Количественный и недорогой бесклеточный флуоресцентный метод для подтверждения способности новых соединений хелатировать железо

Краткое содержание

Мы описываем флуоресцентный анализ, который может быстро и недорого подтвердить способность новых соединений хелатировать железо. В ходе анализа измеряется способность соединений вытеснять железосвязывающую активность слабого хелатирующего железа флуоресцентного зонда кальцеина, что приводит к количественно измеримому увеличению флуоресценции при хелировании.

Аннотация

Раковым клеткам требуется большое количество железа для поддержания их пролиферации. Метаболизм железа считается отличительной чертой рака, что делает железо подходящей мишенью для противораковых подходов. Разработка новых соединений и идентификация отведений для дальнейшей модификации требует проведения тестов на доказательство механизма. Существует множество анализов для оценки воздействия на распространение; Тем не менее, способность хелатировать железо является важной и иногда упускаемой из виду конечной мерой из-за высокой стоимости оборудования и проблемы быстрой и воспроизводимой количественной оценки силы хелатирования. В этой статье мы описываем количественный и недорогой бесклеточный флуоресцентный метод для подтверждения способности новых соединений хелатировать железо. Наш анализ основан на коммерчески доступном недорогом флуоресцентном красителе кальцеин, флуоресценция которого может быть количественно определена на большинстве флуоресцентных микротитровальных планшетов. Кальцеин является слабым хелатором железа, и его флуоресценция гасится, когда он связывает Fe^2+/3+; Флуоресценция восстанавливается, когда новый хелатор превосходит кальцеин по связанному Fe^2+/3+. Устранение флуоресцентного гашения и, как следствие, увеличение флуоресценции позволяет определить хелатирующую способность нового предполагаемого хелатора. Поэтому мы предлагаем недорогой высокопроизводительный анализ, который позволяет проводить быстрый скрининг новых химических соединений-кандидатов.

Введение

Фенотипические изменения в клетках, которые связаны с развитием рака через общий набор измененных биологических возможностей, в настоящее время обычно называют признаками рака. К их числу относятся изменения, возникающие в результате перепрограммирования энергетического обмена, которые широко распространены в биологии раковых клеток¹. Такое метаболическое перепрограммирование включает в себя повышенную потребность в железе для поддержки быстрой пролиферации и роста опухоли². Эта тяга к железу приводит к нарушению регуляции метаболизма железа, что само по себе считается признаком рака ^3,4, причем нарушение регуляции происходит на^всех стадиях5. Отличительные признаки метастазирования, недавно предложенные Уэлчем и Херстом, включают роль железа-6, поскольку железо может вызывать окислительный стресс, а это, в свою очередь, может опосредуть изменения в геноме, эпигеноме и протеоме, увеличивая возможность метастазирования^. Связь между уровнем железа и увеличением заболеваемости раком была продемонстрирована в эпидемиологических исследованиях⁸.

Поскольку раковым клеткам требуется большое количество железа, они подвержены дефициту железа и, следовательно, хелатированию железа. Недавно мы опубликовали обзорную статью, в которой подчеркивается потенциал хелатирования железа в обращении вспять нескольких признаков рака посредством NDRG1, нарушающего онкогенные сигнальные пути⁹. Однако использование хелатирования железа в качестве самостоятельной терапии рака не дало положительных результатов в клинических испытаниях из-за его токсичности, короткого периода полувыведения, быстрого метаболизма и возникающих механизмов резистентности. Тем не менее, хелаторы железа показали многообещающие результаты в исследованиях in vitro и in vivo , что указывает на необходимость дополнительной работы по разработке эффективных хелаторов железа для терапии рака. Специфическое хелатирование железа является проверенной стратегией в разработке противоопухолевых препаратов, но^{на сегодняшний день} сообщалось только о нескольких классах.

Идентификация и характеристика новых хелаторов железа требует возможности измерить их влияние на несколько конечных точек. Многие из них (такие как пролиферация, апоптоз, образование активных форм кислорода) регулярно измеряются и были описаны и рассмотрены в литературе в качестве методов оценки^{признаков рака.} При оценке нового хелатора железа многие группы регулярно изучают влияние на антипролиферативную и окислительно-восстановительную активность, а также влияние на приток или отток железа. Методы прогнозирования in silico ¹² еще больше увеличивают растущий пул хелаторов железа, которые могут быть экранированы.

Дляочистки хелаторов железа требуется возможность измерить их влияние на уровень железа в качестве средства эффективной демонстрации принципа. В настоящее время наиболее распространенным методом является проточная цитометрия¹³ , которая является дорогостоящей, трудоемкой и плохо поддается количественной оценке. Выбор анализа часто основывается на наличии экспериментального оборудования, скорости и стоимости анализа. Таким образом, способность хелатировать железо может быть упущена из виду из-за высокой стоимости оборудования и проблемы быстрой и воспроизводимой количественной оценки силы хелатирования. В этой статье мы описываем количественный и недорогой бесклеточный флуоресцентный метод для подтверждения способности новых соединений хелатировать железо.

Протокол

1. Приготовление исходного раствора

1. При приготовлении стоковых растворов кальцеина предотвратите фотодеградацию, храня растворы в темноте. Приготовьте 1 мМ раствор кальцеина в PBS Дульбекко, без магния или кальция¹⁴. На 5 мл 1 мл раствора кальцеина добавьте 3,1 мг кальцеина (622,5 г/м) к 5 мл PBS Дульбекко. Используя 1 мМ носок кальцеина, приготовьте 1 мл аликвот вторичных исходных растворов в микрофуговой пробирке, как описано в таблице 1.
2. Приготовьте запасы гексагидрата сульфата железа и аммония, растворив 19 мг гексагидрата FAS (392,1 г/М) в 5 мл PBS Dulbecco для получения 10 мМ раствора сульфата железа и аммония (FAS). Готовят вторичные запасы ФАС путем разбавления. Чтобы получить массу массой 2 мМ FAS (fA), разбавьте 200 мкл из 10 мМ массы FAS с PBS с 800 мкл PBS Dulbecco. Для приготовления массы в 100 мкМ FAS (fB) разбавьте 50 мкл массы fA с 950 μл PBS Dulbecco.
3. Чтобы приготовить 10 мМ запаса Deferiprone, растворите 2,8 мг (139,15 г/М) в 2 мл PBS Dulbecco. Подготовьте вторичные запасы хелатора железа 2 мМ путем разбавления 200 мкл 10 мМ запаса 800 мкл PBS Дульбекко.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе выбранный хелатор железа должен быть растворен в PBS Дульбекко без магния или кальция. В качестве рабочего экземпляра мы использовали хелатор железа Deferiprone.

2. Валидация анализа путем определения линейного диапазона флуоресценции кальцеина

1. Приготовьте запасы кальцеина в диапазоне от 1 мМ до 1 мкМ, как описано в таблице исходных растворов (см. Таблицу 1). Храните исходные растворы в темноте, чтобы предотвратить фотохимическую деградацию.
2. Пипетка 90 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) в лунки от A до H и от 1 до 12 планшета на 96 лунок с помощью одноканальной ручной пипетки или многоканальной ручной пипетки.
3. Добавьте 10 мкл 1 мл кальцеина в столбец 12, строки от A до H, планшета с 96 лунками с помощью одноканальной ручной пипетки.
4. Добавьте 10 μL предварительно подготовленного запаса кальцеина 800 μM (Таблица 1) в планшет на 96 лунок в столбце 11, строки от A до H, используя одноканальную ручную пипетку.
5. Повторите процедуру сложения с запасами из таблицы 1 таким образом, чтобы столбец 10 содержал 10 μЛ из 400 μМ, а столбец 9 содержал 10 μЛ из 200 μМ и т.д. Продолжайте эту пошаговую процедуру по столбцам, пока столбец 2 не будет содержать 10 μл запаса 1 μM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация кальцеина в каждой скважине в 10 раз ниже, чем в стандартных растворах, из-за разбавления 1:10.
6. Добавьте 10 мкл PBS в столбец 1, строки с А по Е.
7. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин и установить анализатор на микропланшетном ридере на возбуждение 490 нм и обнаружение 530 нм (или подходящий набор фильтров для флуоресценции Calcien).

3. Валидация анализа методомгашения ионов Fe²⁺ для снижения флуоресценции кальцеина

1. Приготовьте заготовку кальцеина (cB) в концентрации 10 мкМ и заготовку FAS (fA) в концентрации 2 мМ (см. Таблицу материалов). Храните подвой Кальцеин в темноте, чтобы предотвратить фотодеградацию.
2. С помощью одноканальной ручной пипетки или многоканальной ручной пипетки добавьте 50 мкл PBS в столбцы со 2 по 10, строки от A до E. Не добавляйте PBS в столбец 11.
3. Добавьте 100 мкл запаса FAS (fA) объемом 2 мМ в 96-луночный планшет в столбце 11 (строки от A до E) с помощью одноканальной ручной пипетки.
4. С помощью многоканальной ручной пипетки удалите 50 мкл fA из колонки 11 и подайте ее в PBS уже в колонке 10, тщательно перемешайте с помощью пипетирования.
5. Продолжайте эту процедуру ступенчатого двойного разведения в столбцах 9-2, строках от А до Е 96-луночного планшета и перемешивайте с помощью пипетирования.
6. Удалите 50 мкл раствора с помощью пипетирования из колонки 2 и выбросьте раствор впустую.
7. Добавьте 40 мкл PBS во все лунки с раствором в них, столбцы 2-12, строки от А до Е.
8. Добавьте 90 мкл PBS в лунки столбца 1, строки А-Е. Эти лунки действуют как положительный контроль 1 мкМ кальцеина и 0 мкМ ФАС.
9. Добавьте по 10 мкл 10 мкМ кальцеинового запаса (cB) в каждую лунку с раствором в ней (столбцы с 1 по 12, строки от А до Е). Это приводит к максимальной концентрации 1000 мкМ FAS в столбце 11, при этом концентрация FAS уменьшается вдвое для столбцов 10, 9, 8 в столбце 2. Каждая из полученных лунок из колонн содержит 1 мкМ кальцеин и разбавленный ФАС.
10. Добавьте 100 мкл PBS в строку F столбцов с 1 по 5 только для управления PBS. Добавьте 100 мкл 2 мМ FAS в строку F столбцов с 6 по 10 для контроля только FAS. Выдерживать при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте.
11. Анализ проводится на микропланшете, настроенном на возбуждение 490 нм и обнаружение 530 нм (или подойдет фильтр для флуоресценции кальцеина).

4. Анализ для количественной оценки способности хелаторов железа вытеснять слабый хелатор кальцеин поионам Fe²⁺

1. Приготовьте запас кальцеина (cB) в концентрации 10 мкМ, запас FAS (fB) в концентрации 100 мкМ и запас хелатора железа в концентрации 2 мМ, как показано в таблице 1. Храните запасы кальцеина в темноте, чтобы предотвратить фотодеградацию.
2. С помощью одноканальной ручной пипетки или многоканальной ручной пипетки добавьте 50 мкл PBS в столбцы со 2 по 10, строки от A до E, планшета на 96 лунок. Не добавляйте PBS в столбец 11.
3. Добавьте 100 мкл из 2 мМ запаса (fA) хелаторов железа в 96-луночный планшет в столбце 11, строки от A до E с помощью одноканальной ручной пипетки.
4. С помощью многоканальной ручной пипетки извлеките 50 мкл fA из столбца 11 и подайте его в PBS в столбец 10, строки от А до Е, тщательно перемешав с помощью пипетирования.
5. Продолжайте эту процедуру ступенчатого двойного разведения по оставшимся столбцам 9-2, ряды от А до Е пластины, перемешайте каждую лунку с помощью пипетирования. Удалите 50 μL из колонки 2 и выбросьте. Это обеспечивает двукратное разведение 2 мМ хелатора железа (Deferiprone) по 96 луночным планшетам столбцов 11 к 2, ряды от A до E.
6. Пипеткой 30 мкл PBS во все лунки с раствором в них (например, в столбцы 2-11 строк от А до Е).
7. С помощью многоканальной пипетки добавьте 10 мкл 100 мкМ запаса FAS (fB) в столбцы 2-12, строки от A до E. Это приводит к концентрации 1 мкМ кальцеина и 10 мкМ FAS в каждой лунке, а также к двойному разведению хелаторов, при этом концентрация уменьшается вдвое в каждой колонке по всей пластине, колонки 11-2, с максимальной концентрацией хелатора железа на уровне 1000 мкМ в колонке 11 лунок от А до Е.
8. С помощью многоканальной пипетки добавьте 10 μL 10 μM кальцеинового запаса (cB) в столбцы 2-12, строки от A до E.
9. Пипетка 80 мкл PBS и 10 мкл кальцеина (cB) и 10 мкл запаса FAS (fB) в столбец 1, строки A-E с помощью пипетки. Смешайте образцы с помощью пипетирования. Это обеспечивает контроль кальцеина 1 мкМ с 10 мкМ FAS и без хелатора.
10. Пипетируйте 100 мкл PBS в ряд F столбцов с 1 по 5. Это обеспечивает отрицательный контроль PBS.
11. Добавьте 100 мкл 2 мМ хелатора железа (Deferiprone) в строку F, столбцы с 6 по 10. Это обеспечивает контроль только над хелатором.
12. Выдерживать при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте. Анализ проводится с помощью мультимодального считывателя микропланшетов, настроенного на возбуждение на длине волны 490 нм и обнаружение на длине волны 530 нм (или подходящий набор фильтров для флуоресценции Calcien).

5. Анализ данных

1. Анализ для валидации анализа путем определения линейного диапазона флуоресценции кальцеина.
   1. Рассчитайте среднее значение единиц относительной флуоресценции (RFU) строк A-H для каждой концентрации кальцеина в столбцах 96-луночной пластины из шага 1 и нанесите график в зависимости от концентрации. Постройте линейный график концентрации кальцеина по оси x в зависимости от среднего значения RFU по оси y и используйте линейную регрессию для получения линии наилучшего соответствия.
   2. Количественно оцените статистическую значимость путем сравнения концентраций кальцеина в каждом столбце (2-11) с контролем PBS в столбце 1, строки A - E. Проведите дисперсионный анализ (ANOVA) и примените апостериорный анализ с использованием наименее значимой разницы (LSD) с пороговым значением p <0,001 для определения статистической значимости (обозначено ** на рисунке 1).
2. Анализ для валидации анализа методом гашения ионов Fe²⁺ для снижения флуоресценции кальцеина.
   1. Рассчитайте средние относительные единицы флуоресценции (RFU) строк от A до E для каждой концентрации FAS в столбцах 2-11. Построение графика среднего значения РФС для каждой концентрации ФАС по оси y. По оси x строим график концентраций FAS с использованием шкалы Log2, так как она лучше распределяет данные. Постройте линию наилучшего вписывания с помощью линейной регрессии.
   2. Количественно оцените статистическую значимость путем сравнения среднего значения каждого столбца с средним значением RFU контроля PBS, 1 мкМ кальцеина, 0 мкМ FAS (столбец 1 строки от A до E). Для определения статистической значимости проведите ANOVA с апостериорным анализом ЛСД с пороговым значением p <0,001.
3. Анализ для анализа: Количественная оценка способности хелаторов железа вытеснять слабый хелатор кальцеин по ионам Fe²⁺ .
   1. Рассчитайте средние единицы относительной флуоресценции (RFU) строк от A до E для каждой концентрации хелатора в столбцах 2-11. График среднего значения RFU для каждой концентрации хелатора по оси y. На оси X график концентраций хелатора с использованием шкалы Log2, так как она лучше распределяет данные.
   2. Количественно оцените статистическую значимость путем сравнения каждого столбца среднего значения РФП контроля PBS 1 мкМ кальцеина и 10 мкМ FAS (столбец 1, строки от A до E). Для определения статистической значимости проведите ANOVA с апостериорным анализом ЛСД с пороговым значением p <0,001.

Результаты

Для метода, показанного на шаге 2, в этом первом эксперименте (рис. 1) был установлен линейный диапазон считывателя флуоресцентной пластины с микротитром при обнаружении флуоресцентного излучения кальцеина. Наши репрезентативные результаты показывают широкий линейный диапазон флуоресценции кальцеина от 0 до 100 мкМ. ANOVA с апостериорным анализом ЛСД демонстрирует, что существуют статистически значимые различия в средних значениях RFU для всех концентраций кальцеина по сравнению с контролем 0 мкМ кальцеина. В дальнейших экспериментах использовали кальцеин в дозе 1 мкМ (этапы 3 и 4), поскольку он дает статистически значимые отличия от контроля 0 мкМ и находится в диапазоне, в котором он обычно применяется к клеткам в форме кальцеина AM в проточной цитометрии¹³.

Для метода, показанного на шаге 3, мы демонстрируем, что при добавлении железа в форме Fe²⁺ в диапазоне от 0 до 1000 мкМ (в виде FAS) к кальцеину 1 μM, ионы Fe²⁺ приводят к линейному снижению флуоресценции кальцеина (RFU). Это позволяет наблюдать гашение флуоресценции кальцеина на основе Fe²⁺ . Кальцеин, как слабый хелатор железа, связывает железо, и это снижает выход флуоресценции. На рисунке 2 концентрации 8,9 мкМ FAS и выше показали значительное снижение p<0,001 флуоресценции кальцеина по сравнению с 1 мкМ кальцеина в отдельности. Применение 8,9 мкМ ФАС соответствовало снижению флуоресценции кальцеина (среднее значение РФИ) на 33%. Для дальнейших экспериментов (шаг 4) использовали 10 мкМ FAS, так как он находился в диапазоне флуоресцентного гашения кальцеина.

Для метода, показанного на шаге 4, вытеснение кальцеина по ионам^Fe2+ хелатором железа можно наблюдать на рисунке 3. Железо в форме Fe²⁺ снижает флуоресценцию кальцеина по сравнению с контролем 1 мкМ, а хелатор железа deferiprone увеличивает эту флуоресценцию до пика, высвобождая закалку кальцеина железом и увеличивая флуоресценцию (среднее значение RFU). Деферипрон (используемый в качестве примера) в концентрациях в диапазоне 0,97-512 мкМ приводил к статистически значимому увеличению флуоресценции, что наблюдалось при апостериорном анализе ANOVA и LSD (p<0,001). Наибольшее кратное изменение было 3-кратным изменением среднего значения РКГ при 62,5 мкМ хелатора по сравнению с контролем 1 мкМ кальцеина АМ и 10 мкМ ФАС. Выше 512 мкМ деферипрона не было статистически значимой разницы между хелатором и контролем 1 мкМ кальцеина и 10 мкМ ФАС.

Рисунок 1: Концентрации кальцеина и флуоресценция (РФИ) определены с помощью флуоресцентного микротитровального планшетного ридера. Здесь показаны концентрации кальцеина 0-100 мкМ в инкубации в течение 30 мин и определение флуоресценции (РФИ). Данные показывают среднее значение 8 повторений на эксперимент и три независимых эксперимента, погрешности показывают 95% доверительный интервал в среднем. Статистическая значимость обозначается как **, где p<0,001, определяемое с помощью ANOVA и апостериорного анализа ЛСД (рассчитано с помощью призмы графической прокладки). Среднее значение кальцеина RFU каждой концентрации сравнивают с контролем PBS и 0 мкМ кальцеина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Увеличение концентрации FAS приводит к линейному снижению флуоресценции кальцеина. Концентрация FAS была увеличена с 0 до 1000 мкМ, что привело к линейному снижению флуоресценции кальцеина на 1 мкМ после 30-минутной инкубации в PBS Представленные данные представляют собой среднее значение 5 повторений в эксперименте и трех независимых экспериментов, погрешности показывают 95% доверительный интервал в среднем. Статистическая значимость обозначается как **, где p<0,001, определяемое с помощью ANOVA и апостериорного анализа ЛСД (рассчитано с помощью призмы графической прокладки). Среднее значение кальцеина RFU каждой концентрации ФАС и 1 мкМ кальцеина сравнивают с контролем 1 мкМ кальцеина 0 мкМ ФАС в PBS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Увеличение концентраций деферипрона. Концентрацию деферипрона увеличивали с 0-1000 мкМ при инкубации 1 мкМ кальцеина, 10 мкМ ФАС в PBS. Флуоресценцию измеряли на мультимодальном микропланшетном ридоре. Показанные данные являются средним значением 5 повторений на эксперимент и трех независимых экспериментов, погрешности показывают 95% доверительный интервал в среднем. Статистическая значимость обозначается как **, где p<0,001, как определено с помощью ANOVA и апостериорного анализа LSD (рассчитано с помощью призмы графической площадки). Среднее значение РФИ по сравнению с 1 мкМ кальцеина в PBS с 10 мкМ ФАС и 0 мкМ деферипрона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Концентрация (мкм)	Объем от (1 mM stock)	Объем PBS	Общий объем
800	800 мкл	200 μл	1 мл
400	400 мкл	600 мкл	1 мл
200	200 μл	800 мкл	1 мл
100	100 мкл	900 мкл	1 мл
50	50 μл	950 μЛ	1 мл
25	25 мкл	975 μЛ	1 мл
10	10 μл	990 μл	1 мл
6	6 μЛ	994 μл	1 мл
2	2 мкл	998 мкл	1 мл
1	1 μл	999 мкл	1 мл

Таблица 1: Кальцеин для подготовки вторичного сырья.

Обсуждение

Чрезмерная зависимость раковых опухолей от железа в качестве топлива для метаболизма делает хелатирование железа потенциальным дополнением к терапевтическим режимам⁴. Тем не менее, существует ограниченная возможность быстрого скрининга новых хелаторов ионов металлов на их способность связывать ионы железа. Широко используемый и широко доступный флуоресцентный зонд кальцеин, как известно, действует как слабый хелататор железа и связывание ионами железа гасит флуоресценцию кальцеина. Флуоресценцию можно восстановить, соревнуясь за связывание с железом с помощью более сильного хелатора железа. Снижение флуоресценции, наблюдаемое при связывании кальцеина с железом, и восстановление флуоресценции, когда его вытесняет более сильный хелатор, обеспечивает быстрый и простой метод скрининга новых соединений с хелатирующим потенциалом железа. В то время как методы на основе кальцеина¹³ уже используются для визуализации способности хелаторов связывать железо в клетках, эти методы требуют дорогостоящей аппаратуры проточной цитометрии, являются лишь полуколичественными, требуют обширной подготовки персонала и использования более дорогой клеточной формы кальцеина, Кальциен-АМ. Кроме того, этот метод плохо воспроизводим и не облегчает определение значимости данных с помощью статистического анализа. Поэтому мы создали простой недорогой метод in vitro , который может выступать в качестве первого прохода скрининга новых соединений хелатирующих способностей железа. Этот бесклеточный анализ отменяет необходимость в дорогостоящих методах культивирования клеток в качестве высокопроизводительного скрининга с первого прохода на способность к хелатированию железа.

Растет интерес к скринингу или разработке новых хелаторов железа, которые могут быть использованы для борьбы с раком из-за их зависимости от железа для управления их метаболической адаптацией^. В этой статье мы описываем метод in vitro , который может быть использован для подтверждения способности новых соединений хелатировать железо путем вытеснения слабого хелатора кальцеина. Это позволяет просто, количественно и недорого проводить скрининг новых соединений на их способность к хелатированию железа.

Одним из важнейших этапов протокола является определение линейного диапазона считывателя флуоресцентных микротитровальных планшетов (рис. 1). Кальцеин имеет широкий спектр флуоресцентного возбуждения и излучения, который сосредоточен вокруг пика возбуждения 501 нм и пика излучения на 521 нм. Тем не менее, линейный диапазон кальцеина может зависеть от фильтров, используемых для возбуждения и детектирования флуоресцентного излучения кальцеина, линейный диапазон фотоумножителя, используемого для детектирования, также частично определяет линейный диапазон. Поэтому важно сначала установить диапазон концентраций, при которых флуоресценция кальцеина является линейной, чтобы убедиться, что анализ работает в пределах линейного диапазона кальцеина на считывателе флуоресцентных пластин. Учитывая, что мы наблюдали линейность от 0 до 100 мМ кальцеина, это показывает, что кальцеин имеет широкий линейный диапазон. Кроме того, флуоресцентные микротитровальные планшеты обычно имеют наборы фильтров, которые могут измерять флуоресценцию кальцеина, поскольку он имеет спектры, аналогичные некоторым из наиболее часто используемых флуорофоров, излучающих зеленый свет. Таким образом, данный анализ широко применим для широкого круга пользователей.

Использование FAS в качестве донора ионов железа предпочтительно, поскольку он обеспечивает ионы Fe²⁺ , которые являются основным ионом железа в лабильного пуле железа в клетках. Тем не менее, результаты, аналогичные показанным здесь (Рисунок 2), были достигнуты с хлоридом железа и аммония (FAC), который обеспечивает Fe³⁺ (данные не показаны). Таким образом, анализ совместим с обоими окислительно-восстановительными состояниями ионов железа, расширяя применимость к хелаторам с предпочтением любого из этих окислительно-восстановительных состояний.

В этом исследовании мы представили данные для хелатора железа Deferiprone, однако мы также оценили способность других хелаторов железа, включая Mimosine, вытеснять кальцеин в связывании ионов железа с помощью этого анализа (данные не показаны). Одним из ограничений анализа является то, что выше 512 мМ хелатора деферипрона не наблюдалось статистически значимого увеличения флуоресценции по сравнению с контролем 1 мкМ кальцеина и 10 мкМ ФАС. Неясно, почему более высокие концентрации хелатора не приводят к увеличению флуоресценции, хотя это наблюдалось с другими хелаторами (данные не показаны). Тем не менее, терапевтическое соединение свинца должно действовать в <100 мкМ, чтобы анализ работал в диапазонах концентраций, необходимых для эффективности соединения свинца.

Таким образом, этот анализ позволяет быстро проверить любой потенциальный хелататор железа на способность хелатировать железо в качестве доказательства механизма. Это важный первый шаг перед тем, как новые хелаторы будут проверены в дорогостоящих и трудоемких клеточных анализах или in vivo . Ограничением этого анализа является то, что он проводится с использованием водного растворителя и, следовательно, требует, чтобы хелатор был растворим в водных буферах. Однако, учитывая, что самая высокая концентрация, использованная в этом исследовании, составляла 10 мМ Деферипрона, который является небольшим липофильным хелатором железа¹⁵, то хелаторы с ограниченной растворимостью в воде все еще могут быть протестированы.

В заключение следует отметить, что описанный здесь анализ может оказаться ценным в скрининге новых хелаторов железа, который является постоянным направлением терапевтических разработок в области рака.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Сульфат аммония(II) гексагидрат	Sigma-Aldrich	215406	иначе известный как FAS
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Deferiprone	Sigma-Aldrich	379409
Dulbecco′ s Фосфатно-солевой буфер	Sigma-Aldrich	D5652	без магния и кальция
Greiner CELLSTAR 96 лунки	Sigma-Aldrich	M0812	подойдет любая оптически прозрачная 96 луночная пластина