Методическая статья

DNAzyme 10-23 - Наномашины для распознавания нуклеиновых кислот

2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66461

⸱

9 февраля 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1ITMO University, 2University of Central Florida

В этой статье

Краткое содержание

Наномашины на основе ДНКферментов могут быть использованы для высокоселективного и чувствительного детектирования нуклеиновых кислот. В данной статье описан подробный протокол проектирования наномашин на основе ДНКферментов с ядром 10-23 с использованием свободного программного обеспечения и их применение при обнаружении фрагмента вируса Эпштейна-Барр в качестве примера.

Аннотация

Наномашины на основе ДНК (DNM) для обнаружения последовательностей ДНК и РНК (аналитов) представляют собой многофункциональные структуры, изготовленные из олигонуклеотидов. Их функции включают плотное связывание аналита, высокоселективное распознавание аналита, усиление флуоресцентного сигнала путем многократного каталитического расщепления флуорогенной репортерной подложки и притяжение флуорогенной подложки для увеличения отклика сенсора. Функциональные единицы прикрепляются к общему каркасу ДНК для их совместного действия. ДНК, расщепляющие РНК 10-23, отличаются повышенной чувствительностью по сравнению с некаталитическими гибридизационными зондами. Стабильность DNM и повышенные шансы распознавания субстрата обеспечиваются двухцепочечным фрагментом ДНК – плиткой. DNM может дифференцировать два аналита с разницей в одном нуклеотиде в свернутой РНК и двухцепочечной ДНК и обнаруживать аналиты в концентрациях в ~1000 раз ниже, чем у других зондов безбелковой гибридизации. В данной статье представлена концепция, лежащая в основе диагностического потенциала активности ДНК-наномашин, а также рассмотрены разработка, сборка и применение ДНК в анализах детекции нуклеиновых кислот.

Введение

Одним из самых ранних методов обнаружения нуклеиновых кислот является комплементарное связывание селективных олигонуклеотидов с анализируемыми последовательностями РНК или ДНК. В этом методе используются фрагменты нуклеиновых кислот (зонды), которые могут образовывать пары оснований Уотсона-Крика с целевым аналитом ДНК или РНК1. Затем комплекс дифференцируется от аналита и несвязанного зонда с помощью различных методов. Некоторые методы, такие как Норн-блоттинг, гибридизация in situ или кПЦР, основаны на явлении комплементарного связывания2. Наиболее распространенные гибридизационные зонды имеют два существенных недостатка: низкую чувствительность (они могут достигать микромолярного и наномолярного уровней), а также низкую селективность к однонуклеотидным вариациям (SNV), включая точечные мутации. Этот вопрос требует сложного подхода, так как решения этих недостатков противоречат друг другу3. Для обеспечения наилучшей селективности детектирующий олигонуклеотид должен быть достаточно коротким, чтобы образовывать нестабильные гибриды с несовпадающими аналитами. Такие короткие олигонуклеотиды не способны плотно связывать целевые нуклеиновые кислоты и раскручивать их вторичные структуры, поэтому часто не могут обеспечить обнаруживаемый сигнал. Особенно сложно обнаружить богатые компьютерной графикой фрагменты в биологической РНК, или двухцепочечной ДНК (дцДНК). С другой стороны, длинные пробники нечувствительны к SNV3. Чтобы выйти из тупика, была разработана концепция двоичного зонда4.

Бинарные датчики разделяют один зонд обнаружения на две части и специализируют его фрагменты, сохраняя один из них длинным, чтобы раскрутить шпильки или вторгнуться в дцДНК. Второй фрагмент двоичного зонда остается коротким, чтобы быть чувствительным к несовпадающему основанию, что обеспечивает средства для обнаружения SNV. Сигнал будет получен, если две части двоичного датчика будут соединены вместе4. Весь комплекс может быть визуализирован с помощью FRET5, молекулярного маякового зонда 6,7 или G-квадруплексов с пероксидазоподобной активностью 8,9,10, или РНК-расщепляющего 11,12,13 ДНКфермента. Подробно описаны бинарные сенсоры с ядром из 10-23 ДНКферментов. Они были адаптированы для обнаружения фрагментов одноцепочечных нуклеиновых кислот, созданных синтетическим путем11, или одноцепочечных продуктов амплификации14,15. Обнаружение без амплификации также возможно, например, в случае 16S рРНК, выделенной из клеточной культуры, поскольку эта молекула в изобилии присутствует в клетках12,16. Бинарные сенсоры с ядром 10-23 DNAzyme также могут быть адаптированы для обнаружения ненуклеиновых кислот, таких как ионы свинца17. Тем не менее, низкая чувствительность по-прежнему считается одним из основных недостатков двоичных 10-23 DNAzyme сенсоров, и для решения этой проблемы были разработаны различные подходы, включая каскады18 или альтернативные методы усиления сигнала19. К сожалению, вышеперечисленные методики резко увеличивают стоимость и нестабильность компонентов сенсора, и поэтому они так и не получили практического применения.

В эксперименте, описанном в данной работе, используются 10-23 ДНК-наносенсора на основе ДНКферментов, называемых ДНК-наномашинами (ДНК)20,21. Эти структуры включают в себя бинарные сенсоры, а также (1) фасилитаторы ДНК, расположенные по бокам от бинарного зонда, раскручивающие структурированные области и вторгающиеся в двухцепочечные ДНК, и (2) плитку ДНК, которая удерживает все части ДНК вместе в непосредственной близости и увеличивает вероятность формирования сигнала (рис. 1). В целом, 10-23 ДНК на основе ДНКферментов снижают предел обнаружения (LOD) до пикомолярного диапазона21; они могут быть использованы для обнаружения 16рРНК в клеточных лизатах22 или сообщения о наличии вирусной РНК без амплификации 23,24. В то же время ДНК остаются чувствительными к SNV и даже могут быть использованы для генотипирования аллелей в гетерозиготныхорганизмах25. Метод DNM может быть использован в качестве дополнительного метода к любому типу амплификации для визуализации продукта или идентификации продукта в сложной смеси с высокой селективностью. DNM, в отличие от обычных TaqMan и маячковых зондов, не требуют нагрева образца и поэтому могут использоваться в протоколах обнаружения конечных точек, что делает общее обнаружение экономически эффективным.

В данной статье описывается разработка DNM in silico и демонстрируются процедуры сборки и функциональной характеристики DNM. Работа выполнена с использованием синтетического фрагмента вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), соответствующего положениям 13972-14154 вирусной ДНК (OR652423.1) (см. Таблицу материалов).

Протокол

1. Проектирование DNM

  1. Выберите уникальный участок в интересующем вас участке генома.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данной работе используется участок генома вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) в позициях 13972-14154 (OR652423.1).
  2. Создайте набор праймеров для амплификации выделенного фрагмента, например, с помощью инструмента Primer3, встроенного в Ugene26.
  3. Откройте веб-инструмент UNAFold27 (см. Таблицу материалов) и вставьте выбранную область. Измените температуру сворачивания на 55 °C, а ионные условия на 250 мМ одновалентных ионов и 200 мМ Mg2+.
    1. Откройте образовавшуюся вторичную структуру фрагмента одноцепочной ДНК и выберите устойчивую шпильку. Расположите сайт связывания ДНК-наномашин в неструктурированных областях или, в качестве альтернативы, на петлях структур шпильки для достижения более сильного связывания мишени.
  4. Если целевой участок аналита свернут в структуру стержня-петли, поместите плечи 1 и 2 следующим образом: убедитесь, что плечо 2 связывает одну сторону стебля, петлю и 3-5 нт второй стороны стержня; Плечо 1 связывает фрагмент второй стороны стебля.
  5. Откройте инструмент DinaMelt28 (см. Таблицу материалов) и проанализируйте последовательности рук и их последовательности обратного дополнения. С помощью инструмента DinaMelt убедитесь, что Tm групп 2 и 3 выше 65 °C: как минимум на 10 °C выше температуры анализа (55 °C).
    1. Для достижения высокой селективности узнавания29 необходимо поддерживать Tm плеча 1 по меньшей мере на 1-3 °C выше температуры реакции (55 °C).
  6. Объедините последовательности в группах 1 и 2 с половинками ядра ДНКфермента и фрагментами, связывающими F-sub13.
  7. Проанализируйте вторичную структуру сконструированных нитей ДНК с помощью UNAFold27.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 55 °C (температура анализа), 200 мМ Mg2+, 250 мМ одновалентные ионы (HEPES, Na+, K+).
    1. Используйте конструкцию только в том случае, если сворачиваемый ΔG ниже - 4 ккал/моль. Старайтесь избегать длинных последовательностей, насыщенных компьютерной графикой. Если вторичная структура слишком стабильна, введите мутацию в руку, чтобы увеличить сворачивающийся ΔG30. В качестве альтернативы, размещение Arm 3 на расстоянии 2-3 nt от Arm 2 является еще одной стратегией изменения последовательности Arm 3, чтобы избежать стабильных межмолекулярных структур.
  8. Создайте случайную последовательность для фрагмента плитки ДНК длиной с руку 3. Объедините последовательность Arm 3 с последовательностью ДНК через (dT)4-6 или этиленгликоль (например, триэтиленгликоль (TEG) или гексаэтиленгликоль (HEG)). В представленной в эксперименте версии DNM используется (dT)6.
  9. Связывайте плечо 2 с последовательностью, комплементарной фрагменту плитки ДНК, выбранному на шаге 1.8, с помощью линкера.
  10. Анализируйте вторичную структуру спроектированных нитей ДНК с помощью веб-приложения UNAFold. Убедитесь, что энергия сворачивания каждой нити ДНК превышает 4 кДж/моль при 55 °C, и избегайте длинных последовательностей, обогащенных компьютерной графикой. Предпочтительно изменить последовательность плиток ДНК.
  11. Нарисуйте структуру с помощью любого доступного программного обеспечения для векторной графики. В этой статье для визуализации используются Biorender и Pixelmator Pro (см. Таблицу материалов). Проверьте точность в направлениях 5'->3' для каждой нити.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приобретайте последовательности у надежного коммерческого поставщика.

2. Функциональный тест DNM

  1. Приготовление буфера и реагентов
    1. Приготовьте реакционный буфер, состоящий из 50 мМ HEPES (pH 7,5-7,8), 50 мМ NaCl, 150 мМ KCl и 200 мМ MgCl2. Наполните деионизированной водой объемом до 50 мл.
    2. Приготовьте 10 μМ аликвот олигонуклеотидов Dzb-Tile и Tile-Arm3. Приготовьте 1 мкМ раствор Dza, 100 мкМ F-sub, и 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ аналитов в РНКазе/свободной воде или стерильной деионизированной воде. Подробная информация о последовательностях олигонуклеотидов представлена в Таблице материалов.
  2. Сборка DNM
    1. Перед использованием полностью разморозьте растворы олигонуклеотидов. Аккуратно перемешивайте постукивающими движениями (не делайте интенсивного ворксирования). Раскрутите (быстро, в течение нескольких секунд) раствор с помощью микроцентрифуги.
    2. Смешайте по 1 мкМ Dzb-Tile и Tile-Arm3 в 200 мкл реакционного буфера в микроцентрифужных пробирках объемом 0,5 мл.
    3. Осторожно перемешайте пробирку и уменьшите раствор.
    4. Оберните крышку закрытой тубы парафиновой пленкой. В качестве альтернативы можно использовать трубки с завинчивающейся крышкой.
    5. Инкубируйте пробирку в стакане объемом 500 мл с кипящей водой в течение 2 минут, затем выключите нагреватель и дайте температуре пассивно остыть в течение ночи.
    6. Приготовьте 12% нативную СТРАНИЦУ: Смешайте 1 мл 10х TBE буфера, 3 мл 40% AA:BA, деионизированную воду до 10 мл, 50 мкл APS и 5 мкл TEMED (см. Таблицу материалов). Переместите смесь в гелевую кассету и дайте ей полимеризоваться.
    7. Смешайте 1 μL каждого образца, а именно собранных DNM, Dzb-Tile и Tile-arm3, с 1 μL 4x загружающего красителя и загрузите их в гель.
    8. Поместите кассету в камеру, заполните ее буфером 1x TBE и дайте гелю поработать 90 минут при напряжении 80 В.
    9. Окрашивайте гель бромидом этидии и визуализируйте его с помощью системы документирования геля (см. Таблицу материалов).
  3. Анализ LOD
    1. Приготовьте 160 мкл 200 нМ F-sub в реакционном буфере. Это делается для оценки основного фона устойчивости основания.
    2. Приготовьте 7 аликвот по 160 мкл предварительно собранных DNM, F-sub и Dza в концентрациях 20 нМ DNM и Dza и 200 нМ F-sub в реакционном буфере. Из семи пробирок оставьте пробирку #1 в качестве пустого фона для оценки спонтанной сборки ядра ДНКфермента.
    3. Добавьте аналит в пробирки #2-7 в конечных концентрациях 1 пМ, 10 пМ, 100 пМ, 200 пМ, 500 пМ и 1000 пМ.
    4. Аккуратно перемешайте, поверните пробирки вниз и классифицируйте растворы на три порции по 50 мкл в черном 96-луночном планшете. Заклейте пластину оптически прозрачной пленкой.
    5. Выдержать тарелку на водяной бане при температуре 55 °C в течение 1 ч. Вращаем тарелку вниз.
    6. Измерьте флуоресценцию при длине волны 525 нм (λex = 495 нм). Вычислите среднее значение и стандартное отклонение для каждой точки.
    7. Рассчитайте соотношение холостого и основного путем деления сигнала трубки, содержащей F-sub и DNM, на сигнал трубки, содержащей только F-sub. Убедитесь, что соотношение находится в диапазоне 1,1-1,5.
    8. Рассчитайте отношение сигнал/холостой сигнал, разделив сигнал трубки, содержащей F-sub, DNM и аналит, на сигнал трубки, содержащей только F-sub и DNM. Считать сигнал истинно положительным, если он выше среднего фонового плюс три стандартных отклонения.
    9. Повторите эксперимент дважды и убедитесь, что стандартное отклонение между аналитическими повторами меньше 0,5.

Результаты

Цель первого эксперимента состояла в том, чтобы показать сборку ДНМ до синтетического фрагмента анализируемого вещества. Все составляющие нити DNM добавляли в реакционный буфер и собирали в стакан. Собранный комплекс DNM оценивался на корректность по размеру и однородности с помощью нативного PAGE. На нативной странице отображается собранный DNM с аналитом на полосе 1 и двумя цепями DNM на дорожках 2 и 4. Если бы наномашина ДНК не была собрана, то вместо одной полосы с низкой подвижностью были бы видны 2 или 3 отдельные полосы (полоса 2 на рисунке 2A).

Вторая часть Протокола подразумевает функциональную характеристику работоспособности DNM и обнаружение целевых нуклеиновых кислот. В данном исследовании использовался синтетический фрагмент ВЭБ 13972-14154. С этой целью предварительно собранные фрагменты ДНК вместе с Dza инкубировали с различными концентрациями аналита в течение 1 ч при 55 °С. Были измерены два значения контрольного флуоресцентного сигнала: фрагментов предварительно собранных ДНК и Dzb без аналита (холостой) и фона от F-sub (основной). Было проведено три технических измерения. Для статистики также были проведены три независимых исследования. Примечательно, что концентрация магния в данном исследовании выше, чем то, что можно найти в литературе30. Высокий уровень ионов магния усиливает сигнал во всех пробирках, так как они способствуют спонтанному расщеплению F-sub31. Мы оптимизировали состав реакционного буфера на предварительных этапах разработки технологии и не повторяли этот процесс при каждом проведенном исследовании.

После 1 ч инкубации флуоресценцию образца измеряли с помощью спектрофлуориметра (см. Таблицу материалов). Чтобы подтвердить обнаружение анализируемой ДНК с помощью DNM, мы сравнили флуоресцентный сигнал сенсора, собранного с анализируемой ДНК, и сигнал отрицательного контроля, который не содержит добавленного аналита. Отношение сигнал/бланк (отношение между средними относительными единицами флуоресценции лунок, содержащих аналит, и лунок без аналита) должно быть не менее 1,5 для подтверждения успешного обнаружения32. Отношение холостого к основному (флуоресценция отклика сенсора в отсутствие аналита, деленная на флуоресценцию регулятора, работающего только с F-sub) должна находиться в диапазоне 1,1-1,5; это соотношение можно регулировать, изменяя концентрации DNM и Dzb (типичный диапазон концентраций для каждой из них составляет 5-20 нМ). В нашей практике LOD определяется как пересечение линии тренда и трех стандартных отклонений над средним значением (Рисунок 2B). DNM эффективен, если LOD составляет <100 pM33. DNM должен быть перепроектирован, если LOD превышает 100 пМ.

figure-results-1
Рисунок 1: Трехплечевый DNM, использованный в этом исследовании. Три олигонуклеотида, Dza, Dzb-Tile и Tile-Arm3, помечены как зеленый, синий и фиолетовый соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Определение характеристик DNM. (A) Сборка DNM с помощью нативного электрофореза в 12% полиакриламидном геле, 80 В, 1 ч, с использованием лестницы 50.н+ ДНК. (В) Предел обнаружения синтетической ДНК после 60-минутной инкубации при 55°С. Горизонтальная линия обозначает порог, а вертикальная линия — LOD. Средние значения трех независимых измерений представлены с одним стандартным отклонением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Проектирование ДНК-машин является простым, но требует некоторого опыта в разработке гибридизационных зондов или функциональных наноструктур ДНК. Целесообразно делать фрагмент анализируемого материала как можно короче, чтобы уменьшить количество возможных вторичных структур и упростить вторжение DNM во вторичную структуру. Содержание CG предпочтительно должно быть ниже 60%, чтобы избежать стабильных внутримолекулярных структур. Успешная сборка DNM достигается при низких скоростях охлаждения. В некоторых случаях DNM могут быть спонтанно собраны в трубе, и этап отжига может быть исключен. Сборка DNM может быть выполнена в термоамплификаторе с температурой 0,1-0,3 °C/мин или в больших объемах охлаждающей воды. В случае неправильной сборки DNM мы предлагаем замедлить изменение температуры на этапе отжига.

Для измерения LOD необходимо как минимум семь точек концентрации аналита: концентрация аналита 0 пМ, которая равна F-sub + DNM, и шесть различных концентраций аналита, например, в диапазоне от 1 нМ до 1 пМ, чтобы наблюдать линейную зависимость (рис. 2B). Зачастую для повышения точности использовалось более семи точек концентрации. Для каждой точки концентрации необходимо провести три технических испытания (по 50 мкл каждое). Таким образом, общий объем для каждой концентрации составил 160 мкл (избыток на 10 мкл с учетом погрешности пипетки).

Метод DNM обеспечивает более высокую чувствительность к SNV, чем другие системы, основанные на гибридизации. Высокая селективность к SNV может быть релевантной для определенных целей, таких как идентификация точечных мутаций, связанных с бактериальным генотипированием22 или отбор гетерозигот у растений25. Неспецифические аналиты потребовали бы той же экспериментальной процедуры. Чтобы избежать непонимания SNV при низкой концентрации аналита, мы предлагаем сравнивать сигнал экспериментального неизвестного аналита с сигналом известного полностью комплементарного аналита той же концентрации.

Метод может быть успешно применен к одноцепочечной ДНК, микроРНК, свернутой РНК или ампликонам дцДНК. Для длинных фрагментов РНК или дцДНК, особенно богатых CG, может потребоваться DNM, оснащенный 4-6 аналит-связывающими плечами, в то время как для одноцепочечных аналитов с нестабильной вторичной структурой достаточно двух аналит-связывающих плеч. Метод может быть применен для выявления ампликонов ПЦР, АСД или LAMP. DNM может быть использован для безамплификационного обнаружения рРНК в кипяченых образцах бактериальной культуры без выделения общей РНК 22,34,35. Метод может быть неэффективен при концентрациях, столь низких, как фемтомолярный уровень, и с фрагментами дцДНК, содержание CG в фланкирующих областях которых превышает 65%. Содержание КГ можно оценить, например, с помощью калькулятора содержания КГBiologics 36. Мы предлагаем добавить крючковые части37 к конструкциям DNM для повышения чувствительности или преобразования дцДНК в одноцепочечную ДНК в случаях высокого содержания КГ. Еще одним ограничением метода является то, что ДНК чувствительны к качеству образцов, поэтому нуклеиновые кислоты должны быть тщательно очищены. То же самое относится и к качеству олигонуклеотидных последовательностей ДНК. В связи с этим предлагается проверить стабильность и чистоту каждого источника олигонуклеотидов. По сравнению с традиционными методами усиления, проектирование DNM требует навыков и к моменту выпуска статьи практически полностью ручное. ДНК нуждаются в некоторых предварительных испытаниях синтетических фрагментов, прежде чем подвергать их реальным образцам ДНК или РНК, что увеличивает общую продолжительность разработки тест-системы.

Метод универсален и может использовать различные типы репортерных зондов. Он может быть мультиплексирован38, и способ может быть преобразован в колориметрическую версию, если F-sub заменить подложкой39, образующей G-квадруплекс. Наличие полимеразы связано с ошибками в росте нити; следовательно, этот способ имеет преимущество по сравнению с обычной ПЦР в реальном времени и цифровой ПЦР, а также другими нуклеазно-зависимыми методами, такими как SHERLOCK и DETECTR, из-за отсутствия скоропортящихся белковых ферментов и надежной и простой процедуры обнаружения40,41.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Екатерине Владимировне Никитиной за любезное предоставление гДНК ВЭБ. Муханнад Атейя, Мария Юрьевна Березовская и Мария Сергеевна Рубель благодарят Министерство образования и науки Российской Федерации (грант No ФСЭР-2022-0009) и программу «Приоритет 2030».

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл пробиркаBiofilCFT011015
100.н+ DNA LadderEvrogenNL002
100-1000 &; L пипеткаKirgenKG-Pro1000
10-100 &; L пипеткаKirgenKG-Pro100
1-10 & микро; L пипеткаKirgenKG-Pro10
20-200 & L пипеткаKirgenKG-Pro200
2-20 & L пипеткаKirgenKG-Pro20
4x Гелевый загружающий красительEvrogenPB020
Акриламид 4KAppliChemA1090,0500
Персульфат аммонияCarl Roth2809447 Biorender Biorender
https://www.biorender.com
бисакриламидMolekula22797959
Борная кислотаTechSnabH-0202
Система визуализации ChemiDocBioRad12003153
Costar 96-Well Черная полистирольная пластинаCorningCOS3915
ИнститутDinaMelthttp://www.unafold.org/Dinamelt/applications/two-state-melting-hybridization.php
EDTAAmrescoAm-O105
Бромид этидияBioLabMixEtBr-10
HEPESAmrescoAm-O485
Хлорид магнияAppliChem131396
Mini Protean Tetra CellBioRad1658001EDU
пипетка 10 & микро; L наконечникиKirgenKG1111-L
пипетка 1000 & микро; L наконечникиKirgenKG1636
пипетка 200 & микро; L наконечникиKirgenKG1212-L
Pixelmator ProPixelmator Teamhttps://www.pixelmator.com/pro/
Хлорид калияCarl Roth1782751
PowerPac Basic Power SupplyBioRad 1645050
РНКаза / ДНКаза свободная водаInvitrogen10977049
Герметизирующая пленка для ПЦР-планшетовSovtechP-502
Sodium chlorideVektonHCh (0,1)
Искровой многорежимный микропланшетный считывательTecanSpark- 10M
T100 АмплификаторBioRad10014822
TEMEDMolekula68604730
трис(гидроксиметил)аминометанAmrescoAm-O497
UNAFoldИнститутhttp://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php
Водяная баняLOIPLB-140
Oligos used>
Analyte:Evrogenпрямого заказа, стандартная обессоливающая очистка
GAGCACTTGGTCAGGCACAC
ACAGGGTCAGCGGGAGGACGCG
TGGCACAGCAGCCCGGGG
GTCCCCTGG
CGGACTACGCCTTCGTTGC
Tile-Arm3:Evrogenпрямой заказ, стандартная обессоливающая очистка
CCG GGCTGCTGTGCCATTTT
TTGCTGACTGTCACCTCT
CTGCTAGTCT
Dzb-Tile: AGACTAGCAGAGAGGTGACAG
TAGTCAGCTTTTTTCGCGTCCTC
CGCTGACCACAACGAGAGGAA
ACCTT		Evrogenпрямой заказ, стандартная обессоливающая очистка
Dza: TGCCCAGGGAGGCTAGCTCT
GTCCGTGTGCCTGACCA		Evrogenпрямой заказ, стандартная
обессоливающая очисткаF-sub олигонуклеотид: AAGGTT(FAM)TCCTCrGrU
CCCTGGGCA-BHQ1		DNA-Syntezпрямого порядка, очистка ВЭЖХ
РНК РНК

Ссылки

  1. Kolpashchikov, D. M. Evolution of hybridization probes to DNA machines and robots. Acc. Chem Res. 52, 1949-1956 (2019).
  2. Guo, J., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection. Anal. Bioanal Chem. 402, 3115-3125 (2012).
  3. Demidov, V. V., Frank-Kamenetskii, M. D. Two sides of the coin: affinity and specificity of nucleic acid interactions. Tr Bioche Sc. 29 (2), 62-71 (2004).
  4. Kolpashchikov, D. M. Binary probes for nucleic acid analysis. Chem Rev. 110, 4709-4723 (2010).
  5. Marti, A. A., Jockusch, S., Stevens, N., Ju, J., Turro, N. J. Fluorescent hybridization probes for sensitive and selective DNA and RNA detection. Acc Chem Res. 40 (6), 402-409 (2007).
  6. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor. Biosens.Bioelectron. 41, 386-390 (2013).
  7. Dark, P., et al. Accuracy of LightCycler Septi Fast for the detection and identification of pathogens in the blood of patients with suspected sepsis: a systematic review and meta-analysis. Intensive Care Med. 41, 21-33 (2015).
  8. Maltzeva, Y. I., Gorbenko, D. A., Nikitina, E. V., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. Visual Detection of Stem-Loop Primer Amplification (SPA) products without denaturation using peroxidase-like DNA machines (PxDM). Int J Mol Sc. 24 (9), 7812(2023).
  9. Gorbenko, D. A., et al. DNA nanomachine for visual detection of structured RNA and double stranded DNA. Chem Comm. 58 (35), 5395-5398 (2022).
  10. Roembke, B. T., Nakayama, S., Sintim, H. O. Nucleic acid detection using G-quadruplex amplification methodologies. Methods. 64 (3), 185-198 (2013).
  11. Mokany, E., Bone, S. M., Young, P. E., Doan, T. B., Todd, A. V. MNAzymes, a versatile new class of nucleic acid enzymes that can function as biosensors and molecular switches. JACS. 132 (3), 1051-1059 (2010).
  12. Gerasimova, Y. V., Cornett, E., Kolpashchikov, D. M. RNA cleaving deoxyribozyme sensor for nucleic acid analysis: the limit of detection. Chem Bio Chem. 11, 811-817 (2010).
  13. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria. Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).
  14. Hu, M., et al. Allosteric DNAzyme-based encoder for molecular information transfer. Chin. Chem Let. , 109232(2023).
  15. Peeters, B., et al. Solid-phase PCR-amplified DNAzyme activity for real-time FO-SPR detection of the MCR-2 gene. Anal Chem. 92 (15), 10783-10791 (2020).
  16. Wood, H. N., et al. Species typing of nontuberculous Mycobacteria by use of deoxyribozyme sensors. Clin Chem. 65 (2), 333-341 (2019).
  17. Yan, T., et al. Ultralow background one-pot detection of Lead (II) using a non-enzymatic double-cycle system mediated by a hairpin-involved DNAzyme. Biosen Bioelectron. 237, 115534(2023).
  18. Hasick, N. J., Radhika, R., Todd, A. V. Subzymes: Regulating DNAzymes for point of care nucleic acid sensing. Sens. Act. B: Chem. 297, 126704(2019).
  19. Safdar, S., et al. DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes. Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).
  20. Cox, A. J., Bengtson, H. N., Gerasimova, Y. V., Rohde, K. H., Kolpashchikov, D. M. DNA antenna tile-associated deoxyribozyme sensor with improved sensitivity. Chem Bio Chem. 17 (21), 2038-2041 (2016).
  21. Lyalina, T. A., Goncharova, E. A., Prokofeva, N. Y., Voroshilina, E. S., Kolpashchikov, D. M. A DNA minimachine for selective and sensitive detection of DNA. Analyst. 144 (2), 416-420 (2019).
  22. Ateiah, M., Gandalipov, E. R., Rubel, A. A., Rubel, M. S., Kolpashchikov, D. M. DNA Nanomachine (DNM) Biplex Assay for Differentiating Bacillus cereus Species. Int J Mol Sc. 24 (5), 4473(2023).
  23. El-Deeb, A. A., et al. Toward a home test for COVID-19 diagnosis: DNA machine for amplification-free SARS-CoV-2 detection in clinical samples. Chem Med Chem. 17 (20), 202200382(2022).
  24. Kirichenko, A., Bryushkova, E., Dedkov, V., Dolgova, A. A Novel DNAzyme-based fluorescent biosensor for detection of RNA-containing Nipah henipavirus. Biosensors. 13 (2), 252(2023).
  25. Akhmetova, M. M., Rubel, M. S., Afanasenko, O. S., Kolpashchikov, D. M. Barley haplotyping using biplex deoxyribozyme nanomachine. Sens Act Rep. 4, 100132(2022).
  26. Okonechnikov, K., et al. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit. Bioinformatics. 28, 1166-1167 (2012).
  27. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  28. Markham, N. R., Zuker, M. DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res. 33, Web Server issue W577-W581 (2005).
  29. Stancescu, M., Fedotova, T. A., Hooyberghs, J., Balaeff, A., Kolpashchikov, D. M. Nonequilibrium hybridization enables discrimination of a point mutation within 5-40 C. JACS. 138 (41), 13465-13468 (2016).
  30. Dong, J., Ouyang, Y., Wang, J., O'Hagan, M. P., Willner, I. Assembly of dynamic gated and cascaded transient DNAzyme networks. ACS Nano. 16 (4), 6153-6164 (2022).
  31. Montserrat Pagès, A., Hertog, M., Nicolaï, B., Spasic, D., Lammertyn, J. Unraveling the kinetics of the 10-23 RNA-cleaving DNAzyme. Int J Mol Sc. 24 (18), 13686(2023).
  32. Nguyen, C., Grimes, J., Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Molecular-beacon-based tricomponent probe for SNP analysis in folded nucleic acids. Chem-eur J. 17 (46), 13052-13058 (2011).
  33. MacDougall, D., Crummett, W. B. Guidelines for data acquisition and data quality evaluation in environmental chemistry. Anal Chem. 52 (14), 2242-2249 (1980).
  34. Gerasimova, Y. V., Yakovchuk, P., Dedkova, L. M., Hecht, S. M., Kolpashchikov, D. M. Expedited quantification of genetically modified ribosomal RNA by binary deoxyribozyme sensors. RNA. 10, 1834-1843 (2015).
  35. Gerasimova, Y. V., Kolpashchikov, D. M. Folding 16S RNA in a signal-producing structure for detection of bacteria. Angew Chem Int Ed. 52, 10586-10588 (2013).
  36. GC Content Calculator. , Available from: https://www.biologicscorp.com/tools/GCContent/#.ZEfxPiyOHYU (2023).
  37. Hussein, Z., et al. DNAzyme nanomachine with fluorogenic substrate delivery function: advancing sensitivity in nucleic acid detection. Anal Chem. 95 (51), 18667-18672 (2023).
  38. Safdar, S., et al. DNA-only, microwell-based bioassay for multiplex nucleic acid detection with single base-pair resolution using MNAzymes. Biosen Bioelectron. 152, 112017(2020).
  39. Gerasimova, Y. V., et al. Deoxyribozyme cascade for visual detection of bacterial RNA. Chem Bio Chem. 14, 2087-2090 (2013).
  40. Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Gen Res. 1 (1), 17-24 (1991).
  41. Pandya, K., Jagani, D., Singh, N. CRISPR-Cas systems: Programmable nuclease revolutionizing the molecular diagnosis. Mol Biotech. , (2023).

Перепечатки и разрешения

Теги

PAGE
DNAzyme 10-23 - Наномашины для распознавания нуклеиновых кислот
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.