Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Диссекция, гистологическая обработка и анализ экспрессии генов надключичной бурой жировой ткани мышей

3.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66475

⸱

29 марта 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Children's Nutrition Research Center, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, 2Department of BioSciences, Rice University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы предлагаем практическую процедуру препарирования и проведения гистологического анализа и анализа экспрессии генов надключичной бурой жировой ткани мышей.

Аннотация

Опосредованный бурой жировой тканью (BAT) термогенез играет важную роль в регуляции метаболизма, и на его морфологию и функцию могут сильно влиять стимулы окружающей среды у мышей и людей. В настоящее время мышиный межлопаточный BAT (iBAT), который расположен между двумя лопатками в верхнем дорсальном боку мышей, является основным хранилищем BAT, используемым исследовательскими лабораториями для изучения функции BAT. Недавно у мышей было идентифицировано несколько ранее неизвестных депо BAT, в том числе одно, аналогичное надключичной коричневой жировой ткани человека. В отличие от iBAT, мышиная надключичная бурая жировая ткань (scBAT) расположена в промежуточном слое шеи и, таким образом, не может быть легко доступна.

Чтобы облегчить изучение недавно идентифицированного мышиного scBAT, в настоящем документе представлен протокол с подробным описанием шагов по препарированию интактного scBAT у постнатальных и взрослых мышей. Из-за небольшого размера scBAT по сравнению с другими жировыми депо, процедуры были модифицированы и оптимизированы специально для обработки scBAT. Среди этих модификаций – использование препарирующего микроскопа во время забора тканей для повышения точности и гомогенизации замороженных образцов scBAT для повышения эффективности последующего анализа кПЦР. С помощью этих оптимизаций можно определить идентификацию, морфологический вид и молекулярную характеристику scBAT у мышей.

Введение

Растущая распространенность ожирения в США и во всем мире вызвала большой интерес к пониманию его этиологии и выявлению потенциальных методов лечения 1,2. Жировая ткань играет жизненно важную роль в обмене веществ, и дисрегуляция жировой ткани может привести к развитию ожирения. Как правило, существует два типа жировой ткани: белая и коричневая жировая ткань. В то время как белая жировая ткань (ВАТ) может накапливать химическую энергию и выделять эндокринные факторы, бурая жировая ткань (БАТ) может использовать химическую энергию для выработки тепла и поддержания температуры телана холоде. Благодаря этой уникальной способности активация БАТ также может увеличить расход энергии и улучшить чувствительность к инсулину5.

BAT выполняет свою функцию посредством недрожащего термогенеза, процесса, опосредованного развязкой белка 1 (UCP1)6. Млекопитающие, в том числе мыши и люди, обладают разным количеством BAT. Классическая точка зрения БАТ заключается в том, что эти жировые ткани более распространены у мышей и младенцев, чем у взрослых людей. iBAT, расположенный в верхней дорсальной области между лопатками, является наиболее изученным депо BAT у мышей. Применяя радиоизотопную визуализацию и биопсийные тесты, недавние исследования выявили несколько депо БАТ у взрослых людей. Некоторые из них, в том числе депо, обнаруженные в глубокой шейке и надключичной области, ранее не были идентифицированы у мышей или других модельных животных 7,8,9,10,11. Среди этих депо BAT, scBAT является наиболее часто встречающимся депо у взрослых людей. Чтобы лучше понять происхождение и молекулярный вклад этих недавно обнаруженных депо BAT в организме человека, важно идентифицировать эквивалентные депо у мышей, которые позволяют генетическим и молекулярным манипуляциям отслеживать и тестировать функциональную роль этих депо. Таким образом, мы и другие ученые идентифицировали несколько ранее неизвестных депо BAT в различных анатомических местах у мышей, включая scBAT12,13, грудной периваскулярный BAT14,15, околопочечный BAT16 и периаортальный BAT17. Мышиный scBAT анатомически напоминает человеческий scBAT и морфологически напоминает классический iBAT, экспрессируя высокие уровни UCP112.

В отличие от мышиного iBAT, который легко поддается вскрытию, scBAT располагается в промежуточном слое шеи мыши, под слюнными железами и вдоль наружной яремной вены. Выделение этого депо для гистологического и молекулярного анализов может быть сложной задачей. Здесь мы подробно опишем процедуру препарирования scBAT у постнатальных и взрослых мышей и обработки этого депо для гистологии и анализа экспрессии генов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Процедуры на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Медицинском колледже Бэйлора. Все процедуры проводились на самцах мышей C57BL/6J в возрасте 3 недель и 3 месяцев. Перед вскрытием все мыши были подвергнуты эвтаназии с использованием одобренной процедуры эвтаназии углекислым газом для грызунов. См. Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами, реагентами и инструментами, используемыми в этом протоколе.

1. Вскрытие scBAT

  1. Положите тушку мыши на верстак и очистите хирургические ножницы и щипцы с тонким концом 70% этанолом.
  2. Опрыскайте брюшную шею мыши 70% этанолом, чтобы намочить шерсть и свести к минимуму загрязнение шерсти.
  3. Сделайте двусторонний разрез, примерно 1,5 см, вдоль ключиц.
  4. От концов предыдущего надреза разрежьте продольно по направлению к ушам, длиной примерно 1 см. В результате образуется квадратный U-образный разрез вокруг шеи (Рисунок 1A, B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: scBAT находится в промежуточном слое шеи. На этом этапе обнажается поверхностный слой, состоящий из кожи, подкожно-жировой клетчатки и слюнных желез. Промежуточный слой, наряду с scBAT, содержит яремные вены и мышцы шеи. Глубокий слой шеи, содержащий глубокую шейную БАТ и артерию и яремные вены, обнажается путем удаления скелетной мышцы.
  5. Поместите мышь под препарирующий микроскоп и сфокусируйте обнаженную шею (рис. 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот дополнительный шаг значительно повышает точность забора ткани, что необходимо, учитывая небольшой размер scBAT.
  6. Полностью обнажите слюнные железы, приподняв разрезанные участки кожи щипцами.
  7. С помощью хирургических ножниц и щипцов разъедините ткань, соединяющую слюнные железы, с тканью вокруг ключиц и друг с другом.
  8. Обнажайте депо scBAT, приподнимая слюнные железы. Ищите БАТ вдоль наружной яремной вены и, возможно, соединенную с нижней стороной слюнных желез. Определите его по оранжеватому цвету, который выделяется на фоне окружающих тканей.
  9. Удерживают целевую жировую ткань щипцами и аккуратно отклеивают ее от слюнных желез.
  10. После отделения от слюнных желез продолжайте отсоединять scBAT от наружной яремной вены и мускулатуры шеи до тех пор, пока депо по обе стороны шеи не будут удалены целиком.
  11. Осмотрите каждый препарированный образец scBAT под препарирующим микроскопом (рис. 1D, E), используя щипцы, чтобы удалить оставшуюся соединительную ткань.
  12. Поместите каждый образец в стеклянный сцинтилляционный флакон, содержащий 10 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), и извлеките мышь из-под микроскопа.

2. Обработка и окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) scBAT (проиллюстрировано на рисунке 2A)

  1. Замените PBS (шаг 1.12) 10 мл холодного 4% параформальдегида (PFA) и поместите флакон на нутатор, раскачивая при температуре 4 °C в течение ночи, чтобы зафиксировать scBAT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузионная фиксация может быть применена в постнатальном периоде, особенно у взрослых мышей, когда необходима дальнейшая обработка для иммуногистохимического анализа.
  2. На следующий день стерильной трансферной пипеткой извлеките раствор ПФА из флакона и замените его 10-15 мл ПБС. Поместите флакон на нутатор и покачайте на 30 минут при комнатной температуре. Замените ПБС 0,85% физиологическим раствором и продолжайте качать еще 30 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Солевой раствор представляет собой 0,85% физиологического раствора (NaCl) в воде, обработанной ДЭПК (без РНКазы). PBS может быть заменен физиологическим раствором на этом и следующем этапе.
  3. Удалите 0,85% физиологический раствор с помощью трансферной пипетки и добавьте во флакон 10 мл 70% этанола/0,85% физиологического раствора. Храните флакон в холодильнике при температуре 4 °C в течение ночи или до тех пор, пока он не будет готов для введения парафина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PBS можно использовать, если 0,85% физиологический раствор недоступен. scBAT должен быть обработан как можно скорее для облегчения секционирования и лучшей сохранности морфологии тканей.
  4. Перед введением парафина обезвоживайте scBAT с помощью серии обменов этанола, чтобы удалить воду из ткани.
    1. Для начала удалите 70% этанол/0,85% физиологический раствор из флакона с помощью трансферной пипетки и добавьте 10-15 мл 95% дегидрантного спирта, покачивая флакон на нутаторе при комнатной температуре в течение 1 ч. Повторите этот шаг один раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этанол можно использовать вместо спиртовых растворов дегидранта.
    2. Затем замените 95% дегидрантный спирт 10-15 мл 100% дегидрантного спирта и продолжайте качать на нутаторе в течение 1 часа. Долейте новый 100% дегидрантный спирт и продолжайте качать в течение нескольких часов или ночи, в зависимости от количества scBAT во флаконе.
  5. Чтобы очистить скБАТ для встраивания, добавьте 10 мл толуола во флакон и продолжайте качать на нутаторе до тех пор, пока скБАТ не станет прозрачным, примерно 6-8 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность времени, необходимого для достижения удовлетворительной очистки, зависит от размера scBAT. Рекомендуется начинать расчистку сразу утром, чтобы во второй половине дня могла произойти инфильтрация и заделка.
  6. Чтобы внедрить scBAT в парафин, удалите толуол и добавьте во флакон 10 мл расплавленного инфильтрационного парафина. Поместите флакон в духовку при температуре 65 °C на 1 час. Повторите этот шаг с новым воском.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начните плавить восковые гранулы в духовке в течение ночи перед началом заделки, чтобы убедиться, что воск полностью жидкий.
  7. Замените инфильтрационный парафин на заделочный парафин и поместите флакон при той же температуре на 1 ч. Повторите этот шаг один раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стадия инфильтрации может быть прервана и продолжена позже. Выньте флакон из духовки и храните его при комнатной температуре до тех пор, пока он не будет готов.
  8. Поместите ткань, сначала поместив ее в форму для заделки ткани, добавьте расплавленный воск для закладки в форму и переориентируйте ткань под стереомикроскопом. Затем поместите кассету для закладки поверх воска и продолжайте заливать ее поверх воска, пока она не заполнится, а закладной колпачок не будет прикреплен к восковому блоку. Переложите блок в холодильник с температурой 4 °C на ночь, чтобы воск затвердел и дал усадку, прежде чем снимать металлическую форму.
  9. Разрежьте scBAT микротомом до толщины 5-6 мкм18, по три-четыре среза на предметное стекло микроскопа, и поместите в теплую парафиновую секцию флотационной ванны при температуре ~42 °C, чтобы срезы тканей разгладились.
  10. Перенесите секции на направляющие и поставьте их вертикально напротив плавучей ванны, чтобы вода стекала с направляющих.
  11. Переложите предметные стекла на решетку для окрашивания из нержавеющей стали и поместите решетку на стол для сушки слайдов на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Парафиновые предметные стекла можно хранить в течение длительного времени при комнатной температуре, прежде чем будет достигнута дальнейшая обработка.
  12. Выполните окрашивание H&E19. Для начала поместите предметные стекла в штатив для окрашивания, затем поместите штатив в банку для окрашивания с ксилолом на 40 с. Повторите этот шаг один раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если парафин все еще виден после двух этапов, подождите, пока он полностью не растворится, прежде чем продолжить.
  13. Чтобы регидратировать ткань, поместите подставку для выкрашивания в банку для окрашивания, наполненную 100% дегидрантным спиртом, на два 20-секундных этапа, затем 15-секундный этап в 95% дегидрантном спирте и заключительный 15-секундный ополаскиватель в ddH2O.
  14. Поместите предметные стекла в чашку для окрашивания, наполненную раствором гематоксилина, на 75 с для достижения ядерного окрашивания, затем промойте предметные стекла в чашке для окрашивания ddH2O в течение 45 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время можно регулировать в зависимости от желаемого цвета пятна.
  15. Дифференцируйте окрашивание, окунув предметные стекла в посуду для окрашивания, наполненную раствором HCl-этанола, на 15 с, затем перенесите предметные стекла в другую промывку ddH2O на 15 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор HCl-этанола готовят в соответствии с опубликованным методом19.
  16. Для цитоплазматического окрашивания поместите предметное стекло в раствор для противоокрашивания Eosin Y на 15 с.
  17. Обезвоживайте ткани, погружая предметные стекла на 15 секунд каждый в три последовательных этапа раствора 95% дегидрантного спирта, затем две последовательные 100% дегидрантные спиртовые ванны - первая на 15 с, а вторая на 45 с - для завершения обезвоживания.
  18. Наконец, перенесите предметные стекла в ванну с ксилолом на 45 с, чтобы реакклиматизировать ткань к органическим растворителям. После этого этапа окрашивание завершено; Извлеките ткань из раствора.
  19. Нанесите монтажный материал на каждую направляющую и поместите ее в химический вытяжной шкаф. Высушите в течение ночи перед визуализацией. Результаты визуализации показаны на рисунке 2B.

3. Анализ экспрессии генов scBAT

  1. Сбор тканей (шлифовка)
    1. После препарирования scBAT сразу же поместите ткань в микроцентрифужную пробирку, проткните отверстие в верхней части пробирки стерильной иглой и заморозьте в жидком азоте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основные этапы протокола, описанные здесь, проиллюстрированы на рисунке 3A. Протыкание отверстия в верхней части трубки перед тем, как опустить ее в жидкий азот, предотвращает разрыв трубки из-за резкого изменения давления.
    2. Наполните пластиковый стакан жидким азотом и оставьте пестик и тонкую лопатку для пропитки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно поддерживать температуру всех инструментов и образцов тканей как можно более холодную, близкую к температуре жидкого азота, в течение всей процедуры, чтобы предотвратить оттаивание ткани. Размороженная жировая ткань очень адгезивна и усложняет опудривание. Извлекайте инструменты и образцы из ванн с жидким азотом только непосредственно перед использованием.
    3. Возьмите по одному замороженному образцу ткани за раз и вылейте его из пробирки микроцентрифуги в раствор.
    4. Добавьте в ступку небольшое количество жидкого азота, затем пестиком измельчите замороженную ткань до полного измельчения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань начинает становиться мягкой или липкой в какой-либо момент, она оттаивает; Налейте в раствор больше жидкого азота.
    5. С помощью тонкого шпателя осторожно соскребите и перенесите измельченную ткань обратно в пробирку микроцентрифуги. Налейте жидкий азот в раствор во время соскребания, чтобы собрать оставшиеся кусочки ткани, прежде чем переносить шпателем. Повторяйте этапы переноса до тех пор, пока вся ткань не будет удалена из раствора.
    6. Очистите раствор с помощью легкого тканевого салфетки и 70% этанола перед тем, как высыпать следующий образец для измельчения. Храните измельченные в порошок салфетки в морозильной камере при температуре -80 °C длительное время.
  2. Выделение общей РНК
    1. Подготовка
      1. Очистите верстак, пипетки, держатели наконечников и штативы для пробирок 70% этанолом и обеззараживающим средством для поверхности, чтобы удалить РНКазу.
      2. Запустите центрифугу до достижения температуры 4 °C.
      3. Раствор элюирования подогреть до 70 °С.
      4. Разбавляют ДНКазу I, смешивая 5 мкл восстановленной ДНКазы I с 75 мкл раствора для разведения ДНКазы на образец. Поместите раствор ДНКазы I на лед до использования.
    2. Процедура
      1. Для каждого образца промаркируйте две пробирки для микроцентрифуг, две пробирки для хранения колонок (две градуированные пробирки для микроцентрифуг без крышек) и одну связующую мини-колонку.
      2. Добавьте 500 мкл раствора для выделения РНК в каждый образец и проведите ультразвуковую обработку с помощью грануляторного пестик-мотора в течение 30 секунд.
      3. Возьмите шприц для каждого образца и пропитывайте пипетку вверх и вниз 10 раз для дальнейшего лизиса ткани. Убедитесь, что после спринцевания не видно твердых частиц.
      4. Добавляйте 250 мкл хлороформа и время от времени перемешивайте, ожидая 5 минут, пока образцы не инкубируются при комнатной температуре.
      5. Центрифуга при 21 000 × г в течение 20 мин при 4 °C.
      6. Переложите верхнюю водную часть в новую микроцентрифужную пробирку и добавьте эквивалентное количество 70% этанола (~500 мкл).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Верхняя водная часть должна быть прозрачной, нижняя должна быть красным раствором для выделения РНК, а между двумя слоями должны быть некоторые нежелательные твердые частицы.
      7. Перенесите 500 мкл нового лизата в связующую колонку. Центрифугу при 18 000 × г в течение 60 с, а затем фильтрат выбросить.
      8. Повторите предыдущий шаг с оставшимся лизатом, чтобы вся РНК попала в связывающую колонку.
      9. Добавьте 700 мкл промывки с низкой жесткостью в обвязочную колонку, центрифугируйте в течение 30 секунд и выбросьте фильтрат.
      10. Добавьте 80 мкл разбавленной ДНКазы I в каждую связывающую колонку. Выдерживать 15 мин при комнатной температуре.
      11. Добавьте 700 мкл промывки высокой жесткости, центрифугируйте в течение 30 секунд и выбросьте фильтрат.
      12. Добавьте 700 мкл промывки низкой жесткости, центрифугируйте в течение 60 секунд и выбросьте фильтрат.
      13. Переместите обвязочные колонны во2-ю новую колонку без колпачка и центрифугу на 2 минуты, чтобы убедиться, что все жидкости удалены из обвязочной колонны.
      14. Переместите связывающие колонки в новую пробирку микроцентрифуги и добавьте 30 мкл подогретого элюирующего раствора. Выдерживают при комнатной температуре 1 мин.
      15. Центрифуга в течение 2 мин собирает элюированную РНК на дне пробирки микроцентрифуги.
      16. Измерьте общую концентрацию РНК с помощью спектрофотометра.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если общая чистота РНК низкая, на что указывает значение 260/280 ниже 2,0 или значение 260/230 ниже 1,8, то после этапа 3.2.2.12., образцы можно еще раз промыть промывкой низкой строгости, а затем промыть 80% этанолом, прежде чем перейти к этапу 3.2.2.13.
      17. Храните РНК в морозильной камере при температуре -80 °C.
    3. Обратная транскрипция (RT)
      1. В полоску для ПЦР добавьте 0,5-1 мкг общей РНК, разбавленной в воде, обработанной DEPC, до 8 мкл для каждого образца РНК в отдельную лунку.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Количество РНК, используемой для обратной транскрипции, может быть увеличено или уменьшено в соответствии с инструкциями производителя.
      2. Добавьте 1 мкл Oligo dT и 1 мкл dNTP к каждому образцу в пробирке для ПЦР. Убедитесь, что общий объем составляет 10 мкл на образец.
      3. Поместите полоску пробирки для ПЦР в амплификатор и установите ее на 65 °C на 5 минут, а затем на 4 °C на неопределенный срок.
      4. Через 5 мин при 65 °C выньте полоску для ПЦР-пробирки и поместите пробирку на лед минимум на 2 минуты. После инкубации на льду добавьте в каждый образец пять реагентов: 4 мкл 5-цепочечного буфера, 2 мкл 25 мМ MgCl2, 2 мкл 0,1 М DTT, 1 мкл ингибитора РНКазы и 1 мкл обратной транскриптазы. Убедитесь, что общий объем составляет 20 мкл на образец.
      5. Поместите полоску пробирки для ПЦР обратно в амплификатор и установите программу на 50 °C на 50 минут, затем на 85 °C на 5 минут, затем на 4 °C на неопределенный срок.
      6. Как только программа достигнет 4 °C, выньте полоску и добавьте 1 мкл рибонуклеазы H (РНКазы H).
        ПРИМЕЧАНИЕ: РНКаза H используется для удаления любой оставшейся РНК-матрицы в реакции RT; На этом этапе искомая РНК уже должна быть преобразована в кДНК.
      7. Поместите полоску обратно в амплификатор и работайте при температуре 37 °C в течение 20 минут, а затем 4 °C на неопределенный срок.
      8. Обратная транскрипция завершена; измеряют концентрацию кДНК с помощью спектрофотометра.
      9. Разбавляют кДНК до 250 нг/мкл; храните кДНК в морозильной камере при температуре -80 °C или -20 °C.
    4. Количественная ПЦР (кПЦР)
      1. Составьте электронную таблицу, чтобы упорядочить положение каждого праймера и образца на 96-луночном планшете для кПЦР.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Один из праймеров должен быть референсным геном, чтобы нормализовать экспрессию всех других интересующих генов, таких как 36B4.
      2. Сделайте мастер-микс для каждой комбинации «праймер + образец». В каждую лунку для реакции кПЦР добавьте 3 мкл воды молекулярно-биологического класса, 5 мкл основной смеси ферментов для кПЦР, 0,5 мкл прямого праймера и 0,5 мкл обратного праймера, что в сумме составляет 9 мкл на реакцию. Добавьте 1 мкл кДНК на реакцию, чтобы получить в общей сложности 10 мкл на реакцию.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартом является наличие трех технических реплик для каждой комбинации «праймер + сэмпл», поэтому каждый мастер-микс должен быть в 4 раза больше вышеуказанных количеств.
      3. Добавьте 1 мкл кДНК для каждого репликата в каждую мастер-смесь праймера. Если каждая мастер-смесь состоит из 4 мкм, то пипетируют 4 мкл каждого образца кДНК в его собственную меченую пробирку.
      4. Наконец, пипетку 10 мкл каждой реакционной смеси в 96-луночный планшет для кПЦР в положениях, определенных электронной таблицей.
      5. Запечатайте планшет толстым клейким уплотнением, а затем центрифугируйте 96-луночный планшет при 450 × г при 20 °C в течение 2 мин.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы планшет был полностью герметичным, чтобы избежать испарения образцов во время термоциклирования. Используйте легкие тканевые салфетки, чтобы прижать уплотнение к пластине, особенно к краям.
      6. Запустите планшет в приборе для ПЦР в реальном времени. Запрограммируйте реакцию ПЦР в соответствии с инструкциями производителя: 2 мин при 50 °C, затем еще 2 мин при 95 °C и, наконец, 40 циклов по 15 с при 95 °C и 30 с при 60 °C. Результаты анализа экспрессии генов методом кПЦР представлены на рисунке 3Б.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В отличие от iBAT, который располагается в подкожном слое спины между двумя лопатками, scBAT располагается в промежуточном слое шеи, простираясь глубоко между слоями скелетных мышц и слюнной железы по мере роста вдоль наружной яремной вены (рис. 1A). Препарирование scBAT не так просто, как в iBAT. Здесь мы приводим подробную процедуру, включающую важнейшие этапы препарирования интактного scBAT у постнатальных и взрослых мышей (рис. 1B

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе мы подробно представляем процедуры препарирования и обработки scBAT для анализа H&E и экспрессии генов. Поскольку scBAT находится в промежуточном слое шеи и располагается вдоль крупных вен, выделение этого депо требует точной техники. В частности, чтобы получить четкое представление о складе, мы рекомендуем поместить мышь под препарирующий микроскоп после того, как горлышко было открыто. Используя пару тонких щипцов для отклеивания слюнной железы и окружающих вен, следует соблюдать осторожность, чтобы из...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа поддерживается NIDDK Национального института здравоохранения (NIH) под номером R01DK116899, Министерством сельского хозяйства США (USDA/ARS) под номером 3092-51000-064-000D и пилотной премией от Института сердечно-сосудистых исследований Медицинского колледжа Бэйлора. Блок-схемы были созданы с помощью BioRender.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
95% спирт дегидранта (Flex 95)Epredia8201
100% спирт дегидранта (Flex 100)Epredia8101
96-луночный ПЦР-планшетBio-RadMLL9601
связывание Aurum Мини-колонкаBio-Rad7326826
Aurum Промывка высокой жесткостиBio-Rad7326803
Aurum Промывка низкой жесткостиBio-Rad7326804
Базовые формы (для встраивания)Tissue-Tek4122
BD PrecisionGlide Игла 21г x 1 1/2"Becton Dickinson305167
C1000 Touch ТермоциклерBio-Rad1840148
Микроцентрифуга без колпачка 2 млFisherbrand02-681-453
Центрифуга Eppendorf5430R
CFX Opus 96 Прибор для ПЦР в реальном времениBio-Rad12011319
хлороформThermo Scientific Chemicals383760010
Cytoseal 60 Маловязкая монтажная средаEpredia83104
Вода, обработанная DEPC,AmbionAM 9906
Препарирующий микроскопNikon
раствор для разведения ДНКазыBio-Rad7326805
DNase IBio-Rad7326828
dNTPsInvitrogen18427013
раствор для элюированияBio-Rad7326801
EM 400 средняя среда для встраивания парафинLeica Biosystems3801320
Eosin Y (0,5% по объему)RICCA2858-16
Formula R Инфильтрационная среда парафинLeica Biosystems3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349Bio ExpressS-3200-2
Gill #3 ГематоксилинSigma-AldrichGHS332-1L
HCl (для HCL-этанола)Fisher ChemicalA142212
IP VI Встраиваемые кассетыLeica Biosystems39LC-550-5-L
Чистый этанол Koptec - 200 Proof (для 70% этанола)Decon LabsV1001
MgCl2 (25 mM)Thermo Fisher ScientificR0971
Микроцентрифужные пробирки 1,7 млAvantor87003-294
Микроуплотнения 'B' (адгезивные уплотнения)Bio-RadMSB1001
МикротомLeica BiosystemsRM2245
Молекулярная биология Класс ВодаCorning46-000-CM
Раствор Coors TekThomas Scientific60310
NaCl (для 0,85% физиологического раствора)БиореагентыFisher BP358-212
NanoDrop СпектрофотометрNanoDrop TechnologiesND-1000 UV/Vis
Oligo dTInvitrogen18418020
парафиновой секцииBoekel Scientific14792V
Параформальдегид (PFA)Sigma-AldrichP6148-500G
ПЦР-трубкаAvantor76318-802
Пестик от Coors TekThomas Scientific60311
Пест пеллетный моторKimble749540-0000
Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS)Sigma-AldrichD8537-500ML
Прецизионная модель 19 Вакуумная печь Thermo Fisher ScientificCAT# 51221162
Грунтовка: 36B4  (вперед) 10 μ M
5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3'		База данных Chen lab Oligo
Primer: 36B4 (реверс) 10 μ M
5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGA TGG AGT GT 3'		Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (forward) 10 μ М<бр/> 5' ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3'Chen lab Oligo database Primer
: Fabp4 (reverse) 10 μ М<бр/> 5' CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3'Chen lab База данных Олиго
Праймер: Glut 4 (прямой праймер) 10 μ М<бр/> 5' CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3'Chen lab Oligo база данных
Primer: Glut 4 (реверс) 10 μ М<бр/> 5' GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3'Chen lab Oligo база данных
Primer: PPARg (forward) 10 μ М<бр/> 5' AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3'База данных Chen lab Oligo
Primer: PPARg (reserve) 10 μ М<бр/> 5' AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3'База данных Chen lab Oligo
: Ppargc1a (реверс) 10 μ M
5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3'		Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μ M
5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3'		Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (forward) 10 μ М<бр/> 5' AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3'База данных Chen lab Oligo
: Ucp1 (reverse) 10 μ М<бр/> 5' ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3'Chen lab Олиго база данных
Раствор для выделения РНК (PureZol)Bio-Rad7326880
РНКаза Away (поверхностный деконтаминант)Thermo Scientific1437535
РНКаза HNEBM0297S
ингибитор рназы (РНКаза Out)Флакон инвитрогена10777019
сцинтилляции (стекло)Электронная микроскопия Sciences72632
Стол для сушки слайдов Электротермический (Коул-Пармер)MH6616
Штатив для окрашивания нержавеющей сталиЭлектронная микроскопия Sciences70312-54
Стереомикроскоп (для встраивания)OlympusSZ51
Сугические ножницыMcKesson43-1-104
Superfine point Прямой рассекающий щипцыAvantor82027-402
Superfrost Plus Предметные стекла микроскопаFisher Scientific12-550-15
SuperScript III обратная транскриптаза (включает 5x буфер первой цепи и 0,1M DTT)Invitrogen18080044
SUR-VET шприц с иглой 25 г x 5/8", 1 млTerumo100281
SYBR Green (мастер-смесь ферментов qPCR)Applied BiosystemsA25778
Tissue-Tek Набор для ручного окрашивания предметного стекла (баночки)Электронная микроскопия наукиАртикул: 62540-01
ТолуолФишер ХимическийT324-1
Пипетка трансфернаяAvantor414004-005
XyleneFisher ChemicalX3P-1GAL
SMZ1500Флотационная ванна полоска

Ссылки

  1. Boutari, C., Mantzoros, C. S. A 2022 update on the epidemiology of obesity and a call to action: as its twin COVID-19 pandemic appears to be receding, the obesity and dysmetabolism pandemic continues to rage on. Metabolism. 133, 155217(2022).
  2. Hales, C. M., Carroll, M. D., Fryar, C. D., Ogden, C. L. Prevalence of obesity and severe obesity among adults: United States, 2017-2018. NCHS Data Brief. (360), 1-8 (2020).
  3. Berry, D. C., Stenesen, D., Zeve, D., Graff, J. M. The developmental origins of adipose tissue. Development. 140 (19), 3939-3949 (2013).
  4. Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (11), 691-702 (2016).
  5. Maliszewska, K., Kretowski, A. Brown adipose tissue and its role in insulin and glucose homeostasis. Int J Mol Sci. 22 (4), 1530(2021).
  6. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
  7. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. N Engl J Med. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  8. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. N Engl J Med. 360 (15), 1500-1508 (2009).
  9. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. N Engl J Med. 360 (15), 1518-1525 (2009).
  10. Cypess, A. M., et al. Anatomical localization, gene expression profiling and functional characterization of adult human neck brown fat. Nat Med. 19 (5), 635-639 (2013).
  11. Leitner, B. P., et al. Mapping of human brown adipose tissue in lean and obese young men. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (32), 8649-8654 (2017).
  12. Mo, Q., et al. Identification and characterization of a supraclavicular brown adipose tissue in mice. JCI Insight. 2 (11), e93166(2017).
  13. Shi, Y., et al. Gene Expression Analysis of Environmental Temperature and High-Fat Diet-Induced Changes in Mouse Supraclavicular Brown Adipose Tissue. Cells. 10 (6), 1370(2021).
  14. Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-gamma deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
  15. Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cell Mol Life Sci. 76 (4), 777-789 (2019).
  16. de Jong, J. M., Larsson, O., Cannon, B., Nedergaard, J. A stringent validation of mouse adipose tissue identity markers. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (12), E1085-E1105 (2015).
  17. Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 39 (8), 1629-1644 (2019).
  18. Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Sectioning mammary gland whole mounts for lesion identification. J Vis Exp. (125), e55796(2017).
  19. Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods Enzymol. 537, 47-73 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Препарирование тканейокрашивание гематоксилином и эозиномвыделение РНКколичественная ПЦРдиссекционный микроскопжировая ткань мыши
Диссекция, гистологическая обработка и анализ экспрессии генов надключичной бурой жировой ткани мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.