Динамика цАМФ в реальном времени в живых клетках с использованием флуоресцентного дифференциального детектора цАМФ in situ

Summary

Протокол, представленный в этом исследовании, иллюстрирует эффективность дифференциального детектора цАМФ in situ в измерении цАМФ с помощью двух методов. В одном из методов используется 96-луночный планшетный спектрофотометр с ячейками HEK-293. Другой метод демонстрирует отдельные клетки HASM под флуоресцентным микроскопом.

Abstract

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) — это новый биосенсор, который позволяет непрерывно измерять уровни цАМФ в живых клетках. Биосенсор создается из циркулярно переставленного флуоресцентного белка, связанного с шарнирной областью Epac2. В результате создается один флуорофорный биосенсор, который демонстрирует либо повышенную, либо пониженную флуоресценцию при связывании цАМФ. Биосенсор существует в красной и зеленой версиях вверх, а также в зеленой версии вниз, а также в нескольких красных и зеленых версиях, предназначенных для субклеточных мест. Чтобы проиллюстрировать эффективность биосенсора, была использована зеленая версия вниз, которая снижает флуоресценцию при связывании с цАМФ. Продемонстрированы два протокола с использованием этого датчика: один с использованием 96-луночного спектрофотометра, совместимого с высокопроизводительным скринингом, а другой с использованием визуализации одиночных клеток на флуоресцентном микроскопе. На планшете клетки HEK-293, культивируемые в 96-луночных планшетах, стимулировали 10 мкМ форсколином или 10 нМ изопротеренолом, что вызывало быстрое и значительное снижение флуоресценции в зеленом нисходящем варианте. Биосенсор был использован для измерения уровней цАМФ в отдельных клетках гладких мышц дыхательных путей человека (HASM), контролируемых под флуоресцентным микроскопом. Зеленый направленный вниз биосенсор показал аналогичную реакцию на популяции клеток при стимуляции форсколином или изопротеренолом. Этот анализ одиночных клеток позволяет визуализировать местоположение биосенсора при 20-кратном и 40-кратном увеличении. Таким образом, этот биосенсор цАМФ является чувствительным и гибким, что позволяет измерять цАМФ в режиме реального времени как в иммортализированных и первичных клетках, так и в отдельных клетках или популяциях клеток. Эти характеристики делают cADDs ценным инструментом для изучения динамики передачи сигналов цАМФ в живых клетках.

Introduction

Аденозин-3',5'-циклический монофосфат, цАМФ, играет центральную роль в клеточной коммуникации и координации различных физиологических процессов. цАМФ действует как второй посредник, ретранслируя внешние сигналы от гормонов, нейротрансмиттеров или других внеклеточных молекул, чтобы инициировать каскад внутриклеточных событий¹. Кроме того, цАМФ неразрывно связан с различными сигнальными путями, в том числе связанными с рецепторами, связанными с G-белком (GPCR) и аденилатциклазами. Понимание роли цАМФ в передаче клеточной сигнализации имеет основополагающее значение для разгадки сложных механизмов, лежащих в основе нормальных клеточных функций, и разработки потенциальных методов лечения широкого спектра^{заболеваний.}

В прошлом для прямого или косвенного измерения цАМФ использовались различные методы. Они включали радиоактивное мечение клеточных пулов АТФ с последующей очисткой колонки, ВЭЖХ, радиоиммунными анализами и иммуноферментными анализами ^1,2. Эти устаревшие анализы ограничены тем фактом, что они являются конечными измерениями, требующими большого количества образцов для построения зависимых от времени ответов. Совсем недавно были разработаны датчики флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) для создания анализов в живых клетках, производящих динамические данные в режиме реального времени и позволяющих нацеливаться на датчики в различных субклеточных местоположениях. FRET использует два флуорофора, один флуоресцентный донор и один флуоресцентный акцептор, которые при нахождении в непосредственной близости от акцептора флуорофора будут возбуждаться донорским флуоресцентным выходом. Двумя наиболее часто используемыми флуорофорами являются голубой флуоресцентный белок (CFP) и желтый флуоресцентный белок (YFP), поскольку они обладают совместимыми свойствами возбуждения и излучения. В дополнение к CFP и YFP, использование зеленого флуоресцентного белка (GFP) и красного флуоресцентного белка (RFP) обычно используется для биосенсоров FRET. Биосенсоры cAMP FRET работают за счет наличия донора и акцептора на противоположных концах связывающего белка Epac2 cAMP. Связывание цАМФ изменяет подтверждение Epac и увеличивает расстояние между донором и акцепторными флуорофорами ^3,4. Это конформационное изменение обнаруживается потерей FRET, то есть возбуждением акцепторного флуорофора энергией, передаваемой^{от капель} донорного флуорофора3. Несмотря на кажущуюся простоту процесса, существует множество ограничений и проблем с биосенсором FRET для исследований цАМФ⁵. Одним из них является отбор флуоресцентных белков, например, GFP, которые могут димеризоваться естественным образом, снижая таким образом чувствительность⁶. Биосенсоры cAMP на основе FRET были нацелены на конкретные микродомены⁷, но могут быть ограничения из-за большого размера конструкции с двумя флуорофорами⁶. Другой существенной проблемой является низкое отношение сигнал/шум сигналов FRET в результате перекрытия между возбуждением и излучением флуорофора, что приводит к высокой частоте дискретизации и усложнению анализа результатов ^4,5.

Совсем недавно новый биосенсор (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis решил эти и другие ограничения, когда дело доходит до изучения регуляции передачи сигналов cAMP⁸. Одним из важных улучшений является зависимость от одного флуорофора. Это обеспечивает быстрый и эффективный сигнал с более широким динамическим диапазоном и высоким соотношением сигнал/шум. В результате может быть больше точности, так как существует менее широкий диапазон длин волн для прочесывания⁸. Как и FRET-зонды, биосенсор был нацелен на субклеточные места, что позволяет проводить исследования в области теории компартментации и исследовать липидные рафты и не-рафты, а также другие субклеточные^{домены.} Возможно, наиболее важным является пригодность одного флуорофорного биосенсора для высокопроизводительного скрининга, который имеет улучшенную чувствительность и воспроизводимость по сравнению с биосенсорами на основе FRET. Биосенсор упакован в вектор BacMam, что обеспечивает легкую трансдукцию широкого спектра типов клеток и точный контроль экспрессии белков.

Контроль экспрессии с помощью вектора BacMam может быть особенно полезен при анализах с использованием ортологов GPCR различных видов для облегчения интерпретации данных исследований на животных. Кроме того, контроль над экспрессией рецепторов имеет решающее значение для измерения различных степеней эффективности лекарств (например, обратных агонистов и частичных агонистов), а низкие уровни экспрессии рецепторов полезны для имитации низких уровней, обнаруженных в тканях животных. BacMam представляет собой бакуловирусный вектор, который был модифицирован для трансдукции клеток млекопитающих, таких как первичные клеточные культуры и линии HEK-293¹⁰. Доминирующие селективные маркеры позволяют BacMam обеспечивать большую стабильность по сравнению с традиционными плазмидными инфекциями¹¹. Такие селективные промоторы обеспечивают более эффективную доставку и экспрессию генов. Кроме того, добавление трихостатина А (ингибитора гистондеацетилазы) повышает уровень репортерного белка¹¹. Уровни экспрессии можно контролировать с помощью титра используемого вируса BacMam, и они должны быть оптимизированы для каждого типа клеток. В случае этого биосенсора красный или зеленый флуоресцентный белок связан с Epac на N- и C-концах. Когда цАМФ связывается, конформационное изменение в биосенсоре перемещает аминокислоты, прилегающие к флуоресцентному белку. Такой сдвиг перемещает поглощение из анионного состояния в нейтральное состояние с длиной волны 400 нм, тем самым уменьшая флуоресценцию.

В одной клетке экспрессируется 90-120 GPCR, которые реагируют на широкий спектр нейрогуморальных сигналов¹². Таким образом, можно предположить, что по крайней мере несколько десятков GPCR на клетку могут стимулировать или ингибировать цАМФ через Gs или Gi-связь соответственно. Несмотря на то, что был достигнут прогресс в мониторинге этого второго мессенджера в режиме реального времени, такого как FRET, необходимы более эффективные методы. Представлена методология мониторинга синтеза и деградации сигналов cAMP с помощью cADDis в режиме реального времени. Изменение флуоресценции можно контролировать в режиме реального времени с помощью считывателя флуоресцентных планшетов для высокопроизводительных анализов или с помощью флуоресцентного микроскопа для анализа отдельных клеток. Эти методы полезны для решения широкого круга биологических вопросов, касающихся передачи сигналов GPCR через цАМФ.

Protocol

Подробная информация обо всех реактивах и оборудовании, использованных для исследования, приведена в Таблице материалов.

1. Планшетный спектрофотометр высокопроизводительного анализа

1. Посев клеток HEK-293 вектором cADDis BacMam в 96-луночный планшет (день 1)
   1. Расщепляйте и заражайте клетки в вирусном колпаке.
      1. Теплая среда HEK (Таблица 1) и 0,25% трипсин-ЭДТА в водяной бане при температуре 37 °C.
      2. Продезинфицируйте капюшон и материалы, протерев их салфетками, смоченными в этиленоксиде.
      3. Извлеките и выбросьте среду HEK из колбы с помощью серологической пипетки.
      4. Добавьте 5 мл свободного Mg²⁺ и Ca²⁺ DPBS (37 °C) с помощью серологической пипетки. Наклоняйте колбу вперед и назад, чтобы промыть дно с помощью DPBS. Извлеките и утилизируйте DPBS с помощью серологической пипетки.
      5. Трипсинизируйте клетки, добавив 3 мл подогретого 0,25% трипсина-ЭДТА с помощью серологической пипетки. Наклоните колбу, чтобы реагент полностью покрыл дно колбы. Накройте колбу крышкой и дайте реагенту постоять 3-5 минут, чтобы клетки могли отсоединиться от колбы.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот эксперимент оптимизирован для колбы 75 см² ; При использовании аппарата для культивирования другого размера может потребоваться корректировка объема реагентов.
      6. Наберите 5 мл свежей среды, содержащей антибиотики. Вытолкните и вытяните объем колбы, чтобы промыть стенки колбы и физически отделить ячейки.
      7. Соберите общий объем колбы (8 мл) и центрифуги (25 °C) в пробирку объемом 15 мл при давлении 200 x g в течение 5 минут.
      8. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки, стараясь не потревожить гранулу.
      9. Чтобы промыть клетки, не нарушая гранулу, добавьте 500 μL DPBS без Mg²⁺ и Ca²⁺ DPBS на боковую сторону пробирки объемом 15 мл. После осторожного добавления DPBS удалите и выбросьте как можно больше буфера, не повреждая гранулы. Повторите еще раз.
      10. Подсчитайте ячейки и настройте плотность клеток до 250 000 клеток/мл.
      11. Составьте мастер-смесь исходя из того, какие объемы реагентов необходимы на лунку черного прозрачного дна 96-луночного планшета. Это называется «тканевой пластиной». Смотрите тома ниже:
          ПРИМЕЧАНИЕ: Пример 1 лунки (общий объем 200 мкл): 40 мкл биосенсорного вектора BacMam (запас 2 x^{10 10} вирусных генов/мл), 2 мкл трихостатина А (запас 100 мкМ; конечная концентрация 1 мкМ), 158 мкл 250 000 клеток/мл плотности клеток. Пример из 10 лунок (общий объем 2 мл): 400 мкл биосенсорного вектора BacMam (запас 2 x^{10 10} вирусных генов/мл), 20 мкл трихостатина А (запас 100 мкМ), 1580 мкл среды с плотностью клеток 250 000 клеток/мл.
      12. Добавьте 200 μL мастер-смеси на лунку. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5%_CO2 в инкубаторе в течение 24 ч перед запуском на планшете спектрофотометра.
2. Работа на считывателе пластин
   1. На столе осторожно удалите все среды из каждой лунки и замените 180 мкл DPBS с Mg²⁺ и Ca²⁺ при 37 °C.
   2. Осмотрите клетки под микроскопом, чтобы подтвердить их здоровье.
   3. Оберните тарелку алюминиевой фольгой и выдерживайте при температуре 37 °C в течение 30 мин-1 ч.
   4. Во время инкубации подготовьте препараты для считывания при разведении 1:10 (также называемом 10-кратным) для получения желаемой окончательной дозы. Таким образом, готовят 100 мкМ форсколин и 100 нМ изопротеренол.
   5. Добавьте по 60 мкл каждого препарата столбчатым путем в прозрачный 96-луночный планшет (называемый «планшет для лекарств»).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При надлежащем разведении препарата и для оптимизации показаний препараты добавляются в прозрачную 96-луночную пластину, называемую «лекарственной пластиной», которая во время считывания переносится на «тканевую пластину» с помощью 96-мультипипеттора, что позволяет добавлять лекарство во все лунки одновременно и быстро считывать флуоресцентный спектрофотометр.
3. Настройка считывателя флуоресцентных пластин
   1. Отрегулируйте настройки считывателя флуоресцентных пластин.
      1. Режим чтения: флуоресцентный. Тип чтения: кинетический. Показания длин волн: 494 нм и 522 нм.
      2. Время чтения: Введите 3 минуты для исходного флуоресцентного чтения и 7 минут для добавления после приема препарата». Интервал" вводится как 00:00:30 в течение 30 секунд между каждым чтением.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Время чтения может быть оптимизировано и увеличено в зависимости от требуемого времени.
4. Сбор данных
   1. Извлеките тканевую пластину из инкубатора, снимите алюминиевую фольгу и крышку тарелки и поместите тканевую пластину в считыватель тарелок. Закройте ящик для считывателей, чтобы тканевая пластина отдохнула и сбалансировалась до температуры считывателя (37 °C).
   2. Поместите прозрачную 96-луночную пластину (лекарственную пластину) с разведениями препарата под 96-мульти пипетку и потренируйтесь набирать 20 мкл из лунок. Следите за тем, чтобы в кончиках пипеток втягивался равномерный объем препарата.
   3. Запустите «базовый» прогон измерений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 40 RFU или выше считается жизнеспособными данными. Если данные ниже этого значения, эксперимент следует остановить и отменить.
   4. Тканевая пластина будет отделена от считывателя в конце исходного прогона. Быстро и осторожно добавьте 20 μL с прозрачной пластины для лекарства на пластину с черной тканью. Затем быстро приступайте к «лечебному» прогону. Тканевая пластина не должна находиться за пределами считывающего устройства в течение более 30 с после введения лекарственных препаратов.
      Примечание: Если препарат добавляется слишком быстро, клетки отделяются от тканевой пластины, создавая непригодный для использования эксперимент. Кроме того, клетки заражаются светочувствительным зеленым флуоресцентным белком; Таким образом, быстрое и своевременное добавление лекарств и начало второго чтения является обязательным, чтобы не пропустить раннюю часть ответа.
   5. После завершения второго считывания убедитесь, что тканевая пластина извлечена из считывателя и сбор данных завершен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем утилизировать тканевую пластину, рекомендуется убедиться, что клетки все еще прикреплены к пластине. Понаблюдайте за клетками под микроскопом. Если ячейки отделяются, результаты являются недействительными и должны быть отброшены. Эксперимент нужно будет повторить.
   6. Экспортируйте полученные данные в виде файла Excel.
   7. Откройте экспортированные данные для чтения в формате Excel из считывателя табличек и скопируйте и вставьте соответствующую информацию в шаблон преобразования Excel. Данные будут преобразовываться из настроенного считывателя пластин в одну лунку, показания столбцов справа от скопированных данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Столбцы флуоресценции для скважины с течением времени перечислены в RFU (называемое преобразование столбца) и как десятичное изменение относительно показаний RFU при первоначальном чтении (t₀ под названием Delta F). В шаблоне Excel таблица Delta F устанавливается на последнее базовое значение перед добавлением препарата. Это^6-я точка сбора данных.
   8. После преобразования данных скопируйте данные из Delta F и вставьте их в программное обеспечение для анализа данных в виде затухания или относительного затухания флуоресценции с течением времени.
   9. Измените X-title на "time (s)", а Y-title на "ΔF/F₀" для относительных десятичных значений.

2. Анализ одиночных клеток с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа

1. Посев (HASM) клеток вектором cADDis BacMam в чашку диаметром 35 мм (день 1)
   1. Расщепляйте и заражайте клетки в вирусном колпаке.
      1. Теплая среда HASM (Таблица 1), 0,25% трипсин-ЭДТА в водяной бане при температуре 37 °С.
      2. Продезинфицируйте капюшон и материалы и протрите капюшон салфетками, смоченными в EtOH.
      3. Извлеките и выбросьте носители HASM из колбы с помощью серологической пипетки.
      4. Добавьте 5 мл свободного DPBS Mg²⁺ и Ca²⁺ (37 °C) с помощью новой серологической пипетки и наклоните колбу, чтобы промыть дно DPBS.
      5. Трипсинизируйте клетки, добавив 3 мл подогретого 0,25% трипсина-ЭДТА с помощью серологической пипетки. Наклоните колбу, чтобы реагент полностью покрыл дно колбы. Дайте реагенту постоять 3-5 минут, чтобы клетки отделились от колбы.
      6. Наберите 5 мл свежей среды, содержащей антибиотики, и выдавите пипетку, чтобы удалить клетки со дна колбы.
      7. Соберите общий объем колбы (8 мл) центрифуги в центрифужную пробирку при давлении 200 х г в течение 5 минут.
      8. После центрифугирования удалите надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки, стараясь не потревожить гранулу.
      9. Не повреждая гранулу, добавьте 500 мкл DPBS без Mg²⁺ и Ca²⁺ DPBS на боковую сторону центрифужной трубки. Удалите и слейте как можно больше жидкости и повторите еще раз.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот эксперимент оптимизирован для колбы 75 см² ; При использовании аппарата для культивирования другого размера может потребоваться корректировка объема реагентов.
      10. Подсчитайте ячейки и настройте плотность клеток до 40 000 клеток/мл.
      11. Составьте мастер-смесь на основе необходимого объема реагента на лунку 35-миллиметровой чашки. Смотрите тома ниже:
          ПРИМЕЧАНИЕ: Пример 1 лунки (общий объем 500 мкл): 20 мкл биосенсорного вектора BacMam (запас 2 x^{10 10} вирусных генов/мл), 5 мкл трихостатина А (запас 100 мкМ, конечная концентрация 1 мкМ), 500 мкл 40 000 клеток/мл плотности клеток. Пример для 4 лунок (общий объем 2 мл): 80 мкл биосенсорного вектора BacMam (запас вирусных генов/мл), 20 мкл трихостатина А (запас 100 мкМ, конечная концентрация 1 мкМ), 2000 мкл среды 40 000 клеток/мл плотности клеток.
      12. Добавьте 500 мкл мастер-смеси на лунку. Перед продолжением эксперимента инкубируйте клетки при 37 °C и 5%_CO2 в течение 24 часов.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Номер ячейки может варьироваться в зависимости от линии ячейки. Чтобы избежать наложения ячеек для анализа, используйте низкое количество ячеек.
2. Приготовление фармакологических средств (День 2)
   1. Тщательно удалите среду из каждой лунки и замените 450 мкл DPBS с Mg²⁺ и Ca²⁺ при 37 °C.
   2. Оберните пластину алюминиевой фольгой и выдержите диск диаметром 35 мм при температуре 37 °C в течение 30 мин-1 ч.
   3. Осмотрите клетки под микроскопом, чтобы подтвердить их здоровье.
   4. Тем временем подготовьте препараты к считыванию на 1 логическую единицу выше желаемой конечной концентрации (в 10 раз больше). Таким образом, готовят 100 мкМ форсколин и 100 нМ изопротеренол.
   5. Для получения титров логарифмической дозы готовят препарат при 10 мМ и используют серийные разведения для достижения 100 мкМ форсколина и 100 нМ изопротеренола.
3. Сбор данных
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие настройки относятся к флуоресцентному инвертированному микроскопу. Программное обеспечение, прилагаемое к каждому микроскопу, может отличаться; Общие настройки, используемые в текущем протоколе, описаны здесь.
   1. Включите центральный узел, затем инвертированный флуоресцентный микроскоп.
   2. Откройте программное обеспечение, которое будет использоваться для захвата, и выберите опцию покадровой съемки .
   3. Поместите держатель для образцов чашки диаметром 35 мм в предметный столик микроскопа.
   4. Установите объектив на х20.
   5. Используйте автофокус и получите максимально четкую картинку. Если трудно найти отдельные ячейки, начните с цели 4x, затем переходите к 20x. Сфокусируйте образец вручную, если в микроскопе отсутствует функция автофокусировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение в 40x может быть использовано, если требуется более значительная морфологическая детализация клетки.
   6. Отрегулируйте следующие параметры для получения оптимальных данных: Автояркость (экспозиция), Длина волны возбуждения, Баланс черного (для уменьшения фонового шума), Автофокус.
   7. После нахождения области обзора с несколькими цитоплазматическими флуоресцирующими клетками получайте данные с помощью покадровой съемки в течение 20 минут каждые 30 секунд.
   8. Нажмите на кнопку «Перейти », чтобы начать чтение.
   9. Бегите 3 минуты, чтобы собрать базовый уровень. Как только будет сделан 3-минутный захват, аккуратно добавьте 50 мкл препарата в соответствующую лунку. Когда препараты будут добавлены, конечная концентрация на чашке составит 10 мкМ форсколина и 10 нМ изопротеренола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Препарат необходимо добавлять осторожно; Не прикасайтесь к пластине наконечником пипетки, так как это может сместить поле зрения и сделать образец невозможным для анализа.
   10. Оставьте эксперимент на 17 минут с захватом данных каждые 30 секунд.
   11. После завершения теста убедитесь, что данные готовы к анализу.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя текущий протокол не включает в себя контроль дрейфа фокуса, может быть полезно включить его в эксперимент. Например, использование ядерных красителей может помочь в управлении фокальным дрейфом во время микроскопического анализа, особенно при получении изображений живых клеток в течение длительного времени. Биосенсоры cADDis обычно широко распределены внутри клетки, что делает широкую фокальную плоскость наиболее эффективным захватом и снижает потребность в контроле дрейфа фокального⁹.
4. Анализ данных
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение, поставляемое с каждым микроскопом, может отличаться, поэтому общие настройки, которые следует использовать для анализа полученных изображений, описаны здесь.
   1. Откройте файлы изображений, снятые во время эксперимента.
   2. Используйте инструмент Полигон или круг для выбора области интереса каждой ячейки для выполнения анализа. Анализ должен дать яркость каждой ячейки в каждый момент времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего выбирать отдельные клетки, а не клетки, соприкасающиеся со стенкой чашки или другими клетками. Это обеспечивает наилучший сбор данных. Выберите минимум 5 клеток для анализа в каждом условии и повторите эксперимент не менее трех раз.
   3. После анализа данных откройте данные на листе Excel и рассчитайте среднюю яркость для каждого условия на каждой фотографии, начиная с изображения непосредственно перед добавлением фармакологических агентов или транспортного средства. В данном примере на отметке 3 минуты или на^6-м снимке, сделанном на микроскоп, так как каждый снимок делается каждые 30 секунд.
   4. Вычислите ΔF/F₀ для каждого среднего значения в каждом условии.
   5. Загрузите в программу статистического анализа и постройте график зависимости ΔF/F₀ от времени в с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлен схематический обзор основных этапов протоколов.

Results

В настоящем исследовании цитозольный биосенсор был валидирован как в тестах планшетов, так и в анализах микроскопа. После того, как клетки экспрессировали биосенсор, их стимулировали либо 10 мкМ форсколином (прямым активатором аденилатциклазы), 10 нМ изопротеренолом (агонистом при ß₁AR и ß₂AR), либо носителем (рис. 1). Последующие изменения флуоресценции, свидетельствующие о продукции цАМФ, регистрировались каждые 30 с.

Данные преобразовывали как изменение флуоресценции от исходной флуоресценции (ΔF/F₀). К флуоресцентным данным была применена модель распада с одним сайтом для количественной оценки временных изменений уровней цАМФ в различных условиях (рис. 2 и рис. 3). Параметры этих кривых распада могут быть использованы для количественной оценки реакции на заданную концентрацию препарата. Было использовано произведение скорости распада (k) и плато в качестве единой величины, которая количественно определяет реакцию на лекарственное средство, и они были использованы для создания кривых концентрация-реакция при применении нескольких концентраций одного и того же лекарственного препарата¹³.

На планшетном ридере при стимуляции 10 мкМ форсколина цитозольный сенсор показал значительное снижение интенсивности флуоресценции в течение нескольких секунд и прогрессировало в течение многих минут (от исходного уровня 0 ΔF/F_o через 200 с до -0,7 ΔF/F_o через 600 с) в клетках HEK-293 (рис. 2A). Учитывая конструкцию зеленого сенсора, снижение флуоресценции указывает на увеличение продукции цАМФ, что указывает на то, что форсколин вызывал равномерное повышение уровня цАМФ в цитозоле. Стимуляция клеток HEK-293 субмаксимальной концентрацией изопротеренола (10 нМ) приводила к быстрому, но меньшему снижению флуоресценции биосенсора (-0,3 ΔF/F_o через 600 с, рис. 2A). Когда эти более низкие концентрации изопротеренола (10 нМ и 100 нМ) были исследованы в одной лунке клеток с течением времени, колебания уровней цАМФ наблюдались в клетках HEK-293 (рис. 2B). Периодичность этих колебаний постоянно составляла около 200 с. Рутинный анализ данных включает в себя подгонку реакции к модели затухания одного сайта, которая усредняет эти колебания (см. соединительную линию). Усреднение нескольких экспериментов вместе обычно приводило к тому, что эти колебания становились затемненными в данных. Тем не менее, биосенсор демонстрирует чувствительность и быструю кинетику, которые позволяют наблюдать колебания цАМФ.

cADDis также можно измерить с помощью флуоресцентного микроскопа. Этот подход позволяет контролировать цАМФ в отдельных клетках, а также может быть адаптирован для визуализации биосенсоров, нацеленных на различные субклеточные места. В настоящем исследовании биосенсор был использован в первичных клетках гладких мышц дыхательных путей человека (HASM). Стимуляция HASM любым носителем, 10 мкМ форсколином или 10 нМ изопротеренолом приводит к наблюдаемому снижению интенсивности флуоресценции с течением времени (от исходного уровня 0 ΔF/F_o через 120 с до -0,9 ΔF/F_o через 410 с) (Рисунок 3) (Видео 1, Видео 2 и Видео 3). Флуоресценция равномерно распределяется по всему цитозолю клеток и исключает ядро (см. видео с интервальной съемкой). Таким образом, форсколин и изопротеренол вызывали аналогичное быстрое и значительное снижение флуоресцентных HASM-клеток. Эти данные демонстрируют возможность использования биосенсора в первичных клеточных культурах.

Рисунок 1: Схематическое изображение этапов протокола биосенсора. Первоначально клетки культуры расщепляют и ресуспендируют свежей средой, а затем заражают вирусом BacMam, несущим сенсоры cADDis. Клетки после трансфекции стимулируются фармакологическими агентами, запускающими клеточные пути, которые изменяют цАМФ. Изменения интенсивности флуоресценции в ответ на изменение концентрации цАМФ регистрируются с помощью спектрофотометра (А) или флуоресцентного микроскопа (В), что позволяет количественно оценить динамику цАМФ в режиме реального времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Мониторинг цАМФ в реальном времени в живых ячейках HEK-293 на пластинчатом спектрофотометре. Флуоресценция клеток HEK-293 на 96-луночных планшетах, экспрессирующих биосенсор, измерялась с течением времени. После установления исходного уровня флуоресценции распад флуоресценции контролировали в течение 7 мин. (A) Распад флуоресценции после добавления либо 10 мкМ форсколина, либо 10 нМ изопротеренола был построен в виде среднего ± SEM для 10-15 экспериментов. (B) Колебания флуоресцентного затухания показаны путем построения графика одного эксперимента после добавления либо 10 нМ, либо 100 нМ изопротеренола. Данные на обоих графиках подгоняются под одну модель разрушения сайта (соединительная линия). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Мониторинг цАМФ в живых клетках HASM в режиме реального времени на флуоресцентном микроскопе. Флуоресценция HASM-клеток на пластинчатых 35 мм чашках, экспрессирующих биосенсор, измерялась с течением времени. После установления исходных значений затухание флуоресценции измеряли каждые 30 с в течение 20 минут. Указанное средство добавлялось через 120 с (стрелка). Кривые затухания флуоресценции биосенсора изменяются в ответ на носитель, 10 мкМ форсколин или 10 нМ изопротеренол. Данные одного эксперимента показаны соединительной линией. Покадровые видео клеток, обработанных транспортным средством (контроль), форсколином или изопротеренолом, включены для обеспечения визуального представления флуоресцентных реакций биосенсора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Видео 1: Покадровая видеосъемка мониторинга cAMP в реальном времени в живых ячейках HASM в ответ на транспортное средство. Кривые затухания флуоресценции биосенсора в ответ на транспортное средство (управление). Каждый кадр захватывался каждые 30 с в течение 20 минут. Масштабная линейка: 40 μM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Видео 2: Покадровая видеосъемка мониторинга цАМФ в реальном времени в живых клетках HASM в ответ на 10 мкМ форсколин. Кривые затухания флуоресценции биосенсора в ответ на 10 мкМ форсколин. Каждый кадр захватывался каждые 30 с в течение 20 минут. Масштабная линейка: 40 μM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Видео 3: Покадровое видео мониторинга цАМФ в реальном времени в живых клетках HASM в ответ на 10 нМ изопротеренол. Кривые затухания флуоресценции биосенсора в ответ на 10 нМ изопротеренол. Каждый кадр захватывался каждые 30 с в течение 20 минут. Масштабная линейка: 40 μM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Рецептура на носителях
HASM средний
Имя	Том
F-12K Хэма	419,65 мл
ФБС	50 мл
ГЕПЕС (1М)	12,5 мл
Раствор гидроксида натрия	6 мл
L-глутамин 200 мМ (100X)	5 мл
Хлорид кальция (1 М)	0,850 мл
Антибиотик-антимикотик (100X)	5 мл
Примоцин	1 мл
ХЭК средний
Имя	Том
DMEM (1шт.)	444 мл
ФБС	50 мл
Антибиотик-антимикотик (100X)	5 мл
Примоцин	1 мл

Таблица 1: Состав среды HASM и среды HEK.

Discussion

Точное и чувствительное измерение цАМФ имеет решающее значение для понимания его роли в различных клеточных процессах и для изучения активности цАМФ-зависимых сигнальных путей. Существует несколько методов, обычно используемых для измерения уровня цАМФ, включая ИФА, радиоиммунный анализ, биосенсоры FRET и анализ цАМФ GloSensor 14,15,16,17,18. Каждый анализ цАМФ имеет сильные и слабые стороны. Протокол позволяет обнаруживать и контролировать в режиме реального времени, от нескольких минут до нескольких часов, а также измерять динамику цАМФ в живых клетках без необходимости включения ингибиторов фосфодиэстеразы. Этот последний момент имеет решающее значение для исследователей, заинтересованных в изучении роли изоформ фосфодиэстеразы в регуляции передачи сигналов цАМФ19. Биосенсор доступен в продаже (см. Таблицу материалов) в нескольких версиях: зеленый флуорофор, который снижает флуоресценцию при связывании с цАМФ, красный флуорофор, который демонстрирует повышенную флуоресценцию при связывании с цАМФ, и зеленый флуорофор, который демонстрирует повышенную флуоресценцию при связывании с цАМФ. Нисходящая версия биосенсора наиболее полезна, поскольку основным ограничивающим фактором является уровень экспрессии биосенсора, и эта версия будет демонстрировать максимальную флуоресценцию на исходном уровне до начала эксперимента, уменьшая необходимость оценки экспрессии биосенсора путем добавления максимального стимула цАМФ. Биосенсор также доступен в версиях, предназначенных для мембранных микродоменов, первичных ресничек или ядра. Эти различные версии позволяют измерять цАМФ одновременно в цитозольном и мембранном/цилиальном компартментах в одной и той же клетке. Эти новые инструменты обладают уникальными возможностями для визуализации и количественной оценки динамики цАМФ в различных клеточных компонентах, что является быстро развивающейся и важной областью исследований²⁰.

Биосенсоры предлагают простой метод эффективного мониторинга динамики цАМФ в режиме реального времени, позволяя исследователям наблюдать быстрые изменения уровней цАМФ с исключительным временным разрешением. Одним из ключевых преимуществ биосенсора является его высокая чувствительность, которая позволяет обнаруживать как незначительные, так и значительные колебания концентраций^цАМФ8. Примером этого в осцилляциях цАМФ являются низкие уровни изопротеренолового стимула в клетках HEK-293 без присутствия ингибитора фосфодиэстеразы (рис. 2B). Это колебательное поведение не изучено и, по-видимому, уникально для этих клеток, но чувствительность и быстрая кинетика биосенсора позволяют их обнаружить. Однако следует отметить, что биосенсор может быть легко насыщен, поэтому его биосенсор может быть ограничен в количественной оценке различий между сигналами среднего и большого цАМФ. Эта ограничивающая характеристика особенно актуальна при использовании ингибиторов фосфодиэстеразы, которые вызывают глобальное повышение уровня цАМФ при наличии рецепторного стимула. Несмотря на то, что в этом исследовании мы представляем инфекцию HASM, важно признать проблему, связанную с заражением первичных клеток с использованием вектора BacMam. Условия должны быть оптимизированы для отдельных типов клеток, чтобы достичь достаточной экспрессии биосенсора. Тем не менее, чувствительность и масштабируемость биосенсора делают его хорошо подходящим для высокопроизводительных анализов.

Еще одним улучшением использования этого биосенсора по сравнению с сенсорами на основе FRET является минимизация фотообесцвечивания. Многие флуоресцентные биосенсоры подвержены фотообесцвечиванию после длительного и многократного возбуждения. Описанные здесь протоколы включают кратковременные возбуждения, которые происходят с интервалом в 30 с. Биосенсор также чрезвычайно яркий, что ограничивает потенциальное фотообесцвечивание для этого типа анализа. Фотообесцвечивание будет наблюдаться во время начальной базовой линии в виде дрейфа. Если бы произошел дрейф базовой линии, можно было бы вычесть дрейфующую базовую линию из данных перед подгонкой кривой или увеличить интервал выборки, чтобы уменьшить частоту возбуждения.

Как и другие цАМФ-биосенсоры, этот биосенсор обладает высокой специфичностью для связывания с цАМФ. Следовательно, сигналы, генерируемые этим анализом, напрямую коррелируют с уровнями цАМФ, что значительно снижает потенциальные помехи от других компонентов клетки и обеспечивает надежные результаты. Кроме того, стоит отметить универсальность биосенсора. Несмотря на то, что анализ GloSensor широко используется в полевых условиях, он имеет определенные ограничения. Например, использование транзиторной трансфекции может привести к снижению эффективности в определенных типах клеток, а анализ нескольких параметров или процессов в одной и той же клетке представляет собой сложную задачу. Кроме того, анализ основан на ферментах люциферазе, на которые могут влиять определенные соединения, что потенциально может привести к снижению точности результата²¹. С другой стороны, биосенсор может быть использован в различных типах клеток и экспериментальных системах, включая адгезивные и суспензионные клетки. Его совместимость с различными клеточными контекстами позволяет исследователям исследовать динамику цАМФ в различных биологических системах 22,23,24. Интеграция этого биосенсорного анализа с флуоресцентной микроскопией еще больше повышает его полезность, поскольку также может быть собрана клеточная морфологическая информация 25,26,27.

Этот анализ обеспечивает исследователям большую гибкость в планировании экспериментов, позволяя проводить широкий спектр исследований, связанных с передачей сигналов цАМФ. Он служит нескольким целям, позволяя измерять базальные уровни цАМФ, изучать колебания цАМФ в ответ на различные стимулы или методы лечения, а также исследовать динамику цАМФ при различных физиологических или патологических состояниях. Одним из ключевых преимуществ анализа является его совместимость с другими методами, что позволяет получить более полное представление о передаче сигналов цАМФ. Комбинируя биосенсор с такими методами, как иммунофлуоресцентное окрашивание или генетические манипуляции^, исследователи могут получить более глубокое представление о точной пространственной и временной регуляции цАМФ в конкретных клеточных компартментах или сигнальных путях. Благодаря этой интеграции исследователи могут исследовать различные функции цАМФ в различных контекстах, что приводит к ценному пониманию сложностей клеточных процессов, опосредованных цАМФ. Использование этих методов позволяет исследователям визуализировать и количественно оценить уровни цАМФ как на уровне отдельной клетки, так и на уровне популяции, предлагая всестороннее понимание его распределения внутри клетки, включая идентификацию пулов цАМФ. В результате, комбинация этих методов позволяет получать точные данные, внося значительный вклад в наши знания о сигнализации cAMP.

В то время как традиционные методы были полезны для анализа цАМФ, внедрение cADDis представляет собой многообещающий прогресс в этой области. Его специфичность, чувствительность и возможности работы в режиме реального времени делают его ценным дополнением к набору инструментов исследователя, особенно благодаря его совместимости с живыми клетками. Благодаря возможности мониторинга уровня цАМФ в режиме реального времени и его высокой чувствительности биосенсор дает значительное преимущество в различных экспериментальных условиях. Этот прогресс способствует более глубокому пониманию динамической природы передачи сигналов цАМФ и ее функционального влияния как на физиологические, так и на патологические процессы.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-луночная тарелка (прозрачная)	Fisherbrand	21-377-203
35-миллиметровая тарелка	Greiner Bio-One	627870	Чашки для клеточных культур со стеклянным дном
96-луночная тарелка	Corning	3904	Black с прозрачным плоским дном
Антибиотик-антимикотик (100x)	Gibco	15240062	Для сред HEK и HASM
Флуоресцентный микроскоп BZ-X Keyence
Хлорид кальция (IM)	Quality Biological Inc	E506	Для сред HASM
Центрифужная пробирка (15 мл)	Thermo Scientific	339651
DMEM ( 1x)	Gibco	11965092	HEK media
DPBS с Mg2+ и Ca2+	Gibco	14040-133
DPBS без Mg2+ и Ca2+	Corning	14040-133
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	R& D системы	S11195	Для сред HEK и HASM
Forskolin	Millipore	344270	Drug
Green Down cADDis cAMP Assay Kit	Montana Molecular	#D0200G	Реагент
Ham's F-12K	Gibco	21127022	Для сред HASM
HEPES (1M)	Gibco	15630080	Для сред HASM
Isoproterenol	Sigma	I6504	Препарат
L-глютамин 200 мМ (100x)	Gibco	25030-081	Для сред HASM
Микроцентрифужная пробирка (2 мл)	Eppendorf	22363352
Primocin	Invitrogen	ant-pm-1	Антибиотик для HASM среды
РНКсе прочь	Thermo Scientific	700511	Реагент
Раствор гидроксида натрия	Sigma	S2770	Для HASM
среды Spectrmax M5 планшетный ридер	Молекулярные устройства Трихостатин
А	TCI America	T2477	Реагент
Трипсин ЭДТА	Gibco	25200-056	Реагент