Методическая статья

Быстрое выделение ооцитов I стадии у рыбок данио-рерио, лишенных гранулезных клеток

DOI:

10.3791/66458

⸱

26 июля 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery and Laboratory of Pediatric Surgery, West China Hospital / West China School of Medicine, Sichuan University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает модифицированную процедуру быстрого выделения чистых ооцитов стадии I у рыбок данио, лишенных гранулезных клеток, тем самым обеспечивая удобный метод для исследования, специфичного для ооцитов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изучение развития ооцитов имеет важное значение для биологии развития. Данио рерио (Danio rerio) широко использовалась в качестве модельного организма для исследования ранних процессов развития от ооцита до эмбриона. У рыбок данио ооциты окружены одним слоем соматических гранулезных клеток. Тем не менее, отделение гранулезных клеток от ооцитов представляет собой сложную задачу, поскольку получение чистых ооцитов имеет решающее значение для точного анализа. Несмотря на то, что были предложены различные методы выделения ооцитов данио-рерио на разных стадиях развития, современные методы не позволяют полностью удалить гранулезные клетки, что ограничивает точность анализа генома, сосредоточенного исключительно на ооцитах. В этом исследовании мы успешно разработали быстрый и эффективный процесс выделения чистых ооцитов I стадии у рыбок данио-рерио с одновременным устранением загрязнения гранулезных клеток. Этот метод облегчает биохимический и молекулярный анализ, особенно при изучении эпигенетических аспектов и структуры генома, специфичных для ооцитов. Примечательно, что метод удобен в использовании, сводит к минимуму повреждение ооцитов и обеспечивает практическое решение для последующих исследований и анализов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рыбки данио рерио являются одной из наиболее важных модельных систем в биологии развития. В последние годы в многочисленных исследованиях рыбки данио использовались в качестве модели для изучения важных биологических событий и регуляторных процессов от ооцита до эмбриона. Они охватывают сложные процессы развития исозревания ооцитов1, функциональность материнскихгенов2, регуляцию материнско-зиготическихпереходов3, а также обширный омиксныйанализ4.

Гранулезные клетки, соматические клетки, обволакивающие и питающие развивающийся ооцит в фолликуле яичника 5,6, играют ключевую роль в этом процессе развития. По мере того, как первичные половые клетки (ПГК) эволюционируют в оогонию, они оказываются окружены монослоем гранулезных клеток7. Вместе с внешними текальными клетками ооцит и окружающие его гранулезные клетки образуют зрелый фолликул8. Учитывая фундаментальное различие между половыми клетками и соматическими клетками, получение чистого образца ооцитов является обязательным условием, особенно для анализов, связанных с геномом.

В фолликулярной структуре рыбок данио гранулеза обычно имеют диаметр всего внесколько микрон8, что подчеркивает тесную взаимосвязь между гранулезными клетками и ооцитами9. Эта тесная связь представляет собой проблему для достижения полного разделения из-за значительной разницы как в количестве, так и в объеме гранулезных клеток по сравнению с ооцитами (сотни гранулезных клеток по сравнению с одним ооцитом)10,11. Даже минимальное загрязнение одной гранулезной клеткой может препятствовать последующему анализу, специально нацеленному на ооциты. Поэтому для исследований, посвященных геномным и эпигенетическим характеристикам, элиминация гранулезных клеток имеет важное значение.

Благодаря хорошо охарактеризованным морфологическим критериям ооциты на каждой стадии могут быть различимы на основе диаметра11. Процесс оогенеза у рыбок данио делится на пять стадий в соответствии с морфологией и кариотипом11. Ооциты I стадии (диаметр 7-140 мкм) охватывают ооциты с начала мейоза до ранней стадии мейоза I. Важно отметить, что эти ооциты прозрачны, что позволяет наблюдать центральное ядро через проходящий свет (рис. 1Ai). Ооциты II стадии (диаметр 140-340 мкм) постепенно становятся пенистыми и полупрозрачными. При увеличении фолликулов и разрастании кортикальных альвеол зародышевые пузырьки в центре становится трудно различить12 (рисунок 1Aii). Ооциты III стадии (диаметр 340-690 мкм) постепенно накапливают вителлогенин, и свежие фолликулы становятся все более непрозрачными (рисунок 1Aiii). Мейоз продолжается в ооцитах IV стадии (690-730 мкм в диаметре), поскольку хромосомы входят в середину мейоза II, где они застаиваются (Рисунок 1Aiv). Ооциты стадии V (диаметр 730-750 мкм) созрели и готовы к овуляции 7,11 (рис. 1Av).

Основываясь на уникальных характеристиках каждой из вышеупомянутых стадий, был предложен способ выделения ооцитов от стадий I до III путем переваривания яичников данио рерио с использованием пищеварительного раствора, содержащего коллагеназу I, коллагеназу II и гиалуронидазу, с последующей фильтрацией через клеточное сетчатое фильтр определенного размера13. Однако, несмотря на то, что этот метод позволяет получить ооциты на разных стадиях развития, он не позволяет полностью разделить ооциты и гранулезные клетки. Другие исследователи также предложили методы отделения гранулезных клеток от ооцитов. Тем не менее, эти методы в первую очередь основаны на механических подходах, которые могут привести к повреждению ооцитов, требуют много времени и недостаточны для получения значительного количества ооцитов для анализа14,15.

Учитывая ограничения существующих методов и специфические требования к исследованиям, данное исследование направлено на установление процедуры тщательного разделения ооцитов и гранулезных клеток и получение достаточного количества чистых ооцитов I стадии для анализа. Развивая упомянутый способ13, мы используем улучшенный буфер для пищеварения (см. Таблицу материалов), который является более щадящим и способствует диспергированию ооцитов и диссоциации гранулезных клеток. Затем ооциты пропускают через клеточное сетчатое фильтр, после чего проводят промывку и дальнейший микроскопический отбор, что позволяет получить большое количество чистых ооцитов I стадии.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все рыбки данио содержались в соответствии со строгими рекомендациями по уходу за животными, изложенными соответствующими национальными и/или местными органами защиты животных. Содержание и обращение с рыбой получило одобрение как местных властей, так и комитета по этике животных Западно-Китайской больницы Сычуаньского университета (разрешение No 20220422003). Яичники данио-рерио содержат смесь многоступенчатых ооцитов, причем каждая стадия развития присутствует в яичниках взрослых данио-рерио. Тем не менее, молодые рыбки данио были отобраны для этого исследования из-за доминирования ооцитов поздней стадии (стадия II-III) в яичниках взрослых рыб, которые являются крупными и непрозрачными. Напротив, молодые особи имеют плоские и удлиненные яичники, состоящие в основном из ооцитов стадии I (Рисунок 1B) (Рисунок 1B). Предыдущие исследования показали, что морфологические особенности раннего оогенеза у взрослых и молодых рыбок данио очень последовательны, что подтверждает возможность использования молоди данио-рерио13. Описанные ниже процедуры, представленные на рисунке 2, содержат подробное описание процесса выделения, от вскрытия до получения чистых ооцитов I стадии. Для справки реагенты, буферы и оборудование, использованные в исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Диссекция яичников

  1. Выберите несколько самок данио-рерио со стандартной длиной (SL) от 10 мм до 15 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SL, измеряемый от рыла до основания хвоста в миллиметрах, служит надежным критерием для выбора подходящей рыбы. Для этой процедуры рекомендуется использовать молодь рыб в период от 5 до 7 недель после оплодотворения (wpf) с SL в диапазоне от 10 мм до 15 мм. Яичники молоди данио-рерио преимущественно заняты ранними ооцитами, что обеспечивает оптимальные условия для легкого получения ооцитов I стадии (рис. 1В).
  2. Усыпьте молодых самок, поместив их в ледяную воду (0-4 °C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения эвтаназии и минимизации боли, испытываемой рыбками данио-рерио во время эвтаназии, необходимо выполнить следующие процедуры: подтвердить, что температура ледяной воды находится в пределах 0-4 °C с помощью термометра, быстро перевести рыбок данио в ледяную воду и поддерживать их в ледяной воде в течение как минимум 10 минут после прекращения оперкулярного движения. 17,18.
  3. Высушите лишнюю воду на поверхности рыбы с помощью впитывающей бумаги.
  4. Препарируйте рыбок данио под стереомикроскопом, выполнив следующие действия:
    1. Отрежьте голову с помощью микроножниц по заднему краю жаберной крышки; Отрежьте хвост вдоль клоаки. Переложите средний ствол в чашку диаметром 35 мм, содержащую 2 мл среды L-15 (с L-глутамином).
    2. Рассекаем средний ствол у Л-15 средний. Разрежьте по центральной оси брюшной полости и удалите внутренности и плавательный пузырь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренности рыбок данио соединены. Поэтому зажмите заднюю кишку возле анальной области и приподнимите ее, чтобы легко удалить всю висцеральную массу.
    3. Отделите двусторонние яичники от брюшной полости с помощью пинцета. Удалите жировую ткань, чешуйки и другие ткани организма, прикрепленные к яичнику.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Яичники покрыты жировой тканью. Поэтому лучше всего удалять их вместе, чтобы избежать механических повреждений ооцитов.
      ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с пинцетом осторожно, чтобы не получить травму.

2. Пищеварение

  1. Перенесите яичники в 6-луночный планшет, содержащий 2 мл раствора для диссоциации клеток Кингера, и инкубируйте в течение 2-3 ч при 28,5 °C. Встряхивайте 6-луночный планшет каждые 30 минут, чтобы способствовать дисперсии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пинцет для разделения яичников на небольшие блоки тканей для повышения эффективности пищеварения. Время переваривания варьируется; регулярно контролировать и прекращать процесс при рассеивании под стереомикроскопом значительного количества ооцитов I стадии. Раствор для диссоциации клеток Кингера является рабочим раствором и может использоваться напрямую. Его можно стабильно хранить при температуре −20 °C после упаковки и размораживать при низкой температуре (4 °C) перед использованием.
  2. Добавьте среду L-15, предварительно нагретую до 28,5 °C, в буфер для разложения, чтобы остановить разложение.

3. Фильтрация

  1. Поместите сетчатый фильтр 100 μм в другую лунку 6-луночного планшета, добавьте среду L-15 и убедитесь, что уровень среды выше, чем в фильтре.
    Примечание: Теоретический диаметр ооцитов I стадии составляет менее 140 мкм. Тем не менее, ооциты с большим диаметром все еще могут проходить через клеточный фильтр. Поэтому на этом этапе был выбран клеточный фильтр с меньшим диаметром, чем мишень. Размеры ячеек могут быть скорректированы в зависимости от конкретных экспериментальных потребностей.
  2. Пропустите пищеварительную среду через клеточный фильтр с помощью пипетки. Подождите 1-2 минуты, пока все яйцеклетки I стадии пройдут через ситечко, затем удалите его. Следите за тем, чтобы ооциты оставались в жидкости на протяжении всего процесса переноса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удержание ооцитов в среде помогает поддерживать их целостность и оптимальное состояние. Если ооциты подвергаются воздействию воздуха в течение длительного периода времени, они могут высохнуть и повредиться, что повлияет на итоговую эффективность разделения. При переносе ооцитов через клеточный фильтр пипетку держите ниже поверхности жидкости, а не добавляйте их во взвешенном виде.

4. Стирка

  1. Удалите лишнюю среду с помощью пипетки. Добавьте 4 мл свежей среды L-15 и аккуратно суспендируйте яйцеклетки. Подождите 1-2 минуты, затем удалите надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте инструменты с низкими адгезионными свойствами для предотвращения повреждения ооцитов.
  2. Повторите шаг 4.1 5-6 раз до тех пор, пока не исчезнут другие примеси.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бережное обращение во время процесса промывки имеет решающее значение для предотвращения повреждения ооцитов. Несмотря на получение большого количества ооцитов стадии I (примерно 200-400 ооцитов стадии I от одной рыбки данио) после предыдущих этапов промывания, ооциты все еще могут быть смешаны с фрагментами клеток, ооцитами других стадий или небольшими гранулами, образованными сломанными ооцитами поздней стадии. Кроме того, некоторые гранулезные клетки могут все еще прилипать к поверхности нескольких ооцитов из-за неполного переваривания ферментов. Поэтому для задач, требующих более высокого уровня чистоты, таких как секвенирование генома, необходимы дополнительные шаги для выбора полностью чистых ооцитов. Чтобы решить эту проблему, перейдите к шагам 5 и 6.

5. Отбор для контроля качества

  1. Переложите промытые яйцеклетки I стадии в чашку диаметром 35 мм, содержащую свежую среду L-15.
  2. Под микроскопом с увеличением, равным или превышающим 10x, удалите фрагменты клеток, ооциты другой стадии и яйцеклетки I стадии, прикрепленные гранулезными клетками, с помощью инструмента, которым можно манипулировать с высокой точностью, например, тупой инъекционной иглы.
    Примечание: Этот шаг требует от экспериментатора терпения, но он обеспечивает выделение чистых и неповрежденных ооцитов.
    ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с инъекционными иглами осторожно, чтобы не получить травму.

6. Подтверждение ядерным окрашиванием

Примечание: Для дальнейшей доработки выделенных ооцитов было использовано окрашивание препаратом Hoechst 33342 для идентификации и удаления отдельных ооцитов, прикрепленных к гранулезным клеткам, которые могли быть пропущены на предыдущем этапе.

  1. Добавьте конечную концентрацию 5 г/мл Hoechst 33342 в среду L-15 и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут.
  2. Наблюдайте флуоресценцию Хёхста через флуоресцентный микроскоп под воздействием ультрафиолетового лазера.
    Примечание: Хёхст обычно возбуждается в ультрафиолетовой области, обычно на длинах волн от 310 до 360 нм. Во время этого процесса рекомендуется использовать увеличение от 80x до 100x. Используйте автоматический режим экспозиции. Длина волны возбуждения и время экспозиции могут быть отрегулированы в зависимости от конкретной модели микроскопа и индивидуальных требований.
  3. С помощью иглы тщательно отбирают ооциты, которые не соответствуют нужным критериям.
    Примечание: При визуализации клеток в центре ооцита присутствует большой ядерный хроматин. Если бы гранулезные клетки были прикреплены к ооциту, были бы видны маленькие и яркие ядра, цепляющиеся за край ооцита (рис. 3). Рассмотрите их под микроскопом.
  4. Тщательно и многократно промойте ооциты L-15, чтобы удалить избыток Хёхста.
  5. Идентифицированные ооциты I стадии используют непосредственно для последующей экстракции или хранят их при температуре −80 °С после мгновенной заморозки в жидком азоте.
    ВНИМАНИЕ: Надевайте защитную маску для лица и криогенные перчатки при работе с жидким азотом и сверхнизкотемпературными морозильными камерами.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 показана морфология яичников, наблюдаемая как у взрослых, так и у молодых рыбок данио, демонстрируя ооциты на разных стадиях развития, которые служат в качестве ориентира. На рисунке 1А представлено графическое представление морфологии и размера ооцитов на каждой стадии развития, начиная с первичной стадии роста (стадия I) и заканчивая овулированной яйцеклеткой (стадия V). На рисунках 1Ai-v показаны диаметры, соответствующие стадиям от I до V ооцитов. На рисунке 1B (левая панель) показаны изображения яичников у молоди рыб (6 wpf при SL = 1,5 см). Примечательно, что ювенильный яичник демонстрирует отчетливый дольчатый вид, в первую очередь характеризующийся обилием прозрачных яйцеклеток I стадии, сопровождаемым меньшей популяцией ооцитов II стадии. Такая распространенность ооцитов I стадии значительно облегчает их наблюдение и извлечение. На правой панели изображена морфология яичника взрослой рыбы (6 месяцев), где можно наблюдать ооциты на различных стадиях развития. Тем не менее, в яичниках преобладают непрозрачные ооциты поздней стадии (стадии II-III).

На рисунке 2 показаны репрезентативные процессы от диссекции до получения чистых ооцитов I стадии. На рисунке 3 представлены ооциты I стадии, полученные как референсным, так и модифицированным методом. После окрашивания по методу Хёхста ядра клеток ооцитов и гранулезы демонстрировали синюю флуоресценцию под действием ультрафиолетового света. На изображениях, полученных референсным методом (рис. 3А), поверхность ооцитов была плотно окружена многочисленными окрашенными гранулезными ядрами клеток. Напротив, ооциты I стадии, разделенные модифицированным методом (рис. 3В), демонстрируют полную экспозицию и чистоту, без окрашивания гранулезных ядр клеток.

Полученные нами результаты продемонстрировали эффективность предложенного метода выделения ооцитов I стадии. Процесс развития ооцитов у костистых рыб имеет несколько общих характеристик7. Чтобы оценить его межвидовую применимость, был проведен дальнейший анализ других видов рыб. Самки прудовых гольцов были приобретены на местном рынке, и ооциты ранних стадий (диаметр <100 мкм) были выделены с помощью той же процедуры. В составе яичников прудового гольца также наблюдалась смесь ооцитов на нескольких стадиях развития, характеризующаяся поразительным сходством морфологии и размера ооцитов с таковой у рыбок данио на той же стадии. Как показано на рисунке 4А, в яичниках взрослых самок прудового гольца преобладали непрозрачные поздние ооциты, перемежающиеся с прозрачными ранними ооцитами. На поверхности ооцитов наблюдался четкий монослой гранулезных клеток. В соответствии с нашими наблюдениями у рыбок данио, ооциты вьюна размером менее 100 мкм в диаметре соответствовали стадии, предшествующей стадии диплотена. На рисунке 4В изображены ооциты чистого прудового гольца (Misgurnus anguillicaudatus), полученные модифицированным методом. По сравнению с яичниками данио-рерио, яичники прудового вьюна сложнее диссоциировать. После 6-7 ч пищеварения происходит диссоциация более ранних стадий ооцитов. Тем не менее, этот скорректированный подход позволил получить желаемые чистые и голые ооциты. Данио-рерио относятся к семейству карповых, в то время как прудовые гольцы относятся к семейству Cobitidae. Эти два семейства демонстрируют отдаленное таксономическое родство, но их стадия развития яичников и морфология удивительно схожи, что указывает на то, что этот метод в целом может быть использован для анализа ооцитов различных видов рыб.

figure-results-1
Рисунок 1: Репрезентативные изображения яичников и ооцитов рыбок данио на разных стадиях. (A) Морфология и размер ооцитов на каждой стадии развития (St). i-v представляет изображения и диаметр ооцитов от стадии I до V. Масштабная линейка = 200 мкм. (B) Морфология яичников взрослых и молодых рыбок данио. Масштабные линейки = 500 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Репрезентативные изображения процедуры выделения, от вскрытия до получения чистых ооцитов I стадии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Ооциты I стадии, полученные двумя методами. (A) Ооциты I стадии (St), выделенные указанным методом. (B) Ооциты I стадии выделены модифицированным методом. Ядра клеток ооцитов и гранулезы окрашивали методом Хёхста и возбуждали ультрафиолетовым светом. Масштабные линейки = 100 мкм. BF = светлое поле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Ооциты ранних стадий из прудового гольца, полученные модифицированным методом. (А) Репрезентативные изображения яичников и ооцитов прудового гольца. I, II представляют собой яичники прудовых гольцов при различных увеличениях, а III-IV — ооциты прудовых гольцов на ранних стадиях. Масштабные линейки: i (500 μм); ii (200 мкм); III, IV (100 мкм). (B) Ооциты ранних стадий, выделенные из прудового вьюна. Ядра ооцитов и гранулезных клеток окрашивали методом Хёхста и возбуждали ультрафиолетовым светом. Масштабные линейки = 100 мкм. BF = светлое поле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы разработали метод выделения чистых и чистых ооцитов I стадии, за исключением гранулезных клеток, для последующего анализа (в частности, геномного анализа). Сравнивая этот модифицированный метод с упомянутым методом13, можно отметить, что ооциты I стадии, полученные с помощью этого метода, морфологически интактны, многочисленны и свободны от контаминации другими соматическими клетками, что делает их пригодными для различных последующих исследований и анализов. Кроме того, по сравнению с другими методами механического разделения14,15, усовершенствованный способ более прост в эксплуатации, облегчает получение большего количества ооцитов и предотвращает повреждение ооцитов.

Более того, в дополнение к эффективному выделению ооцитов рыбок данио I, этот метод также может быть применен к прудовым гольцам, что указывает на его широкую применимость среди различных видов рыб. Для изучения влияния контаминации гранулезных клеток на экспрессию генов и эпигенетический анализ мы провели секвенирование РНК (RNA-seq) и анализ CUT&Tag на ооцитах, полученных референтным и модифицированным методами. Несмотря на то, что несколько дифференциально экспрессируемых генов были идентифицированы с помощью РНК-секвенирования, некоторые гены, которые были специфически экспрессированы в гранулезных клетках, все же были идентифицированы (данные не показаны). Анализ также выявил существенные различия в модификациях гистонов между ооцитами, выделенными разными методами (данные не показаны). Эти результаты подчеркивают важность этого метода в полном разделении ооцитов и гранулезных клеток для точной экспрессии генов и эпигенетического анализа.

Несколько аспектов требуют внимания при реализации предложенного метода: (1) Выбор подходящего размера рыбок данио имеет решающее значение. Это обеспечивает получение достаточного количества ооцитов и сокращает количество последующих этапов промывания. Яичники рыбок данио-рерио с SL <10 мм не обеспечивают достаточного количества ооцитов, что требует большего количества рыб для удовлетворения требований к отбору проб и увеличения давления размножения. И наоборот, у рыбок данио рерио с SL более 15 мм наблюдается постепенное образование ооцитов II-III стадии, мембраны которых легко разрываются в ходе реакции пищеварения. (2) При использовании более крупной рыбы утечка содержимого клеток в результате повреждения ооцитов может привести к загрязнению, тем самым в некоторой степени ингибируя реакцию пищеварения. В таких случаях рекомендуется удалить старый пищеварительный буфер, промыть его L-15, а затем добавить новый раствор для диссоциации клеток Кингера для дальнейшего пищеварения. (3) При наличии соответствующего оборудования, встряхивание во время сбраживания может усилить сепарацию.

На шаге 3.1 более мелкие гранулезные клетки могут сопровождать ооциты через клеточный фильтр. Однако практические наблюдения показывают, что окончательный собранный образец ооцитов не содержит гранулезных клеток. За исключением случаев, когда неполное переваривание приводило к присутствию остаточных гранулезных клеток в некоторых ооцитах, другие гранулезные клетки, меченные Хёхстом, не были обнаружены в системе. Здесь мы предположили, что гранулезные клетки, будучи меньше и легче, могут оставаться во взвешенном состоянии в культуральной среде и впоследствии удаляться во время нескольких этапов промывки. Эффективность выделения также количественно оценивали путем расчета доли ооцитов с прикреплением гранулезных клеток и чистых ооцитов после окрашивания по методу Хёхста. Уровень чистых ооцитов до 98% наблюдался в образцах, содержащих 1000 ооцитов.

Несмотря на свои многочисленные преимущества, предложенный подход имел и некоторые заслуживающие внимания ограничения. Во-первых, этот метод был валидирован для экстракции ДНК или РНК, секвенирования и немедленного обнаружения интактных живых клеток, но возможность и надежность его распространения на другие области анализа еще предстоит подтвердить. Еще одним ограничением является то, что предложенный метод может быть применен только для выделения ооцитов I стадии, так как эффективность выделения для других стадий неудовлетворительна. Поэтому требуются дополнительные усилия для повышения эффективности и применимости предложенного метода. Кроме того, будущие исследования должны быть сосредоточены на изучении того, может ли предложенный метод быть применен для эффективной изоляции ооцитов от других стадий, тем самым расширяя его применимость.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (32170813 и 31871449) и Департаментом науки и технологий провинции Сычуань (2024NSFSC0651), а также проектом 1·3·5 для дисциплин передового опыта – Фондом клинических исследований, Западно-Китайская больница, Сычуаньский университет (2024HXFH035). Авторы хотели бы поблагодарить Чжао Вана и Яньцю Гао из лаборатории детской хирургии за разведение рыбок данио, связанных с этой работой. Авторы также хотели бы поблагодарить всех рецензентов, принимавших участие в рецензировании, а также MJEditor (www.mjeditor.com) за предоставление услуг по редактированию на английском языке во время подготовки данной рукописи.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Раствор для диссоциации клеток КингераPlantChemMedPC-33689Раствор для диссоциации клеток Кингера можно стабильно хранить при температуре -20 °°; C после упаковки и может использоваться после размораживания при низкой температуре (4° В). Его можно использовать непосредственно для диссоциации яичников данио-рерио. Оптимальная температура – 28,5°; С, примерно на 2-3 часа. Продолжительность может быть скорректирована в соответствии с конкретными условиями диссоциации, сокращена или увеличена (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
Клеточные сетчатые фильтры (100 μ m )Falcon352360
Флуоресцентный микроскопZeissAxio Zoom.V16
ЩипцыDumont#5
Стеклянная капиллярная игла//Затупленный при прижигании зажигалкой
HoechstYesen40732ES03
Наконечники пипеток с низкой адсорбцией (10 μ l )LabsellectT-0010-LR-R-S
Leibovitz' s L-15 средний средний (с L-глутамином)HycloneSH30525.01
Ведро для льда//Ледяная вода используется для эвтаназии рыбок данио-рерио
ИнкубаторWIGGENSWH-01
Молодь рыб//5– 6 недель после оплодотворения, стандартная продолжительность [SL] 10–
Пластиковая тарелка 15 мм (35 мм)SORFA230101
СтереомикроскопMoticSMZ-161
Тарелка для культуры тканей (6 лунок)Пружинные ножницы SORFA0110006
VannasFine Science Toosl#15000-00

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qin, J. Y., et al. Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish. Chemosphere. 277, 130304(2021).
  2. Hau, H. T. A., et al. Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation. Development. 147 (4), 187385(2020).
  3. Cabrera-Quio, L. E., Schleiffer, A., Mechtler, K., Pauli, A. Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition. PLoS Genet. 17 (2), e1009390(2021).
  4. Liu, Y., et al. Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary. Elife. 11, 76014(2022).
  5. Li, C. W., Ge, W. Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication. Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).
  6. Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
  7. Lubzens, E., Young, G., Bobe, J., Cerda, J. Oogenesis in teleosts: How eggs are formed. Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).
  8. Song, Y., Hu, W., Ge, W. Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells. Gen Comp Endocrinol. 314, 113907(2021).
  9. Sousa, M. L., et al. Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish. Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).
  10. Yan, Y. L., et al. Gonadal soma controls ovarian follicle proliferation through Gsdf in zebrafish. Dev Dyn. 246 (11), 925-945 (2017).
  11. Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).
  12. Wallace, R. A., Selman, K. Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians. J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).
  13. Elkouby, Y. M., Mullins, M. C. Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish. Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).
  14. Ai, N., Liu, L., Lau, E. S., Tse, A. C., Ge, W. Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish. Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).
  15. Zhan, C., et al. Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).
  16. Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Avma. , Available from: https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
  17. Phs policy on humane care and use of laboratory animals. Olaw. , Available from: https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction (2015).
  18. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

L 15

Похожие статьи