Методическая статья

Гемостаз пункционной раны и подготовка образцов для анализа методом широкоугольной электронной микроскопии

1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66479

⸱

24 мая 2024 г.

 ,  , 
1Department of Physiology and Cell Biology, University of Arkansas for Medical Sciences

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлена процедура колотой раны при образовании гемостатического тромба. Образующиеся тромбы имеют большие размеры и достигают сотен микрон в диаметре. Следовательно, подходят подходы к объемной визуализации. Мы предлагаем смонтированную широкозонную просвечивающую электронную микроскопию в качестве подхода с высоким разрешением, доступного многим, и детализируемого препаративного протокола.

Аннотация

Гемостаз, процесс нормального физиологического контроля повреждения сосудов, имеет основополагающее значение для жизни человека. Все мы время от времени получаем небольшие порезы и колотые раны. При гемостазе самоограничивающаяся агрегация тромбоцитов приводит к образованию структурированного тромба, при котором остановка кровотечения происходит за счет закрытия отверстия снаружи. Детальная характеристика этой структуры может привести к различиям между гемостазом и тромбозом, случаем чрезмерной агрегации тромбоцитов, приводящей к окклюзионному свертыванию. Здесь представлен подход к структуре тромба колотой раны, основанный на визуализации, который основан на способности тонкой электронной микроскопии визуализировать внутреннюю часть гемостатического тромба. Самым основным шагом в любом экспериментальном протоколе, основанном на визуализации, является хорошая подготовка образцов. В протоколе подробно описаны процедуры подготовки колотых ран и тромбов, обогащенных тромбоцитами, у мышей к последующей электронной микроскопии. Подробно описана методика фиксации in situ образовавшегося тромба пункционной раны и его последующей обработки для окрашивания и встраивания в электронную микроскопию. Электронная микроскопия представлена в качестве метода конечной визуализации из-за ее способности в сочетании с последовательным срезом визуализировать детали внутренней части тромба с высоким разрешением. Как метод визуализации, электронная микроскопия дает несмещенную выборку и экспериментальный результат, который масштабируется от нанометра до миллиметра в 2 или 3 измерениях. Упоминается соответствующее бесплатное программное обеспечение для электронной микроскопии, которое будет поддерживать широкозонную электронную микроскопию, в которой сотни кадров могут быть объединены для получения нанометровой визуализации целых поперечных сечений тромбов проколотой раны. Следовательно, любая подобласть файла изображения может быть легко помещена в контекст полного поперечного сечения.

Введение

Образование тромба колотой раны, приводящего к остановке кровотечения, является одним из самых важных событий в жизни1. Тем не менее, несмотря на эту важность, знание того, что происходит структурно во время формирования тромба, будь то в вене, артерии, атеросклеротическом событии или окклюзионном сгустке, было ограничено разрешением и глубиной визуализации. Традиционная световая микроскопия ограничена по глубине по сравнению с полностью сформированным тромбом колокольной раны, от 200 до 300 мкм вZ1, и по уровню разрешения по сравнению с размером тромбоцитарных органелл и расстоянием между ними, часто менее 30нм2. Двухфотонная световая микроскопия может обеспечить необходимую глубину изображения, но не приводит к значительному повышению разрешения. Самые последние достижения в световой микроскопии, например, методы сверхвысокого разрешения, все еще ограничены разрешением, на практике ~20 нм в XY и в два раза больше в Z, и ограничены по глубине, не больше, чем в обычной световой микроскопии. Кроме того, световая микроскопия со сверхвысоким разрешением, как и большая часть исследовательской световой микроскопии, основана на флуоресцентной микроскопии, методе, который по своей сути смещен в сторону небольшого набора белков-кандидатов, для которых существуют хорошие антитела или хорошие меченыеконструкции. В заключение следует отметить, что обычная сканирующая электронная микроскопия может в лучшем случае визуализировать поверхность формирующегося тромба, обогащенного тромбоцитами.

Чтобы преодолеть эти технические ограничения в определении характеристики структуры тромба, мы преследовали три цели. Во-первых, воспроизводимо получить определенную колотую рану в вене или артерии мыши, которая затем может быть легко стабилизирована in situ с помощью химической фиксации. Во-вторых, применять препаративную процедуру, которая подчеркивает сохранение мембраны, что согласуется с целью определения положения отдельных тромбоцитов в формирующемся тромбе. В-третьих, используйте метод непредвзятой визуализации, который в одном изображении можно масштабировать от нанометра до почти миллиметра.

Широкоугольная электронная микроскопия была выбрана в качестве основного метода визуализации по одной важной причине: при визуализации с помощью электронного микроскопа можно увидеть огромное количество особенностей внутри клетки, которые очерчивают ее органеллы и особенности внутри органелл. Небольшие объекты, такие как рибосомы, могут быть распознаны. Этот диапазон особенностей виден потому, что электронно-плотные красители тяжелых металлов, уранил, свинец и осмий, которые используются в электронной микроскопии для получения контраста, связываются с широким спектром молекул. На изображении, полученном с помощью электронного микроскопа, можно увидеть многое из того, что есть, в то время как при использовании иммунофлуоресценции и белкового мечения можно увидеть только то, что светится. Это означает, например, сайты антигенов, присутствующие на данном отдельном виде белка. В случае меченой молекулы, часто белка, это место (участки), где находится этот белок. Все остальные молекулы темные и не подсвечиваются. Однако практичен ли такой выбор электронной микроскопии? Тромб колотой раны имеет размеры 300 на 500 мкм, а при размере пикселя 3 нм это изображение 100 000 на 167 000 пикселей. Качественная камера электронного микроскопа имеет размеры 4000 на 4000 пикселей. Это означает, что примерно 1000 кадров должны быть сшиты/смешаны, чтобы получить одно изображение. Именно такая возможность присутствует в большинстве электронных микроскопов, произведенных за последние 15 лет. Предметный столик микроскопа компьютеризирован, а изображения могут быть сшиты с помощью компьютера. Именно это обоснование привело к выбору, лежащему в основе формулирования представленного протокола.

В заключение мы представляем ниже ряд этапов, которые дают воспроизводимую рану в вене или артерии мышей, которая затем, после этапов фиксации in situ и последующих этапов внедрения, может быть визуализирована с помощью монтажной широкозонной просвечивающей электронной микроскопии в масштабе nm, а в сшитом изображении, визуализированном в масштабе, близком к mm, масштабе фактического in situ неподвижный тромб. Масштабируемость такого рода необходима для понимания образования тромбов как проблемы в гематологии/здоровье и как системы биологии развития, в которой тромбоциты являются основным типом клеток. Эти достижения обеспечивают главное достоинство электронной микроскопии, а именно, человек видит то, что есть, а не только то, что светится. Для ознакомления с подробным протоколом подготовки образцов для последовательной блочной сканирующей электронной микроскопии лица (SBF-SEM) читатель может ознакомиться с недавней статьей Joshi et al.4.

Протокол

Эксперименты были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Университете медицинских наук Арканзаса. Здесь были использованы самцы и самки C57BL/6 дикого типа в возрасте от 8 до 12 недель. Эти мыши являются молодыми взрослыми особями с небольшим накоплением жира. Те же процедуры применимы к мышам-мутантам в отношении различных белков, важных для гемостаза, таких как фактор фон Виллебранда или тромбоцитарный гликопротеин VI (GPVI)5,6. Все используемое оборудование, хирургические инструменты, реагенты и другие материалы показаны на рисунке 1 и перечислены в таблице материалов.

1. Прокол раны яремной вены/бедренной артерии 1,7

  1. Обезболивание мыши
    1. Поместите мышь в индукционную камеру и поверните испаритель изофлурана на высокую скорость потока (500 мл/мин, 3% изофлуран). Изофлуран выбирают потому, что он мало влияет на диаметр кровеносных сосудов.
      ВНИМАНИЕ: Длительное воздействие изофлурана может вызвать неблагоприятные последствия для здоровья. Использование испарителя с низким расходом, канистр для улавливания газа для анестезии и хорошей вентиляции помещения может значительно снизить воздействие.
    2. Когда мышь будет казаться спящей, зажмите один из пальцев мыши, чтобы проверить, реагирует ли мышь. Если это так, поместите мышь обратно в индукционную камеру на несколько минут, а затем повторите попытку теста на сжатие. Если мышь не реагирует, поместите ее в лежачем положении на нагревательную пластину (предварительно накрытую алюминиевой фольгой).
    3. Убавьте расход вапорайзера до низкого расхода (100 мл/мин, 1,75% изофлуран). Поместите нос мыши в носовой конус. Вытяните каждую конечность и примотайте вниз небольшими кусочками клейкой ленты.
    4. Вставьте ректальный датчик температуры и установите температуру на 37 °C на терморегуляторе. Заклейте шнур датчика температуры скотчем, чтобы предотвратить случайное вытягивание щупа.
  2. Разрез мыши
    1. С помощью машинок для стрижки побрейте шею и грудь мыши (для яремной вены) или внутреннюю правую ногу (для бедренной артерии). Сотрите обрезки шерсти спиртовой салфеткой. При необходимости еще раз пройдитесь по участку машинкой для стрижки, чтобы удалить остатки шерсти.
    2. Снова протрите участок свежей спиртовой салфеткой, чтобы удалить все обрезки. Очень важно, чтобы территория была максимально чистой. Подтвердите операционную плоскость анестезии с помощью щипка на пальце ноги.
    3. С помощью ножниц и тупых щипцов приподнимите и разрежьте кожу над правой яремной веной. Вырежьте на коже круглое окошко, достаточно большое, чтобы обнажить яремную вену и часть окружающих тканей.
  3. Чистка яремной вены (те же принципы действуют и для бедренной артерии)
    1. Используя технику тупого рассечения, аккуратно отодвигайте в сторону жировые и лимфатические узлы, а также соединительную ткань.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе проводится некоторая генеральная уборка вокруг судна; Тем не менее, тщательная, тщательная чистка будет проведена под микроскопом после того, как яремная вена будет зафиксирована в параформальдегиде в течение 24 часов.
    2. Наполните шприц объемом 20 мл обычным физиологическим раствором, подогретым до 37 °C. Загрузите шприц в шприцевой инфузионный насос. Прикрепите иглу-бабочку 27G и соответствующую трубку к шприцу.
    3. Установите шприцевой насос на расход 0,5 мл/мин. Нежная струя физиологического раствора смоет кровь из проколотой вены/артерии. Расположите струю физиологического раствора на несколько мм сбоку от места прокола, а не прямо над ним.
  4. Пункция яремной вены/бедренной артерии
    1. Запустите таймер. Приобретите иглу для подкожных инъекций 30G (номинальный диаметр 300 мкм) для яремной вены и иглу для подкожных инъекций 33G (диаметр 200 мкм) для бедренной артерии. Использование иглы меньшего размера дает лишь немного больше времени кровотечения при артериальной ситуации с высоким давлением.
    2. Поверните фаску лицевой стороной вверх. Расположите иглу под углом 25° над яремной веной/бедренной артерией. Обратите внимание на время.
    3. Быстро проколите сосуд, проткнув только верхнюю часть сосуда. Будьте осторожны, чтобы не проколоть дно сосуда. Обратите внимание на время, когда кровотечение полностью прекращается.
    4. Подождите, пока не произойдет образование тромба (рисунок 2A), прежде чем начинать перфузионную фиксацию (т.е. 1, 5, 10 или 20 минут для получения различных стадий развития тромба). Усыпьте животное путем обескровливания или следуйте местным рекомендациям по эвтаназии.
  5. Проведение транскардиальной перфузионной фиксации
    1. Настройте перистальтическую помпу перед началом операции. Поместите две конические пробирки объемом 50 мл в штатив для пробирок. Заполните одну пробирку 4% раствором фиксатора параформальдегида, приготовленным в буферном растворе какодилата натрия (0,2 М какодилата натрия, 0,15 М хлорида натрия при pH 7,4) для исследования яремной пункции, а другую пробирку заполните буферным раствором какодилата натрия.
      Примечание: Описанные здесь условия достаточны для случая низкого давления в яремной кости и затем модифицируются для случая более высокого давления в артерии. При исследовании системы высокого давления с артериями, т.е. бедренной артерией, параформальдегидный фиксатор дополняют 0,1% глутаральдегида, а наружную капельную фиксацию сочетают с перфузионной фиксацией.
    2. Поместите всасывающий конец трубки насоса в трубку, содержащую буферный раствор. Прикрепите иглу-бабочку 27G с соответствующей трубкой к выходному концу трубки насоса и поместите иглу в чистую мензурку.
    3. Установите перистальтический насос на расход 10 мл/мин. Включите перфузионный насос.
    4. Когда буферный раствор начнет вытекать из иглы в стакан, выключите насос. Теперь трубка и игла подготовлены для транскардиальной перфузии.
    5. Обнажите грудную полость, сделав разрез по средней линии кожи от верхней части грудины до нескольких миллиметров за нижней частью грудины с помощью рассекающих ножниц и тупых щипцов. Сделайте поперечные надрезы вдоль основания грудной клетки, начиная от средней линии и разрезая от медиальной к боковой с каждой стороны.
    6. Непосредственно перед началом транскардиальной перфузии быстро разрежьте грудную клетку и отразите каждую сторону, чтобы обнажить сердце.
    7. Включите перистальтическую помпу. Поместите кончик иглы-бабочки 27G в основание левого желудочка.
    8. Надежно удерживая иглу в левом желудочке, вырежьте разрез в правой ушной раковине с помощью острых ножниц, чтобы кровь и перфузионная жидкость вытекли. Обратите внимание на время на таймере.
    9. Перфузируйте буферным раствором в течение 3 мин для вымывания крови из кровеносной системы. Все еще удерживая иглу в левом желудочке, выключите перистальтический насос и переместите всасывающий конец трубки перистальтического насоса к трубке объемом 50 мл, содержащей фиксирующий раствор.
    10. Обратите внимание на время на таймере. Снова включите перистальтический насос и перфузируйте фиксирующим раствором в течение 7 минут. Выключите перистальтический насос.
    11. Извлеките иглу из левого желудочка и поместите ее в стакан для отходов. Поместите всасывающий конец трубки насоса в стакан с дистиллированной водой.
    12. Включите перистальтический насос и дайте примерно 20 мл воды протекать через трубку и выйти из иглы 27G в стакан для отходов для очистки трубки. Перед выключением насоса убедитесь, что вся вода вышла из трубки и иглы.

2. Забор образцов для электронной микроскопии

  1. После перфузионной фиксации, дополненной начальным наружным фиксатором в течение 2 мин в случае прокола бедренной артерии, осторожно рассекают участок яремной вены/бедренной артерии, содержащий место пункции и тромб (рис. 2А). Острыми ножницами сделайте диагональный разрез поперек дистального конца сегмента сосуда и сделайте прямой разрез поперек проксимального конца сегмента сосуда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение надрезов таким образом помогает впоследствии сориентировать сосуд и определить направление кровотока в сосуде.
  2. Погрузите сегмент сосуда в свежий 4% параформальдегид комнатной температуры в буферный раствор какодилата натрия (0,2 М какодилат натрия, 0,15 М хлорид натрия при pH 7,4) и поместите при комнатной температуре на 1 ч.
  3. Перенесите неподвижную ткань при температуре 4 °C на 24 часа. На следующий день возьмите чашку для культивирования 35 мм, содержащую силиконовый коврик толщиной ~5 мм (приготовленный заранее в соответствии с инструкциями производителя). Налейте в чашку достаточное количество буферного раствора какодилата натрия, чтобы погрузить неподвижный сегмент вены.
  4. При просмотре под световым микроскопом (~15-кратное увеличение) осторожно перенесите ткань в чашку диаметром 35 мм, содержащую буферный раствор, и прикрепите каждый конец сосуда к силиконовому коврику с помощью мелких булавок из нержавеющей стали и тонких щипцов.
  5. Осторожно очистите сегмент яремной вены/бедренной артерии с помощью микроножниц и очень тонких щипцов.
    1. Только для яремной вены: Удалите один из штифтов и с помощью микроножниц разрежьте стенку сосуда напротив места прокола/тромба вдоль. Аккуратно откройте сосуд и, используя от 4 до 5 булавок (каждый из которых разрезается пополам кусачками), приколите его к силиконовому коврику внутрипросветной стороной вверх.
  6. Отсадите буферный раствор, быстро замените его 1% раствором параформальдегида в буферном растворе какодилата натрия и накройте посуду крышкой. Ни в коем случае не допускайте пересыхания ткани. Всегда держите его погруженным в жидкость.
  7. Храните ткань при температуре 4 °C до тех пор, пока не придет время обрабатывать ее для электронной микроскопии (рис. 2B). Обработайте некоторые образцы проколотой раны яремной вены/бедренной артерии для визуализации с помощью SBF-SEM4, а другие для визуализации с помощью WA-TEM 8,9. Шаги WA-TEM подробно описаны ниже.
    ВНИМАНИЕ: Выполняйте все работы с формальдегидом, оксидом пропилена, OsO4 и 2,4,6-трис(диметиламинометил)фенолом (DMP-30) в химическом вытяжном шкафу. Это опасные химические вещества. Воздействие OsO4 может привести к слепоте и смерти.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все объемы полоскания и пятен как минимум в 2 раза превышают объем образца. 1x фосфатно-солевой буфер (PBS) может быть заменен 0,1 М буфером какодилата натрия. Во время процедуры фиксации очень важно не допускать пересыхания образцов, так как это существенно повлияет на ультраструктуру. Используйте полипропиленовые трубки.

3. Подготовка образца для монтажной широкозонной просвечивающей электронной микроскопии (WA-TEM)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг представляет собой момент принятия решения, в котором исследователь обязуется подготовиться к WA-TEM. Эта препаративная процедура не поддерживает SBF-SEM. Для SBF-SEM volume EM все окрашивания должны быть выполнены перед заделкой в пластик. Протокол подготовки SBF-SEM см.в пункте 4 .

  1. Промойте образец ткани в чашке диаметром 35 мм 2 раза сбалансированным раствором соли Хэнка (HBSS) или PBS при комнатной температуре (RT). Держите образец закрепленным, чтобы можно было отслеживать его ориентацию с помощью этих подготовительных этапов.
  2. Зафиксируйте 0,8 мл 0,05% малахитового зеленого / 2,5% глутаральдегида / 0,1 М какодилата натрия (pH 6,7 - 7,0) на 20 минут на льду.
  3. Снимите фиксатор и промойте образец 4 раза в течение 5 мин каждый с 0,1 М какодилата натрия. Удалите 0,1 М какодилата натрия.
  4. Постфикс с 0,8 мл 0,8% K3Fe(CN)6 или K4Fe(CN)6 / 1,0% OsO4 K3Fe(CN)6 в 0,1 М какодилата натрия. Накройте тарелку крышкой, чтобы свет не попадал внутрь (OsO4 светочувствительна). Окрашивать от 20 минут до 1 часа в режиме RT.
  5. Удалите OsO4 и промойте 4 раза в течение 5 минут каждый 0,1 М буфером какодилата натрия. Удалить буфер какодилата натрия и нанести на лед 1% дубильную кислоту на 20 минут.
  6. Удалите дубильную кислоту и мойте в течение 5 минут с 0,1 М буфером какодилата натрия 1x и 2x по 5 минут каждый с молекулярной дистиллированной (DI) водой.
  7. Окрашивать 0,5% уранилацетатом (UA) в течение 1 ч RT или на ночь при температуре 4 °C в темноте.
  8. Удалите уранилацетат и промойте 5 раз в течение 5 минут каждый молекулярной дистиллированной водой. Перед последней промывкой и пока образец еще погружен в деионизионную воду, разрежьте силиконовый коврик вокруг прикрепленного образца лезвием бритвы. Извлеките этот небольшой кусочек силиконового коврика из пластины и поместите его в полипропиленовую трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы образец оставался прикрепленным к силиконовой части, пока она находится в пробирке. Переход на полипропиленовые трубки на этом этапе необходим, потому что оксид пропилена, используемый на последующих этапах, будет разрушать полистирол пластин диаметром 35 мм.
  9. После удаления последнего буфера кратко промойте 1x 25% этанолом. Выбросьте 25% этанол и инкубируйте с 25% этанолом в течение 3 минут на льду.
  10. Удалите 25% этанол. Кратко смойте 1x 50% этанолом. Выбросьте 50% этанол и инкубируйте с 50% этанолом в течение 3 минут на льду.
  11. Удалите 50% этанол и кратко промойте 1 раз 75% этанолом. Выбросьте 75% этанол и инкубируйте с 75% этанолом в течение 3 минут на льду.
  12. Удалите 75% этанол и кратко промойте 1x 95% этанолом. Выбросьте 95% этанол и инкубируйте с 95% этанолом в течение 3 минут на льду.
  13. Удалите 95% этанол и промойте 3 раза, не менее 10 минут каждый раз, 100% этанолом (200 proof). Удалите 100% этанол и добавьте оксид пропилена (PO). Смойте 3 раза не менее 10 минут каждый, с пероральным приемом.
  14. Приготовьте смоляную смесь, как описано ниже.
    1. Нагрейте компоненты смолы до 60 °C для полного разжижения. Тщательно перемешайте 12,5 мл Embed-218, 7,5 мл Araldite 502 и 27,5 мл DDSA в пробирке объемом 50 мл при температуре 60 °C. Эту смесь можно хранить в течение 6 месяцев при температуре 4 °C. Перед использованием нагрейте его до 60 °C. Перед использованием наберите необходимое количество.
  15. Внедрите примеры, как описано ниже.
    1. Поместите аликвоту смоляной смеси в пробирку и добавьте 20 мкл/мл активатора DMP-30. Тщательно перемешать, вращая при температуре 60 °C; Цвет должен потемнеть.
    2. Разбавьте эту аликвоту активированной смолы на 50% в пероральном креме и дайте смоле и ПО полностью смешаться.
    3. Удалите последний ополаскиватель PO из пробирки, содержащей образец, и замените его смесью 50% смолы и PO, почти полностью заполнив пробирку. Поверните образец на ночь при комнатной температуре.
    4. На следующий день смешайте новую аликвоту смолы (1 мл на образец) с 20 мкл/мл DMP-30.
  16. Поместите образец в полипропиленовую чашку с небольшим объемом 50% смеси смолы и PO из пробирки для образца под препарирующим микроскопом (~6-кратное увеличение) и осторожно выньте штифты из ткани. Перенесите только ткань в другую полипропиленовую чашку, содержащую небольшое количество 100% смолы с активатором DMP-30.
  17. Заполните силиконовую форму для встраивания 100% смолой с помощью активатора DMP-30 и осторожно поместите образец в форму. Поместите форму в духовку и выпекайте при температуре 60 °C не менее 48 часов. Подготовленный образец представлен на рисунке 2В.
  18. Выполните монтированную широкозонную просвечивающую электронную микроскопию (WA-TEM), как описано впунктах 10,11. На рисунке 3 показан процесс, идущий от начального прокола до трехмерного тромба за 1 минуту. Включение подробного протокола для монтажной электронной микроскопии WA-TEM здесь не включено и выходит за рамки настоящих протоколов по пробоподготовке.
    Примечание: WA-TEM является недооцененной способностью большинства современных просвечивающих электронных микроскопов с компьютеризированным столиком. Условно-бесплатное программное обеспечение, поддерживающее эти функции10,11, доступно в группе доктора Дэвида Мастронарда, Университет Колорадо, Боулдер (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/, http://bio3d.colorado.edu/imod/.)

Результаты

Количественная оценка влияния препарата на время кровотечения из колотой раны
Время кровотечения из колотой раны обеспечивает физиологическую модель риска приема лекарственного препарата, которая может быть легко проведена на мышах. Результаты, полученные в результате эксперимента с колотой раной, являются прогностическими. Здесь мы показываем кривую зависимости доза-реакция на дабигатран. Дабигатран, ингибитор тромбина, используется в качестве перорального антикоагулянта прямого действия, так называемого DOAC12. Модель проколотой раны яремной вены была использована для оценки риска, присущего различным дозам дабигатрана, через потенциальное длительное кровотечение через замедленное образование тромбов у мышей. Различные дозы 15, 50 или 150 мкг/кг дабигатрана вводили внутривенно (в/в) за 20 минут до пункции яремной вены. Мы показываем среднее время кровотечения при различных концентрациях дабигатрана (рис. 4). При уровне дозы наблюдается значительное удлинение времени кровотечения, p <0,051. Это свидетельствует о значительном факторе риска применения препарата у человека. Экспериментально установлено, что препарат в этих дозах оказывает существенное влияние на ультраструктуру формирующегося тромба.

Оценка состояния активации тромбоцитов в формирующемся тромбе колотой раны
Подход WA-TEM обеспечивает как обзор области раны в одной плоскости при рассмотрении при меньшем увеличении, так и большую детализацию при большем увеличении (Рисунок 5). Полученные детали могут быть непосредственно размещены в контексте обзора. Мы использовали этот подход для оценки рекрутирования дисковидных тромбоцитов в формирующийся тромб проколотой раны. Циркулирующие тромбоциты дисковидные, отсюда и название, и содержат полный набор секреторных гранул. Ключевой вопрос заключался в том, как циркулирующие тромбоциты могут быть привлечены к растущему тромбу, не нарушая свойства свободного течения оставшихся тромбоцитов. Наша работа указывает на гипотезу Tether and Activate, в которой циркулирующие тромбоциты возвращаются в тромб один за другим через процесс связывания в виде дисковидных тромбоцитов, содержащих полный набор органелл2. Доказательством этого является WA-TEM тромба яремной вены через 1 минуту после пункции. После среза для получения полных срезов тромба из середины все еще кровоточащей раны мы получили 500-800 кадров размером 4000 на 4000 пикселей и размером пикселя 3,185 нм в прямоугольной растровой сетке XY по всему размеру тромба в поперечном сечении с помощью автоматизированного предметного столика и просвечивающего электронного микроскопа с использованием программного обеспечения SerialEM10. Затем рамы были сшиты вместе с помощью программного обеспечения eTomo, входящего в состав программного пакета IMOD11. В результате получается одно изображение разного размера, например, 120 000 пикселей на 90 000 пикселей, которое является полноэкранным при низком масштабе, 0,02, или с детализацией при большем масштабе, от 0,25 до 1,0 с использованием программного обеспечения 3DMOD, опять же является частью программного пакета IMOD (Рисунок 5). В NET, программный анализ показал, что периферически связанные, связанные с тромбом дисковидные пластинки в проколе отверстия были разнесены друг от друга, как бусины на нитке. На небольшом расстоянии внутри тромба дискоидная форма была менее отчетливой, а тромбоциты были более тесно связаны друг с другом. Глубже внутри тромба тромбоциты были округлены, плотно упакованы и частично дегранулированы. Морфологическая последовательность предполагала первоначальное связывание тромбоцитов с тромбом через молекулу длинного троса, вероятно, фактор фон Виллебранда, и что любые дальнейшие этапы активации тромбоцитов были ограничены внутренней частью формирующегося тромба. Следовательно, рекрутирование тромбоцитов в тромб может происходить без нарушения циркуляции крови в яремной вене.

figure-results-1
Рисунок 1: Хирургическая установка для проведения эксперимента с тромбом в яремной вене/бедренной артерии с проколом раны. Хирургическое оборудование (А) и инструменты (В) тщательно расположены для обеспечения эффективности движения, поскольку время имеет решающее значение во время эксперимента. (C) После перфузионной фиксации часть сосуда, содержащая тромб колотой раны, прикрепляют к силиконовому коврику в чашке для культуры диаметром 35 мм при просмотре под световым микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Переход от кровеносного сосуда к пластиковым внедренным образцам, которые будут разрезаны для WA-TEM или SBF-SEM. (А) Показана бедренная артерия с колотой раной и накапливающимся внесосудистым тромбом (круг и стрелка). (B) Тромб (круг и стрелка) встроен в пластик для разрезания для WA-TEM с микротомом для последующей 2D-визуализации. (C) Тромб (круг и стрелка) встроен в пластик, обрезан так, чтобы образовалась короткая палочка, менее 1 мм, для крепления к штифту в камере визуализации SBF-SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: От колотой раны до образования тромба: Схема препаративного течения от колотой раны (А) к изображению тромба яремной вены (В) через 1 минуту после пункции. Стенка сосуда помечена синим цветом на срезе изображения, маленькие черные точки возле стенки сосуда — это эритроциты, а агрегаты тромбоцитов выглядят как темно-серые области. Эта цифра была изменена с1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Пример данных в графической форме, полученных в эксперименте с проколом яремной вены. Показана кривая зависимости «доза-реакция» дабигатрана. Эта цифра была изменена с1. Средние значения времени кровотечения при различных концентрациях дабигатрана показаны вместе с полосами погрешности, обозначающими плюсовое или минусовое стандартное отклонение. Статистический анализ с использованием t-критерия Стьюдента показал p-значение <0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: WA-TEM изображения среза, сшитые вместе для формирования монтажа. (A) Отдельные кадры с высоким разрешением собираются, а затем сшиваются вместе с целью размещения объектов в более широком контексте. (Б) Увеличивая масштаб, можно выявить важные детали в контексте (полиморфноядерный лейкоцит, эндо эндотелий и коллагеновые волокна). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Подробно описана методика производства гемостатических тромбов в яремных венах и бедренных артериях, их перфузионной фиксации in situ , а также обработки образцов для монтажной широкозонной просвечивающей электронной микроскопии. Общие процедуры полезны для генерации гемостатических тромбов для ультраструктурного анализа и для сравнения времени кровотечения у подопытных мышей, например, мышей, получавших различные типы и дозы фармацевтических препаратов. Он также полезен для сравнения времени кровотечения у контрольных мышей дикого типа с временем кровотечения у мышей с нокаутом (т.е. нокаутами для различных гликопротеинов в тромбоцитах, которые взаимодействуют с адгезивными лигандами) и последующей электронной микроскопии с высоким разрешением. Протокол может быть легко адаптирован к иммунофлуоресцентному анализу в качестве первичного считывания с потерей особенностей, которые делают электронную микроскопию надежным выбором. С другой стороны, иммунофлуоресценция является основным инструментом для определения местоположения белков в структуре. Как и в любом техническом протоколе, есть некоторые шаги, которые более важны, чем другие, и есть шаги в протоколе, которые можно рассматривать как точки выбора, важные для последующего анализа.

Критические шаги, точки выбора для последующего анализа и ограничения описаны ниже. Фактический этап прокола иглой: Колотая рана делается иглой шприца, расположенной под углом 25° к вене или артерии. Это сводит к минимуму вероятность прокола с обеих сторон вены или артерии. С другой стороны, угол 90° максимизирует шансы не соскоблить внутрисосудистый эндотелиальный слой или повредить внесосудистый коллагеновый матрикс на внешней стороне кровеносного сосуда, но несет больший риск прокола с обеих сторон вены или артерии. Выбор заключается в опыте, руках и уверенности.

Первичная фиксация здесь осуществляется с помощью перфузированного параформальдегида, небольшой молекулы, содержащей одну реакционноспособную альдегидную группу. Поскольку параформальдегид содержит одну химически активную группу, он имеет небольшую тенденцию к сшиванию клеточных компонентов и небольшую тенденцию к разрушению антигенности и, следовательно, в сумме считается сравнительно слабым фиксатором к глутаральдегиду, общему фиксатору для электронной микроскопии, который содержит два реакционноспособных альдегида и, следовательно, производит гораздо больше молекулярныхсшивок13. Это этап in situ, предназначенный для сохранения конструкции. Этапы перфузии выводят из препарата эритроциты, не захваченные тромбами. Это дает препарат, который не содержит большинства красных кровяных телец и позволяет легко сосредоточиться на свойствах тромбоцитов. Мы исследовали использование фиксации in situ смесью глутаральдегида/параформальдегида, наносимой экстраваскулярно. Эта процедура эффективна, особенно в условиях высокого расхода/давления. Тем не менее, он фиксирует циркулирующие эритроциты на месте. Это может усложнить последующий сегментационный анализ электронных микрофотографий на предмет формы и состава агрегатов тромбоцитов, образующих тромб проколотой раны. Использование глутарового альдегида значительно усложняет альтернативные иммунофлюоресцентные процедуры из-за высокого уровня автофлуоресценции, генерируемой фиксатором.

Закрепление/растяжение неподвижного кровеносного сосуда на силиконовой прокладке имеет решающее значение для определения местоположения тромба с целью внедрения. На этом этапе ориентация образца по отношению к кровотоку отслеживается и известна для последующих этапов. Отверстие для прокола и образовавшийся тромб могут быть легко расположены в открытом кровеносном сосуде. Напротив, тромб трудно обнаружить в иссеченных, неповрежденных кровеносных сосудах. Это было бы особенно верно для образца, богатого фиксированными циркулирующими эритроцитами. Возможность отслеживать, где находится иголка в стоге сена, имеет решающее значение.

После растяжения кровеносного сосуда и фотографирование, где находится образовавшийся тромб, отверстие для прокола, представляет собой точку выбора. В общем протоколе представленные последующие шаги относятся к подготовке образца для WA-TEM. На этом этапе можно было бы выбрать другие протоколы. С одной стороны, образец может быть обработан для иммунофлуоресцентной микроскопии, а не для электронной микроскопии. С другой стороны, образец может быть обработан для последовательной блочной сканирующей электронной микроскопии (SBF-SEM или другой метод объемной электронной микроскопии) вместо WA-TEM. Этапы обработки для SBF-SEM кардинально отличаются, потому что для подготовки к этой процедуре все этапы окрашивания тяжелыми металлами для электронной микроскопии должны быть выполнены с предварительным встраиванием4.

Этапы окрашивания тяжелыми металлами в этом протоколе предназначены для выделения мембран в сравнении с рибосомами и хромосомами, биологическими комплексами, богатыми нуклеиновыми кислотами. Можно использовать и другие протоколы окрашивания тяжелыми металлами, например, Storrie and Attardi14 and Liu et al.15.

Важно обращать внимание на различия в венах и артериях. Более высокое давление артерии по отношению к вене должно быть смещено 16,17. Например, игла меньшего диаметра используется для создания раны бедренной артерии по сравнению с яремной раной. Это компенсирует более высокое давление, обеспечивая почти равное время для остановки кровотечения. При пункции раны яремной вены предпочтение отдается использованию параформальдегида в качестве фиксатора в гипертонических условиях, поскольку параформальдегид, как небольшой одиночный альдегидсодержащий фиксатор, действует быстро, но является слабым фиксатором, который имеет тенденцию оставлять антигенность нетронутой. Это означает, что описанные здесь протоколы могут быть дополнены антитело-опосредованными исследованиями локализации на уровне света или электронного микроскопа18,19. В случае прокола раны бедренной артерии глутаральдегид, более прочный фиксатор поперечной связи, используется в сочетании с параформальдегидом в 0,1 М буфере какодилата натрия, pH 7,4, для стабилизации и фиксации артериальных тромбов. Эта модификация необходима для компенсации более высокого кровяного давления артерии по сравнению с веной. В артериальном случае концентрация какодилата натрия составляет половину концентрации, используемой в фиксирующем растворе для тромбов яремных вен.

Представленная здесь процедура обработки образцов для электронной микроскопии адаптирована к WA-TEM и позволяет получить информацию об электронной микроскопии в ограниченном объеме. WA-TEM создает ограниченную серию изображений с высоким разрешением, размером пикселя 3,185 нм или меньше, на полных поперечных сечениях тромбов, параллельных или перпендикулярных потоку1. Комбинация стеклянных и алмазных ножей используется для ручного создания серии поперечных сечений с примерно 10%, 25%, 50%, 75% и 90% в тромбе. Для получения полного сечения тромба требуется визуализация сотен кадров с помощью камеры качества электронного микроскопа 4000 x 4000 пикселей. Затем рамы сшиваются между собой. Для получения изображения с полным поперечным сечением требуется около 400 - 800 кадров. WA-TEM может быть дополнен SBF-SEM. SBF-SEM создает серию последовательных изображений поверхности блока по мере того, как он постепенно отрезается небольшими шагами с помощью алмазного ножа, заключенного в вакуум камеры визуализации SEM1. Эти изображения могут быть собраны вместе, чтобы получить полную трехмерную визуализацию формирующегося тромба. Поскольку микротом находится внутри камеры визуализации SEM, все этапы окрашивания для SBF-SEM должны быть выполнены предварительно встроенными. Комбинация этих двух подходов с помощью электронного микроскопа позволяет получать изображения с разрешением ~3 нм или более в ограниченном числе поперечных сечений, WA-TEM, или на всей глубине тромба проколотой раны почти миллиметрового размера, SBF-SEM. Просмотр сшитых изображений WA-TEM в программном обеспечении 3DMOD10 позволяет быстро переключаться между различными уровнями масштабирования, так что даже виды с высоким разрешением могут быть помещены в контекст в пределах полного поперечного сечения ширины тромба.

В заключение мы представляем проверенный протокол получения тромбов колотой раны у мышей, фиксации их in situ и обработки для электронной микроскопии таким образом, чтобы тромб мог быть легко расположен в вене или артерии и прослеживаться его ориентация по отношению к кровотоку. Представлены различные точки принятия решений, чтобы пользователь мог сделать выбор в отношении того, как будут анализироваться образцы. Мы уделяем особое внимание подготовке к электронной микроскопии, которая выделяет мембраны в сравнении с другими компонентами клетки. В конце концов, наиболее общей частью протокола для других исследований является понимание авторами того, что широкозонная просвечивающая электронная микроскопия (WA-TEM) является подходом к монтажу, который поддерживает наноразмерные знания о клетках, т.е. тромбоцитах внутри большой структуры, близкой к миллиметровому размеру, в данном случае формирующегося тромба. Полученная в результате способность помещать детали в общий контекст является главным преимуществом объединения различных этапов в полноценную процедуру.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, связанного с данным исследованием.

Благодарности

Авторы выражают благодарность коллегам из Университета медицинских наук Арканзаса (Джерри Уэр и Сунг В. Ри), Университета Пенсильвании (Тим Сталкер и Лоуренс Брасс), Университета Кентукки (Сидни В. Уайтхарт и Смита Джоши) и Национального института биовизуализации и биоинженерии Национальных институтов здравоохранения (Ричард Д. Липман и Мария А. Аронова), у которых мы многому научились. Авторы выражают признательность Американской кардиологической ассоциации и Национальному институту сердца, легких и крови Национальных институтов здоровья (R01 HL119393, R56 HL119393, R01 155519 до BS и субгранты от NIH R01 HL146373 и R35 HL150818) за финансовую поддержку.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,9% физиологический растворMedlineBHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint набор для кожи головыMedlineNDA26709
30G x 1/2 EXELint иглы для подкожных инъекцийMedlineNDA264372
33G x 1/2 EXELint специальные иглы для подкожных инъекцийMedlineNDA26393
50 мл Конические трубкиFisher Scientific06-443-20
Спиртовые салфетки (70% изопропилового спирта)MedlineMDS090670Z
алюминиевая фольгаFisher Scientific01-213-100
Нагревательная пластина для животныхPhysitemp InstrumentsHP-1M
Araldite GY 502Электронная микроскопия Sciences10900
Axiocam 305 Цветная камера для микроскопии R2 CarlZeiss426560-9031-000
BD Шприцы Luer-Lok, 20 млMedlineB-D303310Z
Хлорид кальцияFisher ScientificC79-500
Чашки для клеточных культур 35 мм x 10 ммCorning Inc.
Аппликаторы с хлопковым наконечникомMedlineMDS202055H
DMP-30 АктиваторЭлектронная микроскопия Sciences13600
Додецениловый янтарный ангидрид / DDSAЭлектронная микроскопия Sciences13700
Перевязочные щипцы, 5 дюймов, изогнутые, зубчатые, узкоконечныеIntegra Miltex6-100
Перевязочные щипцы, 5", стандартный, зубчатыйIntegra Miltex6-6
EMBED 812 СмолаЭлектронная микроскопия Науки14900
Этиловый спирт, безводный 200 proofЭлектронная микроскопияНауки 15055
Fisherbrand 4-ходовой штатив для трубFisher Scientific03-448-17
Цифровой таймер FisherbrandFisher Scientific14-649-17
Инфузионный насос Fisherbrand для одного шприцаFisher Scientific7801001
Марлевые губки 2" x 2"- 4 слояMedlineNON26224H
глутаральдегида (10% раствор)Электронная микроскопия Sciences16120
Изофлуран жидкая ингаляционная анестезия, 100 мл Medline66794-017-10
Ювелирный стиль Micro-Fine Щипцы, Style 5FIntegra Miltex17-305Нужно 2 пары.
L/S Трубка насоса, силиконовая, L/S 15; 25 футовVWRMFLX96410-15
L-аспарагиновая кислотаFisher ScientificBP374-100
Нитрат свинцаFisher ScientificL-62
Малахитовый зеленый 4Электронная микроскопияSciences 18100
Masterflex L/S Easy-Load II Насосная головкаVWRMFLX77200-62
Masterflex L/S Цифровой привод с регулируемой скоростьюVWRMFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Кусачки для проволокиFisher Scientific50-191-9855
Тетраоксид осмия 4% Водный раствор ЭлектроннаямикроскопияНауки 19150
Параформальдегид (16% раствор)Электронная микроскопия Науки15710
Регулятортемпературы PhysitempPhysitemp InstrumentsTCAT-2LV
Ферроцианид калияSigma-AldrichP-8131
Оксид пропилена, реагент ACSЭлектронная микроскопия Sciences20401
Стеклянные стаканы Pyrex FisherScientific02-555-25B
Ректальный температурный зонд для мышейPhysitemp InstrumentsRET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"3M Company305289
Буфер какодилата натрия 0,2M, pH 7,4Электронная микроскопия Sciences11623
SomnoFlo Электронный испаритель с низким потокомKent ScientificSF-01
SomnoFlo Стартовый набор для мышейKent ScientificSF-MSEKIT
Нержавеющая сталь Минутиены булавкиFine Science Инструменты26002-10
Стереомикроскоп steREO Discovery.V12Carl Zeiss Микроскопия495015-9880-010
Sylgard 184 Силиконовый эластомерWorld Precision InstrumentsSYLG184силиконовый мат
Дубильная кислотаЭлектронная микроскопия Sciences21700
Тиокарбогидразид (ТЧ)Sigma-Aldrich88535
УранилацетатЭлектронная микроскопиянауки 22400
Пружинные микроножницы VannasFine Science Tools15000-08
Щипцы для глаз фон Грефе, 2,75 дюйма, изогнутые, зубчатыеIntegra Miltex18-818Требуется 2 пары.
Ножницы ВагнераИнструменты для тонкой науки14068-12
Wahl MiniFigura Триммер для животныхBraintree ScientificCLP-9868
Zen Lite программное обеспечениеCarl Zeiss Микроскопия410135-1001-000
430165

Ссылки

  1. Rhee, S. W., et al. Venous puncture and wound hemostasis results in a vaulted thrombus structured by locally nucleated platelet aggregates. Comm Biol. 4 (1), 1090(2021).
  2. Pokrovskaya, I. D., et al. Tethered platelet capture provides a mechanism for restricting circulating platelet activation in the wound site. Res Pract Thromb Haemost. 7 (2), 100058(2023).
  3. Yadav, S., Storrie, B. The cellular basis of platelet secretion: emerging structure/function relationships. Platelets. 28 (2), 108-118 (2017).
  4. Joshi, S., et al. Ferric chloride-induced arterial thrombosis and sample collection for 3D electron microscopy analysis. J Vis Exp. (193), e64985(2023).
  5. Guerrero, J. A., et al. Visualizing the von Willebrand factor/glycoprotein Ib-IX axis with a platelet-type von Willebrand disease mutation. Blood. 114 (27), 5541-5546 (2009).
  6. Kato, K., et al. The contribution of glycoprotein VI to stable platelet adhesion and thrombus formation illustrated by targeted gene deletion. Blood. 102 (5), 1701-1707 (2003).
  7. Tomaiuolo, M., et al. Interrelationships between structure and function during the hemostatic response to injury. Proc NatlAcad Sci U S A. 116 (6), 2243-2252 (2019).
  8. Cocchiaro, J. L., et al. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proc Natl Acad Sci. 105 (27), 9379-9384 (2008).
  9. Pokrovskaya, I. D., et al. Chlamydia trachomatis hijacks intra - Golgi COG complex - dependent vesicle trafficking pathway. Cell Microbiol. 14 (5), 656-668 (2012).
  10. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. J Str Biol. 152 (1), 36-51 (2005).
  11. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Str Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
  12. Chan, N. C., Eikelboom, J. W., Weitz, J. J. Evolving treatments for arterial and venous thrombosis: role of the direct oral anticoagulants. Circ Res. 118 (9), 1409-1424 (2016).
  13. Kiernan, J. A. Formaldehyde, formalin, paraformaldehyde, and glutaraldehyde: what they are and what they do. Microscopy Today. 8 (1), 8-13 (2000).
  14. Storrie, B., Attardi, G. Expression of the mitochondrial genome in HeLa cells: XV. Effect of inhibition of mitochondrial protein synthesis on mitochondrial formation. J CellBiol. 56, 819-831 (1973).
  15. Liu, S., Pokrovskaya, I. D., Storrie, B. High - pressure freezing followed by freeze substitution: an optimal electron microscope technique to study Golgi apparatus organization and membrane trafficking. Meth Mol Biol. 2557, 211-223 (2023).
  16. Klarhofer, M., et al. High-resolution blood flow velocity measurements in the human finger. Mag Res Med. 45 (4), 716-719 (2001).
  17. Chaudry, R., Miao, J. H., Rehman, A. Physiology, cardiovascular. StatPearls. , Treasure Island, FL, USA. (2022).
  18. Pokrovskaya, I. D., et al. SNARE - dependent membrane fusion initiates a-granule matrix decondensation in mouse platelets. Blood Adv. 2 (21), 2947-2958 (2018).
  19. Pokrovskaya, I. D., et al. 3D ultrastructural analysis of a-granule, dense granule, mitochondria, and canalicular system arrangement in resting human platelets. Res Pract Thrombosis Haemostasis. 4 (1), 72-85 (2019).

Перепечатки и разрешения

Теги

Гемостаз пункционной раны и подготовка образцов для анализа методом широкоугольной электронной микроскопии
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.