Методическая статья

Высокоскоростная атомно-силовая микроскопия: визуализация самосборки мотива ДНК в виде трехконечной звезды с использованием фототермического внерезонансного таппинга

DOI:

10.3791/66470

⸱

22 марта 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Bio-Nano Instrumentation, Interfaculty Bioengineering Institute, School of Engineering, Ecole Polytechnique Fédérale Lausanne, 2Programmable Biomaterials Laboratory, Institute of Materials, School of Engineering, Ecole Poly-technique Fédérale Lausanne

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы показываем протокол визуализации для наблюдения за биомолекулярными взаимодействиями с фототермическим внерезонансным постукиванием (PORT), в котором мы оптимизировали параметры визуализации, определили пределы системы и исследовали потенциальные улучшения в визуализации сборки мотива ДНК в виде трехконечной звезды.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высокоскоростная атомно-силовая микроскопия (HS-AFM) является популярным методом молекулярной визуализации для визуализации одномолекулярных биологических процессов в режиме реального времени благодаря своей способности получать изображения в физиологических условиях в жидких средах. В режиме фототермического внерезонансного отбора (PORT) используется приводной лазер для контролируемого колебания кантилевера. Это прямое консольное срабатывание эффективно в диапазоне МГц. В сочетании с работой петли обратной связи на силовой кривой во временной области, а не на резонансной амплитуде, PORT обеспечивает высокоскоростную визуализацию со скоростью до десяти кадров в секунду с прямым контролем сил между зондом и образцом. Было показано, что PORT позволяет визуализировать тонкую динамику сборки и точно отслеживать узоры, формируемые биомолекулами. До сих пор этот метод использовался для различных динамических исследований in vitro , включая схемы сборки мотива ДНК с 3-конечной звездой, показанные в этой работе. С помощью серии экспериментов этот протокол систематически определяет оптимальные настройки параметров визуализации и предельные значения системы визуализации HS-PORT AFM, а также то, как они влияют на процессы сборки биомолекул. Кроме того, он исследует потенциальные нежелательные тепловые эффекты, вызванные приводным лазером на образец и окружающую жидкость, особенно когда сканирование ограничено небольшими областями. Эти результаты дают ценную информацию, которая будет способствовать продвижению применения режима PORT в изучении сложных биологических систем.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высокоскоростная атомно-силовая микроскопия (HS-AFM) является быстро развивающимся методом визуализации 1,2,3,4. Он работает со скоростью, которая позволяет исследователям визуализировать биомолекулярные взаимодействия в режиме реального времени 5,6,7,8,9. Фототермическая внерезонансная отработка (PORT) — это режим внерезонансной визуализации, аналогичный пиковой силовой отстукиванию10,11, импульсной силовой модели12,13 или прыгающей модели14. Однако вместо вертикального колебания сканера PORT вертикально вращает только консоль с помощью возбуждающего лазера, сфокусированного на кантилевере (обычно близком к точке зажима). Кантилевер деформируется из-за эффекта биморфа: лазер с модулированной мощностью возбуждения периодически нагревает кантилевер с покрытием, который изгибается из-за различных коэффициентов теплового расширения кантилевера и материалов покрытия15. Нагрев кантилевера и образца может быть сведен к минимуму за счет использования приводного лазера, который периодически выключается и снова включается во время каждого цикла колебаний, а не с помощью полного синусоидального привода5.

ДНК использовалась для формирования биологически значимых, структурно интересных и биохимически полезных мотивов в течение ряда лет 16,17,18,19,20. Кроме того, было доказано, что структуры ДНК идеально подходят для характеристики качества визуализацииАСМ 21 и для оценки зонд-эффекта высокоскоростной АСМ22. Трехконечные звезды ДНК (3PS) стали практичными в качестве программируемой модельной системы для исследования супрамолекулярной организации молекул с аналогичной структурой в сложных биологических системах. Ранее самосборка решеток, образованных тримерными мономерами ДНК с тупыми концами, отслеживалась с помощью HS-AFM23. В конце концов, они организуются в большие сети с гексагональным порядком. Здесь самосборка 3-конечных звездДНК 19 визуализируется с помощью метода PORT со скоростью, достаточно быстрой, чтобы отслеживать самосборку и механизмы ее коррекции24, обеспечивая при этом минимальное нарушение процесса или повреждение образца. Как и в любом режиме HS-AFM, существует компромисс между достижимым качеством изображения, скоростью визуализации и нежелательным возмущением образца. Выбрав правильный компромисс, можно лучше понять паттерны самоорганизации надмолекулярных сборок. Таким образом, этот протокол будет использовать аналогичную установку с DNA 3PS в качестве модельной системы для оптимизации параметров, специфичных для PORT. Это позволит работать с высокой скоростью визуализации при достаточно больших размерах сканирования, сводя к минимуму повреждение образцов.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Выборка и буферы

ПРИМЕЧАНИЕ: Плитка ДНК, использованная в этом исследовании, представляет собой мотив 3-конечной звезды, разработанный в лаборатории Мао в Университете Пердью19,25. Все олигонуклеотиды, использованные в этом исследовании, были приобретены у компании Integrated DNA Technologies, Inc. Соберите необходимые материалы и реагенты.

  1. Смешайте одноцепочечные ДНК (одноцепочечные ДНК) в молярном соотношении 1:3:3 (S1 0,6 мкМ, 1,8 мкМ для S2 и 1,8 мкМ для S3) в буфере для отжига (5 мМ TRIS, 1 мМ EDTA и 10 мМ MgAc2). Конечная концентрация мотива ДНК должна составлять 0,6 мкМ (49 нг/мкл при молекулярной массе 3PS 82020,3 г/моль).
  2. Поместите раствор ДНК в термостойкий контейнер и нагрейте его до 80 °C. Медленно охладите раствор ДНК с 80 °C до 20 °C в течение 4 часов. Этот процесс отжига помогает олигонуклеотидам одноцепочечной ДНК формировать желаемый двухцепочечный мотив ДНК.
  3. Для очистки загрузите отожженный раствор ДНК на 3% агарозный гель, чтобы удалить избыток одноцепочечной ДНК и любой нежелательный побочный продукт. Запустите 3% гель при напряжении 60 В в течение примерно 2,5 ч в буфере, содержащем 0,5x Tris-Borate-EDTA (TBE) и 10 мМ Mg(CH3COO)2.
  4. Определите и найдите полосу на геле, содержащую мотив ДНК. Убедитесь, что полоса переместилась в определенное положение в зависимости от ее размера.
  5. Аккуратно вырежьте из геля ленту, содержащую мотив ДНК. Извлеките мотив ДНК из вырезанного фрагмента геля, поместив его в спин-колонку для экстракции гелем и центрифугируя при 3 000 x g и 4 °C в течение 10 минут.
  6. Замените буфер в извлеченном мотиве ДНК на буфер для отжига с помощью центробежного концентратора. Центрифугируйте при 3000 x g при комнатной температуре (или ниже) до тех пор, пока концентрированный раствор не станет менее 100 μл. Затем добавьте 300 μL буфера для отжига и повторите этот шаг дважды, чтобы убедиться, что буфер заменен.
  7. Разбавьте мотив ДНК до 6 нМ для целей визуализации. Используйте спектрофотометр или другие подходящие методы для точного определения и корректировки концентрации. Теперь мотив ДНК готов к визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все буферы в протоколе имеют pH 8,0. Информация о последовательности для трех соответствующих полос выглядит следующим образом:
    S1: AGGCACCATCGTAGGTTTTTTGCCAGGCACCATCGT
    AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
    S2: ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCAAGCCTACGATGGACA
    CGGTAACG
    S3: CGTTACCGTGTGGTTGCATAGT

2. Рост кончика кончика консоли

  1. Монтаж консольного консоля на консольном держателе SEM: Убедитесь, что консоли чистые и не содержат загрязнений. Установите консоли на подходящий держатель, совместимый с системой SEM. Изготовленный на заказ дизайн консольного держателя может быть предоставлен по запросу.
  2. Впрыск газа: Нагрейте газ-предшественник (например, прекурсор фенантрена C14H10 для наконечников из аморфного углерода), который будет использоваться в системе впрыска газа для выращивания нового наконечника. Как только вакуум опустится ниже 10-5 мбар, продуйте линию впрыска газа 10 раз в течение 2 с, чтобы убедиться, что в линии сопла нет нежелательных остатков воздуха (это необходимо сделать при закрытом клапане в камере пистолета).
  3. Регулировка положения наконечника: Используйте сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) для определения местоположения конца консоли. Наклоните держатель кантилевера на угол (например, 11° в данном случае), эквивалентный тому, который будет представлять консоль при размещении на держателе консоли AFM по отношению к поверхности, чтобы увеличенный кончик был перпендикулярен поверхности во время визуализации. Отрегулируйте положение и фокус SEM, чтобы получить четкий обзор консоли, где будет расти острый углеродный нанонаконечник.
  4. Индуцированное сфокусированным электронным пучком осаждение (FEBID):
    1. Установите параметры осаждения в выбранном программном обеспечении (в данном случае SmartFIB), такие как ток луча (I) и напряжение ускорения (В), рабочее расстояние (WD), увеличение, экспонируемая форма, время дозы/осаждения и время выдержки. Для выращивания зондов из аморфного углерода, обладающих хорошими механическими свойствами для АСМ визуализации, приводящими к длине около 130 нм и радиусам в диапазоне 2-4 нм, были использованы следующие параметры:
      Выберите пятно/точку в качестве открытой формы
      WD = 5 мм
      I = 78 пА, а V = 5 кВ
      Время задержки = 1 μс
      Доза = 0,05 нС, а время осаждения = 0,64 с
      Увеличение = 20000x
    2. Начните процесс осаждения для выращивания наконечника путем облучения электронного пучка в пятне на кончике кантилевера с одновременным впрыском газа-предшественника, закрывая газ после завершения осаждения. В этом случае программное обеспечение SmartFIB выполняет это автоматически после настройки рецепта, упомянутого выше.
  5. Анализ после роста: Выполните визуализацию SEM после роста, чтобы изучить недавно выращенный кончик и убедиться в его качестве и характеристиках (радиус и длина кончика). Подождите 1-2 минуты после роста кончика, чтобы убедиться, что весь прекурсор откачан и избежать повторного осаждения во время СЭМ-визуализации. Извлеките держатель образца из камеры SEM.
  6. Переработка консоли: Если в системе SEM также установлен комбинированный сфокусированный ионный пучок (FIB), удалите поврежденный или загрязненный ранее выращенный наконечник, фрезеровав его с помощью системы FIB с использованием низких токов FIB (например, 1 пА, чтобы избежать повреждения консоли). Выполняйте удаление наконечника путем фрезерования в виде поперечного сечения, от конца наконечника до основания, чтобы избежать смятия наконечника. Это позволит вырастить заново новый.

3. Аппаратное обеспечение HS-AFM

  1. Система визуализации состоит из специально изготовленной головки5, 26 порта (рис. 1A), высокоскоростного сканера26 с диском для образцов со слюдой в верхней части, совместимого контроллера27, высоковольтного усилителя с высокой пропускной способностью, необходимой для высокоскоростной визуализации, базы AFM и ПК с необходимым программным обеспечением для управления вышеупомянутым оборудованием27.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном случае речь идет о компонентах с открытым исходным кодом, планы по которым можно получить в Лаборатории био- и наноприборостроения на EPFL27, 28. Также можно посетить семинары по сборке головки порта и контроллера29, а также загрузить и использовать программное обеспечение на основе LabView.
  2. Осторожно поместите ультракороткий консоль (например, AC10DS или аналогичную) под пружинный зажим на держателе консоли с помощью пинцета. Убедитесь, что консольный чип зафиксирован и устойчив.
  3. Добавьте 50 мкл жидкости с помощью шприца через левое отверстие для доступа к жидкости, как показано на рисунке 1B. Когда возбуждающий лазер все еще выключен, совместите считывающий лазер на кантилеворе с помощью трех специальных ручек на головке АСМ, показанных на рисунке 1A. Для этого наблюдайте за тенью кантилевера на белой бумаге, максимизируя сумму (метод тени). Затем центрируйте лазерное пятно на фотодиоде с помощью двух специальных ручек.
  4. Включите и отровняйте приводной лазер, установив флажок Excitation Enable в Excitation VI, чтобы он приводил в действие и вращал консоль. Отображение сигнала возбуждения кантилевера и сигнала отклонения кантилевера на подключенном осциллографе. Если колебания отклонения слишком малы (или отсутствуют), возможно, лазер находится очень далеко от консоли. В этом случае используйте метод тени и выключите отклоняющий лазер для более легкой юстировки. Увеличьте амплитуду колебаний с помощью ручек лазерной регулировки привода, показанных на рисунке 1A.
  5. Для регулировки амплитуды колебаний кантилевера в PORT необходимо ввести в соответствующее управление программного обеспечения размаховое напряжение, подаваемое на цепь управления лазерным диодом (далее – размах на входе переменного тока) в режиме возбуждения VI. Для удержания лазерного диода в режиме проводимости и, следовательно, генерации, в цепь управления лазерным диодом добавляется напряжение постоянного тока (с этого момента вход смещения постоянного тока), что также делается из конфигурационного блока в Excitation VI. Оба фактора также влияют на мощность лазера, которая может быть измерена с помощью измерителя мощности лазера и используется для настройки амплитуды колебаний кантилевера.
  6. Определите максимальную частоту фототермического возбуждения, которая может быть приложена к кантилеверу, которая должна быть ниже резонансной частоты консоли. Определение резонансной частоты с помощью тепловой настройки или развертки по частоте. Используемые в этом исследовании кантилеверы (AC10DS), резонансная частота которых в жидкостях составляет около 400 кГц (1 МГц на воздухе)30, имеют область квазистатического изгиба ниже 300кГц5. Таким образом, необходимо использовать частоты PORT ниже этого предела (около 100-200 кГц).
  7. Отрегулируйте параметры визуализации и настройки для PORT rate и Scan rate до требуемых значений в полях Excitation и Scan Vis соответственно (параметры, используемые в этой статье, указаны в описании рисунков). После настройки параметров и визуализации выполните необходимые эксперименты по визуализации для наблюдения и отслеживания молекулярных взаимодействий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку консоли AC10DS больше не продаются, может потребоваться использование альтернативы, такой как Fastscan D или BioLever31 , пока не появится эквивалент.

4. Получение правильных кривых взаимодействия

  1. Первоначально подойдите к поверхности образца в контактном режиме, нажав кнопку «Пуск » на Z-контроллере VI, для которого установлено положение «Контактный режим».
    1. В этом режиме зонд АСМ вступает в непосредственный контакт с образцом. Как только поверхность будет достигнута, выполните кривую зависимости силы от расстояния на рампе VI, чтобы получить калибровку чувствительности кантилевера к отклонению.
    2. Кроме того, оцените постоянную консольной пружины либо по спецификациям поставщика кантилеверов (менее точно), полученным с помощью интерферометра, либо с помощью калибровки на основе тепловой настройки после калибровки чувствительности к прогибу. Точная калибровка кантилевера имеет важное значение для точного контроля усилия зонда и образца.
  2. После полного втягивания Z-пьезо с поверхности, где наконечник не может достать до поверхности, нажав Вверх в контроллере Z VI, переключитесь в режим PORT в контроллере Z VI и включите лазер возбуждения в флажке Возбуждение VI. Для начала установите режим PORT для работы на нужной частоте в Excitation VI, которая в данном экспериментальном случае составляет 100 кГц, с помощью консоли AC10DS.
  3. Запишите бесконельные колебания близко, но не касаясь поверхности. Затем включите функцию «Обратная связь» в контроллере Z при контакте с поверхностью для записи и нажмите «Correct », чтобы получить колебания кантилевера, когда консоль периодически соприкасается с поверхностью, в нанометрах. Вычтите кривую свободных колебаний из кривой прерывистого контакта, чтобы получить кривую истинного взаимодействия, преобразовав их в пН с помощью постоянной пружины кантилевера (в данном случае 0,1 Н/м).

5. Визуализация HS-AFM

  1. Приготовьте раствор Mg(CH3COO)2 в концентрации 10 мМ. С помощью шприца Гамильтона введите 50 мкл приготовленного раствора 10 мМ Mg(CH3COO)2 в жидкостный канал держателя кантилевера, создавая каплю жидкости, которая охватывает консолев.
  2. Постепенно приближайте консоль к поверхности, нажав кнопку «Пуск » на контроллере Z VI. Как только поверхность будет обнаружена, включите функцию «Обратная связь » и найдите пик кривой взаимодействия на кривых силы ОРТ VI. Найдите минимальное установочное значение усилия, которое обеспечивает правильное отслеживание (ниже 300 пН, чтобы избежать повреждения хрупких биологических образцов).
  3. Установите Размер сканирования в Scan VI на 800 нм x 800 нм, а Line Rate на 100 Гц. Отсканируйте поверхность, щелкнув стрелку Рамка (вниз) в Scan VI, чтобы проверить качество поверхности. Если обнаружены какие-либо загрязнения, устраните проблему, очистив поверхность, консоль и/или держатель консоли, прежде чем продолжить.
  4. После сканирования втяните консоль в сторону от поверхности, нажав кнопку «Извлечь» в контроллере Z VI. Извлеките буферный раствор из отверстия в держателе консоли с помощью шприца Hamilton, чтобы предотвратить проблемы с мертвым объемом.
  5. Приготовьте разбавленный раствор ДНК 3PS из части 1 протокола. Введите 50 мкл разбавленного раствора ДНК 3PS в специальный канал держателя кантилевера.
  6. Начните процесс визуализации, повторив шаги 5.2-5.3, сканируя область размером 800 нм на 800 нм с частотой линии по умолчанию 100 Гц (256 линий × 256 пикселей). После первоначального сканирования отрегулируйте размер и скорость изображения в Scan VI до заданных значений для дальнейшего сбора данных.
  7. Поддерживайте установочное значение входного усилия взаимодействия зонда и образца в поле Z Controller VI Setpoint на самом низком уровне, необходимом для правильного отслеживания (ниже 300 пН) на протяжении всего процесса визуализации, чтобы свести к минимуму повреждение/возмущение образца, если не указано иное. Повторите этот процесс для всех необходимых областей образца.

6. Обработка изображений

  1. Настройте среду для запуска настроенного кода пакетной обработки Pygwy (Python для Gwyddion), гарантируя, что Python и все необходимые библиотеки будут доступны. Более подробную информацию можно найти на веб-сайте Gwyddion,32 из которых правильно установлены в системе. Это гарантирует, что код будет работать без сбоев и сможет получить доступ к необходимым функциям.
  2. Откройте настроенный код пакетной обработки Pygwy (предоставляется по запросу). Это обеспечит доступ к инструментам и функциональным возможностям, необходимым для обработки и анализа изображений.
  3. Начните обработку изображения, выполнив коррекцию горизонтальной медианной линии на изображениях. Этот шаг направлен на устранение любых неровностей или артефактов, присутствующих в строках сканирования, гарантируя, что последующие этапы обработки основаны на точных данных. После удаления фона плоскости примените коррекцию линии. Используйте удаление шрамов для дальнейшего улучшения изображений, устраняя любые нежелательные следы или дефекты, вызванные внешними факторами. Этот шаг улучшает общий визуальный вид изображений.
  4. Улучшите видимость и контрастность изображений, настроив цветовую карту высоты. Это гарантирует, что интересующие вас объекты будут четко визуализированы и выделяться на изображениях.
  5. Выберите обработанные изображения, которые необходимо объединить в видео. Определите желаемую частоту кадров для видео. В этом случае установите его на 7 кадров в секунду (fps).
  6. Рассчитайте длительность каждого кадра. Используйте Fiji (ImageJ) для объединения обработанных изображений в видео. Убедитесь, что частота кадров и продолжительность кадра установлены правильно.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании был успешно отслежен процесс динамической сборки мотивов 3-конечных звезд ДНК в стабильные острова с использованием возможностей АФМ HS-PORT. Этот метод позволил нам зафиксировать сборку этих конструкций в режиме реального времени. На рисунках 2A, B мы получаем четкое сканирование изображения при линейных скоростях 100 Гц и 200 Гц соответственно для скорости порта 100 кГц (размер сканирования 800 нм на 800 нм). Это соответствует 3,9 и 1,95 циклам колебаний на пиксель соответственно. Тем не менее, получение изображений на более высоких скоростях без одновременного увеличения скорости PORT, которое позволило бы провести минимум один цикл колебаний на пиксель, приведет к резкому снижению качества изображения, как видно на рисунке 2C (0,78 цикла колебаний на пиксель). Скорость визуализации ограничена скоростью, с которой кантилевер зондирует поверхность при соответствующем контроле силы зонда-образца, поскольку скорость изменения рельефа становится слишком быстрой, чтобы ее можно было отследить при частоте дискретизации поверхности.

В дополнение к установке достаточно высокой скорости PORT, важно, чтобы кривые PORT содержали информацию, необходимую для управления силами. В частности, гидродинамическое сопротивление и низкая пропускная способность могут заслонить приложенную силу. На рисунке 3 показано отклонение кантилевера на различных расстояниях от поверхности образца и частота возбуждения с использованием в среднем 4096 кривых для уменьшения шума. Синие кривые на рисунке 3A (для скорости порта 100 кГц) и на рисунке 3D (для скорости порта 500 Гц) представляют движение консоли, когда консоль находится далеко от поверхности и свободно колеблется (не касаясь поверхности в течение одного цикла колебаний). Красные кривые показывают прогиб кантилевера, когда кантилевер колеблется близко к поверхности и периодически соприкасается с поверхностью, зондируя образец. Чтобы получить истинную кривую взаимодействия и, следовательно, взаимодействие зонда и образца, мы вычитаем синюю кривую из красной кривой, чтобы получить рисунок 3B, E соответственно. Пример четкой кривой взаимодействия, необходимой для визуализации неразрушающего биообразца, показан на рисунке 3B. Такая конфигурация обеспечивает хорошее качество изображения, показанное на рисунке 3C, где частота PORT составляет 100 кГц. По мере увеличения частоты возбуждения, близкой к резонансу кантилевера, в какой-то момент управление обратной связью ухудшается, даже когда кантилевер демонстрирует колебания достаточной амплитуды, чтобы оторваться от поверхности после увеличения мощности возбуждающего лазера (рис. 3E). Если частота PORT слишком близка к резонансной частоте кантилевера, то резонанс кантилевера ограничивает временную характеристику динамики кантилевера. Таким образом, изгиб кантилевера больше не точно отражает взаимодействие зонда и образца, и кривая взаимодействия, которую мы получаем, затемняется. Это приводит к ухудшению качества изображения, как показано на рисунке 3F.

Нарушение кривой взаимодействия на более высоких частотах PORT также может произойти из-за снижения эффективности срабатывания на более высоких частотах33, что в настоящее время является одним из ограничивающих факторов коммерческих высокоскоростных консолей AFM. Это снижение в конечном итоге достигает порогового уровня в спаде, при котором получение изображений затруднено: амплитуда колебаний может быть недостаточной для отрыва от поверхности, а зонд постоянно находится в контакте, повреждая структуры образца. Чтобы противодействовать снижению амплитуды, вызванному более высокими скоростями PORT, мы исследовали увеличение мощности лазера. Мы использовали головку PORT, которая может достигать более высоких мощностей лазера, чтобы лучше наблюдать этот эффект. Мощность лазера возбуждения, которую мы измерили с помощью измерителя мощности, была разделена на постоянную и переменную составляющие. Общая мощность контролируется путем регулировки в программном обеспечении размаха напряжения (размах напряжения переменного тока) и напряжения постоянного тока (вход смещения постоянного тока), подаваемого на цепь управления лазерным диодом. На рисунке 4A показана амплитуда колебаний кантилевера от размаха до размаха, возникающая в результате увеличения входного напряжения переменного тока от размаха до размаха. Как и ожидалось, амплитуда колебаний хорошо коррелирует со значением входного напряжения переменного тока. Важно отметить, что эти амплитуды от пика к пику выше, чем те, которые обычно используются при визуализации PORT. При визуализации хрупких образцов амплитуда переменного тока составляет порядка 10-30 нм. На рисунке 4B показана амплитуда колебаний кантилевера от размаха до размаха для увеличенных входов смещения постоянного тока. Амплитуда колебаний от размаха до пика остается довольно постоянной в диапазоне напряжений смещения постоянного тока. Мы приписываем небольшие вариации нелинейностям в обнаружении. На рисунке 4C показано увеличение составляющих мощности лазера переменного и постоянного тока в результате увеличения размаха переменного тока. На рисунке 4D показано увеличение составляющих мощности лазера переменного и постоянного тока в результате увеличения смещения входного напряжения постоянного тока.

Эффекты увеличения размаха на входе переменного тока и на входе смещения постоянного тока были протестированы отдельно для определения соответствующего влияния на общую мощность и амплитуду колебаний. Увеличение мощности лазера приводит к разрушению образца, вероятно, из-за повышения температуры, в то время как увеличение амплитуды колебаний увеличивает силу удара пообразцу5. Увеличение исключительно размаха входного напряжения переменного тока окажет меньшее влияние на общее увеличение мощности лазера, как показано на рисунке 4C, и преимущественно увеличит амплитуду колебаний кантилевера (и, следовательно, силу удара), как показано на рисунке 4A. Увеличение входного напряжения смещения постоянного тока окажет большее влияние на увеличение выходной мощности лазера, как показано на рисунке 4D, которое нагревает образец, но оказывает незначительное влияние на амплитуду отклонения, как показано на рисунке 4B. Результаты визуализации представлены на рисунках 4E,F. На рисунке 4E изображена ДНК 3PS для самого низкого входного напряжения переменного тока от размаха до пика (левое изображение, обведено синим цветом) и самого высокого входного напряжения переменного тока от размаха до пика (правое изображение, обведено красным цветом), что приводит к повреждению образца, предположительно из-за более высоких сил. На рисунке 4F показана ДНК 3PS для самого низкого входного напряжения смещения постоянного тока (левое изображение, обведено синим цветом) и самого высокого входного напряжения постоянного тока (правое изображение, обведено красным цветом), где структуры повреждены.

figure-results-1
Рисунок 1: Настройка HS-AFM. (A) Головка PORT на сканере и основании AFM, показывающая (i) ручку для регулировки считываемого лазерного фокуса на консоли, (ii) ручку для регулировки положения считываемого лазера на консоли, (iii) ручку для регулировки горизонтального положения лазера на фотодиоде, (iv) ручку для регулировки вертикального положения лазера на фотодиоде, и (v) ручки для регулировки положения фототермического лазера на консоли. (B) Крупный план кантилевера в поперечном сечении головки с образцом предметного столика, где (vi) - пружинный зажим, удерживающий консоль. Канал для впрыска жидкости отмечен красным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Образец ДНК 3PS визуализирован с помощью AC10 при частоте порта 100 кГц при различных скоростях линии. (A) 100 Гц (3,9 цикла колебаний на пиксель), (B) 200 Гц (1,95 циклов колебаний на пиксель) и (C) 500 Гц (0,78 циклов колебаний на пиксель). Изображения были получены при заданных значениях 350 пН или менее. Масштабная линейка 200 нм. После визуализации была взята силовая кривая для получения чувствительности к отклонению. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Иллюстрация 3: Отклонение кантилевера, кривая взаимодействия и качество изображения на частотах 100 кГц и 500 кГц. (А) отклонение кантилевера (свободные колебания кантилевера близко, но не касаясь поверхности выделены синим цветом, и колебания кантилевера, когда кантилевер периодически соприкасается с поверхностью, выделены красным цветом), (В) кривая взаимодействия и (В) соответствующее качество изображения для скорости порта 100 кГц. (D) Отклонение кантилевера (свободные колебания кантилевера близко, но не касаясь поверхности синим цветом, и колебания кантилевера, когда консоль периодически соприкасается с поверхностью, выделены красным цветом), (E) кривая взаимодействия и (F) соответствующее качество изображения для скорости порта 500 кГц. Изображения были сделаны с линейной частотой 100 Гц. Масштабная линейка 200 нм. После визуализации была взята силовая кривая для получения чувствительности к отклонению. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Влияние размаха на входное напряжение переменного тока на смещение постоянного тока. Влияние увеличения (A) размахового входного напряжения переменного тока и (B) входного напряжения смещения постоянного тока на размаховые колебания кантилевера. Влияние увеличения (C) размахового входного напряжения переменного тока и (D) входного напряжения смещения постоянного тока на мощность лазера переменного и постоянного тока. Минимальное (обведено синим кружком) и максимальное (обведено красным) (E) размаховое входное напряжение переменного тока и (F) входное напряжение смещения постоянного тока. При увеличении размаха входного напряжения переменного тока входное напряжение смещения постоянного тока поддерживалось на уровне 600 мВ. При увеличении входного напряжения смещения постоянного тока размаховое входное напряжение переменного тока поддерживалось на уровне 200 мВ. Целостность образца нарушается в конфигурации с высокой мощностью. Скорость PORT была сохранена на уровне 100 кГц, а линейная скорость на уровне 100 Гц. Масштабная линейка 200 нм. После визуализации была взята силовая кривая для получения чувствительности к отклонению. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

При визуализации хрупких биологических образцов особенно полезны режимы визуализации с внерезонансным постукиванием в АСМ, поскольку они могут напрямую управлять силами взаимодействия зонда с образцом10. Среди них режим PORT выделяется благодаря более высокой скорости колебаний, которую он может достичь, что обеспечивает более высокую скорость сканирования. Поскольку PORT напрямую и только приводит в действие кантилевер с помощью лазера, он позволяет возбуждать на гораздо более высоких частотах, чем обычные режимы внерезонансного постукивания, особенно при использовании ультракоротких консолей с высокими резонансными частотами. Тем не менее, при использовании PORT для HS-AFM необходимо быть осторожным с параметрами визуализации для достижения хорошего качества изображения.

Как показано на рисунке 2, увеличение скорости сканирования без одновременного повышения скорости PORT приведет к низкому качеству визуализации. Во-первых, скорость PORT, приводящая к менее чем одному циклу колебаний на пиксель, резко снижает качество изображения. Скорость визуализации по своей сути ограничена скоростью, с которой кантилевер зондирует поверхность с соответствующим контролем силы зонда и образца. В PORT управление обратной связью дискретно действует в конце каждого цикла колебаний34. Эта ограниченная частота дискретизации вызывает чистую задержку в контуре обратной связи, тем самым ограничивая достижимую полосу обратной связи. Если скорость изменения топографии становится слишком высокой для отслеживания с частотой дискретизации PORT, топография больше не может быть точно обнаружена или отслежена петлей обратной связи. Поэтому скорость PORT необходимо увеличить, чтобы точно разрешать образец на более высоких скоростях поверхности. Тем не менее, резонансная частота консоли по своей сути ограничивает максимальную скорость PORT, которую мы можем использовать. Если скорость PORT близка к резонансной частоте консоли, отклонение, измеренное методом оптического рычага, больше не точно отражает силы зонда и образца. Для получения правильной кривой взаимодействия зонда с образцом как механическая полоса пропускания кантилевера, так и электрическая полоса пропускания системы АСМ должны быть достаточно большими, чтобы обнаруживать компоненты Фурье кривой отклонения, которые в несколько раз превышают частоту PORT. Если какая-либо из этих полос пропускания слишком мала, кривая взаимодействия больше не показывает одностороннее отсечение (рисунок 3A), а скорее синусоидальное поведение (рисунок 3D), которое скрывает фактическое взаимодействие с образцом зонда (рисунок 3E). Это приводит к плохому контролю силы при визуализации (Рисунок 3F). Поэтому для дальнейшего увеличения скорости PORT требуются даже меньшие консоли с высокой резонансной частотой, которые в то же время обладают низкими пружинными постоянными. Такие высокие скорости PORT и скорости сканирования представляют собой проблему для электроники АСМ, требующую тщательного программного обеспечения и электронного проектирования, обеспечивающего требуемую высокую пропускную способность и оптимизированные стратегии цифровой обработки сигналов.

Одним из преимуществ PORT по сравнению с высокоскоростным АСМ с режимом отбора резьбы является возможность настройки скорости отбора проб с поверхности. В режиме постукивания АСМ частота дискретизации поверхности определяется резонансной частотой консоли. При работе в порту значительно ниже резонансной частоты кантилевера мы предполагаем, что каждый поверхностный отбор проб дает достоверную точку данных. Таким образом, ширина полосы обнаружения PORT определяется частотой Найквиста, равной половине скорости PORT. В случае режима отвода ширина полосы обнаружения определяется как f0/2Q35. Благодаря новейшим разработкам в области PORT мы можем постепенно увеличивать скорость PORT вплоть до резонансной частоты. В этой ситуации режим PORT и режим постукивания становятся практически идентичными, поскольку на этих частотах PORT не может точно определить взаимодействие образца между консолью и наконечником, как показано на рисунке 3E. При работе на резонансной частоте недостатком становится большая амплитуда колебаний PORT по сравнению с режимом постукивания. Таким образом, целью увеличения скорости визуализации PORT остается увеличение резонансной частоты кантилевера для поддержания работы со скоростью PORT достаточно ниже резонансной частоты.

По мере того, как мы увеличиваем скорость PORT для обеспечения более высокой скорости сканирования, мы столкнемся с еще одной проблемой, присущей возбуждению фототермического кантилевера: на более высоких частотах амплитуда колебаний уменьшается из-за снижения эффективности фототермического возбуждения, в конечном итоге до такой степени, что нам нужно увеличить мощность лазера, что приведет к повышению температуры образца. Увеличение скорости PORT затруднит балансировку мощности лазера и амплитуды колебаний, поскольку требуется более высокая мощность возбуждения, чтобы компенсировать снижение эффективности срабатывания, которое приводит к повреждению образца. При более высоких уровнях мощности лазера мы больше не могли наблюдать образец, несмотря на использование минимально возможного заданного значения силы (правые панели на рисунках 4E, F). Мы должны быть осторожны в отношении того, как мы будем увеличивать амплитуду колебаний кантилевера и увеличивать мощность лазера. Есть два параметра, которые мы можем настроить для увеличения мощности лазера. Во-первых, входной сигнал переменного тока от размаха до пика, который управляет синусоидальным сигналом, подаваемым на лазерный диод, синусоидально изменяет интенсивность подаваемой лазерной мощности. Во-вторых, входное напряжение смещения постоянного тока, которое удерживает лазерный диод в режиме проводимости и, следовательно, генерации. Увеличение первого приходится совмещать с увеличением второго, так как увеличение амплитуды переменного сигнала, подаваемого на лазер, требует увеличения напряжения постоянного тока, чтобы избежать пересечения порога генерации. Однако на амплитуду колебаний кантилевера влияет только входной сигнал переменного тока от размаха до размаха, как показано на рисунке 4A. Напряжение постоянного тока не приводит к изменению амплитуды колебаний (рис. 4B). Таким образом, если мы хотим синусоидального срабатывания, нам нужно установить напряжение постоянного тока на минимальное напряжение, которое позволяет диодному лазеру находиться в режиме генерации. В качестве альтернативы мы можем свести к минимуму нагрев, периодически выключая и снова включая лазерный диод во время каждого цикла колебаний, а не используя полный синусоидальный привод5. Температурные колебания, необходимые для приведения в действие кантилевера при фототермическом возбуждении, могут быть более эффективно достигнуты путем выключения лазера на части цикла, что снижает температуру кантилевера и, следовательно, приводит к изгибу кантилевера. Это сведет к минимуму энергию, подаваемую к кантилеверу и образцу, и, таким образом, снизит общую температуру в окружающей среде, смягчая тепловое повреждение образца.

В этом исследовании мы показываем пределы параметров визуализации в HS-PORT, которые предотвращают повреждение теплового образца и обеспечивают надлежащий контроль обратной связи. Понимание этих пределов поможет наилучшим образом использовать текущее состояние метода PORT AFM, что позволит лучше контролировать взаимодействие зонда с образцом и поможет сохранить нативное состояние мотивов ДНК в этих измерениях. Благодаря достигнутой высокой скорости сканирования в сочетании с хорошим контролем обратной связи, PORT позволил нам получить четкие и подробные изображения ДНК 3PS и их взаимодействий 7,8,36. Благодаря возможности увеличения скорости визуализации и прямого управления силой зонда-образца23 мы можем более точно отслеживать рост и реорганизацию биомолекулярных сборок и наблюдать детальную динамику.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Рафаэля Зингга за помощь в программировании скрипта Python для обработки серий изображений. ГЭФ выражает признательность за финансирование по линии H2020 - Рамочной программы ЕС по исследованиям и инновациям (2014-2020 гг.); ERC-2017-CoG; ИнСелл; Проект No 773091. VC признает, что этот проект получил финансирование в рамках программы исследований и инноваций Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 754354 Марии Склодовской-Кюри. Это исследование было поддержано Швейцарским национальным научным фондом в рамках гранта 200021_182562.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AC10DSOlympusBL-AC10FS-A2Снят с производства 
Biometra Compact XS/SBiometra GmbH846-025-199 Аппарат электрофореза
Biometra TRIOBiometra GmbH207072XТермоамплификатор для отжига
Пользовательская настройка AFMЛаборатория для био-нано-приборов, Межфакультетский институт биоинженерии, Инженерная школа, Политехническая школа Fé dé rale LausanneМожно получить через Лабораторию био-нано-приборов
EDTAITW ReagentsA5097В буфере отжига
Лазерный измеритель мощностиThorlabsPM100DЦифровой портативный оптический прибор  Консоль счетчика мощности и электроэнергии
Lively 3AP Блок питания, MP-310Major ScienceMP-310Электрофорез Блок питания
MgAc2ABCR GmbHAB544692В буфере для отжига
TBEThermo Scientific327330010Рабочий буфер для электрофореза
TRISBio-Rad1610719В буфере для отжига

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ando, T. High-speed atomic force microscopy and its future prospects. Biophysical Reviews. 10 (2), 285-292 (2017).
  2. Uchihashi, T., Scheuring, S. Applications of high-speed atomic force microscopy to real-time visualization of dynamic biomolecular processes. Biochimica Et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 229-240 (2018).
  3. Eghiaian, F., Rico, F., Colom, A., Casuso, I., Scheuring, S. High-speed atomic force microscopy: Imaging and force spectroscopy. FEBS Letters. 588 (19), 3631-3638 (2014).
  4. Umeda, K., McArthur, S. J., Kodera, N. Spatiotemporal resolution in high-speed atomic force microscopy for studying biological macromolecules in action. Microscopy. 72 (2), 151-161 (2023).
  5. Nievergelt, A. P., Banterle, N., Andany, S. H., Gönczy, P., Fantner, G. E. High-speed photothermal off-resonance atomic force microscopy reveals assembly routes of centriolar scaffold protein SAS-6. Nature Nanotechnology. 13 (8), 696-701 (2018).
  6. Heath, G. R., Scheuring, S. High-speed AFM height spectroscopy reveals µs-dynamics of unlabeled biomolecules. Nature Communications. 9, 4983(2018).
  7. Ando, T. High-Speed Atomic Force Microscopy in Biology. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2022).
  8. Fukuda, S., Ando, T. Faster high-speed atomic force microscopy for imaging of biomolecular processes. Review of Scientific Instruments. 92 (3), 033705(2021).
  9. Jiao, F., Cannon, K. S., Lin, Y. -C., Gladfelter, A. S., Scheuring, S. The hierarchical assembly of septins revealed by high-speed AFM. Nature Communications. 11 (1), 5062(2020).
  10. PeakForce Tapping. , Available from: https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/materials-afm/afm-modes/peakforce-tapping.html (2023).
  11. Wang, S., Hao, C. Principle and application of peak force tapping mode atomic force microscope. International Conference on Cognitive-based Information Processing and Applications (CIPA 2021). , Springer. Singapore. 671-679 (2022).
  12. Krotil, H. -U., Stifter, T., Waschipky, H., Weishaupt, K., Hild, S., Marti, O. Pulsed force mode: a new method for the investigation of surface properties. Surface and Interface Analysis. 27 (5-6), 336-340 (1999).
  13. Rosa-Zeiser, A., Weilandt, E., Hild, S., Marti, O. The simultaneous measurement of elastic, electrostatic and adhesive properties by scanning force microscopy: pulsed-force mode operation. Measurement Science and Technology. 8 (11), 1333(1997).
  14. De Pablo, P. J., Colchero, J., Gómez-Herrero, J., Baró, A. M. Jumping mode scanning force microscopy. Applied Physics Letters. 73 (22), 3300-3302 (1998).
  15. Umeda, N., Ishizaki, S., Uwai, H. Scanning attractive force microscope using photothermal vibration. Journal of Vacuum Science & Technology B. 9 (2), 1318-1322 (1991).
  16. Avakyan, N., Conway, J. W., Sleiman, H. F. Long-range ordering of blunt-ended DNA tiles on supported lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 139 (34), 12027-12034 (2017).
  17. Wang, R., Kuzuya, A., Liu, W., Seeman, N. Blunt-ended DNA stacking interactions in a 3-helix motif. Chemical Communications. 46 (27), 4905-4907 (2010).
  18. Parikka, J. M., Sokołowska, K., Markešević, N., Toppari, J. J. Constructing large 2D lattices out of DNA-tiles. Molecules. 26 (6), 1502(2021).
  19. He, Y., Chen, Y., Liu, H., Ribbe, A. E., Mao, C. Self-assembly of hexagonal DNA two-dimensional (2D) arrays. Journal of the American Chemical Society. 127 (35), 12202-12203 (2005).
  20. Lipid-DNA Method. , Available from: http://sabatinilab.wi.mit.edu/sabatini_public/reverse_transfection/lipid_dna_method.htm (2023).
  21. Pyne, A. L. B., et al. Base-pair resolution analysis of the effect of supercoiling on DNA flexibility and major groove recognition by triplex-forming oligonucleotides. Nature Communications. 12 (1), 1053(2021).
  22. Kielar, C., Zhu, S., Grundmeier, G., Keller, A. Quantitative assessment of tip effects in single-molecule high-speed atomic force microscopy using DNA origami substrates. Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (34), 14336-14341 (2020).
  23. Nievergelt, A. P., et al. Large-range HS-AFM imaging of DNA self-assembly through in situ data-driven control. Small Methods. 3 (7), 1900031(2019).
  24. Caroprese, V., et al. Structural flexibility dominates over binding strength for supramolecular crystallinity. bioRxiv. , (2023).
  25. Welcome to Mao Group. , Available from: https://www.chem.purdue.edu/mao/index.html (2023).
  26. Nievergelt, A. P., Andany, S. H., Adams, J. D., Hannebelle, M. T., Fantner, G. E. Components for high-speed atomic force microscopy optimized for low phase-lag. 2017 IEEE International Conference on Advanced Intelligent Mechatronics (AIM). , Munich, Germany. (2017).
  27. SPM Controller/Software. EPFL. , Available from: https://www.epfl.ch/labs/lbni/spm-controller-software/ (2023).
  28. Open Hardware. EPFL. , Available from: https://www.epfl.ch/labs/lbni/openhardware/ (2023).
  29. AFM head for small cantilevers with photothermal drive. EPFL. , Available from: https://www.epfl.ch/labs/lbni/smallleverhead/ (2023).
  30. AFM head for small cantilevers with photothermal drive. BioLever. , Available from: https://www.keybond.com.tw/index.php?route=product/category&path=87_89_88&lang_code=zh-TW (2023).
  31. BioLever. AppNano. , Available from: https://www.appnano.com/product-page/biolever (2023).
  32. Python Scripting. , Available from: http://gwyddion.net/documentation/user-guide-en/pygwy.html (2023).
  33. Stahl, S. W., Puchner, E. M., Gaub, H. E. Photothermal cantilever actuation for fast single-molecule force spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 80 (7), 073702(2009).
  34. Kangül, M., Asmari, N., Andany, S. H., Penedo, M., Fantner, G. E. Enhanced feedback performance in off-resonance AFM modes through pulse train sampling. arXiv. , (2023).
  35. Giessibl, F. J. Advances in atomic force microscopy. Reviews of Modern Physics. 75 (3), 949-983 (2003).
  36. Ando, T. High-Speed Atomic Force Microscopy (AFM). Encyclopedia of Biophysics. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PORT

Похожие статьи