В настоящем протоколе описан метод создания мышиной модели ксенотрансплантата (PDX), полученной от пациента, с использованием ткани остеосаркомы человека.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Создание модели мыши, полученной от пациента, ксенотрансплантата с тканями остеосаркомы человека
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Остеосаркома является наиболее распространенной первичной злокачественной опухолью костей у детей и подростков. Несмотря на разработку новых планов лечения в последние годы, прогноз для пациентов с остеосаркомой существенно не улучшился. Поэтому крайне важно создать надежную доклиническую модель с высокой точностью. Модель ксенотрансплантата (PDX), полученная от пациента, точно сохраняет генетические, эпигенетические и гетерогенные характеристики злокачественных новообразований человека для каждого пациента. Следовательно, PDX-модели считаются аутентичными моделями in vivo для изучения различных видов рака в трансформационных исследованиях. В данной статье представлен комплексный протокол создания и поддержания мышиной модели PDX, которая точно отражает морфологические особенности остеосаркомы человека. Это включает в себя немедленную трансплантацию свежерезецированной ткани остеосаркомы человека мышам с ослабленным иммунитетом с последующим последующим пассажированием. Описанная модель служит платформой для изучения роста, лекарственной устойчивости, рецидива и метастазирования остеосаркомы. Кроме того, он помогает в скрининге целевых терапевтических средств и создании персонализированных схем лечения.
Введение
Остеосаркома является первичным злокачественным новообразованием костей, происходящим из межкостных долевых клеток, и чаще всего встречается у подростков, а также у детей. Часто возникает в эпифизе длинного диафиза и характеризуется высокой злокачественностью, ранним метастазированием, плохим прогнозом 1,2. Метастазирование в легкие является основной причиной смерти у пациентов с остеосаркомой. 5-летняя выживаемость пациентов с неметастатической остеосаркомой составляет 65%-70%3. Однако за последние 40 лет 5-летняя выживаемость (только у 20%) пациентов с метастатической остеосаркомой существенно не улучшилась, а у 25% пациентов с остеосаркомой метастазы на момент постановки диагноза4. В настоящее время достигнут консенсус в отношении препаратов первой линии для лечения остеосаркомы, но все еще существуют значительные различия в схеме химиотерапии и времени лечения. Важно проводить доклинические эксперименты на основе соответствующих животных моделей для получения более эффективных схем химиотерапии.
В настоящее время модели, обычно используемые для доклинических экспериментов по остеосаркоме, включают клеточную культуру на основе клеточной линии in vitro и ксенотрансплантаты in vivo (CDX), а также ксенотрансплантаты, полученные от пациента (PDX)6,7.
Клеточные линии удобны для культивирования и использования в исследованиях in vitro, а также для трансплантации иммунодефицитным мышам для создания моделей CDX8. Тем не менее, клеточные линии, культивируемые in vitro, могут неточно отражать гетерогенность злокачественных новообразований и индивидуальные особенности пациентов из-за потенциальных мутаций, которые возникают для адаптации к среде культивирования in vitro во время повторных пассажей. Кроме того, у них отсутствует микроокружение и иммунная система, необходимые для роста и развития опухоли in vivo. Несмотря на то, что модели CDX имеют некоторые преимущества по сравнению с культурами клеток in vitro, они все же могут не полностью отражать индивидуальные особенности пациентов с остеосаркомой, хотя опухолевые ткани, полученные с помощью моделей CDX, имеют ограниченную внутриопухолевую гетерогенность и представительство иммунной системы по сравнению с клеточными линиями, культивируемыми in vitro 9. Поэтому создание доклинической модели с высокой точностью имеет решающее значение.
Модели PDX предполагают немедленную трансплантацию свежерезецированных раковых тканей человека мышам с иммунодефицитом. Этот метод позволяет достоверно сохранить генетические, эпигенетические и гетерогенные характеристики злокачественных новообразований человека у каждого пациента, даже после последовательных пассажей у мышей. Кроме того, известно, что модели PDX позволяют точно предсказывать последующие клиническиеисходы10, что делает их ценными инструментами для создания индивидуализированных методов лечения и продвижения исследований в области точной медицины11.
В данной работе описана процедура создания модели PDX у иммунодефицитных мышей путем трансплантации ткани остеосаркомы человека. Такие модели служат платформами для проведения доклинических экспериментов по остеосаркоме.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все исследования, связанные с человеческими тканями, были одобрены Комитетом по обзору институциональной этики больницы Лунхуа, аффилированной с Шанхайским университетом традиционной китайской медицины (Шанхай, Китай) (2013LC52), и было получено письменное информированное согласие пациентов в соответствии с Хельсинкской декларацией. Номер IACUC для этого исследования на животных — PZSHUTCM221017013. Четырехнедельные самцы мышей CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl получали облученную диету для грызунов с двойным львом GB 14924.3 и стерильную воду, а также помещали в клетку для мышей IVC по пять мышей в клетке в условиях SPF с 12-часовым циклом свет/темнота. Таблица материалов содержит подробную информацию обо всех материалах, реактивах и инструментах, используемых в данном протоколе.
1. Подготовка тканей при остеосаркоме человека
Примечание: В этом исследовании ткань остеосаркомы человека была резецирована12 из поражения бедренной кости 15-летнего пациента с остеосаркомой перед химиотерапией.
- Немедленно храните только что резецированную ткань остеосаркомы в тканезащитном растворе для максимального сохранения активации клеток остеосаркомы после полоскания стерильным физиологическим раствором.
ПРИМЕЧАНИЕ: Свежерезецированные ткани остеосаркомы должны быть пересажены мышам как можно скорее. Они могут храниться в тканевом защитном растворе не более 24 часов до трансплантации. Ткани остеосаркомы, используемые для моделирования, должны быть получены от пациентов, которые не получали химиотерапию. Активность опухолевых клеток у пациентов, получавших химиотерапию, будет слабой, что приведет к сбою создания модели и потере высокой точности. - Как можно скорее перенесите свежерезецированные ткани остеосаркомы, хранящиеся в тканевом защитном растворе, в лабораторию.
- Подготовка экспериментальных приборов и материалов для создания модели PDX: скальпелей (рис. 1А); офтальмологический пинцет (рис. 1B,C); офтальмологические ножницы (Рисунок 1D); игла для наложения швов (рисунок 1E); линия наложения швов (рисунок 1F); прямой иглодержатель (рисунок 1G); маркерное перо (рисунок 1H).
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием убедитесь, что все хирургические инструменты стерилизованы автоклавированием. - Дважды промойте ткани остеосаркомы предварительно охлажденным стерильным физиологическим раствором в стерильном капюшоне.
- Удаляют участки тканей остеосаркомы с кровотечением и некрозом.
- Очищенную ткань остеосаркомы разрежьте скальпелем на 3 мм по3 части в чашке для культуры, содержащей предварительно охлажденный стерильный физиологический раствор, и держите ее на льду.
2. Создание PDX-моделей методом трансплантации ткани остеосаркомы в области фланга мыши
- Провести предоперационную анальгезию мелоксикамом (5 мг/кг/24 ч) путем подкожной инъекции мышам и поместить обнаженных мышей на стерильные хирургические простыни. Обеспечьте тепловую поддержку на протяжении всей процедуры.
- Вызывайте анестезию у мышей, подвергая их воздействию 3% изофлурана и 97% кислорода. После того, как мыши будут полностью обезболены, перенесите их в носовой конус и поддерживайте анестезию 1,5% изофлураном и 98,5% кислородом.
- Сожмите пальцы ног, чтобы убедиться, что мыши полностью обезболились, и подождите дольше, если спазмы или судорожные реакции все еще присутствуют.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры должны проводиться с использованием стерильного оборудования в стерильном капюшоне. Избегайте сухости мышей во время анестезии, нанося на их глаза офтальмологическую мазь. - Закрепите мышь в боковом положении пролежня (рисунок 2A). Продезинфицируйте одну сторону области бока мыши для трансплантации ткани при остеосаркоме 3 раза, чередуя циклы ватных шариков с повидон-йодом и дезинфицирующим средством 70% этанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическая дезинфекция проводится по кругу, начиная от центра и по спирали наружу. - Отметьте место хирургического разреза на коже маркером.
- Сделайте скальпелем разрез 5 мм от кожи до подкожных тканей (рисунок 2Б).
- Поднимите верхнюю сторону кожи края разреза офтальмологическим пинцетом с помощью левой руки, а правой рукой выполните тупое рассечение вверх под дермой мышей прямым иглодержателем (рисунок 2В).
- Удерживайте верхнюю сторону кожи разреза офтальмологическим пинцетом левой рукой и поместите ткань остеосаркомы под кожу примерно на 5 мм выше края разреза с помощью офтальмологического пинцета, используя правую руку, чтобы пересадить ткань остеосаркомы (рис. 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ткань остеосаркомы пересажена чуть ниже дермы кожи. Тупое рассечение выполняется с помощью прямых и тупых щипцов для рассечения, таких как прямой иглодержатель, чтобы избежать проникновения в грудную полость мыши при нахождении дермального слоя кожи мыши. - Зашить разрез рассасывающимся швом 2-3 швами для разреза 5 мм (Рисунок 2D).
- Верните мышей в чистые клетки и наблюдайте за ними до тех пор, пока они полностью не оправятся от наркоза.
PDX, установленный путем трансплантации ткани остеосаркомы человека, обозначается как пассаж 0 (P0), PDX, установленный путем трансплантации ткани PDX в P0, обозначается как пассаж 1 (P1), за которым следуют P2 и P3.
3. Забор опухолевых тканей PDX
- Измеряйте объем опухоли раз в неделю. Когда размер опухоли достигнет 1500мм3, усыпить мышей методом шейного вывиха после ингаляцииСО2 . Гуманные конечные точки включают изъязвление опухоли или проблемы с подвижностью передних конечностей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте длинный диаметр (a) и короткий диаметр (b) опухоли с помощью штангенциркуля. Рассчитайте объем опухоли (V) по формуле: V = 1/2 × a × b2. - Расположите мышь сбоку, чтобы обнажить опухоль, и продезинфицируйте кожу в месте опухоли ватным тампоном, смоченным в спирте.
- Используйте офтальмологические ножницы, чтобы отделить всю опухоль. Взвесьте опухолевую массу с помощью электронных весов.
4. Патологоанатомическое исследование первичных клинических и PDX опухолевых тканей
- Зафиксируйте опухолевую ткань 13 в пробирке объемом50 мл, содержащей 30 мл 10% нейтрального буферизованного раствора формалина в течение 24 ч. Тщательно промойте ткани опухоли проточной водой, чтобы удалить фиксатор.
- Обезвоживайте и встраивайте опухолевые ткани в парафин14.
- Срез тканей опухоли и проведение планового гистологического исследования15.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этом протоколе подробно описана процедура создания мышиной модели PDX с сохранением морфологических особенностей остеосаркомы человека после немедленной трансплантации свежерезецированной ткани остеосаркомы человека и последующих пассажей у мышей. Здесь была успешно создана мышиная модель PDX с использованием ткани остеосаркомы человека.
На рисунке 3А показана репрезентативная мышь PDX в точке P0 через два месяца после трансплантации ткани бедренной остеосаркомы...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Модели PDX могут имитировать характеристики рака человека и сохранять большее сходство с первичной опухолью, включая генетические и геномные изменения, гистологию, гетерогенность и профиль экспрессии генов 16,17,18,19. Таким образом, они сохраняют молекулярные фенотипы и генотипы онкологических больных, обеспечивая инновационные подходы к изучению биологии и оц...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа поддерживается грантами от (1) Национального фонда естественных наук (81973877 и 82174408); (2) Проект строительства Шанхайского высокоприоритетного исследовательского центра (2022ZZ01009); (3) Национальная программа ключевых исследований и разработок Китая (2020YFE0201600); (4) Шанхайский центр совместных инноваций по промышленной трансформации подготовки к ТКМ в больницах и (5) исследовательские проекты в рамках бюджета Шанхайского университета традиционной китайской медицины (2021LK047).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10% нейтральный раствор формалина | Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd | G1101-500ml | Фиксация тканей |
| Автоклав | Япония Hiryama Company | HVE-50 | Стерилизация хирургических инструментов |
| CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | |
| Штангенциркуль | для животных Yantai Green Forest Tools Co., Ltd. | 034180A | Измерьте объем опухоли |
| Чашка (60 мм) | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | 430166, Corning | Образец размещения во время трансплантации |
| Дезинфицирующее ватное средство | Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd. | 20230627 | Дезинфекция кожи мышей |
| Одноразовые стерильные перчатки | Guilin Hengbao Health Protection Co., Ltd. | YT21131 | Стерильная операция |
| Двойной лев Облученная диета для грызунов | Сучжоу Шуанши Экспериментальная технология кормов для животных Co., Ltd. | GB 14924.3 | Корм для животных |
| Электронные весы | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | 1-2000 | Взвешивать вес опухоли |
| Eosin | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | E4009-25G | Гематоксилин эозин краситель |
| Гематоксилин | Шанхай Gengyun Biotechnology Co., Ltd | H3136-25G | гематоксилин эозин краситель |
| Изофлуран | Шэньчжэнь RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Мышиная анестезия |
| Клетка для мышей IVC | Сучжоу Обезьяний Король Животных Экспериментальное оборудование Технология Ко., Лтд. | HH-MMB-2 | Барьер для животных |
| Mark pen | Zebra Trading (Shenzhen) Co., Ltd. | YYST5 | Отметьте хирургический разрез |
| Olympus Оптический микроскоп Olympus Японская | компания Olympus | BH20 | Сканируйте срезы ткани |
| Офтальмологическая мазь | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | SOICOEYEGRL | Избегайте сухости глаз мышей во время анестезии |
| Офтальмологические ножницы | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | Y00030 JZ | Разрежьте кожу |
| Офтальмологический пинцет | Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd | BS-ZER-S-100 Biosharp | Hold остеосаркома тканей во время |
| трансплантации | Парафин Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd. | 80200-0015 | при остеосаркоме |
| Lyca Microsystem (Shanghai) Trading Co., Ltd. | RM2235 | Секция тканей при остеосаркоме | |
| физиологический раствор | Гуанчжоу Jinsheng Biotechnology Co., Ltd. | 605-004057 | Промывка и временное хранение тканей остеосаркомы |
| Скальпели | Завод хирургических инструментов Shanghai Medical Devices (Group) Co., Ltd. | J11010-10# JZ | Отделение тканей остеосаркомы и выполнение хирургических разрезов |
| Стерильный капюшон | Thermo Fisher Technology (China) Co., Ltd. | ECO0.9 | Хирургический операционный стол |
| стерильные хирургические простыни | Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd. | 20160090 | Обеспечить стерильную хирургическую зону |
| Прямой иглодержатель | Shanghai Gengyun Biotechnology Co., Ltd | J31050 JZ | Шов для раны |
| Линия швов | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd | F3124 | Шов для раны |
| Игла для швов | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd | F3124 | Шов для раны |
| Защитный раствор для тканей | Nanjing Shenghang Biotechnology Co., Ltd | BC-CFM-03 | Поддержание активности клеток тканей |
| Tube (50 мл) | Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd. | BLD-BL2002500 | Установка раствора для фиксации формалина |
Ссылки
- Saraf, A. J., Fenger, J. M., Roberts, R. D. Osteosarcoma: accelerating progress makes for a hopeful future. Front Oncol. 8, 4(2018).
- Ligon, J. A., et al. Pathways of immune exclusion in metastatic osteosarcoma are associated with inferior patient outcomes. J Immunother Cancer. 9 (5), e001772(2021).
- Miwa, S., et al. Current and emerging targets in immunotherapy for osteosarcoma. J Oncol. 2019, 7035045(2019).
- Eaton, B. R., et al. Osteosarcoma. Pediatr Blood Cancer. 68 (2), e28352(2021).
- Ritter, J. Osteosarcoma. Ann Oncol. 21, 320-325 (2010).
- Lowery, C. D., et al. Broad spectrum activity of the checkpoint kinase 1 inhibitor prexasertib as a single agent or chemo potentiator across a range of preclinical pediatric tumor models. Clin Cancer Res. 25 (7), 2278-2289 (2019).
- Hingorani, P., et al. Trastuzumab deruxtecan, antibody-drug conjugate targeting Her2, is effective in pediatric malignancies: a report by the pediatric preclinical testing consortium. Mol Cancer Ther. 21 (8), 1318-1325 (2022).
- Brennecke, P., et al. CXCR4 antibody treatment suppresses metastatic spread to the lung of intratibial human osteosarcoma xenografts in mice. Clin Exp Metastasis. 31 (3), 339-349 (2014).
- Pan, B., Wei, X., Xu, X. Patient-derived xenograft models in hepatopancreatobiliary cancer. Cancer Cell Int. 22 (1), 41(2022).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumor xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- Yoshida, G. J. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 13 (1), 4(2020).
- Stitzlein, R. N., Wojcik, J., Sebro, R. A., Balamuth, N. J., Weber, K. L. Team approach: Osteosarcoma of the distal part of the femur in adolescents. JBJS Rev. 5 (12), 5(2017).
- Kai, K., et al. Formalin fixation on Her-2 and PD-l1 expression in gastric cancer: A pilot analysis using the same surgical specimens with different fixation times. World J Clin Cases. 7 (4), 419-430 (2019).
- Yang, T. S., et al. A practical protocol to prepare paraffin-embedded whole tick histology sections. Ticks Tick Borne Dis. 14 (4), 102162(2023).
- Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Mol Med Rep. 18 (1), 945-957 (2018).
- de Alava, E. Ewing sarcoma, an update on molecular pathology with therapeutic implications. Surg Pathol Clin. 10 (3), 575-585 (2017).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: An emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Eoh, K. J., et al. Comparison of clinical features and outcomes in epithelial ovarian cancer according to tumorigenicity in patient-derived xenograft models. Cancer Res Treat. 50 (3), 956-963 (2018).
- Stewart, E. L., et al. Clinical utility of patient-derived xenografts to determine biomarkers of prognosis and map resistance pathways in EGFR-mutant lung adenocarcinoma. J Clin Oncol. 33 (22), 2472-2480 (2015).
- Kresse, S. H., Meza-Zepeda, L. A., Machado, I., Llombart-Bosch, A., Myklebost, O. Preclinical xenograft models of human sarcoma show nonrandom loss of aberrations. Cancer. 118 (2), 558-570 (2012).
- Dobrolecki, L. E., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer Metastasis Rev. 35 (4), 547-573 (2016).
- Abdolahi, S., et al. Patient-derived xenograft (PDX) models, applications and challenges in cancer research. J Transl Med. 20 (1), 206(2022).
- Deng, N., et al. Deep whole-genome sequencing identifies recurrent genomic alterations in commonly used breast cancer cell lines and patient-derived xenograft models. Breast Cancer Res. 24 (1), 63(2022).
- Chen, F., et al. Generation and characterization of patient-derived xenografts from patients with osteosarcoma. Tissue Cell. 79, 101911(2022).
- Fortuna-Costa, A., et al. An association between successful engraftment of osteosarcoma patient-derived xenografts and clinicopathological findings. Histol Histopathol. 35 (11), 1295-1307 (2020).
- Beck, J., et al. Canine and murine models of osteosarcoma. Vet Pathol. 59 (3), 399-414 (2022).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
