойте несвязанное первичное антитело фосфатно-солевым буфером (PBS) в течение 5 x 3 минут. Инкубируйте образцы с соответствующими вторичными антителами при 37 °C в течение 2 ч. После окрашивания промойте образцы в течение 3 x 5 минут PBS и инкапсулируйте образцы на предметное стекло водорастворимым инкапсулятором с использованием покровного стекла.
    7. Для оценки получите полное изображение улитки (разделенной на четыре части) с 10-кратным увеличением и рассчитайте карту частот улитки с помощью прилагаемого программного модуля ImageJ для точной локализации конкретных областей улитки на частотах 12,0 кГц, 16,0 кГц, 20,0 кГц и 24,0 кГц.
    8. Рассчитайте показатели выживаемости ГЦ и количество синапсов на каждой частоте.
      1. Чтобы рассчитать показатели выживаемости ГЦ, подсчитайте количество выживших и отсутствующих ГЦ на 200 мкм длины на каждой частоте и рассчитайте коэффициент выживаемости ГЦ с помощью уравнения (1), показанного ниже:
        Выживаемость УК (%) = (Количество выживших УК / Количество выживших и отсутствующих УК) × 100 (1)
      2. Для расчета количества синапсов необходимо получить z-stack-изображения внутренней области НЦ с высоким разрешением с помощью объектива масляной иммерсии (63×) с 3,1-кратным цифровым зумом и шагом 0,25 мкм при конфокальной флуоресцентной микроскопии. Импортируйте стеки изображений в ImageJ и автоматически подсчитайте CtBP2 точек на IHC в диапазоне 50 μм в каждом стеке изображений. Рассчитаем выживаемость синаптических лент с помощью уравнения (2):
        Выживаемость синаптических лент (%) = (Количество синаптических лент в открытых ушах LISW / Количество синаптических лент в контрольных ушах) × 100 (2)
    9. Для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) удалите улитку, как описано ранее, а затем зафиксируйте 2% PFA и 2,5% глутаральдегидом вместе при 4 °C на ночь. После декальцинации улитки путем встряхивания в 0,5 моль/л раствора ЭДТА при температуре 4 °C в течение 7 дней рассеките улитки на четыре части для подготовки целиком.
    10. Зафиксируйте ткани 1% тетраоксидом осмия при температуре 4 °C на 30 мин, обезвоживайте в 50% этаноле при комнатной температуре в течение 10 мин, повторите с 70 %, 80 %, 95 %, а затем 100 % этанолом, распылите покрытие осмием и рассмотрите под электронным микроскопом при напряжении 5,0 кВ, как сообщалось ранее14.
    11. Проведите количественный анализ разрушения стереоцилиарного пучка в наружных волосковых клетках (ОНК) путем расчета соотношения нарушенных стереоцилий (количество нарушенных стереоцилий ОНК/общее число стереоцилий ОНК) в каждой энергетической группе с использованием изображений СЭМ14. Подсчитайте количество стереоцилий на 100 мкм в центре областей 16,0 и 24,0 кГц. Обозначьте один или несколько рядов пучков OHC, которые изогнуты к боковой стороне, запутаны или не имеют основания, как нарушенные.
  2. СГН
    1. Чтобы количественно оценить количество SGN через 1 месяц после воздействия LISW, выполните транскардиальную перфузию с 4% PBS, обезглавливайте, удалите улитку и выполните заднюю фиксацию в тех же условиях, которые описаны выше. Декальцинируйте улитку в 0,5 М ЭДТА в течение 1 недели.
    2. После декальцинации улитки погрузить на ночь в 30% сахарозу, погрузить их в криосекционный состав, заморозить в жидком азоте для получения срезов вблизи канала Розенталя толщиной 15 мкм, окрашивать гематоксилином и эозином и рассмотреть их под световым микроскопом14.
    3. Для измерения плотности SGN подсчитайте количество SGN в среднем повороте канала Розенталя и рассчитайте выживаемость SGN для каждого контроля.

5. Статистический анализ

  1. Выполняйте статистический анализ с помощью выбранного программного обеспечения.
  2. Проанализируйте статистические различия в сдвиге порога ABR, HC, SGN и синаптическом подсчете с помощью двухфакторных повторяющихся измерений ANOVA ["частота или кохлеарные части (апикальные/средние/основание)" × "группы животных"], двусторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим множественным сравнением Тьюки.
  3. Представьте все данные в виде среднего ± стандартной ошибки и установите уровень статистической значимости на уровне p < 0,05.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Форма волны LISW
Воспроизводимость формы сигнала давления LISW была измерена в 5 раз при 2,0 Дж/см2 следующим образом. Формы сигналов были в целом схожими и стабильными и демонстрировали резкое увеличение с временной широтой, пиковым давлением и импульсом 0,43±0,4 μс, 92,1 ± 6,8 МПа и 14,1 ± 1,9 Па∙с (медиана ± SD), что соответствует характеристикам ПО (рис. 1B). LISW характеризуются быстрым временем нарастания, высоким пиковым давлением, короткой продолжительностью и доминированием положительного давления. При нанесении на биологическую ткань мишень помещается непосредственно на живую ткань через желе, и можно считать, что ПО имеет почти те же характеристики, что и измеренное ПО, нанесенное на ткань. После воздействия LISW возникновение ТМП оценивали с помощью небольшого цифрового эндоскопа. Ни у одной из мышей в энергетической группе LISW не наблюдалось TMP после воздействия (рис. 1C).

Слуховая оценка
Для определения слуховой функции было проведено исследование ABR. ABR — это измерение звукового потенциала в слуховом пути, а ABR P1 представляет собой накопленную нейронную активность в кохлеарном нерве. Через сутки после воздействия LISW в открытом ухе наблюдалась значительная разница в смещении порога ABR среди различных групп LISW (двусторонний ANOVA, p < 0,0001; Рисунок 2А). Это увеличение сдвига порога СБР сохранялось в течение 1 месяца после воздействия LISW в группах 2,25 и 2,5 Дж/см2 (двусторонний ANOVA, 2,25 Дж/см2, p < 0,0001; 2,5 Дж/см2, p < 0,0001). В частности, в высокочастотной области наблюдалось заметное увеличение сдвига порога ПБР. Тем не менее, пороговые значения ABR восстановились до уровня, который существенно не отличался от предоблучения в группе 2,0 Дж (двусторонний ANOVA, 2,0 Дж/см2, p = 0,76), что указывает на энергетическую зависимость от повышения порога. Что касается амплитуд ABR P1, то во всех группах, облученных LISW, наблюдалось достоверное снижение амплитуд ABR P1 на всех частотах через 1 день и 1 месяц после воздействия LISW (двусторонний ANOVA, p < 0,0001; Рисунок 2В). В необнаженном ухе (контроль; левое ухо) не наблюдалось заметных изменений порога слуха ABR после воздействия LISW (данные не показаны).

Выживаемость HC и SGN
Микроскопическое наблюдение за ушами, подвергшимися воздействию LISW, не выявило механических повреждений улиток, таких как перелом и вывих косточек, разрыв мембраны круглого окна или внутрикохлеарное кровоизлияние, после воздействия LISW (данные не показаны), что согласуется с предыдущими результатами 6,14.

Флуоресцентное иммуноокрашивание ГЦ с помощью Myo7A, синаптических лент с CtBP2 и кохлеарного нерва с НФ показано на рисунке 3A. Ни в одной из групп не наблюдалось серьезных повреждений улитки, таких как потеря ГЦ или нервных волокон. Тем не менее, количественная оценка выживаемости положительных OHC Myo7A достоверно различалась между группами (двусторонний ANOVA, p = 0,002; Рисунок 3В). В группе с концентрацией 2,5 Дж/см2 наблюдалась достоверно более низкая выживаемость ОХК, чем в контрольной группе, особенно в высокочастотной области (двусторонний ANOVA, 2,5 Дж/см2, p = 0,0002). Тем не менее, показатели выживаемости ИГХ были сопоставимы между группами, что указывает на то, что ОНК уязвимы к высокоэнергетическому LISW (двусторонний ANOVA, p = 0,76). Количественная оценка выживаемости синаптической ленты показана на рисунке 3C. Синаптические ленты были значительно снижены в группах с концентрацией 2,25 и 2,5 Дж/см2 по сравнению с контролем (двусторонняя ANOVA, 2,25 Дж/см2, p < 0,0001; 2,5 Дж/см2, p < 0,0001), а более высокие частоты демонстрировали более сильную тенденцию к снижению, аналогичную сдвигу порога ABR и выживаемости OHC.

Затем была проведена оценка плотности SGN, как показано на рисунке 3D. Выявлена достоверная разница в плотности SGN между группами (двухфакторный ANOVA, p = 0,76), а в группе 2,5 Дж/см2 наблюдались достоверно более низкие показатели выживаемости SGN по сравнению с контрольными группами (двухфакторный ANOVA, 2,5 Дж/см2, p = 0,007). Тем не менее, группы 2,0 и 2,25 Дж/см2 показали сопоставимую выживаемость SGN по сравнению с контрольной группой. Этот результат указывает на то, что тяжесть кохлеарной дегенерации и нарушения слуха зависит от воздействия энергии LISW, что согласуется с результатами ABR и выживаемости HC.

Стереоцилиарный пучок
Мы наблюдали заметное увеличение порога ABR, примерно на 30 дБ, в обеих группах 2,25 и 2,5 Дж/см2 на частотах выше 20 кГц, которое сохранялось до 1 месяца после воздействия LISW (как показано на рисунке 2A). Тем не менее, наблюдаемый нами сдвиг порога на 30 дБ не может быть связан исключительно с потерей OHC, дегенерацией синапсов улитки или уменьшением количества SGC (рис. 3). Предыдущее исследование показало, что сдвиги порога ABR были минимальными, когда количество синаптических лент уменьшалось на 50%19. Поэтому мы провели СЭМ, чтобы выяснить причину повышения порога ABR. После воздействия LISW с интенсивностью 2,5 Дж/см2 некоторые стереоцилиарные пучки OHC, по-видимому, были нарушены, особенно в высокочастотных областях (рис. 4A), что может быть одной из причин повышения порога ABR после воздействия LISW. Количественная оценка стереоцилиарных разрушений показала, что коэффициент разрушения имеет тенденцию быть выше в области высоких частот в зависимости от энергии (рисунок 4B).

figure-results-1
Рисунок 1: Экспериментальные установки и профиль давления LISW. (A) Экспериментальная установка для генерации LISW у животных. (B) Характеристики волн давления LISW, установленных на уровне 2,0 Дж/см2. (C) Репрезентативные изображения барабанной перепонки. TMP не наблюдались ни в одном из ушей, подвергшихся воздействию LISW. В качестве ориентира показана репрезентативная ТМП, вызванная взрывом (желтые стрелки) с использованием взрывной трубки. Сокращения: LISW = лазерно-индуцированная ударная волна; ПЭТ = полиэтилентерефталат; TMP = перфорация барабанной перепонки; YAG = иттрий-алюминиевый гранат; SHG = генерация второй гармоники. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
(A) Значительные сдвиги пороговых значений ABR наблюдались во всех группах через 1 день после контакта с LISW. Сдвиги пороговых значений ПБР в группах 2,25 и 2,5 Дж/см2 оставались значительно повышенными в течение 1 месяца после воздействия LISW. (B) Амплитуда ABR P1 через 1 день и 1 месяц после воздействия LISW значительно снизилась во всех группах. Звездочки указывают на значимые различия между группами по сравнению со значениями до воздействия (**p < 0,001, ****p < 0,0001). Полосы погрешностей указывают на стандартную погрешность среднего значения. Сокращения: ABR = слуховая реакция ствола мозга; LISW = ударная волна, вызванная лазером; P1 = пик 1; SPL = уровень звукового давления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Кохлеарная патология после воздействия LISW. (A) Конфокальные флуоресцентные изображения органа Corti в области 20 кГц, окрашенного Myo7A (синий), CtBP2 (красный) и NF (зеленый) после воздействия LISW. (В) Средний процент выживших ГЦ показан на цитоклеограммах. Количественная оценка выявила значительную потерю ОНК при концентрации 2,5 Дж/см2, хотя существенной разницы в выживаемости ИГЦ между группами не было. (C) Выживаемость пресинаптических лент по сравнению со значениями до воздействия была значительно снижена в группах 2,25 и 2,5 Дж/см2 . (D) Репрезентативные микрофотографии SGN во всех группах через 1 месяц после контакта с LISW. Выживаемость SGN значительно снизилась на 2,5 Дж/см2. Звездочками обозначены значимые отличия по сравнению с предэкспозиционными значениями (**p < 0,001, ****p < 0,0001). Полосы погрешностей указывают на стандартную погрешность среднего значения. Масштабные линейки = 5 мкм (А), 100 мкм (Г). Сокращения: LISW = лазерно-индуцированная ударная волна; IHC = внутренняя волосковая клетка; NF = нейрофиламент; OHC = наружная волосковая клетка; SGN = нейрон спирального ганглия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Поверхностные структуры OHC. (A) Репрезентативные сканирующие электронные микроскопические изображения стереоцилии OHC в областях Corti с частотой 16 кГц и 24 кГц через месяц после воздействия LISW. Стереоцилиарное нарушение видно на увеличенных изображениях прямоугольной области в группе 2,5 Дж/см2 (область 24 кГц). Масштабная линейка -= 2 мкм. (B) Скорость стереоцилиарного разрушения была выше с увеличением избыточного давления LISW. Сокращения: LISW = лазерно-индуцированная ударная волна; OHC = наружные волосковые клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было направлено на валидацию мышиной модели взрывного повреждения улитки с использованием LISW. Наши результаты показали, что после введения LISW через височную кость у подвергшихся воздействию уха мышей наблюдалось последовательное патологическое и физиологическое снижение улитки, которое сопровождалось повышением избыточного давления LISW. Эти результаты указывают на то, что данная модель мыши подходит для репликации различных кохлеарных патологий путем корректировки выходных данных LISW. В частности, эта мышиная модель кохлеарной дисфункции, вызванная LISW, может служить хорошей моделью повреждения улитки из-за ее контролируемой, воспроизводимой и количественной природы, а также ее способности воспроизводить патофизиологическое снижение улитки в контролируемых условиях.

В нашем предыдущем исследовании использовалась модель крысы и наблюдалась индуцированная LISW кохлеарная дегенерация, включая повышение порога слышимости, потерю синаптических лент и разрушение стереоцилиарного пучка14. В другом исследовании изучалась патофизиологическая кохлеарная дегенерация после взрывной травмы у мышей с использованием двух типов бластов с различными характеристиками: низкочастотная доминантная с использованием струйной трубки и высокочастотная доминантная с использованием LISW15. Они определили, что доминирующая частота спектра мощности взрыва является основным фактором при определении области повреждения улитки, о чем сообщалось ранее15. Насколько нам известно, это первое исследование, демонстрирующее подробную методологию воздействия улитки LISW и энергетическую и частотно-зависимую LISW-индуцированную дегенерацию улитки.

Мы использовали воздействие LISW для повреждения улитки через постаурикулярную височную кость, а не через наружный слуховой проход, чтобы создать модель, которая включала бы исключительно повреждение улитки без какой-либо TMP или прерывания цепи слуховых косточек. Наши результаты подразумевают, что нарушение слуха, продемонстрированное в этом исследовании, было связано с ухудшением сенсоневральных компонентов в слуховом пути. Недавние исследования показали, что TMP может служить буфером против повреждения улитки, поглощая энергию SW 2,20,21. Эта модель LISW не могла индуцировать TMP даже при высокоинтенсивной LISW, потому что SW облучался непосредственно во внутреннее ухо, а не через барабанную перепонку. Поэтому для анализа смешанной тугоухости с ТМП и СНХЛ идеальным вариантом является взрыв высокой интенсивности, созданный с помощью настоящего взрыва или электрошоковой трубки. Выбор типа струйной обработки зависит от конкретного использования или цели исследования. Таким образом, данная модель травмы животных на основе LISW полезна для выяснения чистой бласт-индуцированной кохлеарной патофизиологии без ТМП, приводящей к кондуктивной тугоухости. С другой стороны, облучение LISW требовало 1 ч на животное, включая настройку оборудования и проверку барабанной перепонки после облучения. Поэтому, если несколько животных подверглись воздействию LISW подряд в течение 1 суток, измерить облучение LISW и ABR в один и тот же день с помощью одной дозы анестетика затруднительно. Из-за риска гибели животного при увеличении дозы анестетика в этом исследовании мы решили проводить измерения ABR на следующий день, а не сразу после облучения в тот же день.

При взрывной травме первичная фаза вызывается физическими силами взрыва и быстрой передачей ПО со значительными изменениями плотности тканей, таких как тканево-воздушные соединения22. Таким образом, считается, что большинство травм улитки, вызванных взрывом, возникают из-за SW во время первичной фазы6, что позволяет предположить, что исследования повреждений улитки, подверженных воздействию SW, имеют решающее значение для понимания механизмов дисфункции улитки, вызванной взрывом. Создание ПО с помощью высокоэнергетического лазерного импульса на твердом материале известно как LISW. В предыдущих исследованиях LISW использовался для разработки животных моделей травматических повреждений головного мозга и легких, вызванных взрывом16,17. Преимущества использования LISW для исследований, связанных с взрывами, включают в себя модель повторяемого повреждения в зависимости от интенсивности лазера и специфическое нацеливание на поврежденный орган, поскольку LISW не воздействует на участки за пределами целевой области.

В этом исследовании мы обнаружили, что LISW вызывает патологические изменения в кохлеарных ГЦ, СГН, их синапсах и стереоцилиарном пучке, аналогичные повреждениям, вызванным реальной взрывной травмой12. Ущерб, наносимый различными формами кохлеарных нарушений, такими как потеря слуха, вызванная шумом, можно объяснить двумя фундаментальными факторами: прямым механическим стрессом и вторичным нарушением обмена веществ. Мы предполагаем, что нарушение стереоцилиарного пучка является первичной патологией, возникающей в результате прямого механического напряжения LISW. Стереоцилиарные нарушения являются распространенными патологиями, связанными с возрастной и шумовой дисфункцией слуха23,24. Точный механизм, лежащий в основе этого стереоцилиарного разрушения, до сих пор не выяснен. Предыдущее исследование показало, что стереоцилиарное нарушение наблюдалось через 1 неделю после воздействия взрыва12. Возможной причиной этого уникального морфологического изменения может быть разъединение кончиковых звеньев и боковых связей между нарушенным внешним рядом стереоцилий и стереоцилиейсреднего ряда 14. Кроме того, корешки самого дальнего ряда стереоцилий, которые состоят из актина и связывающих белков, таких как TRIOBP, также механическиповреждены15.

Кохлеарные повреждения обычно приводят к дальнейшему нарушению метаболических процессов, которые могут сохраняться в течение суток или даже месяцев19. В частности, синапсы в улитке, которые отвечают за обработку слухового звука, очень уязвимы к взрывномувоздействию25. Наши животные модели показали, что дегенерация функции ANs, о чем свидетельствует снижение амплитуды ABR P1, была вызвана LISW-индуцированным повреждением улитки. Одним из возможных механизмов индуцированной LISW кохлеарной синаптопатии является чрезмерное высвобождение глутамата ИГХ, такое как ототоксичность глутамата26. Воздействие LISW вызывает сильную вибрацию базилярной мембраны, вызывая чрезмерное высвобождение глутамата из ИГХ, что приводит к дегенерации АН. LISW может воспроизводить тип токсичности глутамата, который влияет на улитку, приводя к синаптопатии улитки и снижению количества синапсов без повреждения ГЦ. Другой возможный механизм заключается в том, что воздействие LISW может повредить клетки, поддерживающие улитку, что способствует выживанию ANF в зависимости от высвобождения нейротрофинов27. Кроме того, LISW может передаваться непосредственно в ANF и вызывать повреждение нейронов. Следовательно, наши модели повреждения улитки, индуцированного LISW, могут быть полезны как для исследования взрывов, так и для изучения различных форм кохлеарной дегенерации, которые включают кохлеарную синаптопатию.

Существует острая потребность в терапевтических вмешательствах для лечения потери слуха, вызванной взрывом, что подчеркивает важность стратегий лечения, направленных на кохлеарную синаптопатию или нарушение стереоцилиарного пучка при OHC. Эти подходы также могут быть применены к другим типам нарушений слуха с аналогичными патологическими механизмами. Кохлеарная синаптопатия наблюдалась в нашей модели бласт-индуцированной кохлеарной дисфункции, что позволяет предположить, что она может быть многообещающей терапевтической мишенью. LISW может быть использован для создания мышиных моделей, которые точно воспроизводят патофизиологию улитки, вызванную бластами, и эти модели могут быть использованы для изучения различных типов кохлеарных дисфункций.

Наше исследование имеет несколько ограничений. Во-первых, мы измерили пороги ABR на частоте 12-24 кГц. Согласно предыдущему исследованию, вызванное LISW повреждение улитки приводит к высокочастотной потере слуха у животных из-за особенностей SW и уязвимости основания улитки. Необходимы дальнейшие исследования ABR в более широких частотных областях (>24 кГц). Во-вторых, в этом исследовании мы провели только гистологическую оценку улитки и не оценивали центральный слуховой путь. Нарушение слуха при взрывной травме не ограничивается только улиткой, но и является сложным нарушением ствола мозга и центральной слуховой системы. В дальнейшем было бы желательно оценить слуховой центр на животных моделях, подвергшихся воздействию LISW.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана двумя грантами от JSPS KAKENHI (номера грантов 21K09573 (K.M.) и 23K15901 (T.K.)).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
532 нм лазер Nd:YAG с модуляцией добротности QuantelBrilliant b
программное обеспечение для анализа пиковABR Mass Eye and EarN/AEPL Cochlear Function Test
Suite Клей для сварки акриловой смолы Acrysunday Co., LtdN/A
конфокальная флуоресцентная микроскопияLeicaTCS SP8
криосекционный составSakuraTissue-Tek O.C.T
CtBP2 антителоBD Transduction#612044
Диэлектрические многослойные зеркалаSIGMAKOKI CO.,LTDTFMHP-50C08-532M1-M3
Цифровой осциллографTektronixDPO4104B
НаушникиCUICDMG15008-03A
HydrophoneRP акустика e.K.
Image J программное обеспечениеплагин NIHизмерительная линияhttps://myfiles.meei.harvard.edu/xythoswfs/webui/_xy-e693768_1-t_wC4oKeBD
Световой микроскопKeyence CorporationBZ-X700
Myosin 7A антителоProteus Biosciences#25– 6790 
Антитело к нейрофиламентуSigma#AB5539
Плоско-выпуклая линзаSIGMAKOKI CO.,LTDSLSQ-30-200PM
Программное обеспечение для призмGraphPadN/Aver.8.2.1
Сканирующий электронный микроскопJEOL LtdJSM-6340F
Малый цифровой эндоскопAVS Co. LtdAE-C1
Ультразвуковое желеHitachi Aloka MedicalN/A
Переменный аттенюаторShowa Optronics Co.Н/ДВ настоящее время доступный преемник: KYOCERA SOC Corporation, RWH-532HP II
Водорастворимый инкапсулятор Дако#S1964
FOPH2000

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arun, P., et al. Blast exposure causes long-term degeneration of neuronal cytoskeletal elements in the cochlear nucleus: A potential mechanism for chronic auditory dysfunctions. Front Neurol. 12, 652190(2021).
  2. Kurioka, T., Mizutari, K., Satoh, Y., Shiotani, A. Correlation of blast-induced tympanic membrane perforation with peripheral cochlear synaptopathy. J Neurotrauma. 39 (13-14), 999-1009 (2022).
  3. Liberman, M. C., Epstein, M. J., Cleveland, S. S., Wang, H., Maison, S. F. Toward a differential diagnosis of hidden hearing loss in humans. PLoS One. 11 (9), e0162726(2016).
  4. Koizumi, Y., et al. Y-27632, a rock inhibitor, improved laser-induced shock wave (lisw)-induced cochlear synaptopathy in mice. Mol Brain. 14 (1), 105(2021).
  5. Parthasarathy, A., Kujawa, S. G. Synaptopathy in the aging cochlea: Characterizing early-neural deficits in auditory temporal envelope processing. J Neurosci. 38 (32), 7108-7119 (2018).
  6. Kurioka, T., et al. Characteristics of laser-induced shock wave injury to the inner ear of rats. J Biomed Opt. 19 (12), 125001(2014).
  7. Paik, C. B., Pei, M., Oghalai, J. S. Review of blast noise and the auditory system. Hear Res. 425, 108459(2022).
  8. Bryden, D. W., Tilghman, J. I., Hinds, S. R. Blast-related traumatic brain injury: Current concepts and research considerations. J Exp Neurosci. 13, 1179069519872213(2019).
  9. Ma, X., Aravind, A., Pfister, B. J., Chandra, N., Haorah, J. Animal models of traumatic brain injury and assessment of injury severity. Mol Neurobiol. 56 (8), 5332-5345 (2019).
  10. Shao, N., et al. Central and peripheral auditory abnormalities in chinchilla animal model of blast-injury. Hear Res. 407, 108273(2021).
  11. Ou, Y., et al. Traumatic brain injury induced by exposure to blast overpressure via ear canal. Neural Regen Res. 17 (1), 115-121 (2022).
  12. Cho, S. I., et al. Mechanisms of hearing loss after blast injury to the ear. PLoS One. 8 (7), e67618(2013).
  13. Kurioka, T., Mizutari, K., Satoh, Y., Kobayashi, Y., Shiotani, A. Blast-induced central auditory neurodegeneration affects tinnitus development regardless of peripheral cochlear damage. J Neurotrauma. , (2023).
  14. Niwa, K., et al. Pathophysiology of the inner ear after blast injury caused by laser-induced shock wave. Sci Rep. 6, 31754(2016).
  15. Kimura, E., et al. Effect of shock wave power spectrum on the inner ear pathophysiology in blast-induced hearing loss. Sci Rep. 11 (1), 14704(2021).
  16. Satoh, Y., et al. Pulmonary blast injury in mice: A novel model for studying blast injury in the laboratory using laser-induced stress waves. Lasers Surg Med. 42 (4), 313-318 (2010).
  17. Kawauchi, S., et al. Effects of isolated and combined exposure of the brain and lungs to a laser-induced shock wave(s) on physiological and neurological responses in rats. J Neurotrauma. 39 (21-22), 1533-1546 (2022).
  18. Cassinotti, L. R., et al. Cochlear neurotrophin-3 overexpression at mid-life prevents age-related inner hair cell synaptopathy and slows age-related hearing loss. Aging Cell. 21 (10), e13708(2022).
  19. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: Cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  20. Hickman, T. T., Smalt, C., Bobrow, J., Quatieri, T., Liberman, M. C. Blast-induced cochlear synaptopathy in chinchillas. Sci Rep. 8 (1), 10740(2018).
  21. Jiang, S., Sanders, S., Gan, R. Z. Hearing protection and damage mitigation in chinchillas exposed to repeated low-intensity blasts. Hear Res. 429, 108703(2023).
  22. Nakagawa, A., et al. Mechanisms of primary blast-induced traumatic brain injury: Insights from shock-wave research. J Neurotrauma. 28 (6), 1101-1119 (2011).
  23. Wu, P. Z., Liberman, M. C. Age-related stereocilia pathology in the human cochlea. Hear Res. 422, 108551(2022).
  24. Kurabi, A., Keithley, E. M., Housley, G. D., Ryan, A. F., Wong, A. C. Cellular mechanisms of noise-induced hearing loss. Hear Res. 349, 129-137 (2017).
  25. Kim, J., Xia, A., Grillet, N., Applegate, B. E., Oghalai, J. S. Osmotic stabilization prevents cochlear synaptopathy after blast trauma. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (21), E4853-E4860 (2018).
  26. Hu, N., Rutherford, M. A., Green, S. H. Protection of cochlear synapses from noise-induced excitotoxic trauma by blockade of ca(2+)-permeable ampa receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (7), 3828-3838 (2020).
  27. Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, e03564(2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи