Методическая статья

Выделение мутантов Interaction-Null/Impairment с помощью двухгибридного анализа дрожжей

DOI:

10.3791/66423

⸱

29 декабря 2023 г.

 ,  , 
1Graduate School of Engineering, Kochi University of Technology, 2School of Engineering Science, Kochi University of Technology

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Взаимодействия биомолекул, такие как белок-белковые взаимодействия, являются молекулярной основой биологических функций. Если можно изолировать мутантов с нулевым взаимодействием, у которых отсутствует соответствующее взаимодействие, это значительно поможет понять функцию (функции) этого взаимодействия. В этой статье представлен эффективный способ выделения мутантов с нулевым взаимодействием.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белок-белковые взаимодействия являются одним из самых основных процессов, лежащих в основе биологических явлений. Одним из самых простых и лучших способов понять роль и функцию (функции) конкретного белок-белкового взаимодействия является сравнение фенотипа дикого типа (с соответствующим белок-белковым взаимодействием) и тех мутантов, у которых отсутствует соответствующее взаимодействие. Поэтому, если таких мутантов удастся выделить, они помогут пролить свет на связанные с ними биологические процессы. Двухгибридная процедура дрожжей (Y2H) является мощным подходом не только к обнаружению белок-белковых взаимодействий, но и к выделению мутантов с нулевым взаимодействием. В данной статье представлен протокол для выделения мутантов с нулевым взаимодействием/ослабленных с использованием технологии Y2H. Во-первых, библиотека мутаций создается путем объединения полимеразной цепной реакции и эффективной технологии бесшовного клонирования, которая эффективно исключает пустой вектор из библиотеки. Во-вторых, мутанты с нулевым взаимодействием/поврежденные мутанты проверяются с помощью анализа Y2H. Из-за хитрости вектора Y2H нежелательные мутанты, такие как мутанты со сдвигом рамки считывания и нонсенс-мутациями, эффективно устраняются из процесса скрининга. Эта стратегия проста и поэтому может быть применена к любой комбинации белков, взаимодействие которых может быть обнаружено с помощью двухгибридной системы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Взаимодействия между биомолекулами являются самой основной частью биологических явлений. Белок-белковые взаимодействия составляют значительную часть таких взаимодействий. Таким образом, идентификация партнера (партнеров) по взаимодействию представляющего интерес белка имеет решающее значение для дальнейшего выяснения функции представляющего интерес белка/гена. Двухгибридный метод дрожжей (Y2H) является популярным методом выявления белок-белковых взаимодействий in vivo1. В этой системе два белка (X и Y), взаимодействие которых необходимо проверить, сливаются с ДНК-связывающим доменом (DB) и доменом активации транскрипции (AD) соответственно. Слитый белок DB-X связывается с узнавающей последовательностью домена DB; следовательно, когда белки X и Y взаимодействуют, гибридный белок AD-Y оказывается в непосредственной близости от узнавающей последовательности. Следовательно, активируется транскрипция репортерного гена после узнавающей последовательности. Таким образом, наличие или отсутствие активности репортерного гена может быть использовано для определения наличия или отсутствия белок-белкового взаимодействия1.

После того, как определен конкретный партнер по взаимодействию с представляющим интерес белком, следует провести дальнейший анализ для выяснения биологической функции взаимодействия. С этой целью, если удастся выделить мутанты белков, которые нарушают или удаляют специфическое белок-белковое взаимодействие, они послужат мощными инструментами. Система Y2H может быть использована непосредственно для изоляции таких мутантов путем скрининга клонов с отрицательным взаимодействием, начиная с «положительного по взаимодействию» клона дикого типа. Для ускорения этого процессабыли разработаны «обратные» системы Y2H (rY2H) 2,3. В системах rY2H штаммы дрожжей-хозяев содержат контрселективные маркерные гены в качестве репортерных генов, что означает, что дрожжевые клетки растут только тогда, когда белки AD-Y и DB-X не взаимодействуют.

Несмотря на то, что системы Y2H и rY2H позволяют изолировать мутанты, отрицательные по отношению к взаимодействию, процесс выделения мутантов является трудоемким, поскольку не все кандидаты, полученные в результате скрининга, несут желаемый тип мутаций (обычно миссенс-мутации). Самая серьезная проблема заключается в том, что значительная часть кандидатов содержит сдвиг рамки считывания или бессмысленные мутации, и необходимо выполнять вестерн-блоттинг, чтобы исключить нежелательные клоны. Для решения этой проблемы были разработаны новые плазмидныевекторы4. В этих векторах KanMX, маркер лекарственной устойчивости, расположен вне кадра ниже домена DB или AD. Маркерный ген становится в кадре с доменом DB или AD только тогда, когда в него вставлен интересующий ген. Когда случайная мутация (мутации) вводится в интересующий ген, нежелательные мутанты, такие как мутанты со сдвигом рамки считывания или нонсенс-мутациями, могут быть легко элиминированы путем отбора лекарственной устойчивости, а кандидаты, несущие желательные миссенс-мутации, могут быть легко идентифицированы спомощью скрининга Y2H4. В данной статье представлен протокол выделения мутантов с нулевым взаимодействием/поврежденных белков, представляющих интерес, с использованием этой стратегии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Построение библиотеки мутантов

  1. Настройте полимеразную цепную реакцию (ПЦР) (пример приведен ниже). Как правило, готовят 50 мкл реакции, которую делят на десять аликвот по 5 мкл, и амплифицируют фрагмент гена-мишени в ПЦР-машине4.
    Примечание: Пользователи должны выбрать подходящую полимеразу для эффективного введения мутаций. Если фрагмент ДНК, подлежащий амплификации, короткий, то необходима полимераза с более высокой частотой ошибок, такая как Taq-полимераза, которой не хватает корректурной активности. Если фрагмент ДНК, подлежащий амплификации, длинный, то для уменьшения количества мутаций необходима полимераза более высокой точности. Мутации происходят каждые несколько сотен пар оснований после 30 циклов амплификации обычной Taq-полимеразой4. В репрезентативных результатах была использована другая Taq-полимераза (см. Таблицу материалов), которая имеет более высокую точность, чем обычная Taq-полимераза, а частота мутаций составила 1 на 600 пар оснований. Пример ПЦР-смесей, детали праймера и условия реакции приведены в Дополнительном файле 1.
  2. Когда ПЦР будет завершена, объедините все аликвоты реакции, подтвердите, что интересующие фрагменты ДНК были амплифицированы с помощью электрофореза в агарозном геле и т.д., и очистите ДНК5.
  3. Соберите фрагмент ДНК, сгенерированный на шаге 1.2, с помощью соответствующего вектора Y2H, используя «бесшовную» стратегию клонирования (рис. 1).
    Примечание: Бесшовная система клонирования, такая как Gibson assembly6, сводит к минимуму загрязнение сконструированной мутантной библиотеки пустыми векторами, сгенерированными с помощью самолигирования. Список векторов Y2H представлен в таблице 1. Они могут быть приготовлены путем разложения BamHI перед сборкой. Все плазмиды доступны в рамках Национального проекта «Биоресурс» - дрожжей (см. Таблицу материалов).
  4. Вводят реакционную смесь, полученную на стадии 1.3, в компетентные клетки Escherichia coli , приготовленные в соответствии с высокоэффективным протоколом трансформации E. coli (например, Inoue et al.7). Распределите все компетентные клетки на нескольких LB-планшетах (1% триптон, 0,5% экстракт дрожжей, 1% NaCl и 2% агар), содержащих соответствующие антибиотики (см. Таблицу материалов). На этом этапе распределите небольшое количество (~1/100 от общей реакции) на ту же выборочную пластину, чтобы рассчитать титр библиотеки. Инкубируйте пластины при температуре 37 °C в течение ночи.
  5. Как только появилось большое количество колоний кишечной палочки , соскребите все клетки с поверхности пластины с помощью одноразовой пластиковой петли. Восстановите плазмидную ДНК из этих клеток с помощью популярных методов, таких как щелочной лизис8. При этом подсчитайте количество колоний, которые появляются после нанесения на тарелку небольших аликвот смеси для трансформации. Используя это число, оцените общее количество независимых клонов в библиотеке.
    Примечание: На этом этапе выберите несколько независимых колоний (4-6), которые появляются на пластине, на которой были распределены небольшие аликвоты реакции трансформации, культивируйте их отдельно и выделите из них плазмиды, чтобы подтвердить, что практически все клоны несут желаемыефрагменты ДНК. Существует множество коммерческих наборов для выделения плазмид из E. coli. Количество колоний, которые появляются на пластине после раскладывания мелких аликвот, можно посчитать вручную.
  6. Измерьте концентрацию библиотечного пула ДНК. Обычно нескольких сотен нанограммов библиотечной ДНК достаточно для получения нескольких тысяч трансформантов на следующем этапе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется измерять концентрацию ДНК с помощью флуоресцентного красителя, который связывается с ДНК, поскольку измерение A260 часто бывает неточным.

2. Трансформация дрожжей с помощью мутантной библиотеки и нанесение реплик

  1. Введите мутантную библиотеку в штамм дрожжей хозяина (TAT-7 (L40-ura3)9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)4-HIS3, ura3:(lexAop)8-lacZ) для анализа Y2H с использованием около 100 нг ДНК. Предварительно трансформируйте клетки-хозяева с помощью плазмиды-приманки.
    1. После процедуры трансформации дрожжевые клетки суспензируют в стерильной воде и разложат аликвоты в разном количестве на соответствующие планшеты (обычно это среда СК, в которой отсутствуют лейцин и триптофан: SC-LW [0,67% азота дрожжевого азота, 2% глюкозы, 1,546 г/л двойной дропа-аут смеси -Leu-Trp и 2% агара, см. Таблицу материалов]). Инкубируйте эти планшеты в течение ночи при температуре 30 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный протокол, такой как метод 11 на основе ацетата лития11 с ~5 × 106 логарифмически растущими клетками, достаточен для трансформации дрожжей. Также может быть использован другой метод с высокой эффективностью преобразования, такой как электропорация.
  2. На следующий день, когда появятся крошечные колонии, отбирают пластины с подходящим количеством клеток (500-2000) и делают из них репликации следующим образом.
  3. Положите два листа фильтровальной бумаги на блок-реплику, чтобы сделать несколько реплик (среда — SC-LW и SC-LW, содержащие канамицин) (см. Таблицу материалов). Выдерживать при 30 °C в течение 1-2 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация канамицина (G418) составляет 600 мкг/мл. Не используйте бархат для репликации покрытия, потому что разрешение колоний будет потеряно.
  4. Как только колонии вырастут, сравните пластины и выберите кандидатов. Проведите анализ цвета Y2H (см. шаг 3), если в качестве репортера используется lacZ .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для репортера Y2H lacZ обычно лучше обнаруживает слабое взаимодействие, чем HIS3.

3. Анализ цвета Y2H

  1. Положите лист фильтровальной бумаги, обрезанный заранее до соответствующего размера, на макет пластины, подготовленный с использованием шага 2. Будьте осторожны, чтобы не допустить образования пузырьков воздуха между фильтровальной бумагой и пластиной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте фильтровальную бумагу No 4А или фильтровальную бумагу класса 50 (см. Таблицу материалов). Для цветового анализа могут быть использованы любые SC-LW или SC-LW, содержащие канамициновые пластины, которые изготавливаются методом литического покрытия.
  2. Когда фильтровальная бумага на тарелке полностью смочится (когда цвет фильтровальной бумаги полностью изменится), положите сверху несколько листов бумажного полотенца и сделайте так, чтобы оно соприкасалось с фильтровальной бумагой, чтобы удалить лишнюю влагу. Снимите бумажное полотенце, когда оно впитает воду и изменит цвет. Повторите этот процесс два или три раза.
  3. Подцепите пинцетом края фильтровальной бумаги, быстро снимите ее с плиты, погрузите в жидкий азот и заморозьте. Если жидкий азот недоступен, поместите фильтровальную бумагу на пластиковый лоток колонией вверх и немедленно поместите ее в морозильную камеру (от -20 °C до -80 °C) для полного замерзания.
  4. Снимите замороженную фильтровальную бумагу и положите ее колонией вверх на сухое бумажное полотенце, чтобы оно оттаяло. Сразу после размораживания поместите фильтровальную бумагу колонией вверх на другую фильтровальную бумагу, помещенную на пластиковый лоток или герметичный контейнер и смоченную Z-буфером (60 мМ Na2HPO4, 40 мМ2PO4, 10 мМ KCl и 1 мМ MgSO4, pH 7,0), содержащую X-gal (5-бром-5-хлор-3-индолил-β-D-галактозид) и 2-меркаптоэтанол9 (см. Таблицу материалов). Будьте осторожны, чтобы не допустить образования пузырьков воздуха между верхней и нижней фильтровальной бумагой.
  5. Накройте пластиковый лоток с фильтровальной бумагой и положите его в герметичный контейнер или полиэтиленовый пакет. Закройте герметичный контейнер или полиэтиленовый пакет и выдерживайте его при температуре 37 °C до появления синего цвета.
  6. Когда появится синий цвет, положите фильтровальную бумагу колонией вверх на примерно 500 мкл стоп-раствора (1 M Na2CO3), помещенного на чистый пластиковый лоток. Стоп-раствор быстро впитывается; Поэтому немедленно снимите фильтр, положите его на свежее бумажное полотенце колонией вверх и дайте ему высохнуть.
  7. После того, как бумажное полотенце будет заменено и фильтр достаточно высохнет, используйте сканер или другое устройство для сбора данных.

4. Восстановление и подтверждение клонов-кандидатов

  1. Выберите белые клоны и клоны-кандидаты KanR с оригинальной пластины реплики (или с реплицированной пластиной, которая не использовалась для анализа цвета). Примеры показаны на рисунке 1C. Подтвердите, что клоны-кандидаты являются белыми и имеютKan R , повторно нанеся их в виде небольшого участка на среду SC-LW, содержащую канамицин, и инкубируя при 30 °C в течение 1-2 дней. Сделайте не менее двух сетов или сделайте повторы на следующий день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует выбирать белые колонии, потому что бледно-голубые колонии могут сохранить взаимодействие.
  2. После того, как клоны-кандидаты хорошо вырастут, повторите анализ цвета, по крайней мере, с одной пластиной, созданной на шаге 4.1, как описано на шаге 3, и убедитесь, что они остаются белыми и не становятся синими (рисунок 2A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При повторном нанесении полос кандидатам не переносите большое количество клеток. Слишком большое количество клеток не позволяет различить клоны KanR и KanS .
  3. Возьмите клоны, которые еще белого цвета, и KanR , сгенерированный на шаге 4.2 из остатков пластины, и вырастите их самостоятельно в 1 мл селекционной среды (SC-L или SC-W, в зависимости от того, какой вектор используется для построения библиотеки) в течение ночи при 30 °C.
  4. Перенесите культуру в микропробирку и соберите клетки центрифугированием (~15 000 × г, в течение 10-30 секунд при комнатной температуре). Выделите целую ДНК из клеточной гранулы следующим образом.
  5. Суспендируйте клеточную гранулу в 400 мкл буфера для лизиса (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 мМ NaCl, 10 мМ Tris-Cl (8,0) и 1 мМ ЭДТА), содержащем по 1 мкл 2-меркаптоэтанола и 20 мг/мл зимолязы 100T (см. Таблицу материалов), и инкубируйте при 37 °C в течение 30 мин для расщепления клеточных стенок. В это время аккуратно перемешивайте, переворачивая трубку каждые 5-10 минут.
  6. Когда клеточная суспензия станет непрозрачной или полупрозрачной, добавьте равный объем смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1) и хорошо перемешайте путем вортексирования с умеренной скоростью в течение 10-20 с.
  7. Центрифугируйте микропробирки в микроцентрифуге в течение 5 минут на полной скорости (~15 000 × г при комнатной температуре) и восстановите водную фазу, содержащую ДНК, в новой микропробирке. Добавьте 0,8 объема изопропанола и хорошо перемешайте, перевернув пробирку.
  8. Оставьте пробирку при комнатной температуре на 2-3 минуты, а затем центрифугируйте в микроцентрифуге в течение 4-5 минут на полной скорости (~15 000 × г, при комнатной температуре) для осаждения ДНК.
  9. Удалите надосадочную жидкость и промойте осадок примерно 500 мкл 70% этанола. Удалите этанол полностью и ненадолго высушите осадок.
  10. Добавьте 20 μL TE буфера (10 mM Tris-Cl (8,0) и 1 mM EDTA) в осадок, быстро перемешайте и оставьте пробирку на ночь при комнатной температуре, чтобы осадок растворился.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если пользователи спешат, держите трубки при температуре 37-50 °C. Осадок ДНК растворится через несколько часов.
  11. Как только гранула полностью растворится, трансформируйте кишечную палочку с небольшим количеством этого раствора ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Около 0,5 мкл раствора ДНК достаточно, если используется E. coli с высокой эффективностью трансформации.
  12. Когда появляются колонии кишечной палочки , выберите несколько независимых колоний, культивируйте их и восстановите плазмиды стандартными методами, такими как щелочной лизис.
  13. Введите плазмидную ДНК, полученную на шаге 4.12, в клетки-хозяева Y2H, содержащие плазмиду-приманку. Когда появятся трансформанты, проверьте их по цветовому анализу (они должны казаться белыми) и вестерн-блоттингу4 (они должны экспрессировать белок нужного размера).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Постщелочной метод12 является простым и быстрым способом приготовления цельноклеточного экстракта из дрожжей.
  14. Если выполняются два вышеуказанных критерия, определить сайт мутации клонов с помощью нуклеотидного секвенирования4.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавно было обнаружено, что С-концевая половина белка Pol2 (Pol2-C) взаимодействует с Mcm10. Оба белка необходимы для инициации репликации ДНК и, следовательно, для роста клеток почковающихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Чтобы помочь понять биологическое значение этого взаимодействия, мутанты Pol2-C, которые не имеют взаимодействия с Mcm10 или имеют уменьшенное взаимодействие, были выделены с помощью опис...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье описывается, как изолировать мутанты с нулевым взаимодействием/ослабленные мутанты с помощью анализа Y2H. Такие мутанты являются мощными инструментами для анализа функции интересующего белка. Для выделения таких мутантов ранее были разработаны анализы rY2H путем модификации штамма Y2H-хозяина 2,3. Тем не менее, они не сильно сократили количество рабочей силы. Напротив, мутанты могут быть изолированы с помощью этого метода без значительного количеств...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ю. Танака выполнил техническое усовершенствование Y2H. Эта работа поддерживается грантом JSPS KAKENHI No JP22K06336 и Институтом ферментации в Осаке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,5 М ЭДТА (8,0)Nacalai Tesque Inc.14347-21
10% раствор SDSFujifilm Wako Pure Chemical Corp.313-90275
2-меркаптоэтанолFujifilm Wako Pure Chemical Corp.135-07522
2-пропанолКисида Кемикал Ко. Лтд.110-64785
5-бромо-4-хлор-3-индолил-&бета;-D-галактопиранозид (X-Gal)Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.021-07852
АгарФормедиумAGR60
Ампициллин натрияFujifilm Wako Pure Chemical Corp.68-52-3
Анти-HA-tag mAb-HRP-DirecT   Медицина и Биологические лаборатории Ко. Лтд.M180-7
ДНК из яичек лососяMerck KGaA.D1626
ЭтанолMerck KGaA.9-0770-4-4L-J
Фильтровальная бумага для лифтинга колонии (Grade 50)Whatman, Cytiva1450-090
Фильтровальная бумага для лифта колонии (No4A)Advantec Toyo Kaisha, Ltd.
Фильтровальная бумага для тиражирования (No1)Advantec Toyo Kaisha, Ltd.
G-418 СульфатFujifilm Wako Pure Chemical Corp.075-05962
Соляная кислотаKishida Chemical Co. Ltd.230-37585
KClFujifilm Wako Pure Chemical Corp.163-03545
Дигидрат ацетата литияNacalai Tesque Inc.20604-22
MgSO4• 7H2OFujifilm Wako Pure Chemical Corp.131-00405
Na2HPO4• 12H2ONacalai Tesque Inc.10039-32-4
NaClNacalai Tesque Inc.31319-45
NaH2PO4• 2H2ONacalai Tesque Inc.31717-25
Бумажное полотенцеAS ONE Corp.7-6200-02
Фенол:Хлороформ:Изоамиловый спирт 25:24:1Накалай Теске Инк.25970-56
Плазмидные ДНКНациональный биоресурсный проект - дрожжи (https://yeast.nig.ac.jp/yeast/top.xhtml)
Набор для выделения плазмидNippon Genetics Co. Ltd.FG-90502
Полиэтиленгликоль #4,000Nacalai Tesque Inc.11574-15
SC Двойная дропа-аут смесь -Leu -TrpFormediumDSCK172
Бесшовный комплект для клонирования (In-Fusion сборка)Takara Bio Inc.#639648
Сухое обезжиренное молокоFujifilm Wako Pure Chemical Corp.190-12865
Стрептомицина сульфатFujifilm Wako Pure Chemical Corp.3810-74-0
Taq полимераза (GoTaq Green Master Mixes)Promega Corp.M7122
TRIS (гидроксиметил) аминометанFormediumTRIS01
Triton X-100Nacalai Tesque Inc.12967-45
ТриптонThermoFisher scientific Inc.
Tween 20Nacalai Tesque Inc.35624-15
Экстракт дрожжейThermoFisher scientific Inc.212750
Дрожжевое азотное основание (YNB)FormediumCYN0210
Zymolyase 100TNacalai Tesque Inc.07665-55
0141109000011150211705

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Leanna, C. A., Hannink, M. The reverse two-hybrid system: A genetic scheme for selection against specific protein/protein interactions. Nucleic Acids Res. 24 (17), 3341-3347 (1996).
  3. Vidal, M., Brachmann, R. K., Fattaey, A., Harlow, E., Boeke, J. D. Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (19), 10315-10320 (1996).
  4. Tanaka, S. An efficient method for the isolation of interaction-null/impaired mutants using the yeast two-hybrid technique. Genes Cells. 24 (12), 781-788 (2019).
  5. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. 4th edn. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  6. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  7. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
  8. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
  9. Bartel, P. L., Fields, S. Analyzing protein-protein interactions using two-hybrid system. Meth Enzymol. 254, 241-263 (1995).
  10. Hollenberg, S. M., Sternglanz, R., Cheng, P. F., Weintraub, H. Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system. Mol Cell Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).
  11. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Meth Enzymol. 350, 87-96 (2002).
  12. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  13. Van Deursen, F., Sengupta, S., De Piccoli, G., Sanchez-Diaz, A., Labib, K. Mcm10 associates with the loaded DNA helicase at replication origins and defines a novel step in its activation. EMBO J. 31 (9), 2195-2206 (2012).
  14. Watase, G., Takisawa, H., Kanemaki, M. T. Mcm10 plays a role in functioning of the eukaryotic replicative DNA helicase, cdc45-mcm-gins. Current Biology: CB. 22 (4), 343-349 (2012).
  15. Miyazawa-Onami, M., Araki, H., Tanaka, S. Pre-initiation complex assembly functions as a molecular switch that splits the mcm2-7 double hexamer. EMBO Rep. 18 (10), 1752-1761 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Protein Protein InteractionInteraction Null MutantsMutant ScreeningMutation LibrarySeamless CloningPolymerase Chain ReactionCell Cycle RegulationCyclin Dependent KinasesDNA Replication

Похожие статьи