Диссекция, гистологическая обработка и анализ экспрессии генов надключичной бурой жировой ткани мышей

Summary

Здесь мы предлагаем практическую процедуру препарирования и проведения гистологического анализа и анализа экспрессии генов надключичной бурой жировой ткани мышей.

Abstract

Опосредованный бурой жировой тканью (BAT) термогенез играет важную роль в регуляции метаболизма, и на его морфологию и функцию могут сильно влиять стимулы окружающей среды у мышей и людей. В настоящее время мышиный межлопаточный BAT (iBAT), который расположен между двумя лопатками в верхнем дорсальном боку мышей, является основным хранилищем BAT, используемым исследовательскими лабораториями для изучения функции BAT. Недавно у мышей было идентифицировано несколько ранее неизвестных депо BAT, в том числе одно, аналогичное надключичной коричневой жировой ткани человека. В отличие от iBAT, мышиная надключичная бурая жировая ткань (scBAT) расположена в промежуточном слое шеи и, таким образом, не может быть легко доступна.

Чтобы облегчить изучение недавно идентифицированного мышиного scBAT, в настоящем документе представлен протокол с подробным описанием шагов по препарированию интактного scBAT у постнатальных и взрослых мышей. Из-за небольшого размера scBAT по сравнению с другими жировыми депо, процедуры были модифицированы и оптимизированы специально для обработки scBAT. Среди этих модификаций – использование препарирующего микроскопа во время забора тканей для повышения точности и гомогенизации замороженных образцов scBAT для повышения эффективности последующего анализа кПЦР. С помощью этих оптимизаций можно определить идентификацию, морфологический вид и молекулярную характеристику scBAT у мышей.

Introduction

Растущая распространенность ожирения в США и во всем мире вызвала большой интерес к пониманию его этиологии и выявлению потенциальных методов лечения ^1,2. Жировая ткань играет жизненно важную роль в обмене веществ, и дисрегуляция жировой ткани может привести к развитию ожирения. Как правило, существует два типа жировой ткани: белая и коричневая жировая ткань. В то время как белая жировая ткань (ВАТ) может накапливать химическую энергию и выделять эндокринные факторы, бурая жировая ткань (БАТ) может использовать химическую энергию для выработки тепла и поддержания температуры тела^{на холоде.} Благодаря этой уникальной способности активация БАТ также может увеличить расход энергии и улучшить чувствительность к инсулину⁵.

BAT выполняет свою функцию посредством недрожащего термогенеза, процесса, опосредованного развязкой белка 1 (UCP1)⁶. Млекопитающие, в том числе мыши и люди, обладают разным количеством BAT. Классическая точка зрения БАТ заключается в том, что эти жировые ткани более распространены у мышей и младенцев, чем у взрослых людей. iBAT, расположенный в верхней дорсальной области между лопатками, является наиболее изученным депо BAT у мышей. Применяя радиоизотопную визуализацию и биопсийные тесты, недавние исследования выявили несколько депо БАТ у взрослых людей. Некоторые из них, в том числе депо, обнаруженные в глубокой шейке и надключичной области, ранее не были идентифицированы у мышей или других модельных животных 7,8,9,10,11. Среди этих депо BAT, scBAT является наиболее часто встречающимся депо у взрослых людей. Чтобы лучше понять происхождение и молекулярный вклад этих недавно обнаруженных депо BAT в организме человека, важно идентифицировать эквивалентные депо у мышей, которые позволяют генетическим и молекулярным манипуляциям отслеживать и тестировать функциональную роль этих депо. Таким образом, мы и другие ученые идентифицировали несколько ранее неизвестных депо BAT в различных анатомических местах у мышей, включая scBAT^12,13, грудной периваскулярный BAT^14,15, околопочечный BAT¹⁶ и периаортальный BAT¹⁷. Мышиный scBAT анатомически напоминает человеческий scBAT и морфологически напоминает классический iBAT, экспрессируя высокие уровни UCP1¹².

В отличие от мышиного iBAT, который легко поддается вскрытию, scBAT располагается в промежуточном слое шеи мыши, под слюнными железами и вдоль наружной яремной вены. Выделение этого депо для гистологического и молекулярного анализов может быть сложной задачей. Здесь мы подробно опишем процедуру препарирования scBAT у постнатальных и взрослых мышей и обработки этого депо для гистологии и анализа экспрессии генов.

Protocol

Процедуры на животных были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Медицинском колледже Бэйлора. Все процедуры проводились на самцах мышей C57BL/6J в возрасте 3 недель и 3 месяцев. Перед вскрытием все мыши были подвергнуты эвтаназии с использованием одобренной процедуры эвтаназии углекислым газом для грызунов. См. Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами, реагентами и инструментами, используемыми в этом протоколе.

1. Вскрытие scBAT

1. Положите тушку мыши на верстак и очистите хирургические ножницы и щипцы с тонким концом 70% этанолом.
2. Опрыскайте брюшную шею мыши 70% этанолом, чтобы намочить шерсть и свести к минимуму загрязнение шерсти.
3. Сделайте двусторонний разрез, примерно 1,5 см, вдоль ключиц.
4. От концов предыдущего надреза разрежьте продольно по направлению к ушам, длиной примерно 1 см. В результате образуется квадратный U-образный разрез вокруг шеи (Рисунок 1A, B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: scBAT находится в промежуточном слое шеи. На этом этапе обнажается поверхностный слой, состоящий из кожи, подкожно-жировой клетчатки и слюнных желез. Промежуточный слой, наряду с scBAT, содержит яремные вены и мышцы шеи. Глубокий слой шеи, содержащий глубокую шейную БАТ и артерию и яремные вены, обнажается путем удаления скелетной мышцы.
5. Поместите мышь под препарирующий микроскоп и сфокусируйте обнаженную шею (рис. 1C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот дополнительный шаг значительно повышает точность забора ткани, что необходимо, учитывая небольшой размер scBAT.
6. Полностью обнажите слюнные железы, приподняв разрезанные участки кожи щипцами.
7. С помощью хирургических ножниц и щипцов разъедините ткань, соединяющую слюнные железы, с тканью вокруг ключиц и друг с другом.
8. Обнажайте депо scBAT, приподнимая слюнные железы. Ищите БАТ вдоль наружной яремной вены и, возможно, соединенную с нижней стороной слюнных желез. Определите его по оранжеватому цвету, который выделяется на фоне окружающих тканей.
9. Удерживают целевую жировую ткань щипцами и аккуратно отклеивают ее от слюнных желез.
10. После отделения от слюнных желез продолжайте отсоединять scBAT от наружной яремной вены и мускулатуры шеи до тех пор, пока депо по обе стороны шеи не будут удалены целиком.
11. Осмотрите каждый препарированный образец scBAT под препарирующим микроскопом (рис. 1D, E), используя щипцы, чтобы удалить оставшуюся соединительную ткань.
12. Поместите каждый образец в стеклянный сцинтилляционный флакон, содержащий 10 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), и извлеките мышь из-под микроскопа.

2. Обработка и окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) scBAT (проиллюстрировано на рисунке 2A)

1. Замените PBS (шаг 1.12) 10 мл холодного 4% параформальдегида (PFA) и поместите флакон на нутатор, раскачивая при температуре 4 °C в течение ночи, чтобы зафиксировать scBAT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузионная фиксация может быть применена в постнатальном периоде, особенно у взрослых мышей, когда необходима дальнейшая обработка для иммуногистохимического анализа.
2. На следующий день стерильной трансферной пипеткой извлеките раствор ПФА из флакона и замените его 10-15 мл ПБС. Поместите флакон на нутатор и покачайте на 30 минут при комнатной температуре. Замените ПБС 0,85% физиологическим раствором и продолжайте качать еще 30 минут при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Солевой раствор представляет собой 0,85% физиологического раствора (NaCl) в воде, обработанной ДЭПК (без РНКазы). PBS может быть заменен физиологическим раствором на этом и следующем этапе.
3. Удалите 0,85% физиологический раствор с помощью трансферной пипетки и добавьте во флакон 10 мл 70% этанола/0,85% физиологического раствора. Храните флакон в холодильнике при температуре 4 °C в течение ночи или до тех пор, пока он не будет готов для введения парафина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: PBS можно использовать, если 0,85% физиологический раствор недоступен. scBAT должен быть обработан как можно скорее для облегчения секционирования и лучшей сохранности морфологии тканей.
4. Перед введением парафина обезвоживайте scBAT с помощью серии обменов этанола, чтобы удалить воду из ткани.
   1. Для начала удалите 70% этанол/0,85% физиологический раствор из флакона с помощью трансферной пипетки и добавьте 10-15 мл 95% дегидрантного спирта, покачивая флакон на нутаторе при комнатной температуре в течение 1 ч. Повторите этот шаг один раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этанол можно использовать вместо спиртовых растворов дегидранта.
   2. Затем замените 95% дегидрантный спирт 10-15 мл 100% дегидрантного спирта и продолжайте качать на нутаторе в течение 1 часа. Долейте новый 100% дегидрантный спирт и продолжайте качать в течение нескольких часов или ночи, в зависимости от количества scBAT во флаконе.
5. Чтобы очистить скБАТ для встраивания, добавьте 10 мл толуола во флакон и продолжайте качать на нутаторе до тех пор, пока скБАТ не станет прозрачным, примерно 6-8 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность времени, необходимого для достижения удовлетворительной очистки, зависит от размера scBAT. Рекомендуется начинать расчистку сразу утром, чтобы во второй половине дня могла произойти инфильтрация и заделка.
6. Чтобы внедрить scBAT в парафин, удалите толуол и добавьте во флакон 10 мл расплавленного инфильтрационного парафина. Поместите флакон в духовку при температуре 65 °C на 1 час. Повторите этот шаг с новым воском.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Начните плавить восковые гранулы в духовке в течение ночи перед началом заделки, чтобы убедиться, что воск полностью жидкий.
7. Замените инфильтрационный парафин на заделочный парафин и поместите флакон при той же температуре на 1 ч. Повторите этот шаг один раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стадия инфильтрации может быть прервана и продолжена позже. Выньте флакон из духовки и храните его при комнатной температуре до тех пор, пока он не будет готов.
8. Поместите ткань, сначала поместив ее в форму для заделки ткани, добавьте расплавленный воск для закладки в форму и переориентируйте ткань под стереомикроскопом. Затем поместите кассету для закладки поверх воска и продолжайте заливать ее поверх воска, пока она не заполнится, а закладной колпачок не будет прикреплен к восковому блоку. Переложите блок в холодильник с температурой 4 °C на ночь, чтобы воск затвердел и дал усадку, прежде чем снимать металлическую форму.
9. Разрежьте scBAT микротомом до толщины 5-6 мкм¹⁸, по три-четыре среза на предметное стекло микроскопа, и поместите в теплую парафиновую секцию флотационной ванны при температуре ~42 °C, чтобы срезы тканей разгладились.
10. Перенесите секции на направляющие и поставьте их вертикально напротив плавучей ванны, чтобы вода стекала с направляющих.
11. Переложите предметные стекла на решетку для окрашивания из нержавеющей стали и поместите решетку на стол для сушки слайдов на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Парафиновые предметные стекла можно хранить в течение длительного времени при комнатной температуре, прежде чем будет достигнута дальнейшая обработка.
12. Выполните окрашивание H&E¹⁹. Для начала поместите предметные стекла в штатив для окрашивания, затем поместите штатив в банку для окрашивания с ксилолом на 40 с. Повторите этот шаг один раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если парафин все еще виден после двух этапов, подождите, пока он полностью не растворится, прежде чем продолжить.
13. Чтобы регидратировать ткань, поместите подставку для выкрашивания в банку для окрашивания, наполненную 100% дегидрантным спиртом, на два 20-секундных этапа, затем 15-секундный этап в 95% дегидрантном спирте и заключительный 15-секундный ополаскиватель в ddH₂O.
14. Поместите предметные стекла в чашку для окрашивания, наполненную раствором гематоксилина, на 75 с для достижения ядерного окрашивания, затем промойте предметные стекла в чашке для окрашивания ddH₂O в течение 45 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время можно регулировать в зависимости от желаемого цвета пятна.
15. Дифференцируйте окрашивание, окунув предметные стекла в посуду для окрашивания, наполненную раствором HCl-этанола, на 15 с, затем перенесите предметные стекла в другую промывку ddH₂O на 15 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор HCl-этанола готовят в соответствии с опубликованным методом¹⁹.
16. Для цитоплазматического окрашивания поместите предметное стекло в раствор для противоокрашивания Eosin Y на 15 с.
17. Обезвоживайте ткани, погружая предметные стекла на 15 секунд каждый в три последовательных этапа раствора 95% дегидрантного спирта, затем две последовательные 100% дегидрантные спиртовые ванны - первая на 15 с, а вторая на 45 с - для завершения обезвоживания.
18. Наконец, перенесите предметные стекла в ванну с ксилолом на 45 с, чтобы реакклиматизировать ткань к органическим растворителям. После этого этапа окрашивание завершено; Извлеките ткань из раствора.
19. Нанесите монтажный материал на каждую направляющую и поместите ее в химический вытяжной шкаф. Высушите в течение ночи перед визуализацией. Результаты визуализации показаны на рисунке 2B.

3. Анализ экспрессии генов scBAT

1. Сбор тканей (шлифовка)
   1. После препарирования scBAT сразу же поместите ткань в микроцентрифужную пробирку, проткните отверстие в верхней части пробирки стерильной иглой и заморозьте в жидком азоте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основные этапы протокола, описанные здесь, проиллюстрированы на рисунке 3A. Протыкание отверстия в верхней части трубки перед тем, как опустить ее в жидкий азот, предотвращает разрыв трубки из-за резкого изменения давления.
   2. Наполните пластиковый стакан жидким азотом и оставьте пестик и тонкую лопатку для пропитки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно поддерживать температуру всех инструментов и образцов тканей как можно более холодную, близкую к температуре жидкого азота, в течение всей процедуры, чтобы предотвратить оттаивание ткани. Размороженная жировая ткань очень адгезивна и усложняет опудривание. Извлекайте инструменты и образцы из ванн с жидким азотом только непосредственно перед использованием.
   3. Возьмите по одному замороженному образцу ткани за раз и вылейте его из пробирки микроцентрифуги в раствор.
   4. Добавьте в ступку небольшое количество жидкого азота, затем пестиком измельчите замороженную ткань до полного измельчения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань начинает становиться мягкой или липкой в какой-либо момент, она оттаивает; Налейте в раствор больше жидкого азота.
   5. С помощью тонкого шпателя осторожно соскребите и перенесите измельченную ткань обратно в пробирку микроцентрифуги. Налейте жидкий азот в раствор во время соскребания, чтобы собрать оставшиеся кусочки ткани, прежде чем переносить шпателем. Повторяйте этапы переноса до тех пор, пока вся ткань не будет удалена из раствора.
   6. Очистите раствор с помощью легкого тканевого салфетки и 70% этанола перед тем, как высыпать следующий образец для измельчения. Храните измельченные в порошок салфетки в морозильной камере при температуре -80 °C длительное время.
2. Выделение общей РНК
   1. Подготовка
      1. Очистите верстак, пипетки, держатели наконечников и штативы для пробирок 70% этанолом и обеззараживающим средством для поверхности, чтобы удалить РНКазу.
      2. Запустите центрифугу до достижения температуры 4 °C.
      3. Раствор элюирования подогреть до 70 °С.
      4. Разбавляют ДНКазу I, смешивая 5 мкл восстановленной ДНКазы I с 75 мкл раствора для разведения ДНКазы на образец. Поместите раствор ДНКазы I на лед до использования.
   2. Процедура
      1. Для каждого образца промаркируйте две пробирки для микроцентрифуг, две пробирки для хранения колонок (две градуированные пробирки для микроцентрифуг без крышек) и одну связующую мини-колонку.
      2. Добавьте 500 мкл раствора для выделения РНК в каждый образец и проведите ультразвуковую обработку с помощью грануляторного пестик-мотора в течение 30 секунд.
      3. Возьмите шприц для каждого образца и пропитывайте пипетку вверх и вниз 10 раз для дальнейшего лизиса ткани. Убедитесь, что после спринцевания не видно твердых частиц.
      4. Добавляйте 250 мкл хлороформа и время от времени перемешивайте, ожидая 5 минут, пока образцы не инкубируются при комнатной температуре.
      5. Центрифуга при 21 000 × г в течение 20 мин при 4 °C.
      6. Переложите верхнюю водную часть в новую микроцентрифужную пробирку и добавьте эквивалентное количество 70% этанола (~500 мкл).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Верхняя водная часть должна быть прозрачной, нижняя должна быть красным раствором для выделения РНК, а между двумя слоями должны быть некоторые нежелательные твердые частицы.
      7. Перенесите 500 мкл нового лизата в связующую колонку. Центрифугу при 18 000 × г в течение 60 с, а затем фильтрат выбросить.
      8. Повторите предыдущий шаг с оставшимся лизатом, чтобы вся РНК попала в связывающую колонку.
      9. Добавьте 700 мкл промывки с низкой жесткостью в обвязочную колонку, центрифугируйте в течение 30 секунд и выбросьте фильтрат.
      10. Добавьте 80 мкл разбавленной ДНКазы I в каждую связывающую колонку. Выдерживать 15 мин при комнатной температуре.
      11. Добавьте 700 мкл промывки высокой жесткости, центрифугируйте в течение 30 секунд и выбросьте фильтрат.
      12. Добавьте 700 мкл промывки низкой жесткости, центрифугируйте в течение 60 секунд и выбросьте фильтрат.
      13. Переместите обвязочные колонны во^2-ю новую колонку без колпачка и центрифугу на 2 минуты, чтобы убедиться, что все жидкости удалены из обвязочной колонны.
      14. Переместите связывающие колонки в новую пробирку микроцентрифуги и добавьте 30 мкл подогретого элюирующего раствора. Выдерживают при комнатной температуре 1 мин.
      15. Центрифуга в течение 2 мин собирает элюированную РНК на дне пробирки микроцентрифуги.
      16. Измерьте общую концентрацию РНК с помощью спектрофотометра.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Если общая чистота РНК низкая, на что указывает значение 260/280 ниже 2,0 или значение 260/230 ниже 1,8, то после этапа 3.2.2.12., образцы можно еще раз промыть промывкой низкой строгости, а затем промыть 80% этанолом, прежде чем перейти к этапу 3.2.2.13.
      17. Храните РНК в морозильной камере при температуре -80 °C.
   3. Обратная транскрипция (RT)
      1. В полоску для ПЦР добавьте 0,5-1 мкг общей РНК, разбавленной в воде, обработанной DEPC, до 8 мкл для каждого образца РНК в отдельную лунку.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Количество РНК, используемой для обратной транскрипции, может быть увеличено или уменьшено в соответствии с инструкциями производителя.
      2. Добавьте 1 мкл Oligo dT и 1 мкл dNTP к каждому образцу в пробирке для ПЦР. Убедитесь, что общий объем составляет 10 мкл на образец.
      3. Поместите полоску пробирки для ПЦР в амплификатор и установите ее на 65 °C на 5 минут, а затем на 4 °C на неопределенный срок.
      4. Через 5 мин при 65 °C выньте полоску для ПЦР-пробирки и поместите пробирку на лед минимум на 2 минуты. После инкубации на льду добавьте в каждый образец пять реагентов: 4 мкл 5-цепочечного буфера, 2 мкл 25 мМ MgCl₂, 2 мкл 0,1 М DTT, 1 мкл ингибитора РНКазы и 1 мкл обратной транскриптазы. Убедитесь, что общий объем составляет 20 мкл на образец.
      5. Поместите полоску пробирки для ПЦР обратно в амплификатор и установите программу на 50 °C на 50 минут, затем на 85 °C на 5 минут, затем на 4 °C на неопределенный срок.
      6. Как только программа достигнет 4 °C, выньте полоску и добавьте 1 мкл рибонуклеазы H (РНКазы H).
         ПРИМЕЧАНИЕ: РНКаза H используется для удаления любой оставшейся РНК-матрицы в реакции RT; На этом этапе искомая РНК уже должна быть преобразована в кДНК.
      7. Поместите полоску обратно в амплификатор и работайте при температуре 37 °C в течение 20 минут, а затем 4 °C на неопределенный срок.
      8. Обратная транскрипция завершена; измеряют концентрацию кДНК с помощью спектрофотометра.
      9. Разбавляют кДНК до 250 нг/мкл; храните кДНК в морозильной камере при температуре -80 °C или -20 °C.
   4. Количественная ПЦР (кПЦР)
      1. Составьте электронную таблицу, чтобы упорядочить положение каждого праймера и образца на 96-луночном планшете для кПЦР.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Один из праймеров должен быть референсным геном, чтобы нормализовать экспрессию всех других интересующих генов, таких как 36B4.
      2. Сделайте мастер-микс для каждой комбинации «праймер + образец». В каждую лунку для реакции кПЦР добавьте 3 мкл воды молекулярно-биологического класса, 5 мкл основной смеси ферментов для кПЦР, 0,5 мкл прямого праймера и 0,5 мкл обратного праймера, что в сумме составляет 9 мкл на реакцию. Добавьте 1 мкл кДНК на реакцию, чтобы получить в общей сложности 10 мкл на реакцию.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартом является наличие трех технических реплик для каждой комбинации «праймер + сэмпл», поэтому каждый мастер-микс должен быть в 4 раза больше вышеуказанных количеств.
      3. Добавьте 1 мкл кДНК для каждого репликата в каждую мастер-смесь праймера. Если каждая мастер-смесь состоит из 4 мкм, то пипетируют 4 мкл каждого образца кДНК в его собственную меченую пробирку.
      4. Наконец, пипетку 10 мкл каждой реакционной смеси в 96-луночный планшет для кПЦР в положениях, определенных электронной таблицей.
      5. Запечатайте планшет толстым клейким уплотнением, а затем центрифугируйте 96-луночный планшет при 450 × г при 20 °C в течение 2 мин.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы планшет был полностью герметичным, чтобы избежать испарения образцов во время термоциклирования. Используйте легкие тканевые салфетки, чтобы прижать уплотнение к пластине, особенно к краям.
      6. Запустите планшет в приборе для ПЦР в реальном времени. Запрограммируйте реакцию ПЦР в соответствии с инструкциями производителя: 2 мин при 50 °C, затем еще 2 мин при 95 °C и, наконец, 40 циклов по 15 с при 95 °C и 30 с при 60 °C. Результаты анализа экспрессии генов методом кПЦР представлены на рисунке 3Б.

Results

В отличие от iBAT, который располагается в подкожном слое спины между двумя лопатками, scBAT располагается в промежуточном слое шеи, простираясь глубоко между слоями скелетных мышц и слюнной железы по мере роста вдоль наружной яремной вены (рис. 1A). Препарирование scBAT не так просто, как в iBAT. Здесь мы приводим подробную процедуру, включающую важнейшие этапы препарирования интактного scBAT у постнатальных и взрослых мышей (рис. 1B, C). После вскрытия шеи по предоставленному протоколу под препарирующим микроскопом можно определить тонкий слой scBAT и отделить его от соединенной слюнной железы и наружной яремной вены с помощью пары щипцов (рис. 1D, E). Для оценки морфологии депо свежевыделенный scBAT обрабатывали с использованием предложенной процедуры обработки в сочетании с ранее опубликованной процедурой окрашивания H&E¹⁹ (рис. 2A). Как показано на рисунке 2B, scBAT обладает тканевыми структурами, типичными для BAT-депо, и состоит из множества маленьких мультилокулярных адипоцитов у здоровых постнатальных и взрослых мышей. Для оценки уровней экспрессии генов в scBAT РНК выделяли из изолированных депо scBAT с использованием предложенных процедур (рис. 3A). Затем уровни экспрессии интересующих генов могут быть оценены стандартными методами ОТ-кПЦР (рис. 3A). Как показано на рисунке 3B, дифференциальные уровни экспрессии генов, участвующих в опосредовании функции scBAT, включая Pparg, главный регулятор развития BAT; Fabp4 и Glut4, два переносчика питательных веществ; и Ucp1 и Ppargc1a, два гена, участвующие в термогенезе, могут быть легко определены. Для сравнения РНК выделяли из изолированного iBAT, а экспрессию перечисленных выше генов также оценивали с помощью предложенных процедур (рис. 3А). Уровни экспрессии этих генов относительно схожи между этими двумя депо. (Рисунок 3Б).

Рисунок 1: Анатомическое расположение scBAT и процесс его рассечения. (A) Расположение scBAT в промежуточном слое шеи. (Б) Поверхностный слой шеи до и после удаления кожи. Масштабная линейка = 250 мкм. Пунктирными желтыми линиями очерчивается область, которая должна быть обнажена после выполнения U-образного разреза. (C) Изображение туши мыши, помещенной под препарирующий микроскоп для повышения визуальной четкости во время вскрытия. (Д,Э) Репрезентативные изображения промежуточного слоя шеи до и после scBAT удаляют у мышей в возрасте 3 недель и 3 месяцев. Масштабная линейка = 250 мкм. Пунктирными желтыми линиями обведены открытые двусторонние склады scbat; n = 2. Сокращения: scBAT = надключичная бурая жировая ткань; sfi = поверхностный слой; sg = слюнная железа; tr = трахея; jv = наружная яремная вена; sm = скелетная мускулатура. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Обработка scBAT для окрашивания H&E. (A) Блок-схема, иллюстрирующая основные этапы обработки scBAT для окрашивания H&E. После препарирования ткани ее последовательно фиксируют, обезвоживают, встраивают, секционируют и окрашивают. (B) Репрезентативные изображения окрашенных H&E-scBAT мышей в возрасте 3 недель и 3 месяцев; n = 3 для каждой стадии развития; масштабная линейка = 250 мкм для изображений с меньшим увеличением; Масштабная линейка = 50 мкм для изображений с большим увеличением. Сокращения: scBAT = надключичная бурая жировая ткань; PFA = параформальдегид; H&E = гематоксилин и эозин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Подготовка РНК из scBAT для анализа экспрессии генов. (A) Блок-схема, иллюстрирующая этапы выделения РНК и анализа экспрессии гена scBAT методом ОТ-кПЦР. Из-за небольшого размера и мягкой текстуры быстрое замораживание депо scBAT и измельчение его в жидком азоте имеет решающее значение для успешного выделения РНК. (B) Относительная экспрессия маркерных генов, включая Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1 и Ppargc1a, в scBAT и iBAT, выделенных от самцов мышей в возрасте 3 месяцев, n = 5. Данные представлены в виде среднего ± SEM. 36B4 был использован в качестве гена, ответственного за хозяйство для нормализации. Сокращения: scBAT = надключичная бурая жировая ткань; ОТ-кПЦР = ПЦР с обратной транскрипцией; LN₂ = жидкий азот. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

В этом протоколе мы подробно представляем процедуры препарирования и обработки scBAT для анализа H&E и экспрессии генов. Поскольку scBAT находится в промежуточном слое шеи и располагается вдоль крупных вен, выделение этого депо требует точной техники. В частности, чтобы получить четкое представление о складе, мы рекомендуем поместить мышь под препарирующий микроскоп после того, как горлышко было открыто. Используя пару тонких щипцов для отклеивания слюнной железы и окружающих вен, следует соблюдать осторожность, чтобы избежать прокола вен. Чрезмерное кровотечение может затруднить обнаружение scBAT. Для обработки scBAT для окрашивания H&E мы адаптировали использование опубликованного протокола¹⁹ с небольшими изменениями, включив в него использование 4% PFA, дегидрантных спиртов и органического растворителя толуола для обработки тканей, как показано в разделе протокола. Вся процедура занимает ~6 дней, а слайды, окрашенные H&E, можно сфотографировать на следующий день после завершения окрашивания.

ОТ-кПЦР с использованием РНК в качестве исходного материала является наиболее часто используемым методом анализа экспрессии генов в области биологии жировой ткани. Поскольку scBAT является относительно небольшим депо BAT по сравнению с iBAT, получение достаточного количества РНК для экспрессии генов может быть затруднено. Чтобы увеличить выход РНК, мы рекомендуем применять последовательные этапы подготовки лизата, как описано в разделе протокола, начиная с припудривания ткани с помощью пестика и ступки во время замораживания. Используя этот метод получения лизата, мы успешно получили высокопродуктивный и высококачественный образец РНК для анализа экспрессии генов scBAT от одной взрослой мыши. Этот метод получения лизата также может быть применен для получения высококачественных белковых лизатов из scBAT для вестерн-блоттинга с использованием буфера для лизиса белка.

Используя мышиный iBAT, исследователи получили существенные знания о функции BAT в термогенезе и метаболизме. Недавняя идентификация нескольких ранее неизвестных депо БАТ у мышей и людей, включая scBAT, показала необходимость проведения дополнительных исследований, прежде чем мы сможем полностью понять физиологический вклад БАТ у мышей и взрослых людей. В частности, необходимы исследования, проливающие свет на происхождение, функции и участие этих недавно обнаруженных депо BAT в термогенезе и регионарном или общеорганизменном метаболизме.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
95% спирт дегидранта (Flex 95)	Epredia	8201
100% спирт дегидранта (Flex 100)	Epredia	8101
96-луночный ПЦР-планшет	Bio-Rad	MLL9601
связывание Aurum Мини-колонка	Bio-Rad	7326826
Aurum Промывка высокой жесткости	Bio-Rad	7326803
Aurum Промывка низкой жесткости	Bio-Rad	7326804
Базовые формы (для встраивания)	Tissue-Tek	4122
BD PrecisionGlide Игла 21г x 1 1/2"	Becton Dickinson	305167
C1000 Touch Термоциклер	Bio-Rad	1840148
Микроцентрифуга без колпачка 2 мл	Fisherbrand	02-681-453
Центрифуга	Eppendorf	5430R
CFX Opus 96 Прибор для ПЦР в реальном времени	Bio-Rad	12011319
хлороформ	Thermo Scientific Chemicals	383760010
Cytoseal 60 Маловязкая монтажная среда	Epredia	83104
Вода, обработанная DEPC,	Ambion	AM 9906
Препарирующий микроскоп	Nikon
раствор для разведения ДНКазы	Bio-Rad	7326805
DNase I	Bio-Rad	7326828
dNTPs	Invitrogen	18427013
раствор для элюирования	Bio-Rad	7326801
EM 400 средняя среда для встраивания парафин	Leica Biosystems	3801320
Eosin Y (0,5% по объему)	RICCA	2858-16
Formula R Инфильтрационная среда парафин	Leica Biosystems	3801470
Genemark Nutator Gyromixer 349	Bio Express	S-3200-2
Gill #3 Гематоксилин	Sigma-Aldrich	GHS332-1L
HCl (для HCL-этанола)	Fisher Chemical	A142212
IP VI Встраиваемые кассеты	Leica Biosystems	39LC-550-5-L
Чистый этанол Koptec - 200 Proof (для 70% этанола)	Decon Labs	V1001
MgCl2 (25 mM)	Thermo Fisher Scientific	R0971
Микроцентрифужные пробирки 1,7 мл	Avantor	87003-294
Микроуплотнения 'B' (адгезивные уплотнения)	Bio-Rad	MSB1001
Микротом	Leica Biosystems	RM2245
Молекулярная биология Класс Вода	Corning	46-000-CM
Раствор Coors Tek	Thomas Scientific	60310
NaCl (для 0,85% физиологического раствора)	Биореагенты	Fisher BP358-212
NanoDrop Спектрофотометр	NanoDrop Technologies	ND-1000 UV/Vis
Oligo dT	Invitrogen	18418020
парафиновой секции	Boekel Scientific	14792V
Параформальдегид (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148-500G
ПЦР-трубка	Avantor	76318-802
Пестик от Coors Tek	Thomas Scientific	60311
Пест пеллетный мотор	Kimble	749540-0000
Фосфатный буферный физиологический раствор (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
Прецизионная модель 19 Вакуумная печь	Thermo Fisher Scientific	CAT# 51221162
Грунтовка: 36B4  (вперед) 10 μ M 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3'			База данных Chen lab Oligo
Primer: 36B4 (реверс) 10 μ M 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGA TGG AGT GT 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Fabp4 (forward) 10 μ М<бр/> 5' ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3'			Chen lab Oligo database Primer
: Fabp4 (reverse) 10 μ М<бр/> 5' CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3'			Chen lab База данных Олиго
Праймер: Glut 4 (прямой праймер) 10 μ М<бр/> 5' CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3'			Chen lab Oligo база данных
Primer: Glut 4 (реверс) 10 μ М<бр/> 5' GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3'			Chen lab Oligo база данных
Primer: PPARg (forward) 10 μ М<бр/> 5' AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3'			База данных Chen lab Oligo
Primer: PPARg (reserve) 10 μ М<бр/> 5' AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3'			База данных Chen lab Oligo
: Ppargc1a (реверс) 10 μ M 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Ppargc1a(forward) 10 μ M 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3'			Chen lab Oligo database
Primer: Ucp1 (forward) 10 μ М<бр/> 5' AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3'			База данных Chen lab Oligo
: Ucp1 (reverse) 10 μ М<бр/> 5' ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3'			Chen lab Олиго база данных
Раствор для выделения РНК (PureZol)	Bio-Rad	7326880
РНКаза Away (поверхностный деконтаминант)	Thermo Scientific	1437535
РНКаза H	NEB	M0297S
ингибитор рназы (РНКаза Out)	Флакон инвитрогена	10777019
сцинтилляции (стекло)	Электронная микроскопия Sciences	72632
Стол для сушки слайдов	Электротермический (Коул-Пармер)	MH6616
Штатив для окрашивания нержавеющей стали	Электронная микроскопия Sciences	70312-54
Стереомикроскоп (для встраивания)	Olympus	SZ51
Сугические ножницы	McKesson	43-1-104
Superfine point Прямой рассекающий щипцы	Avantor	82027-402
Superfrost Plus Предметные стекла микроскопа	Fisher Scientific	12-550-15
SuperScript III обратная транскриптаза (включает 5x буфер первой цепи и 0,1M DTT)	Invitrogen	18080044
SUR-VET шприц с иглой 25 г x 5/8", 1 мл	Terumo	100281
SYBR Green (мастер-смесь ферментов qPCR)	Applied Biosystems	A25778
Tissue-Tek Набор для ручного окрашивания предметного стекла (баночки)	Электронная микроскопия науки	Артикул: 62540-01
Толуол	Фишер Химический	T324-1
Пипетка трансферная	Avantor	414004-005
Xylene	Fisher Chemical	X3P-1GAL