Характеристика мультилекарственных систем оттока у Acinetobacter baumannii с использованием эффлюкс-дефицитного бактериального штамма и системы экспрессии генов с одной копией

Summary

Мы описываем простую процедуру однокопийной хромосомной комплементации гена насоса оттока с использованием системы экспрессии на основе mini-Tn7 в сконструированный штамм Acinetobacter baumannii с дефицитом эффлюкса. Этот точный генетический инструмент позволяет контролировать экспрессию генов, что является ключом к характеристике насосов оттока у патогенов с множественной лекарственной устойчивостью.

Abstract

Acinetobacter baumannii признан опасным грамотрицательным патогеном из-за его широкой устойчивости к антибиотикам. Крайне важно понять механизмы, лежащие в основе этой резистентности, чтобы разработать новые и эффективные терапевтические варианты. К сожалению, наша способность исследовать эти механизмы у A. baumannii ограничена нехваткой подходящих инструментов для генетических манипуляций. В данной работе мы описываем методы использования хромосомной системы на основе мини-Tn7 для достижения однокопийной экспрессии гена у штамма A. baumannii , у которого отсутствуют функциональные механизмы оттока типа RND. Однокопийная вставка и индуцированная экспрессия насоса эффлюкса весьма выгодны, так как присутствие оперонов оттока RND на плазмидах с высоким числом копий часто плохо переносится бактериальными клетками. Кроме того, включение рекомбинантных векторов экспрессии мини-Tn7 в хромосому суррогатного хозяина A. baumannii с повышенной чувствительностью к эффлюксу помогает обойти помехи от других насосов оттока. Эта система полезна не только для исследования неохарактеризованных насосов бактериального оттока, но и для оценки эффективности потенциальных ингибиторов, нацеленных на эти насосы.

Introduction

Acinetobacter baumannii является наиболее приоритетным патогеном Всемирной организации здравоохранения из-за его устойчивости ко всем классам антибиотиков¹. Это условно-патогенный микроорганизм, поражающий в основном госпитализированных, травмированных или людей с ослабленным иммунитетом. A. baumannii в значительной степени уклоняется от антибиотиков с помощью насосов, наиболее актуальными из которых является семейство экспортеров резистентно-узелкового деления (RND)². Понимание того, как эти насосы работают механически, позволит разработать целевые терапевтические варианты.

Одним из распространенных способов, с помощью которых клеточные процессы могут быть конкретно различимы, является генетическая манипуляция. Тем не менее, инструменты, доступные для генетических исследований A. baumannii, ограничены, и, чтобы еще больше запутать дизайн эксперимента, клинические изоляты часто устойчивы к антибиотикам, обычно используемым для селекции при^{генетических} манипуляциях. Второе препятствие, с которым приходится сталкиваться при изучении насосов оттока, заключается в том, что они строго регулируются, часто неизвестными факторами, что затрудняет точную изоляцию и приписывание функций^{одному насосу}. Видя необходимость расширения исследовательского инструментария, мы разработали индуцируемую экспрессирующую систему на основе mini-Tn7, включающую кассету с рекомбиназной мишенью Flp (FRT), которая позволяет удалить маркер выбора ^5,6,7 (рис. 1). Эта элегантная система клонирования и экспрессии, впервые созданная для Pseudomonas ^8,9,10, была использована для генерации однокопийных комплементов насоса оттока в штамм A. baumannii с дефицитом насоса RND (ATCC 17978::ΔadeIJK,Δ adeFGH,Δ adeAB: далее — A. baumannii AB258), который мы сгенерировали¹¹. Имея возможность изучать один насос оттока за раз и не перегружать бактериальные клетки высокой экспрессией (как это обычно наблюдается в системах экспрессии на основе плазмид), можно лучше узнать о критических, физиологических аспектах каждого насоса оттока с минимальным вмешательством и меньшим количеством осложнений.

В данной статье описывается, как использовать систему mini-Tn7 для дополнения удаленного гена, представляющего интерес, RND efflux pump adeIJK, в хромосому A. baumannii AB258 с помощью серии неосложненных шагов, выполняемых в течение 9 дней⁷. Первый набор этапов заключается в повторном введении удаленных генов насоса оттока, клонированных в инсерционную плазмиду на основе мини-Tn7 (рис. 2A) в единственномместе вставки Tn7 после хорошо консервативного гена glmS (рис. 3A). Этому процессу способствует нерепликативная плазмида-хелпер (рис. 2B), которая кодирует гены транспозазы, необходимые для инсертации, управляемой Tn7. Во втором наборе этапов используется эксцизионная плазмида (рис. 2C) для Flp-рекомбиназного удаления гена гентамицина, окруженного сайтами FRT (рис. 3B) для создания немаркированного штамма. Несмотря на то, что эта система используется для выяснения существенной роли и возможных ингибиторов насосов RND в отношении устойчивости к антибиотикам, она может быть использована для исследования любого интересующего гена.

Protocol

1. Подготовка эксперимента

1. Очистите плазмиду pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (инсерционная плазмида, рис. 2A) с интересующим геном.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь нас интересует ген adeIJK. Конечная концентрация плазмиды должна составлять ≥100 нг/мкл.
2. Очистите вспомогательную плазмиду (pTNS2)⁹ и эксцизионную плазмиду (pFLP2^ab)⁶ (рис. 2B, C, соответственно), в идеале до конечной концентрации плазмидной ДНК ≥100 нг/мкл.
3. Приготовьте 50 мл стерильной сверхчистой воды и 25 мл стерильного бульона LB (Lennox) (см. Таблицу материалов).
4. Подготовьте не менее 10 LB-агаровых пластин, каждая из которых содержит следующие добавки: обычная (без добавок), гентамицин (Gm) в концентрации 50 мкг/мл, карбенициллин (Cb) в концентрации 200 мкг/мл (для отбора по гену резистентности к ампициллину) и 5% сахарозы (см. Таблицу материалов).
5. Штамм для индикации на LB-агар вытесняют и инкубируют при 37 °C в течение 16-18 ч. Здесь используют A. baumannii AB258.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол должен выполняться в максимально возможной стерильной среде с использованием горелки Бунзена на столе или в шкафу биологической безопасности. Все расходные материалы (наконечники для пипеток, петли для инокуляции, пробирки для микрофуги и т.д.) должны быть стерильными.

2. Подготовка культуры

1. Инокулируют одну колонию A. baumannii AB258 в 4 мл бульона LB в стерильную культуральную пробирку объемом 13 мл, используя стерильную инокуляционную петлю или стерильную деревянную инокуляционную палочку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для одного образца и одного контроля используется одна культура объемом 4 мл. Увеличьте количество культур в зависимости от необходимого количества образцов.
2. Инкубировать в течение ночи при температуре 37 °C при встряхивании (250 об/мин).
3. Поместите бутылку со стерильной дистиллированной водой (25-50 мл) при температуре 4 °C на ночь для использования на шаге 3.

3. Подготовка электрокомпетентных ячеек

1. Поместите все стерильные пробирки для микрофуги объемом 1,5 мл (по две на культуру) и стерильные кюветы для электропорации (по две на культуру) на лед (см. Таблицу материалов). Держите образцы на льду как можно дольше на протяжении всей процедуры.
2. Поместите бутылку со стерильной водой, которая хранилась при температуре 4 °C, на лед.
3. Переложите 1,5 мл бактериальной культуры на ночь в одну из пробирок для микрофуги объемом 1,5 мл.
4. Центрифугу при 13 000 x g в течение 2 мин для гранулирования клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугирование в идеале должно выполняться при 4 °C, но центрифугирование при температуре окружающей среды приемлемо и не вредно.
5. С помощью пипетки объемом 1 мл удалите всю надосадочную жидкость, не повредив гранулы клеток.
6. Добавьте еще 1,5 мл бактериальной культуры в ту же пробирку с микрофугой. Центрифуга при 13 000 x g в течение 2 мин, затем удалите весь надосадочную жидкость.
7. Повторите шаг 3,6 в последний раз с оставшимся 1 мл культуры.
8. Добавьте 1 мл ледяной стерильной воды в гранулу клетки и суспендируйте с помощью осторожного пипетирования до тех пор, пока гранула не перестанет оставаться на дне пробирки с микрофугой.
9. Центрифугируют ресуспендированные клетки при 13 000 x g в течение 2 мин.
10. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1 мл. Не сливайте надосадочную жидкость, особенно на последующих этапах промывки, когда клетки имеют тенденцию образовывать менее компактные гранулы.
11. Повторите этот шаг промывки ледяной стерильной водой, шаги 3.8–3.10, еще дважды.
12. Аккуратно ресуспендируйте готовую клеточную гранулу в 200 мкл ледяной стерильной воды.
13. Переложите 100 мкл конечной клеточной суспензии во вторую ледяную пробирку с микрофугой объемом 1,5 мл. Эта вторая аликвота станет отрицательным регулятором для электропорации. Храните образцы клеток на льду.

4. Электропорация

1. Предварительно подогреть 1 мл бульона LB и одну пластину с агаром LB +^{Gm 50} (приготовленную на шаге 1.4) для каждого образца и контролировать в статическом инкубаторе, установленном до 37 °C.
2. В комбинированном объеме 5 мкл или менее добавьте по 100-200 нг плазмиды-хелпера pTNS2 и инсерционной плазмиды pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm-adeIJK к аликвоте электрокомпетентных клеток.
3. Перемешайте легким постукиванием кончиками пальцев, чтобы обеспечить полное смешивание плазмид с электрокомпетентными клетками без образования пузырьков.
4. Добавьте эквивалентный объем стерильной дистиллированной воды в аликвоту ячейки с отрицательным контролем и осторожно перемешайте, как указано выше.
5. Инкубируют образцы на льду в течение 20 мин.
6. Перенесите весь образец клетки в ледяную электропорационную кювету, затем поместите кювету обратно на лед. Повторите то же самое для отрицательного образца контрольной ячейки.
7. Электропорируют образец ячейки.
   1. Включите электропоратор и установите его на напряжение 2,0 кВ (25 мкФ, 200 Ω) (см. Таблицу материалов).
   2. Протрите поверхность кюветы мягкой тканью, чтобы удалить налипший лед или влагу.
   3. Вставьте кювету в электропоратор и подайте удар током.
   4. Немедленно добавьте 0,9 мл предварительно подогретого бульона LB к клеткам в кювете и осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы перемешать клетки со средой.
   5. Переложите всю клеточную суспензию в новую пробирку для микрофуги объемом 1,5 мл (комнатной температуры).
   6. Проверьте значение постоянной времени на электропораторе; Для достижения наилучших результатов это значение должно быть в диапазоне от 4 до 6.
8. Повторите процедуру электропорации (шаги 4.7.1 - 4.7.6) для отрицательного образца контрольной ячейки.
9. Инкубируют электропорированные образцы при 37 °C в течение 1 ч при 250 об/мин для восстановления клеток.
10. С помощью распределителя модификации распределите 100 мкл каждого образца электропорированной ячейки на предварительно нагретую агаровую пластину LB +^{Gm 50} .
    1. Центрифугируют оставшиеся образцы при 13 000 x g в течение 2 мин, чтобы гранулировать клетки.
    2. Удалив всю надосадочную жидкость с помощью пипетки, повторно суспендируйте клетки в 100 мкл бульона LB.
    3. Распределите каждый образец целиком по отдельным предварительно нагретым пластинам из агара LB +^{Gm 50} .
       ПРИМЕЧАНИЕ: Эффективность электропорации может зависеть от деформации. При электропорации штамма в первый раз может быть информативно выделить различные объемы или даже разведения образца для электропорации, чтобы убедиться, что полученные планшеты имеют изолированные колонии.
11. Инкубируют планшеты при 37 °C в течение 16-18 ч.

5. Отбор трансформированных колоний для ПЦР-скрининга

1. Проверьте электропорационные пластины. Отрицательный контроль не должен иметь колоний; Образец должен иметь отчетливые колонии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Планшеты с колониями на этом этапе и на всех последующих этапах, где производятся агаровые пластины с колониями или заплатками, можно хранить при температуре 4 °C до 3 дней, прежде чем продолжить.
2. Используя стерильные зубочистки, возьмите до 10 отдельных колоний из агаровых пластин LB + Gm⁵⁰ и наложите их на свежую агаровую пластину LB + Gm⁵⁰ .
3. Инкубируют планшеты при 37 °C в течение 16-18 ч.

6. Верификация хромосомной вставки методом ПЦР колоний

1. Извлеките из инкубатора агаровые пластины LB + Gm⁵⁰ , содержащие заплатанные колонии.
2. С помощью стерильной зубочистки или стерильного наконечника пипетки удалите небольшую порцию (размером с большую колонию) из пластыря в 20 мкл стерильной дистиллированной воды в пробирке для ПЦР объемом 0,2 мл; Хорошо перемешайте. Образец воды должен заметно помутнеть по мере того, как клетки высвобождаются из зубочистки. Подготовьте любое количество образцов, которые необходимо пройти, но 6 должно быть достаточно.
3. Инкубируют ПЦР-пробирку, содержащую бактериальную суспензию, при 100 °С в течение 5-10 мин.
4. С помощью мини-центрифуги (см. Таблицу материалов) вращайте образец с фиксированной максимальной скоростью в течение 2 мин, чтобы гранулировать клеточный мусор.
5. Переложите надосадочную жидкость в новую ПЦР-пробирку объемом 0,2 мл и поместите ее на лед. Этот образец содержит матричную ДНК для реакции ПЦР.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эту матричную ДНК можно хранить при -20 °C перед проведением ПЦР.
6. Готовят реакционную смесь для ПЦР, содержащую 1x полимеразный буфер, 200 мкМ dNTP, 0,18 мкМ ABglmS2_F_New прямой праймер, 0,18 мкМ обратного праймера Tn7R (табл. 1), 1 ЕД Taq ДНК-полимеразы и 1 мкл подготовленной матричной ДНК в общем объеме 25 мкл. Подготовьте нематричный контроль (NTC), включающий все, кроме матричной ДНК (см. таблицу материалов).
7. Введите условия реакции в термоциклер: 95 °C в течение 2 мин; 95 °C в течение 30 с, 49 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с, всего 35 циклов; 72 °C в течение 10 мин; Выдержка 12 °C. Запустите примеры.
8. После добавления красителя, загружающего ДНК, до конечной концентрации 1x, загружают 10 мкл каждой реакции ПЦР на 2% агарозный гель и запускают при 80 В в течение 40 мин. Ожидаемый размер ампликона для этой пары праймеров составляет 382.н. В NTC не должно быть полос.
9. Определите образцы, из которых был получен ожидаемый продукт ПЦР. Подготовьте полосчатую пластину на агаровых пластинах LB + Gm⁵⁰ из любого из ПЦР-положительных пластырей; выдерживают при 37 °С в течение 16-18 ч. Цель состоит в том, чтобы создать планшет с одиночными колониями для приготовления запаса глицерина для сохранения этого меченого штамма и в качестве отправной точки для создания немаркированного штамма (описанного ниже).

7. Удаление маркера Gm^R с помощью pFLP2^ab

1. Следуйте процедуре, описанной в шаге 2: Подготовка культуры. Образец, используемый для приготовления ночной культуры, представляет собой одну колонию из агаровых пластин LB + Gm⁵⁰ , подготовленную для получения дискретных колоний на стадии 6.9.
2. Следуйте процедуре, описанной в шаге 3: Подготовка электрокомпетентных ячеек. Подготовьте клетки из ночной культуры к электропорации.
3. Следуйте процедуре, описанной в шаге 4: Электропорация. В этом случае плазмидой, которую нужно ввести в клетки, является pFLP2^ab (100-200 нг), которая удаляет ген резистентности к гентамицину, фланкируя хромосомно вставленный ген, представляющий интерес.
4. После восстановления клеток в течение 1 ч (шаг 4.9) распределите 100 мкл образца электропорированной ячейки на предварительно нагретую агаровую пластину LB +^{Cb 200} (приготовленную на стадии 1.4). Это селективное давление гарантирует, что будут расти только клетки, содержащие эксцизионную плазмиду pFLP2^ab .
5. Инкубируют планшеты при 37 °C в течение 16-18 ч.
6. Проверьте пластину на наличие колоний. Отрицательная контрольная пластина не должна иметь колоний; планшет для образцов агара LB +^{Cb 200} должен иметь отчетливые колонии.
7. Используя стерильные зубочистки, наложите до 20 изолированных колоний на агаровую пластину LB + Cb²⁰⁰ и агаровую пластину LB + Gm⁵⁰ .
8. Инкубируют планшеты в течение 16-18 ч при 37 °C.
9. Проверьте пластины на наличие заплаток. У клонов, которые растут на агаровой пластине LB + Cb²⁰⁰ , но не на агаровой пластине LB + Gm⁵⁰ , ген резистентности к гентамицину был удален из оригинальной вставки.
10. Выберите пластыри, устойчивые к карбенициллину и чувствительные к гентамицину, для нанесения полос на отдельные пластины из агара LB, дополненные 5% (w/v) сахарозой, которая вызывает изгнание плазмиды pFLP2^ab из бактерий. Выберите до 10 колоний.
11. Инкубируют планшеты в течение 16-18 ч при 37 °C.
12. Проверьте таблички на наличие колоний.
13. В качестве окончательного подтверждения потери плазмиды pFLP2^ab следует перекрестно заплатить 4-6 изолированных колоний из 5% сахарозы на агаровую пластину LB + Cb²⁰⁰ и агаровую пластину LB.
14. Инкубируют планшеты в течение 16-18 ч при 37 °C.
15. Выберите клон, который растет на агаровой пластине LB и чувствителен к карбенициллину, для приготовления глицеринового материала для сохранения этого немаркированного штамма.
    1. Генетическая верификация немаркированного штамма может быть проведена с помощью ПЦР колонии (шаг 6: Проверка хромосомной вставки с помощью ПЦР колонии) с использованием праймеров, нацеленных на ген резистентности к гентамицину.
    2. Готовят реакционную смесь для ПЦР, содержащую 1x полимеразный буфер, 200 мкМ dNTP, 0,18 мкМ Gm_F прямой праймер, 0,18 мкМ Gm_R обратный праймер (табл. 1), 1 ЕД Taq ДНК-полимеразы и 1 мкл подготовленной матричной ДНК в общем объеме 25 мкл. Подготовьте контрольный материал без матрицы (NTC), включающий все, кроме матричной ДНК, и положительный контроль с использованием ДНК маркированного штамма.
    3. Введите условия реакции в термоциклер: 95 °C в течение 2 мин; 95 °C в течение 30 с, 50 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 40 с, всего 35 циклов; 72 °C в течение 10 мин; Выдержка 12 °C. Запустите примеры.
    4. После добавления красителя с загрузкой ДНК до конечной концентрации 1x загружают 10 мкл каждой реакции ПЦР на 1% агарозный гель и запускают при 80 В в течение 40 мин. Ожидаемый размер ампликона для этой пары праймеров составляет 525.н. Положительный контроль должен иметь одну полосу; сэмплы и НТЦ не должны иметь полос.

Results

Процедура хромосомного введения занимает всего 2 часа в течение 3 дней, чтобы увидеть результат - колонии, растущие на селективной агаровой пластине (рис. 1A-C). Ожидаемое число колоний на трансформационной пластине зависит от деформации: можно увидеть 20-30 или даже сотни колоний, так как вставка Tn7 на участкахTn7 специфична и эффективна⁹. Наложение колоний трансформационных пластин на селективную среду (рис. 4A) сохраняет трансформированный штамм и обеспечивает исходный материал для ПЦР-скрининга колоний (рис. 1E и рис. 4B). Скрининг колоний методом ПЦР может быть сведен к минимуму – необходимо обработать не более 10 колоний, и большинство из них должны дать положительный результат для внедрения. Продукт ПЦР для скрининговых праймеров ABglmS2_F_New и Tn7R (табл. 1) составляет 382.н. (рис. 4Б, полоса 4); отрицательный контроль реакции включает A. baumannii дикого типа ATCC 17978 (Рисунок 4B, дорожка 2), AB258 (Рисунок 4B, дорожка 3) и отсутствие шаблона (Рисунок 4B, дорожка 5). Колонии, положительные на ПЦР, представляют собой комплементарные, маркированные штаммы.

Удаление гена резистентности к гентамицину (немаркирование) занимает менее 3 часов и занимает 6 дней, так как клетки, трансформированные эксцизионной плазмидой, должны быть отобраны с помощью селективного покрытия, а затем эксцизионная плазмида должна быть вылечена от бактерий (рис. 1F). Эксцизия, основанная на рекомбинации Flp-FRT, является точной и эффективной и должна привести к образованию ≥20 колоний на трансформационной пластине. Колонии, которые перекрестно заплатлены на карбенициллин (отбор на резистентность к β-лактаму, обеспечиваемую эксцизионной плазмидой) и гентамицин (поиск потери резистентности к гентамицину), должны быть резистентными к карбенициллину и гентамицину соответственно. Эксцизионная плазмида вытесняется бактериями за счет роста на пластинах 5%-ного сахарозного агара. Рост сахарозы заставляет клетки элиминировать pFLP2^ab, поскольку ген sacB на плазмиде способствует превращению сахарозы в леванс, полисахарид, токсичный для бактерий^12,13. Все колонии, растущие на 5%-ной сахарозной среде, должны расти только на простых пластинах с агаром LB; На пластинах с карбенициллиновым агаром не должно быть нароста. Колонии, растущие на равнинных агаровых пластинах LB, представляют собой немаркированные штаммы. Подтверждение потери маркера гентамицина может быть достигнуто с помощью ПЦР колоний с использованием праймеров Gm_F и Gm_R (табл. 1 и рис. 5). Эта пара праймеров дает ампликон 525.н. только в положительном контроле (первоначально созданный маркированный штамм, рис. 5 дорожка 4); ATCC 17978 дикого типа (Рисунок 5 дорожка 2), AB258 (Рисунок 5 дорожка 3), любая протестированная колония (Рисунок 5 дорожка 5) и контроль без шаблона (Рисунок 5 дорожка 6) не должны показывать усиление.

После подтверждения немаркированного штамма можно приступать к функциональному тестированию с фенотипическим анализом. В этом случае очевидным первым выбором является определение минимальной ингибирующей концентрации (MIC) ряда антибиотиков: ципрофлоксацин является известным субстратом AdeIJK, тетрациклин может быть удален AdeIJK (основным насосом оттока является AdeAB), а канамицин оказывает относительно незначительное влияние на A. baumannii ATCC 17978 ^2,14. Используя метод микроразведения бульона в соответствии с рекомендациями CLSI¹⁵, дополненный немаркированный штамм AB258::adeIJK подвергали воздействию каждого антибиотика в отсутствие и присутствии 50 мкМ IPTG; В качестве контроля были включены штамм дикого типа ATCC 17978 и штамм AB258 с дефицитом оттока RND (табл. 2). В целом, тенденция, наблюдаемая в значениях MIC, говорит об ожидаемом снижении чувствительности AB258::adeIJK к ципрофлоксацину и тетрациклину при индуцированной экспрессии насоса оттока, что подтверждает, что введение adeIJK было успешным.

Рисунок 1: Обзор процедуры. (А) Подготавливается ночная культура штамма A. baumannii, подлежащего дополнению. (B) Клетки из ночной культуры промывают водой 3 раза с помощью центрифугирования и выдерживают на льду. (В) Доставляющую и вспомогательную плазмиды добавляют к клеткам и инкубируют на льду в течение 20 мин. Образец электропорируют, добавляют среду LB, и клеткам дают восстановиться в течение 1 ч при 37 °C. Аликвоту клеток объемом 100 мкл распределяют на агаровые пластины LB +^{Gm 50} и инкубируют при 37 °C в течение ночи. (D) Колонии из трансформационной пластины накладывают на агаровую пластину LB +^{Gm 50} и выращивают в течение ночи при 37 °C. (E) Патчированные колонии подготавливают для ПЦР для скрининга на наличие продукта амплификации, охватывающего сайт хромосомной вставки. Амплификацию ПЦР визуализируют с помощью электрофореза в агарозном геле. ПЦР-положительные образцы свидетельствуют об успешной вставке интересующего гена в хромосому и создании маркированного штамма. (F) Колонию, положительную на гентамицин, готовят, как показано в шагах (A-C), с электропорацией плазмиды pLFP2^ab для удаления кассеты гентамицина из хромосомной вставки. Селективное нанесение на агар LB + Cb²⁰⁰ подтверждает поглощение плазмиды. Дублирующая заплатка на агаровых пластинах LB + Cb²⁰⁰ и LB + Gm⁵⁰ выявляет колонии Cb^R и^{Gm S}, подтверждающие потерю кассеты гентамицина из введения. Рост отобранных колоний Cb^R на 5% сахарозе излечивает плазмиду pLFP2^ab из клеток. Колонии из 5%-ной пластины сахарозы накладываются на агар LB + Cb²⁰⁰ и агар LB, чтобы выявить желаемые колонии Cb^S и Gm^S и подтвердить создание немаркированного штамма. Gm⁵⁰, гентамицин в дозе 50 мкг/мл; Cb²⁰⁰, карбенициллин в концентрации 200 мкг/мл; ^R, устойчивый; ^S, чувствительный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Плазмиды, используемые в этом протоколе. Общие плазмидные карты (A) pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm (инсерционная плазмида), (B) pTNS2 (вспомогательная плазмида) и (C) pFLP2^ab (эксцизионная плазмида). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Схема вставки и снятия маркировки. (А) Вставка. Единственный сайт инсерции Tn7 в хромосоме A. baumannii расположен в 24.н. от конца гена glmS2 . Ко-электропорация инсерционной плазмиды и плазмиды-хелпера позволяет комплементировать интересующий ген (вставленный ген, фиолетовый) вместе с остальной частью инсерционной кассеты (сайты FRT для эксцизии маркеров, желтые; ген accC1 резистентности к гентамицину, зеленый; Ген lacIq для индуцируемой экспрессии, синий) в хромосому. (B) Снятие маркировки. Электропорация комплементарного, меченого инсерционного штамма с эксцизионной плазмидой pFLP2^ab облегчает удаление гена резистентности к гентамицину (accC1, зеленый) через рекомбинацию Flp-FRT (сайты FRT, желтый), создавая немаркированный штамм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Трансформация, патчирование и подтверждение инсерции с помощью ПЦР колонии. Репрезентативный результат (А) роста трансформационных колоний после патчирования и (Б) ПЦР-амплификации колонии с помощью праймеров ABglmS_F_New (серый) и Tn7R (оранжевый) для подтверждения хромосомной вставки. Дорожка 1: Лестница низкомолекулярной ДНК; Полоса 2: ATCC 179798; Полоса 3: AB258; Полоса 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; Полоса 5: управление без шаблона. Обозначен ожидаемый диапазон 382 б.. Обратите внимание, что гентамицин-специфичные праймеры (Gm_F и Gm_R, зеленые) также могут быть использованы для подтверждения хромосомной вставки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Подтверждение потери маркера методом ПЦР колонии. Репрезентативный результат ПЦР-амплификации колоний с гентамицин-специфическими праймерами (Gm_F и Gm_R) для подтверждения потери маркера антибиотика путем эксцизии на основе pFLP^ab. Дорожка 1: лестница низкомолекулярной ДНК; Полоса 2: ATCC 179798; Полоса 3: AB258; Полоса 4: AB258::adeIJK-LAC-Gm; Полоса 5: AB258::adeIJK; Полоса 6: управление без шаблона. Обозначен ожидаемый диапазон 525.н. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Штаммы, плазмиды и праймеры	Релевантные характеристики	Ссылка
Пятно
А. Бауманни АТКС 17978	Тип деформации	УВДК
А. Бауманни АТКС 17978 АВ258	ΔadeAB,Δ adeFGH,Δ adeIJK	11
Плазмиды
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC	ГмР, УсилительР	9
pUC18T-miniTn7T-Gm-LAC-adeIJK	GmR, AmpR, adeIJK	Данное исследование
пТНС2	УсилительR	9
pFLP2ab	Источник или репликация pWH1266, sacB, AmpR	7
Грунтовки	Последовательность (5′–3′)
ABglmS_F_New	CACAGCATAACTGGACTGATTTC	7
Тн7Р	TATGGAAGAAGTTCAGGCTC	7
Gm_F	TGGAGCAGCAACGATGTTAC	Данное исследование
Gm_R	ТГТТАГГГГГГТАКТТГГГГ	Данное исследование

Таблица 1: Бактериальные штаммы, плазмиды и праймеры, используемые в этом протоколе. ГМ, гентамицин; Амп, ампициллин; ^R, устойчивый.

	Ципрофлоксацин		Тетрациклин		Канамицин
IPTG	−	+	−	+	−	+
АТКС 17978	0.250	В то же время	0.500	В то же время	1.5	В то же время
АВ258	0.031	В то же время	0.063	В то же время	4	В то же время
AB258::adeIJK	0.016	0.063	0.031	0.125	8	2
Смена складки		4.01		4.03		0.25

Таблица 2: Тестирование функциональности вставленных генов через чувствительность к антибиотикам. Сравнение значений минимальной ингибирующей концентрации (MIC) для A. baumannii ATCC 17978, AB258, неиндуцированного AB258::adeIJK и IPTG-индуцированного AB258::adeIJK в сравнении с ципрофлоксацином, тетрациклином и канамицином. Изменение складки = индуцированное (+ IPTG)/неиндуцированное (− IPTG); nd = не определено.

Discussion

Несмотря на то, что эта процедура хромосомной вставки индуцируемой системы экспрессии генов с одной копией у A. baumannii технически проста и не трудоемка, необходимо подчеркнуть несколько важных этапов. Во-первых, подготовка компетентных клеток должна производиться на льду, насколько это возможно, так как клетки становятся хрупкими при замене среды ледяной водой. В идеале этапы центрифугирования выполняются при температуре 4 °C, но допустимо центрифугирование при комнатной температуре. Учитывая возрастающую хрупкость клеток во время промывки водой, щадящее пипетирование также имеет решающее значение. Во-вторых, электропорация чувствительна к присутствию ионов. Промывка ячеек с помощью нескольких циклов гранулирования и ресуспендирования в воде обеспечивает полное удаление среды. Кроме того, плазмиды должны быть свежеочищенными и могут быть элюированы в стандартных элюирующих буферах (обычно TE-буфер) до тех пор, пока концентрация плазмидной ДНК достаточно высока. Мы стремимся добавить <5 мкл плазмиды к 100 мкл клеточной суспензии, чтобы сохранить ионную силу образца очень низкой, хотя следует допускать до 10 мкл. В-третьих, селективные агаровые пластины должны быть подготовлены по мере необходимости, чтобы обеспечить эффективность добавленного антибиотика. Отметим, что карбенициллин использовался вместо обычного ампициллина для селекции во время трансформации эксцизионной плазмиды pFLP2^ab. A. baumannii по своей природе устойчив к аминопенициллинам (ампициллину)¹⁶; Замена карбоксипенициллина (карбенициллина) позволяет продолжить отбор плазмидно-кодируемой β-лактамазой.

Оптимизация экспериментального протокола имеет больше нюансов и будет варьироваться в зависимости от разных видов Acinetobacter (или даже генетически модифицированных штаммов в пределах одного вида) и, возможно, конкретных реагентов, используемых в лаборатории. Например, напряжение, используемое для электропорации, может варьироваться от 1,8 до 2,5 кВ, и условия термоциклирования могут быть немного изменены в зависимости от ДНК-полимеразы, используемой для ПЦР. Полезные советы, которые следует учитывать, если клетки плохо растут после электропорации, включают снижение концентрации гентамицина в агаровых планшетах с 50 мкг/мл до 30 мкг/мл и/или увеличение инкубационного времени агаровых планшетов до ≥24 ч. Что касается шагов по удалению кассеты гентамицина, то больший успех может быть достигнут при использовании пластин с агаром LB с 10% сахарозы и/или инкубации их при 30 °C в течение ≥24 ч, если устойчивость к карбенициллину сохраняется.

В литературе можно найти множество методов подготовки клеток A. baumannii для использования с электропорацией, но они часто включают этап субкультивирования после первоначальной ночной культуры, а затем длительную фазу роста до заданной оптической плотности. Мы обнаружили, что простая ночная культура может быть использована так же эффективно. Электропорация A. baumannii была хорошо описана, и читатели могут получить более подробное представление об этом специфическом аспекте протокола здесь^17,18. Ключевыми преимуществами этой системы комплементации хромосомных генов mini-Tn7 по сравнению с системой комплементации на основе плазмид являются способность регулировать уровень экспрессии комплементированного гена с помощью IPTG-контролируемой системы lacI^q и возможность удаления маркера гентамицина (ген aacC1) с помощью фланговые участки FRT. Было замечено, что толерантность клеток к экспрессии насосов оттока может варьироваться в зависимости от вставленного насоса. Например, клетки более чувствительны к экспрессии AdeIJK по сравнению с AdeABC или AdeFGH; Эту проблему можно решить, модифицируя концентрацию ИПТГ в условиях культивирования. Удаление маркера антибиотика снижает риск мутации штамма из-за постоянного давления отбора, а также позволяет проводить исследования чувствительности к антибиотикам^{без ограничений 3}.

Эта система mini-Tn7 была успешно использована с видами Pseudomonas ^9,10, Yersinia⁹, Burkholderia¹⁹, Xanthomonas²⁰ и Acinetobacter ^5,6,21,22, однако существуют некоторые ограничения. Например, у A. baumannii в геноме⁵ имеется только один функциональный сайт инсерции attTn7, поэтому штамм может быть создан с несколькими делециями, но только один ген за раз может быть дополнен. Кроме того, эта система еще не доказала свою эффективность в отношении грамположительных бактерий¹⁰.

Дренажные насосы RND являются важными факторами, способствующими развитию устойчивости к антибиотикам у A. baumannii. Что делает их такими мощными, так это их трехкомпонентная структура, которая охватывает внутреннюю и внешнюю мембраны, что позволяет выводить антибиотики из периплазмы наружу клетки. Было показано, что наиболее изученные и повсеместно распространенные помпы RND, обозначенные как AdeABC, AdeFGH и AdeIJK, устраняют антибиотики всех классов. Детальное выяснение функции насоса оттока обеспечит хорошую отправную точку для разработки новых терапевтических вариантов против штаммов с множественной лекарственной устойчивостью. Использование тройного штамма удаления насоса RND AB258 и добавление по одному насосу за раз позволяет исследовать каждый насос независимо от других, определяя для каждого из них уникальные профили субстрата и наиболее эффективные ингибиторы. Конечно, насосы оттока также играют «повседневную» роль в нормальном функционировании бактерии. Понимание этих ролей может привести к косвенному повреждению насосов, что, в свою очередь, прервет отток антибиотиков, что, возможно, снова сделает бактерии с множественной лекарственной устойчивостью восприимчивыми к широко используемым антибиотикам. Как правило, система mini-Tn7 может быть использована для введения любого гена, представляющего интерес для детального изучения, или полезных маркеров, например, флуоресцентных белков для микроскопической визуализации⁶.

Растущая распространенность бактерий с множественной лекарственной устойчивостью вызывает озабоченность у всех нас. Понимание защитных механизмов, обеспечиваемых насосами оттока у таких патогенов , как A. baumannii , имеет решающее значение для борьбы с серьезными инфекциями. Эта хромосомная система экспрессии генов с одной копией является мощным инструментом для механистических исследований, а также для идентификации ингибиторов, препятствующих функции насоса оттока.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,2 мл ПЦР-пробирки	VWR	20170-012	Для препаратов колоний кипячения и ПЦР-реакций
1,5 мл микрофуги пробирки	Sarstedt	72-690-301	Общее использование
13-мл пробирки для культивирования, Pyrex	Fisher	14-957K	Жидкие культуральные пробирки
6x буфер для загрузки ДНК	Froggabio	LD010	Агарозный гель для электрофореза загрузка образца краситель
Уксусная кислота, ледниковая	Fisher	351271-212	Агарозный гель бегущий буферный компонент
Agar	Bioshop	AGR003	Твердая питательная среда
Agarose	BioBasic	D0012	Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР-реакции; используется в концентрации 0,8&нда; 2%
Аппарат для электрофореза в агарозном геле	Fisher	29-237-54	Электрофорез в агарозном геле; выделение продуктов реакции ПЦР
Карбенициллин	Fisher	50841231	селективных сред
Укупорки пробирок для культур	Fisher	13-684-138	Крышка из нержавеющей стали для пробирок с культивированием 13 мл
Набор дезоксинуклеотидтрифосфата (dNTP)	Biobasic	DD0058	компонент реакции ПЦР; поставляется по 100 мМ каждый dATP, dCTP, dGTP, dTTP; перемешанный и разбавленный по 10 мМ каждый dNTP
Сухая ванна/блочный нагреватель	Fisher	88860023	Isotemp цифровая сухая ванна для приготовления кипячения
Электропорационные кюветы	VWR	89047-208	мм Электропораторы с круглым колпачком
Электропоратор	Cole Parmer	940000009	110 В переменного тока, 60 Гц электропоратор
Бромид этидии	Fisher	BP102-1	Визуализация продуктов реакции ПЦР и ДНК-маркера в агарозном геле
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)	VWR	CA-EM4050	Агарозный гель бегущий буферный компонент
Гентамицин		Биобазовый GB0217	Для приготовления селективных сред
Глицерин	Fisher	G33	Подготовка бактериальных запасов для длительного хранения в ультранизкоморозильной камере
Инкубатор (встряхивание)	Нью-Брансуик Scientific	M1352-0000	Excella E24 Инкубатор Шейкер для выращивания жидких культур
Инкубатор (статический)	Fisher	11-690-550D	Инкубатор Isotemp Модель печи 550D для выращивания твердых (LB агар) культур
Петля инокуляции	Sarstedt	86.1562.050	Нарезка колоний на агаровые пластины
Разбрасыватель инокуляции	Sarstedt	86.1569.005	Разбрасывание культура на агаровых тарелках
Бульон лизогения (LB) бульон, Lennox	Fisher	BP1427	Жидкая питательная среда (20 г/л: 5 г/л натрия хлорид, 10 г/л триптон, 5 г/л дрожжевой экстракт)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 для центрифугирования образцов
Мини-центрифуга	Fisher	S67601B	центрифугирование 0,2 мл ПЦР-пробирок чашки
Петри	SPL Life Sciences	10090	Для твердых питательных сред (агаровые пластины): 90 x 15 мм
Пипетки	Различные	одноканальные пипетки Mandel Gilson (P10, P20, P200, P1000)
Источник питания	Biorad	1645050	PowerPac Базовый источник питания для электрофореза
Праймеры	IDT	NA	ПЦР реакционный компонент; специфичный для интересующего гена; приготовлен при 100 мкм; M как указано в спецификации продукта
Sucrose	BioBasic	SB0498	Для получения контрселективных сред для удаления плазмиды pFLP2ab из трансформированной A. baumannii
Taq ДНК-полимеразы	FroggaBio	T-500	ПЦР реакционного компонента; полимераза поставляется с 10-кратным буфером
Термоамплификатор	Biorad	1861096	модели T100 для ПЦР
Зубочистки	Fisher	S24559	Для заплатки колоний на агаровых пластинах
Тризма Основа Sigma		T1503	Агарозный гель бегущий буферный компонент
Сверхчистая вода	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	Система очистки воды MilliQ: ультрачистая вода для приготовления сред и растворов, а также промывки клеток
Широкий спектр ДНК-маркеров	Biobasic	M103R-2	Определение размера ПЦР-продуктов на агарозном геле
Деревянные инокуляционные палочки	Фишер	29-801-02	Посев культур с колониями из агаровых пластин