Создание модели мыши, полученной от пациента, ксенотрансплантата с тканями остеосаркомы человека

Остеосаркома является первичным злокачественным новообразованием костей, происходящим из межкостных долевых клеток, и чаще всего встречается у подростков, а также у детей. Часто возникает в эпифизе длинного диафиза и характеризуется высокой злокачественностью, ранним метастазированием, плохим прогнозом ^1,2. Метастазирование в легкие является основной причиной смерти у пациентов с остеосаркомой. 5-летняя выживаемость пациентов с неметастатической остеосаркомой составляет 65%-70%³. Однако за последние 40 лет 5-летняя выживаемость (только у 20%) пациентов с метастатической остеосаркомой существенно не улучшилась, а у 25% пациентов с остеосаркомой метастазы на момент постановки диагноза⁴. В настоящее время достигнут консенсус в отношении препаратов первой линии для лечения остеосаркомы, но все еще существуют значительные различия в схеме химиотерапии и времени лечения^. Важно проводить доклинические эксперименты на основе соответствующих животных моделей для получения более эффективных схем химиотерапии.

В настоящее время модели, обычно используемые для доклинических экспериментов по остеосаркоме, включают клеточную культуру на основе клеточной линии in vitro и ксенотрансплантаты in vivo (CDX), а также ксенотрансплантаты, полученные от пациента (PDX)^6,7.

Клеточные линии удобны для культивирования и использования в исследованиях in vitro, а также для трансплантации иммунодефицитным мышам для создания моделей CDX⁸. Тем не менее, клеточные линии, культивируемые in vitro, могут неточно отражать гетерогенность злокачественных новообразований и индивидуальные особенности пациентов из-за потенциальных мутаций, которые возникают для адаптации к среде культивирования in vitro во время повторных пассажей. Кроме того, у них отсутствует микроокружение и иммунная система, необходимые для роста и развития опухоли in vivo. Несмотря на то, что модели CDX имеют некоторые преимущества по сравнению с культурами клеток in vitro, они все же могут не полностью отражать индивидуальные особенности пациентов с остеосаркомой, хотя опухолевые ткани, полученные с помощью моделей CDX, имеют ограниченную внутриопухолевую гетерогенность и представительство иммунной системы по сравнению с клеточными линиями, культивируемыми in vitro 9. Поэтому создание доклинической модели с высокой точностью имеет решающее значение.

Модели PDX предполагают немедленную трансплантацию свежерезецированных раковых тканей человека мышам с иммунодефицитом. Этот метод позволяет достоверно сохранить генетические, эпигенетические и гетерогенные характеристики злокачественных новообразований человека у каждого пациента, даже после последовательных пассажей у мышей. Кроме того, известно, что модели PDX позволяют точно предсказывать последующие клинические^{исходы10}, что делает их ценными инструментами для создания индивидуализированных методов лечения и продвижения исследований в области точной медицины¹¹.

В данной работе описана процедура создания модели PDX у иммунодефицитных мышей путем трансплантации ткани остеосаркомы человека. Такие модели служат платформами для проведения доклинических экспериментов по остеосаркоме.

Все исследования, связанные с человеческими тканями, были одобрены Комитетом по обзору институциональной этики больницы Лунхуа, аффилированной с Шанхайским университетом традиционной китайской медицины (Шанхай, Китай) (2013LC52), и было получено письменное информированное согласие пациентов в соответствии с Хельсинкской декларацией. Номер IACUC для этого исследования на животных — PZSHUTCM221017013. Четырехнедельные самцы мышей CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl получали облученную диету для грызунов с двойным львом GB 14924.3 и стерильную воду, а также помещали в клетку для мышей IVC по пять мышей в клетке в условиях SPF с 12-часовым циклом свет/темнота. Таблица материалов содержит подробную информацию обо всех материалах, реактивах и инструментах, используемых в данном протоколе.

1. Подготовка тканей при остеосаркоме человека

Примечание: В этом исследовании ткань остеосаркомы человека была резецирована¹² из поражения бедренной кости 15-летнего пациента с остеосаркомой перед химиотерапией.

1. Немедленно храните только что резецированную ткань остеосаркомы в тканезащитном растворе для максимального сохранения активации клеток остеосаркомы после полоскания стерильным физиологическим раствором.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Свежерезецированные ткани остеосаркомы должны быть пересажены мышам как можно скорее. Они могут храниться в тканевом защитном растворе не более 24 часов до трансплантации. Ткани остеосаркомы, используемые для моделирования, должны быть получены от пациентов, которые не получали химиотерапию. Активность опухолевых клеток у пациентов, получавших химиотерапию, будет слабой, что приведет к сбою создания модели и потере высокой точности.
2. Как можно скорее перенесите свежерезецированные ткани остеосаркомы, хранящиеся в тканевом защитном растворе, в лабораторию.
3. Подготовка экспериментальных приборов и материалов для создания модели PDX: скальпелей (рис. 1А); офтальмологический пинцет (рис. 1B,C); офтальмологические ножницы (Рисунок 1D); игла для наложения швов (рисунок 1E); линия наложения швов (рисунок 1F); прямой иглодержатель (рисунок 1G); маркерное перо (рисунок 1H).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием убедитесь, что все хирургические инструменты стерилизованы автоклавированием.
4. Дважды промойте ткани остеосаркомы предварительно охлажденным стерильным физиологическим раствором в стерильном капюшоне.
5. Удаляют участки тканей остеосаркомы с кровотечением и некрозом.
6. Очищенную ткань остеосаркомы разрежьте скальпелем на 3 мм по³ части в чашке для культуры, содержащей предварительно охлажденный стерильный физиологический раствор, и держите ее на льду.

2. Создание PDX-моделей методом трансплантации ткани остеосаркомы в области фланга мыши

1. Провести предоперационную анальгезию мелоксикамом (5 мг/кг/24 ч) путем подкожной инъекции мышам и поместить обнаженных мышей на стерильные хирургические простыни. Обеспечьте тепловую поддержку на протяжении всей процедуры.
2. Вызывайте анестезию у мышей, подвергая их воздействию 3% изофлурана и 97% кислорода. После того, как мыши будут полностью обезболены, перенесите их в носовой конус и поддерживайте анестезию 1,5% изофлураном и 98,5% кислородом.
3. Сожмите пальцы ног, чтобы убедиться, что мыши полностью обезболились, и подождите дольше, если спазмы или судорожные реакции все еще присутствуют.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны проводиться с использованием стерильного оборудования в стерильном капюшоне. Избегайте сухости мышей во время анестезии, нанося на их глаза офтальмологическую мазь.
4. Закрепите мышь в боковом положении пролежня (рисунок 2A). Продезинфицируйте одну сторону области бока мыши для трансплантации ткани при остеосаркоме 3 раза, чередуя циклы ватных шариков с повидон-йодом и дезинфицирующим средством 70% этанола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическая дезинфекция проводится по кругу, начиная от центра и по спирали наружу.
5. Отметьте место хирургического разреза на коже маркером.
6. Сделайте скальпелем разрез 5 мм от кожи до подкожных тканей (рисунок 2Б).
7. Поднимите верхнюю сторону кожи края разреза офтальмологическим пинцетом с помощью левой руки, а правой рукой выполните тупое рассечение вверх под дермой мышей прямым иглодержателем (рисунок 2В).
8. Удерживайте верхнюю сторону кожи разреза офтальмологическим пинцетом левой рукой и поместите ткань остеосаркомы под кожу примерно на 5 мм выше края разреза с помощью офтальмологического пинцета, используя правую руку, чтобы пересадить ткань остеосаркомы (рис. 2C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ткань остеосаркомы пересажена чуть ниже дермы кожи. Тупое рассечение выполняется с помощью прямых и тупых щипцов для рассечения, таких как прямой иглодержатель, чтобы избежать проникновения в грудную полость мыши при нахождении дермального слоя кожи мыши.
9. Зашить разрез рассасывающимся швом 2-3 швами для разреза 5 мм (Рисунок 2D).
10. Верните мышей в чистые клетки и наблюдайте за ними до тех пор, пока они полностью не оправятся от наркоза.
    PDX, установленный путем трансплантации ткани остеосаркомы человека, обозначается как пассаж 0 (P0), PDX, установленный путем трансплантации ткани PDX в P0, обозначается как пассаж 1 (P1), за которым следуют P2 и P3.

3. Забор опухолевых тканей PDX

1. Измеряйте объем опухоли раз в неделю. Когда размер опухоли достигнет 1500^мм3, усыпить мышей методом шейного вывиха после ингаляции_СО2 . Гуманные конечные точки включают изъязвление опухоли или проблемы с подвижностью передних конечностей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте длинный диаметр (a) и короткий диаметр (b) опухоли с помощью штангенциркуля. Рассчитайте объем опухоли (V) по формуле: V = 1/2 × a × b².
2. Расположите мышь сбоку, чтобы обнажить опухоль, и продезинфицируйте кожу в месте опухоли ватным тампоном, смоченным в спирте.
3. Используйте офтальмологические ножницы, чтобы отделить всю опухоль. Взвесьте опухолевую массу с помощью электронных весов.

4. Патологоанатомическое исследование первичных клинических и PDX опухолевых тканей

1. Зафиксируйте опухолевую ткань 13 в пробирке объемом⁵⁰ мл, содержащей 30 мл 10% нейтрального буферизованного раствора формалина в течение 24 ч. Тщательно промойте ткани опухоли проточной водой, чтобы удалить фиксатор.
2. Обезвоживайте и встраивайте опухолевые ткани в парафин¹⁴.
3. Срез тканей опухоли и проведение планового гистологического исследования¹⁵.

В этом протоколе подробно описана процедура создания мышиной модели PDX с сохранением морфологических особенностей остеосаркомы человека после немедленной трансплантации свежерезецированной ткани остеосаркомы человека и последующих пассажей у мышей. Здесь была успешно создана мышиная модель PDX с использованием ткани остеосаркомы человека.

На рисунке 3А показана репрезентативная мышь PDX в точке P0 через два месяца после трансплантации ткани бедренной остеосаркомы от 15-летнего пациента. На рисунке 3B изображена репрезентативная мышь PDX в P1 через месяц после трансплантации ткани PDX в P0. На рисунке 3C показана репрезентативная мышь PDX в P2 через месяц после трансплантации PDX ткани в P1. На рисунке 3D показана репрезентативная мышь PDX в P3 через месяц после трансплантации ткани PDX в P2.

Мышей приносили в жертву методом шейного вывиха после ингаляции CO2 , когда размер опухоли достигал 1500мм3 для сбора тканей опухоли PDX. Опухолевые ткани клинических пациентов и мышей затем были погружены в парафин и подвергнуты H&E окрашиванию. Репрезентативное изображение окрашивания опухолевой ткани пациента с помощью H&E показано на рисунке 4A. Репрезентативные изображения окрашивания H&E тканей опухолей PDX мышей в точках P0, P1 и P2 показаны на рисунках 4B, C, D. Признаки остеосаркомы, характеризующиеся мелкими клетками с круглыми гиперхроматическими ядрами в опухолевых тканях родительского клинического пациента, сохранялись в установленных PDX на P0, P1 и P2.

Рисунок 1: Хирургические инструменты. (А) Скальпель. (В,В) Офтальмологический пинцет. (D) Офтальмологические ножницы. (E) Игла для наложения швов. (F) Линия наложения швов. (G) Прямой иглодержатель. (H) Маркировочное перо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Создание модели PDX. (A) Место трансплантации ткани остеосаркомы в области бока мыши помечено маркером. (B) Был сделан разрез длиной 5 мм от кожи до подкожной клетчатки. (В) Тупое расслоение и трансплантация тканей при остеосаркоме. (D) Зашитый разрез. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Рост PDX, первоначально трансплантированного с тканью остеосаркомы бедренной кости от 15-летнего пациента. (A) PDX установлен путем трансплантации ткани остеосаркомы человека (P0). (B) PDX устанавливается путем трансплантации ткани PDX в точке P0 (P1). (C) PDX устанавливается путем трансплантации ткани PDX в P1 (P2). (D) PDX устанавливается путем трансплантации ткани PDX в P2 (P3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Окрашивание гематоксилин-эозином (H&E) срезов тканей из первичных клинических тканей и тканей PDX. При окрашивании H&E были выявлены гистологические особенности (А) остеосаркомы бедренной кости у 15-летнего пациента, (В) PDX у P0, (C) PDX у P1, (D) PDX у P2. Масштабные линейки: (A-D) 100 мкм; (E-H) 20 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.