Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Количественный и недорогой бесклеточный флуоресцентный метод для подтверждения способности новых соединений хелатировать железо

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66421

⸱

23 февраля 2024 г.

 ,  , 
1Department of Applied Sciences, Faculty of Health and Life Sciences, Northumbria University

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем флуоресцентный анализ, который может быстро и недорого подтвердить способность новых соединений хелатировать железо. В ходе анализа измеряется способность соединений вытеснять железосвязывающую активность слабого хелатирующего железа флуоресцентного зонда кальцеина, что приводит к количественно измеримому увеличению флуоресценции при хелировании.

Аннотация

Раковым клеткам требуется большое количество железа для поддержания их пролиферации. Метаболизм железа считается отличительной чертой рака, что делает железо подходящей мишенью для противораковых подходов. Разработка новых соединений и идентификация отведений для дальнейшей модификации требует проведения тестов на доказательство механизма. Существует множество анализов для оценки воздействия на распространение; Тем не менее, способность хелатировать железо является важной и иногда упускаемой из виду конечной мерой из-за высокой стоимости оборудования и проблемы быстрой и воспроизводимой количественной оценки силы хелатирования. В этой статье мы описываем количественный и недорогой бесклеточный флуоресцентный метод для подтверждения способности новых соединений хелатировать железо. Наш анализ основан на коммерчески доступном недорогом флуоресцентном красителе кальцеин, флуоресценция которого может быть количественно определена на большинстве флуоресцентных микротитровальных планшетов. Кальцеин является слабым хелатором железа, и его флуоресценция гасится, когда он связывает Fe2+/3+; Флуоресценция восстанавливается, когда новый хелатор превосходит кальцеин по связанному Fe2+/3+. Устранение флуоресцентного гашения и, как следствие, увеличение флуоресценции позволяет определить хелатирующую способность нового предполагаемого хелатора. Поэтому мы предлагаем недорогой высокопроизводительный анализ, который позволяет проводить быстрый скрининг новых химических соединений-кандидатов.

Введение

Фенотипические изменения в клетках, которые связаны с развитием рака через общий набор измененных биологических возможностей, в настоящее время обычно называют признаками рака. К их числу относятся изменения, возникающие в результате перепрограммирования энергетического обмена, которые широко распространены в биологии раковых клеток1. Такое метаболическое перепрограммирование включает в себя повышенную потребность в железе для поддержки быстрой пролиферации и роста опухоли2. Эта тяга к железу приводит к нарушению регуляции метаболизма железа, что само по себе считается признаком рака 3,4, причем нарушение регуляции происходит навсех стадиях5. Отличительные признаки метастазирования, недавно предложенные Уэлчем и Херстом, включают роль железа-6, поскольку железо может вызывать окислительный стресс, а это, в свою очередь, может опосредуть изменения в геноме, эпигеноме и протеоме, увеличивая возможность метастазирования. Связь между уровнем железа и увеличением заболеваемости раком была продемонстрирована в эпидемиологических исследованиях8.

Поскольку раковым клеткам требуется большое количество железа, они подвержены дефициту железа и, следовательно, хелатированию железа. Недавно мы опубликовали обзорную статью, в которой подчеркивается потенциал хелатирования железа в обращении вспять нескольких признаков рака посредством NDRG1, нарушающего онкогенные сигнальные пути9. Однако использование хелатирования железа в качестве самостоятельной терапии рака не дало положительных результатов в клинических испытаниях из-за его токсичности, короткого периода полувыведения, быстрого метаболизма и возникающих механизмов резистентности. Тем не менее, хелаторы железа показали многообещающие результаты в исследованиях in vitro и in vivo , что указывает на необходимость дополнительной работы по разработке эффективных хелаторов железа для терапии рака. Специфическое хелатирование железа является проверенной стратегией в разработке противоопухолевых препаратов, нона сегодняшний день сообщалось только о нескольких классах.

Идентификация и характеристика новых хелаторов железа требует возможности измерить их влияние на несколько конечных точек. Многие из них (такие как пролиферация, апоптоз, образование активных форм кислорода) регулярно измеряются и были описаны и рассмотрены в литературе в качестве методов оценкипризнаков рака. При оценке нового хелатора железа многие группы регулярно изучают влияние на антипролиферативную и окислительно-восстановительную активность, а также влияние на приток или отток железа. Методы прогнозирования in silico 12 еще больше увеличивают растущий пул хелаторов железа, которые могут быть экранированы.

Дляочистки хелаторов железа требуется возможность измерить их влияние на уровень железа в качестве средства эффективной демонстрации принципа. В настоящее время наиболее распространенным методом является проточная цитометрия13 , которая является дорогостоящей, трудоемкой и плохо поддается количественной оценке. Выбор анализа часто основывается на наличии экспериментального оборудования, скорости и стоимости анализа. Таким образом, способность хелатировать железо может быть упущена из виду из-за высокой стоимости оборудования и проблемы быстрой и воспроизводимой количественной оценки силы хелатирования. В этой статье мы описываем количественный и недорогой бесклеточный флуоресцентный метод для подтверждения способности новых соединений хелатировать железо.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Приготовление исходного раствора

  1. При приготовлении стоковых растворов кальцеина предотвратите фотодеградацию, храня растворы в темноте. Приготовьте 1 мМ раствор кальцеина в PBS Дульбекко, без магния или кальция14. На 5 мл 1 мл раствора кальцеина добавьте 3,1 мг кальцеина (622,5 г/м) к 5 мл PBS Дульбекко. Используя 1 мМ носок кальцеина, приготовьте 1 мл аликвот вторичных исходных растворов в микрофуговой пробирке, как описано в таблице 1.
  2. Приготовьте запасы гексагидрата сульфата железа и аммония, растворив 19 мг гексагидрата FAS (392,1 г/М) в 5 мл PBS Dulbecco для получения 10 мМ раствора сульфата железа и аммония (FAS). Готовят вторичные запасы ФАС путем разбавления. Чтобы получить массу массой 2 мМ FAS (fA), разбавьте 200 мкл из 10 мМ массы FAS с PBS с 800 мкл PBS Dulbecco. Для приготовления массы в 100 мкМ FAS (fB) разбавьте 50 мкл массы fA с 950 μл PBS Dulbecco.
  3. Чтобы приготовить 10 мМ запаса Deferiprone, растворите 2,8 мг (139,15 г/М) в 2 мл PBS Dulbecco. Подготовьте вторичные запасы хелатора железа 2 мМ путем разбавления 200 мкл 10 мМ запаса 800 мкл PBS Дульбекко.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе выбранный хелатор железа должен быть растворен в PBS Дульбекко без магния или кальция. В качестве рабочего экземпляра мы использовали хелатор железа Deferiprone.

2. Валидация анализа путем определения линейного диапазона флуоресценции кальцеина

  1. Приготовьте запасы кальцеина в диапазоне от 1 мМ до 1 мкМ, как описано в таблице исходных растворов (см. Таблицу 1). Храните исходные растворы в темноте, чтобы предотвратить фотохимическую деградацию.
  2. Пипетка 90 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) в лунки от A до H и от 1 до 12 планшета на 96 лунок с помощью одноканальной ручной пипетки или многоканальной ручной пипетки.
  3. Добавьте 10 мкл 1 мл кальцеина в столбец 12, строки от A до H, планшета с 96 лунками с помощью одноканальной ручной пипетки.
  4. Добавьте 10 μL предварительно подготовленного запаса кальцеина 800 μM (Таблица 1) в планшет на 96 лунок в столбце 11, строки от A до H, используя одноканальную ручную пипетку.
  5. Повторите процедуру сложения с запасами из таблицы 1 таким образом, чтобы столбец 10 содержал 10 μЛ из 400 μМ, а столбец 9 содержал 10 μЛ из 200 μМ и т.д. Продолжайте эту пошаговую процедуру по столбцам, пока столбец 2 не будет содержать 10 μл запаса 1 μM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация кальцеина в каждой скважине в 10 раз ниже, чем в стандартных растворах, из-за разбавления 1:10.
  6. Добавьте 10 мкл PBS в столбец 1, строки с А по Е.
  7. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин и установить анализатор на микропланшетном ридере на возбуждение 490 нм и обнаружение 530 нм (или подходящий набор фильтров для флуоресценции Calcien).

3. Валидация анализа методомгашения ионов Fe2+ для снижения флуоресценции кальцеина

  1. Приготовьте заготовку кальцеина (cB) в концентрации 10 мкМ и заготовку FAS (fA) в концентрации 2 мМ (см. Таблицу материалов). Храните подвой Кальцеин в темноте, чтобы предотвратить фотодеградацию.
  2. С помощью одноканальной ручной пипетки или многоканальной ручной пипетки добавьте 50 мкл PBS в столбцы со 2 по 10, строки от A до E. Не добавляйте PBS в столбец 11.
  3. Добавьте 100 мкл запаса FAS (fA) объемом 2 мМ в 96-луночный планшет в столбце 11 (строки от A до E) с помощью одноканальной ручной пипетки.
  4. С помощью многоканальной ручной пипетки удалите 50 мкл fA из колонки 11 и подайте ее в PBS уже в колонке 10, тщательно перемешайте с помощью пипетирования.
  5. Продолжайте эту процедуру ступенчатого двойного разведения в столбцах 9-2, строках от А до Е 96-луночного планшета и перемешивайте с помощью пипетирования.
  6. Удалите 50 мкл раствора с помощью пипетирования из колонки 2 и выбросьте раствор впустую.
  7. Добавьте 40 мкл PBS во все лунки с раствором в них, столбцы 2-12, строки от А до Е.
  8. Добавьте 90 мкл PBS в лунки столбца 1, строки А-Е. Эти лунки действуют как положительный контроль 1 мкМ кальцеина и 0 мкМ ФАС.
  9. Добавьте по 10 мкл 10 мкМ кальцеинового запаса (cB) в каждую лунку с раствором в ней (столбцы с 1 по 12, строки от А до Е). Это приводит к максимальной концентрации 1000 мкМ FAS в столбце 11, при этом концентрация FAS уменьшается вдвое для столбцов 10, 9, 8 в столбце 2. Каждая из полученных лунок из колонн содержит 1 мкМ кальцеин и разбавленный ФАС.
  10. Добавьте 100 мкл PBS в строку F столбцов с 1 по 5 только для управления PBS. Добавьте 100 мкл 2 мМ FAS в строку F столбцов с 6 по 10 для контроля только FAS. Выдерживать при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте.
  11. Анализ проводится на микропланшете, настроенном на возбуждение 490 нм и обнаружение 530 нм (или подойдет фильтр для флуоресценции кальцеина).

4. Анализ для количественной оценки способности хелаторов железа вытеснять слабый хелатор кальцеин поионам Fe2+

  1. Приготовьте запас кальцеина (cB) в концентрации 10 мкМ, запас FAS (fB) в концентрации 100 мкМ и запас хелатора железа в концентрации 2 мМ, как показано в таблице 1. Храните запасы кальцеина в темноте, чтобы предотвратить фотодеградацию.
  2. С помощью одноканальной ручной пипетки или многоканальной ручной пипетки добавьте 50 мкл PBS в столбцы со 2 по 10, строки от A до E, планшета на 96 лунок. Не добавляйте PBS в столбец 11.
  3. Добавьте 100 мкл из 2 мМ запаса (fA) хелаторов железа в 96-луночный планшет в столбце 11, строки от A до E с помощью одноканальной ручной пипетки.
  4. С помощью многоканальной ручной пипетки извлеките 50 мкл fA из столбца 11 и подайте его в PBS в столбец 10, строки от А до Е, тщательно перемешав с помощью пипетирования.
  5. Продолжайте эту процедуру ступенчатого двойного разведения по оставшимся столбцам 9-2, ряды от А до Е пластины, перемешайте каждую лунку с помощью пипетирования. Удалите 50 μL из колонки 2 и выбросьте. Это обеспечивает двукратное разведение 2 мМ хелатора железа (Deferiprone) по 96 луночным планшетам столбцов 11 к 2, ряды от A до E.
  6. Пипеткой 30 мкл PBS во все лунки с раствором в них (например, в столбцы 2-11 строк от А до Е).
  7. С помощью многоканальной пипетки добавьте 10 мкл 100 мкМ запаса FAS (fB) в столбцы 2-12, строки от A до E. Это приводит к концентрации 1 мкМ кальцеина и 10 мкМ FAS в каждой лунке, а также к двойному разведению хелаторов, при этом концентрация уменьшается вдвое в каждой колонке по всей пластине, колонки 11-2, с максимальной концентрацией хелатора железа на уровне 1000 мкМ в колонке 11 лунок от А до Е.
  8. С помощью многоканальной пипетки добавьте 10 μL 10 μM кальцеинового запаса (cB) в столбцы 2-12, строки от A до E.
  9. Пипетка 80 мкл PBS и 10 мкл кальцеина (cB) и 10 мкл запаса FAS (fB) в столбец 1, строки A-E с помощью пипетки. Смешайте образцы с помощью пипетирования. Это обеспечивает контроль кальцеина 1 мкМ с 10 мкМ FAS и без хелатора.
  10. Пипетируйте 100 мкл PBS в ряд F столбцов с 1 по 5. Это обеспечивает отрицательный контроль PBS.
  11. Добавьте 100 мкл 2 мМ хелатора железа (Deferiprone) в строку F, столбцы с 6 по 10. Это обеспечивает контроль только над хелатором.
  12. Выдерживать при комнатной температуре в течение 10 минут в темноте. Анализ проводится с помощью мультимодального считывателя микропланшетов, настроенного на возбуждение на длине волны 490 нм и обнаружение на длине волны 530 нм (или подходящий набор фильтров для флуоресценции Calcien).

5. Анализ данных

  1. Анализ для валидации анализа путем определения линейного диапазона флуоресценции кальцеина.
    1. Рассчитайте среднее значение единиц относительной флуоресценции (RFU) строк A-H для каждой концентрации кальцеина в столбцах 96-луночной пластины из шага 1 и нанесите график в зависимости от концентрации. Постройте линейный график концентрации кальцеина по оси x в зависимости от среднего значения RFU по оси y и используйте линейную регрессию для получения линии наилучшего соответствия.
    2. Количественно оцените статистическую значимость путем сравнения концентраций кальцеина в каждом столбце (2-11) с контролем PBS в столбце 1, строки A - E. Проведите дисперсионный анализ (ANOVA) и примените апостериорный анализ с использованием наименее значимой разницы (LSD) с пороговым значением p <0,001 для определения статистической значимости (обозначено ** на рисунке 1).
  2. Анализ для валидации анализа методом гашения ионов Fe2+ для снижения флуоресценции кальцеина.
    1. Рассчитайте средние относительные единицы флуоресценции (RFU) строк от A до E для каждой концентрации FAS в столбцах 2-11. Построение графика среднего значения РФС для каждой концентрации ФАС по оси y. По оси x строим график концентраций FAS с использованием шкалы Log2, так как она лучше распределяет данные. Постройте линию наилучшего вписывания с помощью линейной регрессии.
    2. Количественно оцените статистическую значимость путем сравнения среднего значения каждого столбца с средним значением RFU контроля PBS, 1 мкМ кальцеина, 0 мкМ FAS (столбец 1 строки от A до E). Для определения статистической значимости проведите ANOVA с апостериорным анализом ЛСД с пороговым значением p <0,001.
  3. Анализ для анализа: Количественная оценка способности хелаторов железа вытеснять слабый хелатор кальцеин по ионам Fe2+ .
    1. Рассчитайте средние единицы относительной флуоресценции (RFU) строк от A до E для каждой концентрации хелатора в столбцах 2-11. График среднего значения RFU для каждой концентрации хелатора по оси y. На оси X график концентраций хелатора с использованием шкалы Log2, так как она лучше распределяет данные.
    2. Количественно оцените статистическую значимость путем сравнения каждого столбца среднего значения РФП контроля PBS 1 мкМ кальцеина и 10 мкМ FAS (столбец 1, строки от A до E). Для определения статистической значимости проведите ANOVA с апостериорным анализом ЛСД с пороговым значением p <0,001.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для метода, показанного на шаге 2, в этом первом эксперименте (рис. 1) был установлен линейный диапазон считывателя флуоресцентной пластины с микротитром при обнаружении флуоресцентного излучения кальцеина. Наши репрезентативные результаты показывают широкий линейный диапазон флуоресценции кальцеина от 0 до 100 мкМ. ANOVA с апостериорным анализом ЛСД демонстрирует, что существуют статистически значимые различия в средних значениях RFU для всех концентраций кальцеина по сравнению с контролем ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Чрезмерная зависимость раковых опухолей от железа в качестве топлива для метаболизма делает хелатирование железа потенциальным дополнением к терапевтическим режимам4. Тем не менее, существует ограниченная возможность быстрого скрининга новых хелаторов ионов металлов на их способность связывать ионы железа. Широко используемый и широко доступный флуоресцентный зонд кальцеин, как известно, действует как слабый хелататор железа и связывание ионами железа гасит флуоре...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Нортумбрийский университет за поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Сульфат аммония(II) гексагидратSigma-Aldrich215406иначе известный как FAS
CalceinSigma-AldrichC0875
DeferiproneSigma-Aldrich379409
Dulbecco′ s Фосфатно-солевой буферSigma-AldrichD5652без магния и кальция
Greiner CELLSTAR 96 лункиSigma-AldrichM0812подойдет любая оптически прозрачная 96 луночная пластина

Ссылки

  1. Hsu, P. P., Sabatini, D. M. Cancer cell metabolism: Warburg and beyond. Cell. 134 (5), 703-707 (2008).
  2. Hsu, M. Y., Mina, E., Roetto, A., Porporato, P. E. Iron: An essential element of cancer metabolism. Cells. 9 (12), 2591(2020).
  3. Torti, S. V., Torti, F. M. Iron and cancer: More ore to be mined. Nat Rev Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).
  4. Zhang, C., Zhang, F. Iron homeostasis and tumorigenesis: Molecular mechanisms and therapeutic opportunities. Protein Cell. 6 (2), 88-100 (2015).
  5. Torti, S. V., Manz, D. H., Paul, B. T., Blanchette-Farra, N., Torti, F. M. Iron and cancer. Annu Rev Nutr. 38, 97-125 (2018).
  6. Welch, D. R., Hurst, D. R. Defining the hallmarks of metastasis. Cancer Res. 79 (12), 3011-3027 (2019).
  7. Lehmann, U., et al. Epigenetic defects of hepatocellular carcinoma are already found in non-neoplastic liver cells from patients with hereditary haemochromatosis. Hum Mol Genet. 16 (11), 1335-1342 (2007).
  8. Fonseca-Nunes, A., Jakszyn, P., Agudo, A. Iron and cancer risk--a systematic review and meta-analysis of the epidemiological evidence. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (1), 12-31 (2014).
  9. Abdelaal, G., Veuger, S. Reversing oncogenic transformation with iron chelation. Oncotarget. 12 (2), 106-124 (2021).
  10. Brown, R. A. M., et al. Altered iron metabolism and impact in cancer biology, metastasis, and immunology. Front Oncol. 10, 476(2020).
  11. Menyhárt, O., et al. Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer. Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 300-319 (2016).
  12. Basu, A., et al. Discovering novel and diverse iron-chelators in silico. J Chem Inf Model. 56 (12), 2476-2485 (2016).
  13. Prus, E., Fibach, E. Flow cytometry measurement of the labile iron pool in human hematopoietic cells. Cytometry A. 73 (1), 22-27 (2008).
  14. Cold Spring Harb. Phosphate-buffered saline (pbs). 2006 (1), Cold Spring Harb Prot. (2006).
  15. Kontoghiorghes, G. J., Pattichis, K., Neocleous, K., Kolnagou, A. The design and development of deferiprone (l1) and other iron chelators for clinical use: Targeting methods and application prospects. Curr Med Chem. 11 (16), 2161-2183 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Хелатирование железафлуоресцентный анализметаболизм раковых клетокхелаторы железафлуоресценция кальцеинапланшетный ридервысокопроизводительный скринингсульфат аммония-железа(III)бесклеточный анализ
Количественный и недорогой бесклеточный флуоресцентный метод для подтверждения способности новых соединений хелатировать железо
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.