Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Модель жевательной объемной мышечной потери у грызунов для изучения биоинженерных материалов

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66450

⸱

31 мая 2024 г.

 ,  , 
1Division of Plastic and Reconstructive Surgery, University of California San Francisco (UCSF)

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье мы описываем протокол хирургического создания объемной мышечной потери (VML) у крысы-массажиста, обеспечивая воспроизводимую и доступную модель для изучения черепно-лицевых мышечных травм и их лечения с использованием биоматериалов, таких как новый гидрогель.

Аннотация

Черепно-лицевая потеря объемной мышечной массы (ВМЛ) может возникнуть в результате тяжелой травмы, хирургического иссечения, воспаления и врожденных или других приобретенных заболеваний. Лечение черепно-лицевой ВМЛ включает в себя хирургический, функциональный мышечный перенос. Тем не менее, эти процедуры не могут восстановить нормальную функцию, чувствительность или выражение, и чаще всего эти состояния не лечатся. Было проведено очень мало исследований по регенерации скелетных мышц на животных моделях черепно-лицевой ВМЛ. В данной рукописи описывается модель крысы для изучения черепно-лицевой травмы ВМЛ и протокол гистологической оценки биоматериалов при лечении этих травм. Жидкий гидрогель и лиофилизированные каркасы наносятся во время хирургического создания VML, а жевательные масла удаляются в терминальных временных точках до 12 недель с высокой скоростью удержания и незначительными осложнениями. Гематоксилин и эозин (ПЭ), трихром Массона и иммуногистохимический анализ используются для оценки параметров регенерации скелетных мышц, а также биосовместимости и иммуномодуляции. В то время как мы демонстрируем исследование гидрогеля на основе гиалуроновой кислоты, эта модель предоставляет средства для оценки последующих итераций материалов при травмах VML.

Введение

Тяжелая травма, хирургическое иссечение, воспаление и другие приобретенные состояния могут привести к такой степени потери тканей, которая подавляет эндогенные механизмы восстановления скелетных мышц. Потеря резидентных клеток и структур, способствующих первичному регенеративному процессу, может привести к патологическому ремоделированию и фиброзу тканей, что приводит к долгосрочному дефициту функции и чувствительности и называется объемной потерей мышечной массы (VML)1,2,3. Воспалительная реакция на повреждения ВМЛ включает в себя хорошо задокументированный и сложный механизм с участием макрофагов, цитокинов и миогенных клеток, который представляет собой множество теоретических мишеней в регенеративной медицине4. В то время как во многих исследованиях in vitro эти мишени использовались на животных моделях лечения VML конечностей, существует недостаток исследований регенерации скелетных мышц на животных моделях черепно-лицевой VML 5,6,7.

Потеря черепно-лицевой ткани может быть результатом состояний, описанных ранее, а дефицит черепно-лицевой ткани также может возникать при врожденных состояниях, таких как расщелина, которая в некоторых случаях включает в себя истинный объемный дефицит мышечной ткани 8,9. Поскольку мышцы черепно-лицевой области важны для функционирования, а также для эстетического вида, долгосрочные последствия ВМЛ могут иметь значительные психологические последствия. Некоторые аспекты черепно-лицевых скелетных мышц отличаются от скелетных мышц конечностей, полученных из сомитов, включая вариации экспрессии генов, эмбрионального происхождения, фенотипа сателлитных клеток, количества сателлитных клеток, состава волокон и архитектуры 10,11,12,13. Эти вариации могут привести к травмам VML, влияющим на черепно-лицевую мышцу иначе, чем на мышцы, полученные от сомитов14,15. На сегодняшний день подходы тканевой инженерии, показавшие увеличение регенерации в животных моделях ВМЛ конечностей, не были эквивалентно перенесены на черепно-лицевые модели ВМЛ на животных16. Это подчеркивает необходимость оптимизации подходов in vivo к черепно-лицевым моделям VML у животных.

Несмотря на то, что было проведено несколько исследований черепно-лицевой ВМЛ in vivo, исследования невелики, и создание надежного дефекта черепно-лицевой мышцы на животных моделях является сложной задачей 8,13. Kim et al. сообщили о разработке жевательной модели VML для мыши. Тем не менее, это исследование оценивало гистологию только до 28 дней после травмы и имело неясную способность обнаруживать различия в гистологических исходах между временными точками17. Rodriguez et al. сообщили о разработке черепно-лицевой модели VML овец. Тем не менее, они сообщили о высокой вариабельности в экспериментальных группах, что свидетельствует о неоднородности тяжести исходной хирургической травмы. В этой статье мы представляем протокол нашей жевательной модели VML на крысе и демонстрируем его полезность для оценки подходов тканевой инженерии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Данное исследование проводилось в соответствии со всеми применимыми нормами, в том числе с соблюдением рекомендаций, изложенных в Руководстве по уходу за лабораторными животными и их использованию. Программа институционального ухода за животными и их использования UCSF одобрила все процедуры для животных и послеоперационный уход (протокол IACUC #AN195944-01).

1. Хирургия VML

  1. Обезболите самцов крыс Спрэг-Доули в возрасте 12 недель массой тела 276-300 г в герметичном контейнере с использованием изофторновой общей анестезии в дозе 1%-5% перед переводом в стерильное хирургическое поле.
    1. Расположите грызунов на левом боку так, чтобы шея была вытянута в нейтральном положении, а нос вошел в носовой конус с анестезирующим веществом, что позволило бы получить доступ к правой стороне лица.
    2. Конусируйте расход изофлуорана от индукционного до поддерживающего расхода (примерно 2%).
  2. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза грызунов.
  3. Очистите операционное место, окаймленное линией между правым уголком рта, основанием правого уха вверху и углом нижней челюсти от шерсти с помощью крема для депиляции.
    1. Продезинфицируйте операционное место несколько раз круговыми движениями, используя скраб из этанола и бетадина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильная драпировка не используется в этом протоколе, учитывая размер и место доступа. Процедура проводится с использованием асептической техники в соответствии с рекомендациями по уходу за животными.
  4. Сделайте продольный разрез длиной 3-4 см, простирающийся от нижней правой подушечки усов до правого уха.
    1. Приподнимите кожный лоскут, что позволит визуализировать правую жевательную мышцу, а также щечную и нижнечелюстную ветви лицевого нерва (рис. 1A).
    2. Очистите кожу от подлежащей фасции с помощью тупого разделения и удерживайте края кожи в отведенном положении с помощью хирургических зажимов для оптимальной визуализации подлежащей мышцы.
  5. Сделайте поперечный разрез длиной 1-2 см в фасции, перекрывающей переднюю часть массажника. Используйте тупое разделение, чтобы расширить пространство между фасцией и жевательной резиной, с осторожностью сохраняя общую целостность оставшейся фасции.
  6. Используя фасциальный разрез в качестве окна к поверхностному массажисту, создайте круговую травму в мышце размером 5 мм в поперечнике и 5 мм в глубину с помощью стерилизованной одноразовой пункционной биопсии. Убедитесь, что дефект расположен между щечной и нижнечелюстной ветвями лицевого нерва, стараясь не травмировать нервы (Рисунок 1B).
  7. Добавьте биоматериал к кольцевой жевательной травме (рис. 1C).
  8. После того, как средство будет на месте, зашите фасциальное окно, инвестирующее мышцы, с помощью одного монофиламентного шва 5-0, чтобы избежать миграции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Твердые агенты помещаются непосредственно в рану, и ткань может быть нарушена для обеспечения насыщения кровью, в то время как жидкие агенты добавляются и при необходимости получают желатин или немедленно закрываются на месте с помощью фасции, чтобы избежать нежелательного движения. В показанном здесь эксперименте вводится криогель на основе акрилированной гиалуроновой кислоты.
  9. Закройте кожу с помощью простой прерывистой или бегущей подкожной техники мононитью 5-0.
    1. Нанесите клей на кожу поверх швов, чтобы предотвратить расхождение послеоперационного разреза.
  10. Дайте крысам восстановиться в клетке с внешним источником тепла (грелкой под клеткой или стерильными грелками для рук в клетке) и наблюдайте в течение 30 минут после операции.
  11. Разведите антибиотик триметоприм-сульфаметоксазол (200 мг триметоприма и 40 мг сульфаметоксазола в 5 мл) в питьевой воде (5 мл/200 мл воды) и введите его в питьевую воду грызунов в течение 7 дней после операции. Убедитесь, что периоперационная анальгезия проводится в соответствии с протоколами учреждения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании 0,25% подкожного бупивакаина вводили до хирургического разреза, 0,05 мг/кг подкожного бупренорфина вводили до восстановления после анестезии, и 2 мг/кг IP-мелоксикама вводили до восстановления после анестезии и повторно на следующее утро.

2. Жевательный сбор, заморозка и анализ

  1. В заранее определенные моменты времени принесите крыс в жертву, вызвав передозировку химического агента (например, CO2 или анестетика) в камере индукции анестетика.
  2. Подтвердите жертвоприношение грызуна путем проведения двусторонней торакотомии с использованием одного разреза скальпеля через4-е ребро вентрально для пункции легких (двусторонняя торакотомия).
  3. Снова откройте хирургический разрез, чтобы обеспечить визуализацию массажиста, и удалите кожу, лежащую над жевательной мышцей, для облегчения доступа.
  4. Рассеките и удалите жевательную мышцу от нижней челюсти, начиная с отделения под нижним углом. Убедитесь, что рассечение происходит вдоль поверхности кости, чтобы захватить всю толщину жевательной мышцы.
    1. Рассекайте спереди вдоль нижней челюсти, разрезая точку прикрепления сухожилия. Затем рассекайте вдоль скуловой дуги кзади (рисунок 1D). Наконец, рассеките заднее прикрепление, так как существует повышенный риск кровотечения.
  5. Промойте исчерченную жевательную жидкость в 1x PBS при комнатной температуре (RT) и удалите излишнюю влагу, тщательно промокнув образец бумажным полотенцем.
  6. Поместите мышцу в криомолд и погрузите ее в среду для встраивания с оптимальной температурой резки (OCT), при этом передний конец должен быть обращен вниз, а задний — вверх.
  7. Добавьте изопентан в металлическую чашку и охладите ее, погрузив в жидкий азот с осторожностью, чтобы предотвратить попадание жидкого азота.
    1. После того как изопентан достигнет оптимальной температуры (от -140 до -149 °C) и слегка загустеет, подержите криомолд, содержащий ОКТ, и жевательную жидкость частично погруженными в изопентан до тех пор, пока ОКТ не замерзнет. Храните замороженный криомольд на сухом льду до тех пор, пока не переложите в морозильную камеру при температуре -80 °C.
  8. Криосекция замораживает жевательные образцы с ориентацией таким образом, что передний полюс рассекается первым, двигаясь кзади через образец. Установите температуру тканевого блока на -20 °C, а температуру криосекционного лезвия на -15 °C. Для каждых 200 μм вырежьте 4 предметных стекла (2 с участками по 10 μм, 2 с участками 6 μм), прежде чем переместиться на 200 μм дальше, вырезав 4 дополнительных предметных стекла и повторив по всему образцу.
  9. Используйте срезы 10 мкм для гистологического анализа (трихром Массона, гематоксилин и эозин, Пикрозириус Ред и т. д.) и срезы 6 мкм для иммуногистохимии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для гистологии также можно использовать срезы 6 мкм.
  10. Захватывайте изображения с помощью световой или флуоресцентной микроскопии.
  11. Измерьте площади поперечного сечения ~200 мышечных волокон жевательной мышцы с помощью программного обеспечения Image J.

3. Иммуногистохимический анализ

  1. Для иммуногистохимического анализа тяжелой цепи эмбрионального миозина фиксируют предметные стекла в 4% ПФА в течение 1 ч в ЛТ.
  2. Промойте предметные стекла в PBS 3 раза при температуре RT, давая каждой стирке постоять 10 минут.
  3. Пермеабилизируйте ткань, инкубируя предметные стекла с 0,5% Triton X-100 при RT в течение 15 минут.
  4. Промойте предметные стекла в PBS 3 раза при температуре RT, давая каждой стирке постоять 10 минут.
  5. Инкубируйте с первичным моноклональным антителом мышей-хозяев (1:200) в 2% нормальной сыворотке крови коз (NGS) при 4 °C в течение ночи.
  6. Промойте слайды в PBS-Tween 3 раза при температуре RT, давая каждой стирке постоять 10 минут.
  7. Инкубировать с мечеными флуорофорами вторичными антителами против мышей из кролика-хозяина (1:500) в 2% NGS при ЛТ в течение 2 ч.
  8. Промойте слайды в PBS-Tween 3 раза при температуре RT, давая каждой стирке постоять 10 минут.
  9. Установите слайды с помощью 3 капель флуоресцентного крепления DAPI перед установкой покровного стекла.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Исходы оценки черепно-лицевой ВМЛ и регенерации тканей с использованием биоматериалов включают как количественные, так и качественные исходы.

На рисунке 2 показан пример качественной оценки с использованием ранее описанной модели. Наблюдение за ростом мышечных волокон de novo в нашем гидрогеле является качественным положительным результатом (рис. 2A) и предполагает, что биоматериал может обеспечить достаточную архитектурную п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В протоколе есть несколько критических этапов, на которые необходимо обратить особое внимание для достижения оптимального результата. В шаге 1.4 описывается первоначальный разрез и тупое отделение кожи от поверхностной жевательной фасции. Тупое рассечение должно быть сделано непосредственно вдоль кожи ножницами, направленными в сторону от основной мышцы и фасции, чтобы предотвратить зазубрины и непреднамеренное создание окна через фасцию. Следует избегать каудальной стороны поверхностной...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование проводится при поддержке Годичной исследовательской стипендиальной программы UCSF и Программы междисциплинарных трансляционных проектов C-Doctor. Выражаем благодарность членам Лаборатории Померанца и Программы черепно-лицевой биологии Калифорнийского университета в Сан-Франциско за их вклад.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
F1.652 Миозиновая тяжелая цепь (эмбриональная) моноклональное антителоDSHBF1.652
Козье анти-мышиное IgG2b Перекрестно-адсорбированное вторичное антитело, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21242
Козье анти-кроличье IgG (H+L) с высокой степенью перекрестной адсорбции вторичное антитело, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11034
Стандартные биопсийные пункции Integra, одноразовые стандартные биопсийные пуансоны; 5 мм, Диаметр: 0,19 дюйма, 0,5 смIntegra12460411
Монтажная среда с DAPI - водная, FluoroshieldAbcamab104139
Rabbit Anti-Mouse IgG H& L (Alexa Fluor 647) предадсорбированныйAbcamab150127
Сульфаметоксазол/Триметоприм Пероральная суспензия, со вкусом вишни, 473 млMed-Vet InternationalАртикул: RXBAC-SUSP

Ссылки

  1. Gilbert-Honick, J., Grayson, W. Vascularized and innervated skeletal muscle tissue engineering. Adv Healthc Mater. 9 (1), 1900626(2020).
  2. Aguilar, C. A., et al. Multiscale analysis of a regenerative therapy for treatment of volumetric muscle loss injury. Cell Death Discov. 4, 33(2018).
  3. Corona, B. T., Wenke, J. C., Ward, C. L. Pathophysiology of volumetric muscle loss injury. Cells Tissues Organs. 202 (3-4), 180-188 (2016).
  4. Kiran, S., Dwivedi, P., Kumar, V., Price, R., Singh, U. Immunomodulation and biomaterials: Key players to repair volumetric muscle loss. Cells. 10 (8), 2016(2021).
  5. Greising, S. M., Corona, B. T., McGann, C., Frankum, J. K., Warren, G. L. Therapeutic approaches for volumetric muscle loss injury: A systematic review and meta-analysis. Tissue Eng Part B: Rev. 25 (6), 510-525 (2019).
  6. Bosse, M. J., et al. An analysis of outcomes of reconstruction or amputation after leg-threatening injuries. N Engl J Med. 347 (24), 1924-1931 (2002).
  7. Testa, S., et al. The War after war: Volumetric muscle loss incidence, implication, current therapies and emerging reconstructive strategies, a comprehensive review. Biomedicines. 9 (5), 564(2021).
  8. Emara, A., Shah, R. Recent update on craniofacial tissue engineering. J Tissue Eng. 12, 204173142110037(2021).
  9. Dado, D. V., Kernahan, D. A. Anatomy of the orbicularis oris muscle in incomplete unilateral cleft lip based on histological examination. Ann Plast Surg. 15 (2), 90-98 (1985).
  10. Stål, P., Eriksson, P. O., Eriksson, A., Thornell, L. E. Enzyme-histochemical and morphological characteristics of muscle fibre types in the human buccinator and orbicularis oris. Arch Oral Biol. 35 (6), 449-458 (1990).
  11. Raposio, E., Bado, M., Verrina, G., Santi, P. Mitochondrial activity of orbicularis oris muscle in unilateral cleft lip patients. Plast Reconstr Surg. 102 (4), 968-971 (1998).
  12. Cheng, X., Shi, B., Li, J. Distinct embryonic origin and injury response of resident stem cells in craniofacial muscles. Front Physiol. 12, 690248(2021).
  13. Carvajal Monroy, P. L., et al. A rat model for muscle regeneration in the soft palate. PLoS One. 8 (3), e59193(2013).
  14. Ono, Y., Boldrin, L., Knopp, P., Morgan, J. E., Zammit, P. S. Muscle satellite cells are a functionally heterogeneous population in both somite-derived and branchiomeric muscles. Dev Biol. 337 (1), 29-41 (2010).
  15. Pavlath, G. K., Thaloor, D., Rando, T. A., Cheong, M., English, A. W., Zheng, B. Heterogeneity among muscle precursor cells in adult skeletal muscles with differing regenerative capacities. Dev Dyn. 212 (4), 495-508 (1998).
  16. Rodriguez, B. L., Vega-Soto, E. E., Kennedy, C. S., Nguyen, M. H., Cederna, P. S., Larkin, L. M. A tissue engineering approach for repairing craniofacial volumetric muscle loss in a sheep following a 2, 4, and 6-month recovery. PLoS One. 15 (9), e0239152(2020).
  17. Kim, H., et al. Real-time functional assay of volumetric muscle loss injured mouse masseter muscles via nanomembrane electronics. Adv Sci. 8 (17), e2101037(2021).
  18. Schiaffino, S., Rossi, A. C., Smerdu, V., Leinwand, L. A., Reggiani, C. Developmental myosins: expression patterns and functional significance. Skelet Muscle. 5, 22(2015).
  19. Agarwal, M., et al. Myosin heavy chain-embryonic regulates skeletal muscle differentiation during mammalian development. Development. 147 (7), (2020).
  20. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), e51586(2014).
  21. Kim, J. H., et al. Neural cell integration into 3D bioprinted skeletal muscle constructs accelerates restoration of muscle function. Nat Commun. 11 (1), 1025(2020).
  22. Anderson, S. E., et al. Determination of a critical size threshold for volumetric muscle loss in the mouse quadriceps. Tissue Eng Part C Methods. 25 (2), 59-70 (2019).
  23. Kim, J. T., Kasukonis, B. M., Brown, L. A., Washington, T. A., Wolchok, J. C. Recovery from volumetric muscle loss injury: A comparison between young and aged rats. Exp Gerontol. 83, 37-46 (2016).
  24. Guédat, C., Stergiopulos, O., Kiliaridis, S., Antonarakis, G. S. Association of masseter muscles thickness and facial morphology with facial expressions in children. Clin Exp Dent Res. 7 (5), 877-883 (2021).
  25. VanSwearingen, J. M., Cohn, J. F., Bajaj-Luthra, A. Specific impairment of smiling increases the severity of depressive symptoms in patients with facial neuromuscular disorders. Aesthetic Plast Surg. 23 (6), 416-423 (1999).
  26. Versnel, S. L., Duivenvoorden, H. J., Passchier, J., Mathijssen, I. M. J. Satisfaction with facial appearance and its determinants in adults with severe congenital facial disfigurement: A case-referent study. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 63 (10), 1642-1649 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Травма краниофациальных мышцмодель жевательной мышцырегенерация скелетных мышцтканевая инженерияоценка биоматериаловгистологический анализиммуногистохимический анализгидрогелевый скаффолд
Модель жевательной объемной мышечной потери у грызунов для изучения биоинженерных материалов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.