Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Характеристика мультилекарственных систем оттока у Acinetobacter baumannii с использованием эффлюкс-дефицитного бактериального штамма и системы экспрессии генов с одной копией

1.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66471

⸱

5 января 2024 г.

 , 
1Department of Microbiology, University of Manitoba

В этой статье

Краткое содержание

Мы описываем простую процедуру однокопийной хромосомной комплементации гена насоса оттока с использованием системы экспрессии на основе mini-Tn7 в сконструированный штамм Acinetobacter baumannii с дефицитом эффлюкса. Этот точный генетический инструмент позволяет контролировать экспрессию генов, что является ключом к характеристике насосов оттока у патогенов с множественной лекарственной устойчивостью.

Аннотация

Acinetobacter baumannii признан опасным грамотрицательным патогеном из-за его широкой устойчивости к антибиотикам. Крайне важно понять механизмы, лежащие в основе этой резистентности, чтобы разработать новые и эффективные терапевтические варианты. К сожалению, наша способность исследовать эти механизмы у A. baumannii ограничена нехваткой подходящих инструментов для генетических манипуляций. В данной работе мы описываем методы использования хромосомной системы на основе мини-Tn7 для достижения однокопийной экспрессии гена у штамма A. baumannii , у которого отсутствуют функциональные механизмы оттока типа RND. Однокопийная вставка и индуцированная экспрессия насоса эффлюкса весьма выгодны, так как присутствие оперонов оттока RND на плазмидах с высоким числом копий часто плохо переносится бактериальными клетками. Кроме того, включение рекомбинантных векторов экспрессии мини-Tn7 в хромосому суррогатного хозяина A. baumannii с повышенной чувствительностью к эффлюксу помогает обойти помехи от других насосов оттока. Эта система полезна не только для исследования неохарактеризованных насосов бактериального оттока, но и для оценки эффективности потенциальных ингибиторов, нацеленных на эти насосы.

Введение

Acinetobacter baumannii является наиболее приоритетным патогеном Всемирной организации здравоохранения из-за его устойчивости ко всем классам антибиотиков1. Это условно-патогенный микроорганизм, поражающий в основном госпитализированных, травмированных или людей с ослабленным иммунитетом. A. baumannii в значительной степени уклоняется от антибиотиков с помощью насосов, наиболее актуальными из которых является семейство экспортеров резистентно-узелкового деления (RND)2. Понимание того, как эти насосы работают механически, позволит разработать целевые терапевтические варианты.

Одним из распространенных способов, с помощью которых клеточные процессы могут быть конкретно различимы, является генетическая манипуляция. Тем не менее, инструменты, доступные для генетических исследований A. baumannii, ограничены, и, чтобы еще больше запутать дизайн эксперимента, клинические изоляты часто устойчивы к антибиотикам, обычно используемым для селекции пригенетических манипуляциях. Второе препятствие, с которым приходится сталкиваться при изучении насосов оттока, заключается в том, что они строго регулируются, часто неизвестными факторами, что затрудняет точную изоляцию и приписывание функцийодному насосу. Видя необходимость расширения исследовательского инструментария, мы разработали индуцируемую экспрессирующую систему на основе mini-Tn7, включающую кассету с рекомбиназной мишенью Flp (FRT), которая позволяет удалить маркер выбора 5,6,7 (рис. 1). Эта элегантная система клонирования и экспрессии, впервые созданная для Pseudomonas 8,9,10, была использована для генерации однокопийных комплементов насоса оттока в штамм A. baumannii с дефицитом насоса RND (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: далее — A. baumannii AB258), который мы сгенерировали11. Имея возможность изучать один насос оттока за раз и не перегружать бактериальные клетки высокой экспрессией (как это обычно наблюдается в системах экспрессии на основе плазмид), можно лучше узнать о критических, физиологических аспектах каждого насоса оттока с минимальным вмешательством и меньшим количеством осложнений.

В данной статье описывается, как использовать систему mini-Tn7 для дополнения удаленного гена, представляющего интерес, RND efflux pump adeIJK, в хромосому A. baumannii AB258 с помощью серии неосложненных шагов, выполняемых в течение 9 дней7. Первый набор этапов заключается в повторном введении удаленных генов насоса оттока, клонированных в инсерционную плазмиду на основе мини-Tn7 (рис. 2A) в единственномместе вставки Tn7 после хорошо консервативного гена glmS (рис. 3A). Этому процессу способствует нерепликативная плазмида-хелпер (рис. 2B), которая кодирует гены транспозазы, необходимые для инсертации, управляемой Tn7. Во втором наборе этапов используется эксцизионная плазмида (рис. 2C) для Flp-рекомбиназного удаления гена гентамицина, окруженного сайтами FRT (рис. 3B) для создания немаркированного штамма. Несмотря на то, что эта система используется для выяснения существенной роли и возможных ингибиторов насосов RND в отношении устойчивости к антибиотикам, она может быть использована для исследования любого интересующего гена.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка эксперимента

  1. Очистите плазмиду pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm9 (инсерционная плазмида, рис. 2A) с интересующим геном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь нас интересует ген adeIJK. Конечная концентрация плазмиды должна составлять ≥100 нг/мкл.
  2. Очистите вспомогательную плазмиду (pTNS2)9 и эксцизионную плазмиду (pFLP2ab)6 (рис. 2B, C, соответственно), в идеале до конечной концентрации плазмидной ДНК ≥100 нг/мкл.
  3. Приготовьте 50 мл стерильной сверхчистой воды и 25 мл стерильного бульона LB (Lennox) (см. Таблицу материалов).
  4. Подготовьте не менее 10 LB-агаровых пластин, каждая из которых содержит следующие добавки: обычная (без добавок), гентамицин (Gm) в концентрации 50 мкг/мл, карбенициллин (Cb) в концентрации 200 мкг/мл (для отбора по гену резистентности к ампициллину) и 5% сахарозы (см. Таблицу материалов).
  5. Штамм для индикации на LB-агар вытесняют и инкубируют при 37 °C в течение 16-18 ч. Здесь используют A. baumannii AB258.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол должен выполняться в максимально возможной стерильной среде с использованием горелки Бунзена на столе или в шкафу биологической безопасности. Все расходные материалы (наконечники для пипеток, петли для инокуляции, пробирки для микрофуги и т.д.) должны быть стерильными.

2. Подготовка культуры

  1. Инокулируют одну колонию A. baumannii AB258 в 4 мл бульона LB в стерильную культуральную пробирку объемом 13 мл, используя стерильную инокуляционную петлю или стерильную деревянную инокуляционную палочку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для одного образца и одного контроля используется одна культура объемом 4 мл. Увеличьте количество культур в зависимости от необходимого количества образцов.
  2. Инкубировать в течение ночи при температуре 37 °C при встряхивании (250 об/мин).
  3. Поместите бутылку со стерильной дистиллированной водой (25-50 мл) при температуре 4 °C на ночь для использования на шаге 3.

3. Подготовка электрокомпетентных ячеек

  1. Поместите все стерильные пробирки для микрофуги объемом 1,5 мл (по две на культуру) и стерильные кюветы для электропорации (по две на культуру) на лед (см. Таблицу материалов). Держите образцы на льду как можно дольше на протяжении всей процедуры.
  2. Поместите бутылку со стерильной водой, которая хранилась при температуре 4 °C, на лед.
  3. Переложите 1,5 мл бактериальной культуры на ночь в одну из пробирок для микрофуги объемом 1,5 мл.
  4. Центрифугу при 13 000 x g в течение 2 мин для гранулирования клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование в идеале должно выполняться при 4 °C, но центрифугирование при температуре окружающей среды приемлемо и не вредно.
  5. С помощью пипетки объемом 1 мл удалите всю надосадочную жидкость, не повредив гранулы клеток.
  6. Добавьте еще 1,5 мл бактериальной культуры в ту же пробирку с микрофугой. Центрифуга при 13 000 x g в течение 2 мин, затем удалите весь надосадочную жидкость.
  7. Повторите шаг 3,6 в последний раз с оставшимся 1 мл культуры.
  8. Добавьте 1 мл ледяной стерильной воды в гранулу клетки и суспендируйте с помощью осторожного пипетирования до тех пор, пока гранула не перестанет оставаться на дне пробирки с микрофугой.
  9. Центрифугируют ресуспендированные клетки при 13 000 x g в течение 2 мин.
  10. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1 мл. Не сливайте надосадочную жидкость, особенно на последующих этапах промывки, когда клетки имеют тенденцию образовывать менее компактные гранулы.
  11. Повторите этот шаг промывки ледяной стерильной водой, шаги 3.8–3.10, еще дважды.
  12. Аккуратно ресуспендируйте готовую клеточную гранулу в 200 мкл ледяной стерильной воды.
  13. Переложите 100 мкл конечной клеточной суспензии во вторую ледяную пробирку с микрофугой объемом 1,5 мл. Эта вторая аликвота станет отрицательным регулятором для электропорации. Храните образцы клеток на льду.

4. Электропорация

  1. Предварительно подогреть 1 мл бульона LB и одну пластину с агаром LB +Gm 50 (приготовленную на шаге 1.4) для каждого образца и контролировать в статическом инкубаторе, установленном до 37 °C.
  2. В комбинированном объеме 5 мкл или менее добавьте по 100-200 нг плазмиды-хелпера pTNS2 и инсерционной плазмиды pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK к аликвоте электрокомпетентных клеток.
  3. Перемешайте легким постукиванием кончиками пальцев, чтобы обеспечить полное смешивание плазмид с электрокомпетентными клетками без образования пузырьков.
  4. Добавьте эквивалентный объем стерильной дистиллированной воды в аликвоту ячейки с отрицательным контролем и осторожно перемешайте, как указано выше.
  5. Инкубируют образцы на льду в течение 20 мин.
  6. Перенесите весь образец клетки в ледяную электропорационную кювету, затем поместите кювету обратно на лед. Повторите то же самое для отрицательного образца контрольной ячейки.
  7. Электропорируют образец ячейки.
    1. Включите электропоратор и установите его на напряжение 2,0 кВ (25 мкФ, 200 Ω) (см. Таблицу материалов).
    2. Протрите поверхность кюветы мягкой тканью, чтобы удалить налипший лед или влагу.
    3. Вставьте кювету в электропоратор и подайте удар током.
    4. Немедленно добавьте 0,9 мл предварительно подогретого бульона LB к клеткам в кювете и осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы перемешать клетки со средой.
    5. Переложите всю клеточную суспензию в новую пробирку для микрофуги объемом 1,5 мл (комнатной температуры).
    6. Проверьте значение постоянной времени на электропораторе; Для достижения наилучших результатов это значение должно быть в диапазоне от 4 до 6.
  8. Повторите процедуру электропорации (шаги 4.7.1 - 4.7.6) для отрицательного образца контрольной ячейки.
  9. Инкубируют электропорированные образцы при 37 °C в течение 1 ч при 250 об/мин для восстановления клеток.
  10. С помощью распределителя модификации распределите 100 мкл каждого образца электропорированной ячейки на предварительно нагретую агаровую пластину LB +Gm 50 .
    1. Центрифугируют оставшиеся образцы при 13 000 x g в течение 2 мин, чтобы гранулировать клетки.
    2. Удалив всю надосадочную жидкость с помощью пипетки, повторно суспендируйте клетки в 100 мкл бульона LB.
    3. Распределите каждый образец целиком по отдельным предварительно нагретым пластинам из агара LB +Gm 50 .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность электропорации может зависеть от деформации. При электропорации штамма в первый раз может быть информативно выделить различные объемы или даже разведения образца для электропорации, чтобы убедиться, что полученные планшеты имеют изолированные колонии.
  11. Инкубируют планшеты при 37 °C в течение 16-18 ч.

5. Отбор трансформированных колоний для ПЦР-скрининга

  1. Проверьте электропорационные пластины. Отрицательный контроль не должен иметь колоний; Образец должен иметь отчетливые колонии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Планшеты с колониями на этом этапе и на всех последующих этапах, где производятся агаровые пластины с колониями или заплатками, можно хранить при температуре 4 °C до 3 дней, прежде чем продолжить.
  2. Используя стерильные зубочистки, возьмите до 10 отдельных колоний из агаровых пластин LB + Gm50 и наложите их на свежую агаровую пластину LB + Gm50 .
  3. Инкубируют планшеты при 37 °C в течение 16-18 ч.

6. Верификация хромосомной вставки методом ПЦР колоний

  1. Извлеките из инкубатора агаровые пластины LB + Gm50 , содержащие заплатанные колонии.
  2. С помощью стерильной зубочистки или стерильного наконечника пипетки удалите небольшую порцию (размером с большую колонию) из пластыря в 20 мкл стерильной дистиллированной воды в пробирке для ПЦР объемом 0,2 мл; Хорошо перемешайте. Образец воды должен заметно помутнеть по мере того, как клетки высвобождаются из зубочистки. Подготовьте любое количество образцов, которые необходимо пройти, но 6 должно быть достаточно.
  3. Инкубируют ПЦР-пробирку, содержащую бактериальную суспензию, при 100 °С в течение 5-10 мин.
  4. С помощью мини-центрифуги (см. Таблицу материалов) вращайте образец с фиксированной максимальной скоростью в течение 2 мин, чтобы гранулировать клеточный мусор.
  5. Переложите надосадочную жидкость в новую ПЦР-пробирку объемом 0,2 мл и поместите ее на лед. Этот образец содержит матричную ДНК для реакции ПЦР.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эту матричную ДНК можно хранить при -20 °C перед проведением ПЦР.
  6. Готовят реакционную смесь для ПЦР, содержащую 1x полимеразный буфер, 200 мкМ dNTP, 0,18 мкМ ABglmS2_F_New прямой праймер, 0,18 мкМ обратного праймера Tn7R (табл. 1), 1 ЕД Taq ДНК-полимеразы и 1 мкл подготовленной матричной ДНК в общем объеме 25 мкл. Подготовьте нематричный контроль (NTC), включающий все, кроме матричной ДНК (см. таблицу материалов).
  7. Введите условия реакции в термоциклер: 95 °C в течение 2 мин; 95 °C в течение 30 с, 49 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с, всего 35 циклов; 72 °C в течение 10 мин; Выдержка 12 °C. Запустите примеры.
  8. После добавления красителя, загружающего ДНК, до конечной концентрации 1x, загружают 10 мкл каждой реакции ПЦР на 2% агарозный гель и запускают при 80 В в течение 40 мин. Ожидаемый размер ампликона для этой пары праймеров составляет 382.н. В NTC не должно быть полос.
  9. Определите образцы, из которых был получен ожидаемый продукт ПЦР. Подготовьте полосчатую пластину на агаровых пластинах LB + Gm50 из любого из ПЦР-положительных пластырей; выдерживают при 37 °С в течение 16-18 ч. Цель состоит в том, чтобы создать планшет с одиночными колониями для приготовления запаса глицерина для сохранения этого меченого штамма и в качестве отправной точки для создания немаркированного штамма (описанного ниже).

7. Удаление маркера GmR с помощью pFLP2ab

  1. Следуйте процедуре, описанной в шаге 2: Подготовка культуры. Образец, используемый для приготовления ночной культуры, представляет собой одну колонию из агаровых пластин LB + Gm50 , подготовленную для получения дискретных колоний на стадии 6.9.
  2. Следуйте процедуре, описанной в шаге 3: Подготовка электрокомпетентных ячеек. Подготовьте клетки из ночной культуры к электропорации.
  3. Следуйте процедуре, описанной в шаге 4: Электропорация. В этом случае плазмидой, которую нужно ввести в клетки, является pFLP2ab (100-200 нг), которая удаляет ген резистентности к гентамицину, фланкируя хромосомно вставленный ген, представляющий интерес.
  4. После восстановления клеток в течение 1 ч (шаг 4.9) распределите 100 мкл образца электропорированной ячейки на предварительно нагретую агаровую пластину LB +Cb 200 (приготовленную на стадии 1.4). Это селективное давление гарантирует, что будут расти только клетки, содержащие эксцизионную плазмиду pFLP2ab .
  5. Инкубируют планшеты при 37 °C в течение 16-18 ч.
  6. Проверьте пластину на наличие колоний. Отрицательная контрольная пластина не должна иметь колоний; планшет для образцов агара LB +Cb 200 должен иметь отчетливые колонии.
  7. Используя стерильные зубочистки, наложите до 20 изолированных колоний на агаровую пластину LB + Cb200 и агаровую пластину LB + Gm50 .
  8. Инкубируют планшеты в течение 16-18 ч при 37 °C.
  9. Проверьте пластины на наличие заплаток. У клонов, которые растут на агаровой пластине LB + Cb200 , но не на агаровой пластине LB + Gm50 , ген резистентности к гентамицину был удален из оригинальной вставки.
  10. Выберите пластыри, устойчивые к карбенициллину и чувствительные к гентамицину, для нанесения полос на отдельные пластины из агара LB, дополненные 5% (w/v) сахарозой, которая вызывает изгнание плазмиды pFLP2ab из бактерий. Выберите до 10 колоний.
  11. Инкубируют планшеты в течение 16-18 ч при 37 °C.
  12. Проверьте таблички на наличие колоний.
  13. В качестве окончательного подтверждения потери плазмиды pFLP2ab следует перекрестно заплатить 4-6 изолированных колоний из 5% сахарозы на агаровую пластину LB + Cb200 и агаровую пластину LB.
  14. Инкубируют планшеты в течение 16-18 ч при 37 °C.
  15. Выберите клон, который растет на агаровой пластине LB и чувствителен к карбенициллину, для приготовления глицеринового материала для сохранения этого немаркированного штамма.
    1. Генетическая верификация немаркированного штамма может быть проведена с помощью ПЦР колонии (шаг 6: Проверка хромосомной вставки с помощью ПЦР колонии) с использованием праймеров, нацеленных на ген резистентности к гентамицину.
    2. Готовят реакционную смесь для ПЦР, содержащую 1x полимеразный буфер, 200 мкМ dNTP, 0,18 мкМ Gm_F прямой праймер, 0,18 мкМ Gm_R обратный праймер (табл. 1), 1 ЕД Taq ДНК-полимеразы и 1 мкл подготовленной матричной ДНК в общем объеме 25 мкл. Подготовьте контрольный материал без матрицы (NTC), включающий все, кроме матричной ДНК, и положительный контроль с использованием ДНК маркированного штамма.
    3. Введите условия реакции в термоциклер: 95 °C в течение 2 мин; 95 °C в течение 30 с, 50 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 40 с, всего 35 циклов; 72 °C в течение 10 мин; Выдержка 12 °C. Запустите примеры.
    4. После добавления красителя с загрузкой ДНК до конечной концентрации 1x загружают 10 мкл каждой реакции ПЦР на 1% агарозный гель и запускают при 80 В в течение 40 мин. Ожидаемый размер ампликона для этой пары праймеров составляет 525.н. Положительный контроль должен иметь одну полосу; сэмплы и НТЦ не должны иметь полос.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Процедура хромосомного введения занимает всего 2 часа в течение 3 дней, чтобы увидеть результат - колонии, растущие на селективной агаровой пластине (рис. 1A-C). Ожидаемое число колоний на трансформационной пластине зависит от деформации: можно увидеть 20-30 или даже сотни колоний, так как вставка Tn7 на участкахTn7 специфична и эффективна9. Наложение колоний трансформационных пластин на селективную среду (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Несмотря на то, что эта процедура хромосомной вставки индуцируемой системы экспрессии генов с одной копией у A. baumannii технически проста и не трудоемка, необходимо подчеркнуть несколько важных этапов. Во-первых, подготовка компетентных клеток должна производиться на льду, насколько это возможно, так как клетки становятся хрупкими при замене среды ледяной водой. В идеале этапы центрифугирования выполняются при температуре 4 °C, но допустимо центрифугирование при комнатной температуре. Учитывая возрастающую хру...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Discovery Grant от Совета по естественным наукам и инженерии Канады для AK. Схемы, используемые на рисунках, созданы с помощью BioRender.com.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 мл ПЦР-пробиркиVWR20170-012Для препаратов колоний кипячения и ПЦР-реакций
1,5 мл микрофуги пробиркиSarstedt72-690-301Общее использование
13-мл пробирки для культивирования, PyrexFisher14-957KЖидкие культуральные пробирки
6x буфер для загрузки ДНКFroggabioLD010Агарозный гель для электрофореза загрузка образца краситель
Уксусная кислота, ледниковаяFisher351271-212Агарозный гель бегущий буферный компонент
AgarBioshopAGR003Твердая питательная среда
AgaroseBioBasicD0012Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР-реакции; используется в концентрации 0,8&нда; 2%
Аппарат для электрофореза в агарозном гелеFisher29-237-54Электрофорез в агарозном геле; выделение продуктов реакции ПЦР
КарбенициллинFisher50841231селективных сред
Укупорки пробирок для культурFisher13-684-138Крышка из нержавеющей стали для пробирок с культивированием 13 мл
Набор дезоксинуклеотидтрифосфата (dNTP)BiobasicDD0058компонент реакции ПЦР; поставляется по 100 мМ каждый dATP, dCTP, dGTP, dTTP; перемешанный и разбавленный по 10 мМ каждый dNTP
Сухая ванна/блочный нагревательFisher88860023Isotemp цифровая сухая ванна для приготовления кипячения
Электропорационные кюветыVWR89047-208мм Электропораторы с круглым колпачком
ЭлектропораторCole Parmer940000009110 В переменного тока, 60 Гц электропоратор
Бромид этидииFisherBP102-1Визуализация продуктов реакции ПЦР и ДНК-маркера в агарозном геле
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)VWRCA-EM4050Агарозный гель бегущий буферный компонент
ГентамицинБиобазовый GB0217Для приготовления селективных сред
ГлицеринFisherG33Подготовка бактериальных запасов для длительного хранения в ультранизкоморозильной камере
Инкубатор (встряхивание)Нью-Брансуик ScientificM1352-0000Excella E24 Инкубатор Шейкер для выращивания жидких культур
Инкубатор (статический)Fisher11-690-550DИнкубатор Isotemp Модель печи 550D для выращивания твердых (LB агар) культур
Петля инокуляцииSarstedt86.1562.050Нарезка колоний на агаровые пластины
Разбрасыватель инокуляцииSarstedt86.1569.005Разбрасывание культура на агаровых тарелках
Бульон лизогения (LB) бульон, LennoxFisherBP1427Жидкая питательная среда (20 г/л: 5 г/л натрия хлорид, 10 г/л триптон, 5 г/л дрожжевой экстракт)
MicrofugeFisher75002431Sorvall Legend Micro 17 для центрифугирования образцов
Мини-центрифугаFisherS67601Bцентрифугирование 0,2 мл ПЦР-пробирок чашки
ПетриSPL Life Sciences10090Для твердых питательных сред (агаровые пластины): 90 x 15 мм
Пипетки Различныеодноканальные пипетки Mandel Gilson (P10, P20, P200, P1000)
Источник питанияBiorad1645050PowerPac Базовый источник питания для электрофореза
ПраймерыIDTNAПЦР реакционный компонент; специфичный для интересующего гена; приготовлен при 100 мкм; M как указано в спецификации продукта
SucroseBioBasicSB0498Для получения контрселективных сред для удаления плазмиды pFLP2ab из трансформированной A. baumannii
Taq ДНК-полимеразыFroggaBioT-500ПЦР реакционного компонента; полимераза поставляется с 10-кратным буфером
ТермоамплификаторBiorad1861096модели T100 для ПЦР
ЗубочисткиFisherS24559Для заплатки колоний на агаровых пластинах
Тризма Основа SigmaT1503Агарозный гель бегущий буферный компонент
Сверхчистая водаMillipore SigmaZLXLSD51040Система очистки воды MilliQ: ультрачистая вода для приготовления сред и растворов, а также промывки клеток
Широкий спектр ДНК-маркеровBiobasicM103R-2Определение размера ПЦР-продуктов на агарозном геле
Деревянные инокуляционные палочкиФишер29-801-02Посев культур с колониями из агаровых пластин
2

Ссылки

  1. Prioritization of pathogens to guide research, discovery, research and development of new antibiotics for drug-resistant bacterial infections, including tuberculosis. World Health Organization. , Geneva, Switzerland . Available from: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-EMP-IAU-2017.12 (2017).
  2. Kornelsen, V., Kumar, A. Update on multidrug resistance efflux pumps in Acinetobacter spp. Antimicrob Agents Chemother. 65 (7), e00514-00521 (2021).
  3. Sykes, E. M., Deo, S., Kumar, A. Recent advances in genetic tools for Acinetobacter baumannii. Front Genet. 11, 601380(2020).
  4. Kumar, A., Chua, K. L., Schweizer, H. P. Method for regulated expression of single-copy efflux pump genes in a surrogate Pseudomonas aeruginosa strain: identification of the BpeEF-OprC chloramphenicol and trimethoprim efflux pump of Burkholderia pseudomallei 1026b. Antimicrob Agents Chemother. 50 (10), 3460-3463 (2006).
  5. Kumar, A., Dalton, C., Cortez-Cordova, J., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for single copy gene cloning in Acinetobacter baumannii. J Microbiol Methods. 82 (3), 296-300 (2010).
  6. Ducas-Mowchun, K., et al. Next generation of Tn7-based single-copy insertion elements for use in multi- and pan-drug resistant strains of Acinetobacter baumannii. Appl Environ Microbiol. 85 (11), e00066-00119 (2019).
  7. Ducas-Mowchun, K., De Silva, P. M., Patidar, R., Schweizer, H. P., Kumar, A. Tn7-based single-copy insertion vectors for Acinetobacter baumannii. Methods Mol Biol. 1946, 135-150 (2019).
  8. Schweizer, H. P. Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics. J Mol Microbiol Biotechnol. 5 (2), 67-77 (2003).
  9. Choi, K. H., et al. A Tn7-based broad-range bacterial cloning and expression system. Nat Methods. 2 (6), 443-448 (2005).
  10. Choi, K. H., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat Protoc. 1 (1), 153-161 (2006).
  11. Kornelsen, V., Unger, M., Kumar, A. Atorvastatin does not display an antimicrobial activity on its own nor potentiates the activity of other antibiotics against Acinetobacter baumannii ATCC 17978 or A. baumannii AB030. Access Microbiol. 3, 000288(2021).
  12. Reyrat, J. M., et al. Counterselectable markers: untapped tools for bacterial genetics and pathogenesis. Infect Immun. 66 (9), 4011-4017 (1998).
  13. Gay, P., et al. Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 164, 918-921 (1985).
  14. Kyriakidis, I., Vasileiou, E., Pana, Z. D. Tragiannidis, Acinetobacter baumannii antibiotic resistance mechanisms. Pathogens. 10 (3), 373(2021).
  15. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. CLSI Supplement M100., 31st edn. , Clinical and Laboratory Standards Institute. (2021).
  16. Dijkshoorn, L., Nemec, A., Seifert, H. An increasing threat in hospitals: multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nature Reviews Microbiology. 5, 939-951 (2007).
  17. Yildirim, S., Thompson, M. G., Jacobs, A. C., Zurawski, D. V., Kirkup, B. C. Evaluation of parameters for high efficiency transformation of Acinetobacter baumannii. Sci Rep. 25 (6), 22110(2016).
  18. Thompson, M. G., Yildirim, S. Transformation of Acinetobacter baumannii: electroporation. Methods Mol Biol. 1946, 69-74 (2019).
  19. Choi, K. H., DeShazer, D., Schweizer, H. P. Mini-Tn7 insertion in bacteria with multiple glmS-linked attTn7 sites: example Burkolderia mallei ATCC 2334. Nat Protoc. 1 (1), 162-169 (2006).
  20. Jittawuttipoka, T., et al. Mini-Tn7 vectors as genetic tools for gene cloning at a single copy number in an industrially important and phytopathogenic bacteria, Xanthomonas spp. FEMS Microbiol Lett. 298 (1), 111-117 (2009).
  21. Pérez-Varela, M., Tierney, A. R. P., Kim, J. S., Vázquez-Torres, A., Rather, P. Characterization of RelA in Acinetobacter baumannii. J Bacteriol. 202 (12), e00045(2020).
  22. Williams, C. L., et al. Characterization of Acinetobacter baumannii copper resistance reveals a role in virulence. Front Microbiol. 11, 16(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Экспрессия эффлюксных насосовхромосомная система Mini-Tn7механизмы эффлюкса RNDэлектрокомпетентные клеткискрининг методом колониальной ПЦРантибиотикорезистентностьинсерция гена
Характеристика мультилекарственных систем оттока у Acinetobacter baumannii с использованием эффлюкс-дефицитного бактериального штамма и системы экспрессии генов с одной копией
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.