Выделение мутантов Interaction-Null/Impairment с помощью двухгибридного анализа дрожжей

Взаимодействия между биомолекулами являются самой основной частью биологических явлений. Белок-белковые взаимодействия составляют значительную часть таких взаимодействий. Таким образом, идентификация партнера (партнеров) по взаимодействию представляющего интерес белка имеет решающее значение для дальнейшего выяснения функции представляющего интерес белка/гена. Двухгибридный метод дрожжей (Y2H) является популярным методом выявления белок-белковых взаимодействий in vivo¹. В этой системе два белка (X и Y), взаимодействие которых необходимо проверить, сливаются с ДНК-связывающим доменом (DB) и доменом активации транскрипции (AD) соответственно. Слитый белок DB-X связывается с узнавающей последовательностью домена DB; следовательно, когда белки X и Y взаимодействуют, гибридный белок AD-Y оказывается в непосредственной близости от узнавающей последовательности. Следовательно, активируется транскрипция репортерного гена после узнавающей последовательности. Таким образом, наличие или отсутствие активности репортерного гена может быть использовано для определения наличия или отсутствия белок-белкового взаимодействия¹.

После того, как определен конкретный партнер по взаимодействию с представляющим интерес белком, следует провести дальнейший анализ для выяснения биологической функции взаимодействия. С этой целью, если удастся выделить мутанты белков, которые нарушают или удаляют специфическое белок-белковое взаимодействие, они послужат мощными инструментами. Система Y2H может быть использована непосредственно для изоляции таких мутантов путем скрининга клонов с отрицательным взаимодействием, начиная с «положительного по взаимодействию» клона дикого типа. Для ускорения этого процесса^{были разработаны «}обратные» системы Y2H (rY2H) ^2,3. В системах rY2H штаммы дрожжей-хозяев содержат контрселективные маркерные гены в качестве репортерных генов, что означает, что дрожжевые клетки растут только тогда, когда белки AD-Y и DB-X не взаимодействуют.

Несмотря на то, что системы Y2H и rY2H позволяют изолировать мутанты, отрицательные по отношению к взаимодействию, процесс выделения мутантов является трудоемким, поскольку не все кандидаты, полученные в результате скрининга, несут желаемый тип мутаций (обычно миссенс-мутации). Самая серьезная проблема заключается в том, что значительная часть кандидатов содержит сдвиг рамки считывания или бессмысленные мутации, и необходимо выполнять вестерн-блоттинг, чтобы исключить нежелательные клоны. Для решения этой проблемы были разработаны новые плазмидные^{векторы4}. В этих векторах KanMX, маркер лекарственной устойчивости, расположен вне кадра ниже домена DB или AD. Маркерный ген становится в кадре с доменом DB или AD только тогда, когда в него вставлен интересующий ген. Когда случайная мутация (мутации) вводится в интересующий ген, нежелательные мутанты, такие как мутанты со сдвигом рамки считывания или нонсенс-мутациями, могут быть легко элиминированы путем отбора лекарственной устойчивости, а кандидаты, несущие желательные миссенс-мутации, могут быть легко идентифицированы с^{помощью скрининга} Y2H4. В данной статье представлен протокол выделения мутантов с нулевым взаимодействием/поврежденных белков, представляющих интерес, с использованием этой стратегии.

1. Построение библиотеки мутантов

1. Настройте полимеразную цепную реакцию (ПЦР) (пример приведен ниже). Как правило, готовят 50 мкл реакции, которую делят на десять аликвот по 5 мкл, и амплифицируют фрагмент гена-мишени в ПЦР-машине⁴.
   Примечание: Пользователи должны выбрать подходящую полимеразу для эффективного введения мутаций. Если фрагмент ДНК, подлежащий амплификации, короткий, то необходима полимераза с более высокой частотой ошибок, такая как Taq-полимераза, которой не хватает корректурной активности. Если фрагмент ДНК, подлежащий амплификации, длинный, то для уменьшения количества мутаций необходима полимераза более высокой точности. Мутации происходят каждые несколько сотен пар оснований после 30 циклов амплификации обычной Taq-полимеразой⁴. В репрезентативных результатах была использована другая Taq-полимераза (см. Таблицу материалов), которая имеет более высокую точность, чем обычная Taq-полимераза, а частота мутаций составила 1 на 600 пар оснований. Пример ПЦР-смесей, детали праймера и условия реакции приведены в Дополнительном файле 1.
2. Когда ПЦР будет завершена, объедините все аликвоты реакции, подтвердите, что интересующие фрагменты ДНК были амплифицированы с помощью электрофореза в агарозном геле и т.д., и очистите ДНК⁵.
3. Соберите фрагмент ДНК, сгенерированный на шаге 1.2, с помощью соответствующего вектора Y2H, используя «бесшовную» стратегию клонирования (рис. 1).
   Примечание: Бесшовная система клонирования, такая как Gibson assembly⁶, сводит к минимуму загрязнение сконструированной мутантной библиотеки пустыми векторами, сгенерированными с помощью самолигирования. Список векторов Y2H представлен в таблице 1. Они могут быть приготовлены путем разложения BamHI перед сборкой. Все плазмиды доступны в рамках Национального проекта «Биоресурс» - дрожжей (см. Таблицу материалов).
4. Вводят реакционную смесь, полученную на стадии 1.3, в компетентные клетки Escherichia coli , приготовленные в соответствии с высокоэффективным протоколом трансформации E. coli (например, Inoue et ^al.7). Распределите все компетентные клетки на нескольких LB-планшетах (1% триптон, 0,5% экстракт дрожжей, 1% NaCl и 2% агар), содержащих соответствующие антибиотики (см. Таблицу материалов). На этом этапе распределите небольшое количество (~1/100 от общей реакции) на ту же выборочную пластину, чтобы рассчитать титр библиотеки. Инкубируйте пластины при температуре 37 °C в течение ночи.
5. Как только появилось большое количество колоний кишечной палочки , соскребите все клетки с поверхности пластины с помощью одноразовой пластиковой петли. Восстановите плазмидную ДНК из этих клеток с помощью популярных методов, таких как щелочной лизис⁸. При этом подсчитайте количество колоний, которые появляются после нанесения на тарелку небольших аликвот смеси для трансформации. Используя это число, оцените общее количество независимых клонов в библиотеке.
   Примечание: На этом этапе выберите несколько независимых колоний (4-6), которые появляются на пластине, на которой были распределены небольшие аликвоты реакции трансформации, культивируйте их отдельно и выделите из них плазмиды, чтобы подтвердить, что практически все клоны несут желаемые^{фрагменты ДНК}. Существует множество коммерческих наборов для выделения плазмид из E. coli. Количество колоний, которые появляются на пластине после раскладывания мелких аликвот, можно посчитать вручную.
6. Измерьте концентрацию библиотечного пула ДНК. Обычно нескольких сотен нанограммов библиотечной ДНК достаточно для получения нескольких тысяч трансформантов на следующем этапе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется измерять концентрацию ДНК с помощью флуоресцентного красителя, который связывается с ДНК, поскольку измерение A₂₆₀ часто бывает неточным.

2. Трансформация дрожжей с помощью мутантной библиотеки и нанесение реплик

1. Введите мутантную библиотеку в штамм дрожжей хозяина (TAT-7 (L40-ura3)^9,10 MATa, leu2-3,112, trp1-901, his3-Δ200, ade2-101, gal80Δ, LYS2:(lexAop)_4-HIS3, ura3:(lexAop)_8-lacZ) для анализа Y2H с использованием около 100 нг ДНК. Предварительно трансформируйте клетки-хозяева с помощью плазмиды-приманки.
   1. После процедуры трансформации дрожжевые клетки суспензируют в стерильной воде и разложат аликвоты в разном количестве на соответствующие планшеты (обычно это среда СК, в которой отсутствуют лейцин и триптофан: SC-LW [0,67% азота дрожжевого азота, 2% глюкозы, 1,546 г/л двойной дропа-аут смеси -Leu-Trp и 2% агара, см. Таблицу материалов]). Инкубируйте эти планшеты в течение ночи при температуре 30 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный протокол, такой как метод 11 на основе ацетата лития¹¹ с ~5 × 10⁶ логарифмически растущими клетками, достаточен для трансформации дрожжей. Также может быть использован другой метод с высокой эффективностью преобразования, такой как электропорация.
2. На следующий день, когда появятся крошечные колонии, отбирают пластины с подходящим количеством клеток (500-2000) и делают из них репликации следующим образом.
3. Положите два листа фильтровальной бумаги на блок-реплику, чтобы сделать несколько реплик (среда — SC-LW и SC-LW, содержащие канамицин) (см. Таблицу материалов). Выдерживать при 30 °C в течение 1-2 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация канамицина (G418) составляет 600 мкг/мл. Не используйте бархат для репликации покрытия, потому что разрешение колоний будет потеряно.
4. Как только колонии вырастут, сравните пластины и выберите кандидатов. Проведите анализ цвета Y2H (см. шаг 3), если в качестве репортера используется lacZ .
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для репортера Y2H lacZ обычно лучше обнаруживает слабое взаимодействие, чем HIS3.

3. Анализ цвета Y2H

1. Положите лист фильтровальной бумаги, обрезанный заранее до соответствующего размера, на макет пластины, подготовленный с использованием шага 2. Будьте осторожны, чтобы не допустить образования пузырьков воздуха между фильтровальной бумагой и пластиной.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте фильтровальную бумагу No 4А или фильтровальную бумагу класса 50 (см. Таблицу материалов). Для цветового анализа могут быть использованы любые SC-LW или SC-LW, содержащие канамициновые пластины, которые изготавливаются методом литического покрытия.
2. Когда фильтровальная бумага на тарелке полностью смочится (когда цвет фильтровальной бумаги полностью изменится), положите сверху несколько листов бумажного полотенца и сделайте так, чтобы оно соприкасалось с фильтровальной бумагой, чтобы удалить лишнюю влагу. Снимите бумажное полотенце, когда оно впитает воду и изменит цвет. Повторите этот процесс два или три раза.
3. Подцепите пинцетом края фильтровальной бумаги, быстро снимите ее с плиты, погрузите в жидкий азот и заморозьте. Если жидкий азот недоступен, поместите фильтровальную бумагу на пластиковый лоток колонией вверх и немедленно поместите ее в морозильную камеру (от -20 °C до -80 °C) для полного замерзания.
4. Снимите замороженную фильтровальную бумагу и положите ее колонией вверх на сухое бумажное полотенце, чтобы оно оттаяло. Сразу после размораживания поместите фильтровальную бумагу колонией вверх на другую фильтровальную бумагу, помещенную на пластиковый лоток или герметичный контейнер и смоченную Z-буфером (60 мМ Na₂HPO₄, 40 мМ₂PO₄, 10 мМ KCl и 1 мМ MgSO₄, pH 7,0), содержащую X-gal (5-бром-5-хлор-3-индолил-β-D-галактозид) и 2-меркаптоэтанол⁹ (см. Таблицу материалов). Будьте осторожны, чтобы не допустить образования пузырьков воздуха между верхней и нижней фильтровальной бумагой.
5. Накройте пластиковый лоток с фильтровальной бумагой и положите его в герметичный контейнер или полиэтиленовый пакет. Закройте герметичный контейнер или полиэтиленовый пакет и выдерживайте его при температуре 37 °C до появления синего цвета.
6. Когда появится синий цвет, положите фильтровальную бумагу колонией вверх на примерно 500 мкл стоп-раствора (1 M Na₂CO₃), помещенного на чистый пластиковый лоток. Стоп-раствор быстро впитывается; Поэтому немедленно снимите фильтр, положите его на свежее бумажное полотенце колонией вверх и дайте ему высохнуть.
7. После того, как бумажное полотенце будет заменено и фильтр достаточно высохнет, используйте сканер или другое устройство для сбора данных.

4. Восстановление и подтверждение клонов-кандидатов

1. Выберите белые клоны и клоны-кандидаты Kan^R с оригинальной пластины реплики (или с реплицированной пластиной, которая не использовалась для анализа цвета). Примеры показаны на рисунке 1C. Подтвердите, что клоны-кандидаты являются белыми и имеют^{Kan R} , повторно нанеся их в виде небольшого участка на среду SC-LW, содержащую канамицин, и инкубируя при 30 °C в течение 1-2 дней. Сделайте не менее двух сетов или сделайте повторы на следующий день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует выбирать белые колонии, потому что бледно-голубые колонии могут сохранить взаимодействие.
2. После того, как клоны-кандидаты хорошо вырастут, повторите анализ цвета, по крайней мере, с одной пластиной, созданной на шаге 4.1, как описано на шаге 3, и убедитесь, что они остаются белыми и не становятся синими (рисунок 2A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При повторном нанесении полос кандидатам не переносите большое количество клеток. Слишком большое количество клеток не позволяет различить клоны Kan^R и Kan^S .
3. Возьмите клоны, которые еще белого цвета, и Kan^R , сгенерированный на шаге 4.2 из остатков пластины, и вырастите их самостоятельно в 1 мл селекционной среды (SC-L или SC-W, в зависимости от того, какой вектор используется для построения библиотеки) в течение ночи при 30 °C.
4. Перенесите культуру в микропробирку и соберите клетки центрифугированием (~15 000 × г, в течение 10-30 секунд при комнатной температуре). Выделите целую ДНК из клеточной гранулы следующим образом.
5. Суспендируйте клеточную гранулу в 400 мкл буфера для лизиса (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 мМ NaCl, 10 мМ Tris-Cl (8,0) и 1 мМ ЭДТА), содержащем по 1 мкл 2-меркаптоэтанола и 20 мг/мл зимолязы 100T (см. Таблицу материалов), и инкубируйте при 37 °C в течение 30 мин для расщепления клеточных стенок. В это время аккуратно перемешивайте, переворачивая трубку каждые 5-10 минут.
6. Когда клеточная суспензия станет непрозрачной или полупрозрачной, добавьте равный объем смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1) и хорошо перемешайте путем вортексирования с умеренной скоростью в течение 10-20 с.
7. Центрифугируйте микропробирки в микроцентрифуге в течение 5 минут на полной скорости (~15 000 × г при комнатной температуре) и восстановите водную фазу, содержащую ДНК, в новой микропробирке. Добавьте 0,8 объема изопропанола и хорошо перемешайте, перевернув пробирку.
8. Оставьте пробирку при комнатной температуре на 2-3 минуты, а затем центрифугируйте в микроцентрифуге в течение 4-5 минут на полной скорости (~15 000 × г, при комнатной температуре) для осаждения ДНК.
9. Удалите надосадочную жидкость и промойте осадок примерно 500 мкл 70% этанола. Удалите этанол полностью и ненадолго высушите осадок.
10. Добавьте 20 μL TE буфера (10 mM Tris-Cl (8,0) и 1 mM EDTA) в осадок, быстро перемешайте и оставьте пробирку на ночь при комнатной температуре, чтобы осадок растворился.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если пользователи спешат, держите трубки при температуре 37-50 °C. Осадок ДНК растворится через несколько часов.
11. Как только гранула полностью растворится, трансформируйте кишечную палочку с небольшим количеством этого раствора ДНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Около 0,5 мкл раствора ДНК достаточно, если используется E. coli с высокой эффективностью трансформации.
12. Когда появляются колонии кишечной палочки , выберите несколько независимых колоний, культивируйте их и восстановите плазмиды стандартными методами, такими как щелочной лизис.
13. Введите плазмидную ДНК, полученную на шаге 4.12, в клетки-хозяева Y2H, содержащие плазмиду-приманку. Когда появятся трансформанты, проверьте их по цветовому анализу (они должны казаться белыми) и вестерн-блоттингу⁴ (они должны экспрессировать белок нужного размера).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Постщелочной метод¹² является простым и быстрым способом приготовления цельноклеточного экстракта из дрожжей.
14. Если выполняются два вышеуказанных критерия, определить сайт мутации клонов с помощью нуклеотидного секвенирования⁴.

Недавно было обнаружено, что С-концевая половина белка Pol2 (Pol2-C) взаимодействует с Mcm10. Оба белка необходимы для инициации репликации ДНК и, следовательно, для роста клеток почковающихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae 13,14,15. Чтобы помочь понять биологическое значение этого взаимодействия, мутанты Pol2-C, которые не имеют взаимодействия с Mcm10 или имеют уменьшенное взаимодействие, были выделены с помощью описанного здесь метода.

Библиотека мутаций была построена в соответствии с методом, описанным в шаге 1. Фрагменты ДНК Pol2-C амплифицировали с помощью полимеразы GoTaq и клонировали в вектор Gal4AD (pST2525) с помощью фермента In-Fusion. Количество независимых клонов в библиотеке оценивалось в 5000.

Как описано на шаге 2, ДНК библиотечной плазмиды была введена в штамм Y2H-хозяина TAT-7, который был предварительно трансформирован с помощью плазмиды LexA-Mcm10. Клетки распределяли на планшете SC-LW и реплицировали на планшеты SC-LW и SC-LW+G418 на следующий день. Репликаты подвергали цветовому анализу, как описано на этапе 3. Некоторые из результатов цветового анализа представлены на рисунке 1С.

Сорок семь колоний, которые были белыми по цвету и устойчивыми к G418, были выделены в качестве первых кандидатов из примерно 8500 трансформантов. Они были снова проверены с помощью цветового анализа, и 25 из 47 клонов были подтверждены как белые (Рисунок 2A). Эти 25 клонов были оставлены в качестве кандидатов. ДНК-кандидаты в плазмиды были извлечены из каждого из 25 кандидатов, как описано на шаге 4. Они были повторно введены в клетки-хозяева дрожжей Y2H, содержащие LexA-Mcm10, и протестированы с помощью цветового анализа, в результате чего были отобраны 16 клонов, которым не хватало цвета. Чтобы еще раз подтвердить, что это были миссенс-мутанты Pol2-C, экспрессия белка Pol2-C была подтверждена с помощью вестерн-блоттинга. Двенадцать кандидатов демонстрировали полосу в положении, которое было почти таким же, как у положительного контроля (гибридный белок Gal4AD-HA-Pol2-C-KanMX, рассчитанный m.w.: 158,8 кДа) (рис. 2B). Анализ цвета показал, что эти 12 клонов не взаимодействовали с Mcm10 (рис. 2C). После определения нуклеотидных последовательностей этих клонов было подтверждено, что все они имели миссенс-мутацию (мутации). Количество миссенс-мутаций варьировало от одной до пяти (данные не показаны). В среднем, примерно одна миссенс-мутация происходила на каждые 1000 оснований.

Рисунок 1: Схемы подхода на основе Y2H для скрининга мутантов с нулевым взаимодействием/поврежденными мутантами. (A) Система Y2H. (В) Стратегия выделения мутантов с нулевым взаимодействием/ослабленных мутантов. 1: Вновь сконструированный вектор Y2H содержит копию гена KanMX, расположенную ниже по течению от метки Y2H, домена DB и AD. Важно отметить, что у этого гена KanMX отсутствует стартовый кодон, и он находится вне кадра с меткой Y2H. Таким образом, не ожидается, что ген KanMX будет экспрессироваться из этого вектора. Когда фрагмент ДНК, амплифицированный методом ПЦР, вставляется в вектор, ген KanMX помещается в кадр с меткой Y2H и экспрессируется. Следовательно, только плазмиды, содержащие вставку дикого типа или вставку с миссенс-мутацией (мутациями), могут экспрессировать ген KanMX, который придает устойчивость к G418. Плазмиды с мутацией (мутациями) нонсенса или сдвига рамки считывания не могут экспрессировать ген KanMX. 2: Мутантная библиотека, созданная на шаге 1, вводится в клетки дрожжей хозяина Y2H. Когда появляются трансформеры, изготавливаются реплики. Сравнивая экспрессию репортерного гена (генов) и резистентность к G418, можно выбрать кандидатов на нулевые/нарушенные мутанты. (C) Пример скрининга. Плазмидная библиотека, содержащая Gal4-AD и мутированный с помощью ПЦР фрагмент ДНК Pol2-C, была введена в штамм Y2H-хозяина TAT-7, который был предварительно преобразован с помощью плазмиды LexA-Mcm10. Показаны изображения клеток до (слева) и после (в центре) цветового анализа, а также клеток, выращенных на планшете SC-LW+G418 (справа). Примеры кандидатов на взаимодействие — нулевые/ослабленные мутанты и ложные кандидаты обозначены белыми и черными стрелками соответственно. (D) Последовательность ДНК вокруг сайта клонирования векторов Y2H, векторов AD (вверху) и DB (внизу). Показана последовательность от последних десяти аминокислот (aa) метки Y2H (красный) до порции, соответствующей первым десяти aa метки KanMX (зеленый). Также показаны сайты распознавания SmaI и BamHI. Позиции ПЦР-праймеров показаны внизу, когда сайт BamHI используется в качестве сайта клонирования. Те же праймеры применяются для клонирования интересующего гена в другие плазмиды (pST2303/2523). Эта цифра была изменена по сравнению с Tanaka et al.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Пример процесса скрининга мутантов с нулевым/поврежденным взаимодействием. (A) 47 колоний, выделенных в качестве клонов-кандидатов, как показано на рисунке 1C, были снова выращены на среде SC-LW, содержащей G418, и подвергнуты анализу цвета. +: положительное управление (Wt Pol2-C), -: отрицательное управление (векторное). Клоны-кандидаты под номерами от 1 до 25 культивировались для восстановления плазмид. (В) Плазмиды извлекали из каждого клона-кандидата в (А), вводили в клетки-хозяева Y2H и снова подвергали цветовому анализу. Шестнадцать из них были белыми (не имели цвета). Из них готовили экстракты цельных клеток, а также проводили вестерн-блоттинг моноклональным антителом против HA. Число на панели соответствует числу в пункте (A). Были проведены анализы нескольких независимых плазмидных клонов, выделенных от каждого кандидата, за исключением #6. (C) Результаты анализа цвета для последних 12 клонов. Числа соответствуют номерам в пункте (А). #16, который сохранил взаимодействие с Mcm10, был использован в качестве положительного контроля в цветовом анализе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Список векторов Y2H, содержащих KanMX вне кадра с тегом Y2H.

Дополнительный файл 1: Пример ПЦР-смесей, детали праймера и условия реакции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.