Method Article

Количественная оценка дендритных отростков с помощью программного обеспечения для автоматической трехмерной реконструкции нейронов

DOI:

10.3791/66493

⸱

September 27th, 2024

 ,  ,  , 
1Section on Synapse Development Plasticity, National Institute of Mental Health, National Institutes of Health, 2Colgate University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дендритные шипики являются постсинаптическими компартментами большинства возбуждающих синапсов. Изменения морфологии дендритного отростка происходят во время неврологического развития, старения, обучения и многих неврологических и психиатрических расстройств, что подчеркивает важность надежного анализа дендритного отростка. Этот протокол описывает точную и воспроизводимую количественную оценку морфологии дендритных шипиков с помощью программного обеспечения для автоматической трехмерной реконструкции нейронов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Синаптические связи обеспечивают обмен и обработку информации между нейронами. Постсинаптический участок возбуждающих синапсов часто формируется на дендритных шипах. Дендритные шипики представляют большой интерес для исследований, сосредоточенных вокруг синаптической пластичности, развития нервной системы, а также неврологических и психиатрических расстройств. Дендритные шипики претерпевают структурные изменения в течение своей жизни, при этом такие свойства, как общее количество шипов, размер дендритных шипиков и морфологически определенный подтип, изменяются в ответ на различные процессы. Определение молекулярных механизмов, регулирующих эти структурные изменения дендритных шипов, основано на морфологических измерениях. Это требует точного и воспроизводимого дендритного анализа позвоночника для получения экспериментальных данных. В настоящем исследовании представлен подробный протокол количественной оценки и классификации дендритных отростков с использованием Neurolucida 360 (программное обеспечение для автоматической трехмерной реконструкции нейронов). Этот протокол позволяет определить ключевые свойства дендритного шипика, такие как общая плотность позвоночника, объем головки позвоночника и классификация по подтипам позвоночника, что позволяет эффективно анализировать структурные фенотипы дендритного шипика.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дендритные шипики представляют собой выступы дендритов, часто составляющие постсинаптический участок глутаматергических синапсов 1,2. Дендритные шипики представляют особый интерес в области синаптической пластичности. Позвоночники часто изменяются при изменении синаптической силы, становясь больше и сильнее при длительной синаптической потенциации или меньше и слабее при долгосрочной синаптической депрессии 3,4,5,6,7. Помимо синаптической пластичности, профиль дендритных шипиков меняется на протяжении всей жизни. На ранних этапах развития наступает период формирования и роста дендритных шипов, за которым следует обрезка дендритных шипиков до достижения устойчивого состояния 8,9,10. В стареющем мозге потеря позвоночника сопровождается уменьшением мозга и снижением когнитивныхфункций11. Кроме того, многие неврологические, нейродегенеративные и психические расстройства характеризуются аберрантными дендритными шипами. Множественные области мозга у людей, страдающих шизофренией, имеют меньшее количество дендритных шипиков, что, вероятно, является результатом измененной синаптическойобрезки. Расстройства аутистического спектра также характеризуются дендритными патологиями позвоночника13. Дендритная потеря позвоночника является отличительной чертой как болезни Альцгеймера, так и болезни Паркинсона14,15. Учитывая широкий спектр тем исследований, охватывающих изучение свойств дендритного шипа, методы точного количественного определения шипиков имеют первостепенное значение.

Окрашивание, т.е. метод Гольджи, или мечение нейронов с помощью наполнения красителя или экспрессии флуоресцентных белков являются распространенными методами визуализации дендритного позвоночника 16,17,18. После визуализации шипы могут быть проанализированы с помощью различных бесплатных и коммерчески доступных программных клиентов. Желаемые результаты анализа являются важным фактором при определении того, какое программное обеспечение будет наиболее полезным. Fiji — это жизнеспособный вариант программного обеспечения для вопросов, связанных с плотностью дендритных шипиков. Тем не менее, этот метод в значительной степени основан на трудоемком ручном подсчете, который может привести к систематической ошибке. Новые плагины, такие как SpineJ, позволяют проводить автоматическую количественную оценку, а также более точный анализ позвоночника и шеи19. Недостатком этих подходов является потеря трехмерного анализа для определения объема позвоночника, так как SpineJ ограничен двумерными стеками изображений. Кроме того, получение информации о подтипах позвоночника становится сложной задачей с помощью этих процессов. Четыре преобладающих подтипа шипов: тонкий, грибовидный, короткий и филоподийный, все они связаны с индивидуальными функциями и в значительной степени классифицируются по морфологии20. Тонкие шипы характеризуются удлиненной шеей и четко выраженной головой21. Грибовидные колючки имеют гораздо более крупную и выраженную головку22. Короткие шипы короткие и имеют небольшую вариативность между головой и шеей23. Филоподии – это неполовозрелые колючки с длинной, тонкой шеей и без явно заметной головы24. В то время как классификация предоставляет ценную информацию, шипы существуют в континууме измерений. Классификация по категориям основана на диапазонах морфологических измерений25,26. Ручное измерение корешков для классификации усложняет логистическую нагрузку для исследователей при таком подходе.

Другие варианты программного обеспечения, ориентированные конкретно на трехмерный дендритный анализ позвоночника, лучше подходят для исследований объема и свойств подтипов позвоночника 27,28,29,30,31. Несмотря на трудности, связанные с трехмерным анализом, такие как низкое разрешение в z-плоскости и размазывание, эти программные опции позволяют проводить надежную трехмерную реконструкцию дендритов и дендритных шипиков в полуавтоматическом режиме, управляемом пользователем. Автоматическая классификация идентифицированных позвоночников по их подтипам также присутствует в некоторых из этих программных пакетов для анализа позвоночника. Это может уменьшить опасения по поводу потенциальной рабочей нагрузки и экспериментальной систематической ошибки. Neurolucida 360 является одним из коммерчески доступных программ, позволяющих надежно и воспроизводимо идентификацию и классификацию трехмерных дендритных отростков32. Здесь мы представляем комплексный протокол для эффективной подготовки неподвижных тканей, получения изображений и, в конечном итоге, количественной оценки и классификации дендритных шипиков с помощью этого программного обеспечения.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры на животных соответствовали рекомендациям Национального института здравоохранения США по использованию животных в внутренних исследованиях и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Национальным институтом психического здоровья.

1. Подготовка фиксированных срезов гиппокампа

  1. Обезболивайте мышей с помощью внутрибрюшинной инъекции кетамина/ксилазина (кетамин: 100 мг/кг; Ксилазин: 8 мг/кг). Подтвердите анестезию с помощью зажима хвоста и приложите мышь к перфузионной пластине.
  2. С помощью больших хирургических ножниц удалите кожу и шерсть с грудной клетки, что позволит легче визуализировать подлежащую грудную клетку.
  3. Сделайте горизонтальный разрез ниже ширины грудной клетки, избегая печени и диафрагмы. С помощью тонких щипцов подтяните мечевидный отросток вверх и разрежьте каждую боковую сторону грудной клетки. Подверните грудную клетку вверх к области шеи и зафиксируйте на месте с помощью щипцов для гемостата.
  4. Введите иглу-бабочку 21 г в левый желудочек сердца и начните перфузию комнатной температурой 1x PBS со скоростью примерно 5 мл/мин. Сделайте небольшой надрез в правом предсердии маленькими хирургическими ножницами. Выполняйте с помощью PBS до тех пор, пока раствор не станет чистым.
  5. Выключите перфузионный насос, чтобы убедиться, что пузырьки не попадают в трубку. Поместите трубку из PBS в ледяной 4% параформальдегид (PFA) в PBS. Перфузию с ПФА со скоростью 5 мл/мин до полного окоченения животного, примерно 25 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что PFA свежий (не старше 1 недели, если запас хранится при температуре 4° C) для оптимальной фиксации.
  6. Снимите кожу с поверхности черепа с помощью небольших хирургических ножниц. Сделайте межсагиттальный надрез маленькими хирургическими ножницами вдоль центральной щели черепа. Сделайте боковые надрезы рострально к обонятельной луковице и над мозжечком.
  7. Вскройте череп тонкими щипцами, чтобы обнажить мозг. С помощью шпателя аккуратно вычерпните мозг из обонятельных луковиц и поместите 4% PFA в PBS на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более полного протокола перфузии грызунов, пожалуйста, обратитесь к Gage et al.33.
  8. Криопротекция неподвижного мозга путем замены 4% PFA на 15% сахарозы в PBS на 1 день. После этого замените 15% сахарозу на 30% сахарозу в растворе PBS на 1 день, пока мозг не погрузится в раствор.
  9. Извлеките мозг из раствора сахарозы и поместите его в чашку Петри с PBS. Отрежьте мозжечок и обонятельную луковицу с помощью лезвия скальпеля.
  10. Нанесите небольшое количество состава, 1-2 см в диаметре, оптимальной температуры резки (OCT) на поверхность держателя образца. Прикрепите мозг коронально к держателю образца с каудальной поверхностью разреза в ОКТ. Быстро заморозьте мозг, поместив держатель образца в измельченный сухой лед до видимого замерзания, примерно на 5-7 минут.
  11. Убедитесь, что угол наклона лопастей криостата установлен в диапазоне от 0° до 5° для получения однородных секций. Отрегулируйте угол наклона роликовой пластины для оптимального выравнивания ломтика. Пожалуйста, обратитесь к руководству по оборудованию для получения конкретных инструкций.
  12. Поместите держатель образца в криостат так, чтобы брюшная поверхность мозга была ближе всего к лезвию. Разрежьте мозг на дорсальные участки гиппокампа размером 30 мкм, отбросив все срезы рострально к гиппокампу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола может быть адаптирована к любой желаемой области мозга по выбору. Шаги 1.9-1.12 будут меняться в зависимости от интересующего региона.
  13. Перенесите дорсальные срезы гиппокампа в PBS. С помощью кисти аккуратно закрепите срезы гиппокампа на предметном стекле микроскопа. Удалите излишки раствора ватными палочками или деликатными салфетками.
  14. Нанесите на предметное стекло микроскопа 100 μл жестко закрепленной монтажной среды, охватывающей все срезы мозга. Чтобы предотвратить образование пузырей, медленно опустите покровное стекло с помощью щипцов на монтажный материал. Если образуются пузыри, осторожно постучите по покровному стеколе щипцами, чтобы они вырвались. Дайте предметным стеклам застыть на ночь перед визуализацией.

2. Конфокальная визуализация с высоким разрешением

  1. Используйте окуляры с малым увеличением для идентификации флуоресцентных клеток. Переключитесь на объектив с 63x (NA = 1.4) или выше, применяя к нему подходящую среду погружения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов используйте лазерный сканирующий конфокальный микроскоп с объективом 63x или выше.
  2. Идентификация хорошо размеченных дендритных сегментов с ограниченным перекрытием для получения изображений. Установите мощность и коэффициент усиления лазера, чтобы гарантировать, что флуоресцентные дендриты не будут насыщены. Кроме того, снижение скорости сканирования может обеспечить лучшее разрешение изображения.
  3. Получение z-стеков, охватывающих полные дендритные сегменты, для будущего анализа. Z-стеки размером более 10 мкм нежелательны из-за дополнительной возможности дендритного перекрытия в z-плоскости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте наименьший доступный размер z-шага (0,2-0,7 мкм) и 1 размер отверстия для воздушного блока. Меньший размер шага приводит к большему количеству изображений в z-стеке, компенсируя ограниченное разрешение Z многих микроскопов.
  4. Дополнительно: Если это возможно, используйте соответствующие функции программного обеспечения для деконволюции микроскопа для деконволюции изображений. Это позволит получать изображения с более высоким разрешением.

3. Количественная оценка дендритных отростков

  1. Откройте Neurolucida 360 (v2022.1.1 или более поздняя версия). Откройте файл изображения в программном обеспечении для анализа позвоночника (File > Open > Image). Убедитесь, что файл изображения виден в главном окне и в 3D-окружении. Если окно 3D-окружения не появляется, щелкните левой кнопкой мыши по пункту «3D-окружение» на верхней панели инструментов главного окна на вкладке «Трассировка » (дополнительный рисунок 1)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел протокола может быть адаптирован для любых дендритных изображений, а не только для дендритов из ткани мыши.
  2. Находясь на вкладке "Изменить отображение изображения " окна "3D-среда", убедитесь, что изображение отображается как 3D-объем в окне "Отобразить изображение как ". В поле «Параметры стека изображений » на вкладке «Изображение » выберите «Максимальная проекция » в раскрывающемся меню «Показать поверхность как ». (Дополнительный рисунок 2)
  3. Определите подходящий дендритный сегмент для трассировки.
    1. Щелкните левой кнопкой мыши инструмент «Переместить точку вращения » на верхней панели инструментов окна 3D среды . Щелкните левой кнопкой мыши по нужному дендриту, чтобы установить новую точку вращения. Это изменит ориентацию для обеспечения эффективного увеличения.
    2. Восстановите исходную ориентацию, щелкнув левой кнопкой мыши значок «Сбросить ориентацию ». После установки опорной точки щелкните левой кнопкой мыши по инструменту «Переместить точку вращения », чтобы начать трассировку дендрита. (Дополнительный рисунок 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальный дендрит - это дендрит с ограниченным перекрытием с другими дендритами в любой из координатных плоскостей и не пересекающийся с другим дендритом или поверхностный по отношению к другому ниже. Дендриты, расположенные в небольшом соседстве с другими в плоскости XY, также предпочтительны для предотвращения неправильного отнесения соседних шипов к трассируемому дендриту. Следует также отметить, что дендриты разной толщины, порядка и расстояния от сомы имеют различную плотность дендритных шипиков34,35. Это должно быть учтено в плане эксперимента. Дендриты вторичного порядка толщиной <1,5 мкм являются идеальными кандидатами для трассировки (рис. 1).
  4. Щелкните левой кнопкой мыши вкладку Дерево в окне 3D Окружающая среда . Щелкните левой кнопкой мыши User-Guided для режима трассировки и Directional Kernels в качестве метода в разделе User-Guided Tracing Options.
  5. Щелкните левой кнопкой мыши по дендриту, когда появится круглое ядро, чтобы начать трассировку. Переместите курсор вдоль дендритного сегмента. Это приведет к автоматическому заполнению ядер. Если ядра не заполняются автоматически, см. шаг 3.51.
    1. Аккуратно перемещайте курсор вперед и назад по дендриту, пока зерна не заполнятся. Щелкните левой кнопкой мыши, чтобы сохранить существующие обнаруженные ядра. Если ядра перестают заполняться, щелкните левой кнопкой мыши, когда ядро заполняется дальше по дендриту, чтобы разместить его вручную. Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы завершить трассировку. Убедитесь, что длина трассируемого дендрита составляет не менее 7 мкм (дополнительный рисунок 3).
  6. Проверьте точность трассировки дендритов, используя все три направления 3D-среды: тангаж, рыскание и крен, щелкнув левой кнопкой мыши и перетащив окно 3D-среды . Определите точки, в которых дендритная трассировка находится за пределами соответствующего местоположения на дендрите. Могут быть случаи, когда он выглядит точно прорисованным сверху вниз, но в z-измерении точки не находятся на дендрите (рис. 2).
  7. Чтобы исправить неправильно прорисованные дендритные сегменты, щелкните левой кнопкой мыши вкладку «Правка » в меню «Дерево ». Щелкните левой кнопкой мыши на интересующем дендрите, затем щелкните левой кнопкой мыши по Точкам.
  8. Переместите неправильно расположенные точки обратно на сегмент дендрита с помощью щелчка и перетаскивания. Удалите лишние точки, щелкнув левую кнопку мыши по точке и нажав кнопку «Удалить ». Измените размер точек, если дендрит заполнен недостаточно. Чтобы изменить размер точки, щелкните левой кнопкой мыши по точке и отрегулируйте ползунок толщины, чтобы изменить размер (дополнительный рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Недостаточно заполненные дендриты могут привести к идентификации ложных шипиков, которые являются компонентами дендритного сегмента. И наоборот, переполнение дендритов может затемнить истинные шипы.
  9. Повторите шаги 3.3-3.8 для множественных дендритов на изображении, прежде чем перейти к идентификации позвоночника на шаге 3.10.
  10. Щелкните левой кнопкой мыши вкладку «Позвоночник » в окне «3D-среда». Установите настройки обнаружения для внешнего диапазона, минимальной высоты и минимального количества вокселей. В зависимости от подготовки может потребоваться изменение предустановленных значений в случае четкого и конкретного обоснования изменений. Предустановленные условия: Внешний диапазон: 2,5 мкм, Минимальная высота: 0,3 мкм, Минимальное количество вокселей: 10 вокселей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Различные препараты, такие как клеточные культуры и острые ткани, а также различные временные точки развития потребуют различных критериев, которые должны быть выведены из существующей литературы. Также важно отметить, что изменение настроек обнаружения может значительно повлиять на результаты. Например, более высокий минимальный рост может исключить короткие шипы. Параметры обнаружения должны оставаться неизменными на протяжении всего эксперимента.
  11. Установите Чувствительность детектора на 70% и щелкните левой кнопкой мыши Обнаружить все. Это позволит заселить шипы, идентифицированные чувствительностью этого детектора, на всех дендритах. Если вы хотите выбрать шипы специфичным для дендритов способом, щелкните левой кнопкой мыши по окошку Щелкните изображение, чтобы обнаружить все на ближайшей ветви и щелкните левой кнопкой мыши по каждому дендриту вручную с разной чувствительностью детектора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе вполне естественно, что не все дендритные шипики будут заселены. Точно так же не-колючки могут неправильно заселяться. Начальная чувствительность в 70% также является гибкой; Это может измениться в зависимости от подготовки.
  12. Изучите шипы, выбранные этим детектором чувствительности, щелкнув и перетащив дендрит во всех трех направлениях. Если большинство обнаруженных колючек заполнены не полностью, переходим к пункту 3.12.1. Если обнаруженные колючки переполнены, перейдите к шагу 3.12.2. Если обнаруженные шипы кажутся достаточно заполненными, перейдите к шагу 3.13.
    1. Увеличьте Чувствительность детектора на 5%-10% и снова нажмите левую кнопку мыши «Обнаружить все». Это позволит заменить все ранее обнаруженные шипы на новые с более высокой чувствительностью. Повторяйте по мере необходимости, пока обнаруженные шипы не будут должным образом заполнены.
    2. Уменьшите Чувствительность детектора на 5%-10% и снова щелкните левой кнопкой мыши по кнопке «Обнаружить все». Это позволит заменить все ранее обнаруженные шипы на новые с меньшей чувствительностью. Повторяйте по мере необходимости, пока обнаруженные шипы не будут должным образом заполнены.
  13. Щелкните левой кнопкой мыши по кнопке "Сохранить существующие шипы " на вкладке "Позвоночник " в окне "3D-среда". Если выбран параметр «Щелкнуть изображение, чтобы обнаружить все на ближайшем ответвлении », снимите с него флажок.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Установка флажка «Сохранить существующие шипы » гарантирует, что вновь идентифицированные дендритные шипы вручную не перезапишут ранее идентифицированные шипы. Убедитесь, что этот флажок выбран, прежде чем продолжить, чтобы не перезаписать предыдущую работу.
  14. Щелкните левой кнопкой мыши по Move Pivot Point и щелкните левой кнопкой мыши по дендриту, требующему дальнейшего обнаружения шипа, чтобы установить точку вращения.
    1. Снимите флажок «Переместить точку вращения». Определите незаполненный дендритный отросток. Увеличьте чувствительность детектора на 10%-20% по сравнению с предыдущим обнаружением и щелкните левой кнопкой мыши по корешку. Если обнаруженный позвоночник недооценен или переполнен, перейдите к пункту 3.14.3 или 3.14.4. Если позвоночник не заполняется, появится сообщение Не удалось обнаружить позвоночник в выбранном месте. В этом случае переходим к шагу 3.14.2.
    2. Увеличивайте чувствительность детектора постепенно, возможно, выше 100%, пока позвоночник не будет обнаружен и адекватно заполнен. Если позвоночник обнаружен, но недостаточно заполнен, перейдите к шагу 3.14.3. Если позвоночник переполнен, переходим к шагу 3.14.4 (рисунок 3).
    3. Щелкните левой кнопкой мыши вкладку «Правка» и щелкните левой кнопкой мыши по недозаполненному корешку. Щелкните левой кнопкой мыши «Удалить». Снимите флажок на вкладке «Правка ». Увеличьте чувствительность на 5%-10% и кликните левой кнопкой мыши по позвоночнику. Повторите этот шаг, если позвоночник все еще недостаточно заполнен.
    4. Щелкните левой кнопкой мыши вкладку «Правка» и щелкните левой кнопкой мыши по переполненному корешку. Щелкните левой кнопкой мыши «Удалить». Снимите флажок на вкладке «Правка ». Уменьшите чувствительность на 5%-10% и нажмите на корешок. Повторите этот шаг, если позвоночник все еще переполнен.
  15. Повторяйте шаги 3.14-3.14.4 до тех пор, пока не будут обнаружены все шипы, идентифицированные с помощью визуальной идентификации. Дважды проверьте дендрит на наличие шипов, принадлежащих соседним дендритам, ложных шипов, не соответствующих истинному сигналу, или потенциальных сегментов дендрита, ошибочно помеченных как шипы. Удалите эти ложные шипы с помощью функции «Удалить ».
  16. Осмотрите выявленные колючки на дендрите. В некоторых случаях несколько шипов могут выглядеть как один конгломератный позвоночник. Если кажется, что позвоночник включает в себя два шипа, щелкните левой кнопкой мыши вкладку «Правка ». Щелкните левой кнопкой мыши корешок и щелкните левой кнопкой мыши «Скрыть выделенное». После подтверждения конгломератного корешка на вкладке «Правка » щелкните левой кнопкой мыши « Показать выделение » и выберите «Разделить». Если в одном конгломерате находится более двух шипов, возможно, потребуется повторить этот шаг (рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если конгломератный корешок не расщепляется после шага 3.16, удалите позвоночник. Затем выберите более интенсивный позвоночник конгломерата с более низкой чувствительностью. Как только более интенсивный позвоночник будет заполнен, увеличьте чувствительность, чтобы выбрать другой незаполненный позвоночник. В качестве альтернативы, удаление конгломератного шипа и последующее увеличение чувствительности может обеспечить правильное разделение.
  17. После того как все визуально идентифицируемые колючки обнаружены и заполнены соответствующим образом, на вкладке «Позвоночник » щелкните левой кнопкой мыши «Классифицировать все », чтобы классифицировать колючки по четырем подтипам: тонкие, грибовидные, короткие и филоподии (рис. 5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры классификации позвоночника могут быть изменены в окне Настройки окна Классификация на вкладке Позвоночник . Как и в случае с настройками детектора, настоятельно рекомендуется иметь четкое обоснование изменения существующих параметров. Заданные значения: отношение головы к шее: 1,1, отношение длины к голове: 2,5, размер головки гриба: 0,35 мкм, длина филоподия - 3 мкм.
  18. На верхней панели инструментов окна 3D-среды выберите «Сохранить и просмотреть в Neurolucida Explorer». Neurolucida Explorer — это место, где собираются данные из трассировки. Работа будет сохранена в виде файла .dat, содержащего все кальки и корешки.
  19. В окне Проводник на вкладке Вид щелкните левой кнопкой мыши Выбрать все , чтобы выделить все дендриты и шипы.
  20. Щелкните левой кнопкой мыши вкладку «Анализ» на верхней панели инструментов. Щелкните левой кнопкой мыши ниспадающее меню «Структура ». Щелкните левой кнопкой мыши Анализ разветвленной структуры (Branched Structure Analysis).
  21. В зависимости от интересующих переменных может быть выбран любой из анализов. Двумя наиболее полезными для вопросов, связанных с плотностью корешка и средним объемом корешка, являются «Каждое дерево > каждым дендритом » и «Шипы > детали шипа». Нажмите OK, и данные появятся в двух отдельных окнах.
  22. Скопируйте данные в электронную таблицу для дальнейшей компиляции и анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельное дерево будет отделено дендритами, но объем корешка не будет отделен. С помощью функции сортировки в таблице детали корешка можно отфильтровать по признакам.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эффективное использование этого метода анализа начинается с выбора дендритных сегментов для трассировки. Как показано на рисунке 1, идеальные дендриты для трассировки не находятся в непосредственной близости от других дендритов. Дендриты, идущие параллельно, могут привести к неправильной идентификации шипов от соседнего дендрита. Дендриты, непосредственно пересекающиеся или идущие перпендикулярно в другой z-плоскости, также значительно затрудняют точную трассировку дендритов. Также важно отметить различия в толщине дендритов. Как сообщалось ранее, существуют ключевые различия в плотности шипиков с дендритами различной толщины36. Также могут быть отличия в одном и том же дендрите при увеличенном расстоянии от точки ветвления37. Трассировка дендритов того же порядка и толщины, в идеале с одинаковыми точками разветвления, может контролировать существующую неоднородность плотности дендритных шипиков. Определение точки ветвления в некоторых препаратах может оказаться невозможным, но толщина дендрита всегда должна быть контролируемым фактором при отслеживании дендритов. Точное отслеживание дендритных сегментов имеет жизненно важное значение для получения точных результатов этого анализа. Необходимо убедиться, что все точки прослеживаемого дендрита действительно находятся внутри дендрита. Наблюдение за трехмерным дендритом с разных сторон может помочь в этом процессе. Как показано на рисунках 2A, B, вид сверху вниз показывает то, что выглядит как правильно прорисованный дендрит. При виде сбоку; Однако многочисленные точки расположены не на самом дендрите. Эти проблемы отсутствуют на виде сбоку на рисунке 2C. Также важно убедиться, что дендриты правильно заполнены во время трассировки. Недозаполнение дендрита может привести к тому, что кусочки дендритов будут неправильно идентифицированы как шипы. Переполненный дендрит может помешать идентификации истинных шипов из-за минимального порога высоты. Эта ручная оценка трассировки по указанию пользователя имеет решающее значение для точного анализа дендритного позвоночника.

Идентификация дендритных шипиков также требует подхода, управляемого пользователем. Использование функции "Detect All" для установки единого порога чувствительности детектора недостаточно по многим причинам. Использование функции «Обнаружить все» полезно для идентификации наиболее явно очевидных шипов, но заполнение этих шипов необходимо проверить для проверки. Выявленные шипы с начальным значением «Обнаружить все» могут быть недозаполнены. Чтобы исправить это, идентифицированный шип должен быть удален по отдельности, а затем повторно идентифицирован вручную при более высокой чувствительности детектора (рис. 3A-C). Это гарантирует, что позвоночник будет адекватно заполнен. Существует существенная неоднородность в требуемой чувствительности детектора для шипов, которую необходимо учитывать вручную. Увеличение чувствительности детектора для обнаружения всех может привести к чрезмерному заполнению шипов, что также потребует ручной коррекции (Рисунок 3D). Еще одной проблемой с неправильной чувствительностью детектора является неуместное создание конгломератного шипа, одного заполненного дендритного шипа, который охватывает несколько шипов. Два шипа, находящиеся в непосредственной близости друг от друга, могут быть неправильно слиты в один конгломератный шип (рис. 4А, В). Программное обеспечение для определения позвоночника имеет функцию «Разделение», которую можно использовать для разделения шипов, которые были слиты из-за переполнения. Функция «Разделение» позволяет легко создавать отдельные шипы из конгломератного шипа (рис. 4C). Точное отслеживание дендритов и заполнение дендритных шипиков позволяют точно классифицировать их по подтипам позвоночника. Классификация шипиков основана на морфологии заполненных шипиков и расстоянии от дендритов, поэтому каждый шаг в этом процессе играет роль в морфологической классификации (рис. 5).

В связи с необходимостью ручного отбора и определения пороговых значений крайне важно следовать единому стандарту для всех анализов. Это особенно актуально, если в анализ данных вносят свой вклад несколько пользователей. Чтобы убедиться, что все исследователи, проводящие анализ, следуют одному и тому же стандарту, исследователи должны сравнивать данные из одних и тех же отслеживаемых дендритов. Это может снизить вероятность систематической ошибки экспериментатора, гарантируя, что каждый исследователь идентифицирует шипы на основе общих, единых критериев в слепой манере. Существует также вероятность предвзятости со стороны одного исследователя между днями или даже в один и тот же день из-за усталости. Это должно контролироваться на протяжении всего процесса анализа данных. Чтобы еще больше убедиться в достоверности анализа, сравнение первоначальных результатов с опубликованными в литературе гарантирует, что протокол эффективно соблюдается. Важно отметить, что это сравнение будет эффективным только в том случае, если подготовка и параметры будут общими. Различия в окрашивании, получении флуоресцентных сигналов, порядке и толщине дендритов или области мозга могут способствовать различным результатам 8,36. В случае отсутствия опубликованных результатов, использование нескольких исследователей для проверки идентификации позвоночника позволяет повысить уверенность в надежности и воспроизводимости анализа. В эту рукопись включена дополнительная аналитическая папка. Эта папка содержит файлы образцов изображений дендритных сегментов, трассированных дендритов, трассированных дендритов с идентифицированными и классифицированными шипами, а также выходные данные (Дополнительная таблица 1, Дополнительный файл 1, Дополнительный файл 2, Дополнительный файл 3 и Дополнительный файл 4). Новые пользователи могут обучаться на этом наборе данных для отработки процедур, описанных в этом документе. Результаты, созданные пользователем в пределах 10% от предоставленного набора данных образца, считаются приемлемыми для воспроизведения стандарта анализа. Из-за потенциально субъективных критериев полностью заполненного позвоночника и необходимости ручного обследования автоматически обнаруженных шипов, различия между исследователями и внутри них являются нормальной частью анализа. Если полученные результаты превысят этот порог; Тем не менее, следует провести параллельное сравнение, чтобы определить случаи разного объема позвоночника, а также неправильно включенные или исключенные шипы. Затем образец набора данных может быть повторно проанализирован до тех пор, пока не будет достигнуто приемлемое пороговое значение.

figure-results-1
Рисунок 1: Выбор дендритов для анализа дендритного позвоночника. (A) 3D-объемное отображение конфокальных изображений z-стека, полученных из проксимальных дендритов CA1 в линии трансгенных мышей THY1-YFP. Обратите внимание на неоднородность порядка дендритов: более толстые первичные дендриты в голубых овалах и более тонкие, вторичные и третичные дендриты в розовых овалов. (B) Идеальные кандидаты для трассировки дендритов обозначены зелеными овалами. Обратите внимание на толщину и ограниченное количество пересечений, перекрытий и близость к другим дендритам. Красным овал обозначает дендритные сегменты, которых следует избегать при трассировке дендритов из-за большого количества пересечений, перекрытий и близости к другим дендритам. Более толстые первичные дендриты также не подходят для трассировки. Масштабная линейка = 25 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Точная трассировка дендритных сегментов. (A) 3D-объемное отображение конфокальных изображений z-стека, полученных из проксимальных дендритов CA1 в линии трансгенных мышей THY1-YFP, для трассировки с помощью метода направленного ядра, управляемого пользователем. Масштабная линейка = 10 мкм. (B) Пример плохой трассировки дендритов. Дендрит выглядит правильно прорисованным при виде сверху. Вид сбоку показывает, что дендрит неправильно заполнен точками, отклоняющимися от дендрита. (C) Пример правильной трассировки дендритов. Вид сверху вниз похож на вид B, но вид сбоку существенно отличается. Дендрит в C правильно прослеживается, на что указывает то, что он полностью заполнен без отклонений от дендрита. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Точное заполнение дендритных шипиков с помощью ручного выбора. (A) 3D-объемное отображение конфокальных изображений z-стека, полученных из проксимальных дендритов CA1 в трансгенной мышиной линии THY1-YFP позвоночника, ожидающего ручного обнаружения. Масштабная линейка = 0,5 мкм. (B) Пример недозаполненного дендритного позвоночника. Из-за неполного наполнения все еще виден существенный флуоресцентный сигнал. (C) Пример правильно заполненного дендритного позвоночника. Наличие «короны» сигнала, едва заметной вокруг внешней стороны наполнения, является стандартом для точного заполнения дендритных шипиков. (D) Пример переполненного дендритного позвоночника. Чувствительность детектора слишком высока, что приводит к переполнению позвоночника. Начинка вышла за границы флуоресценции и имеет практически незаметную корону. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Расщепление конгломератных дендритных шипов. (A) 3D-объемное отображение z-стековых конфокальных изображений, полученных из проксимальных дендритов CA1 в трансгенной линии мышей THY1-YFP с двумя шипами, находящимися в непосредственной близости. Масштабная линейка = 0,15 мкм. (B) Пример двух независимых шипов, неправильно заполненных как один конгломератный дендритный шип. (C) После использования функции "Split" конгломератный шип разделяется на два отдельных правильно заполненных дендритных шипа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Идентификация дендритных шипиков и классификация по подтипам. (A) 3D-объемное отображение конфокальных изображений z-стека, полученных из проксимальных дендритов CA1 в трансгенной мышиной линии THY1-YFP трассированного дендритного сегмента, выделенного для количественного определения и классификации дендритных шипиков. Масштабная линейка = 5 мкм. (B) Прослеженный дендритный сегмент со всеми дендритными шипами, идентифицированными и исследованными для обеспечения правильного заполнения и расщепления. На этом этапе программное обеспечение произвольно присваивает цвета идентифицированным шипам. (C) Классификация всех идентифицированных дендритных шипиков на подтипы с использованием параметров, заданных в программном обеспечении. Синий = гриб, желтый = тонкий, а зеленый = короткий. Филоподии отсутствуют из-за возраста этой ткани. (D) Репрезентативные изображения грибов, тонких и коротких колючек без наполнителя (вверху) и с наполнителем (внизу). Масштабная линейка = 0,3 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Доступ к 3D-среде. Z-стек конфокальных изображений, просматриваемых в интерфейсе программы. Навигация по 3D-окружению с вкладки «Трассировка » в основном средстве просмотра выделена желтым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Параметры изображения и настройки ориентации для 3D среды. Просмотрщик 3D Environment для конфокальных изображений z-стека. Параметры на выделенной вкладке «Изменить отображение изображения », обозначенной желтыми стрелками, установлены на «Отобразить изображение как: 3D-объем » и «Показать поверхность как: максимальная проекция». Параметры «Переместить точку вращения » и « Сбросить ориентацию » обозначены желтыми стрелками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Трассировка сегментов дендритов. (A) 3D-объем конфокальных изображений z-стека для трассировки дендритов. Когда выбрана вкладка дерева, управляемые пользователем и направленные ядра, трассировка начинается с размещения исходного ядра на дендрите щелчком левой кнопкой мыши. (B) Распространение направленных ядер вниз по дендриту после движения курсора. (C) Щелчок левой кнопкой мыши дальше вниз по дендриту заполняет направленные ядра. (D) Пример того, как направленные ядра не заполняют дендриты. Вместо этого одинокое ядро присутствует дальше по сегменту. (E) Щелчок левой кнопкой мыши по одинокому ядру заполняет дендрит между двумя точками. Щелчок правой кнопкой мыши завершает трассировку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Точки выравнивания в трассированных дендритах. (A) Трассированный сегмент дендрита в ожидании корректировки точки. Для редактирования дендритов необходимо выбрать вкладки "Дерево" и "Редактировать". Оба выделены желтым цветом. Дендрит был выбран для редактирования щелчком левой кнопкой мыши. (B) Выбор вкладки точек, выделенной желтым цветом, позволяет выбрать отдельные точки на сегменте дендрита. Зеленая точка имеет толщину 1,2 мкм. (C) Скорректирована точка для более точного заполнения дендрита. Новое значение толщины зеленой точки составляет 0,6 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 1: Примеры результатов анализа изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: Образцы трассировки изображений с дендритами и spines.dat Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Образцы трассировки с dendrites.dat Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Образец изображения дендрита file.czi Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 4: Образец изображения дендрита file.jpx Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе подробно описаны конкретные этапы подготовки образца, визуализации, а также процесс количественной оценки и классификации дендритных шипиков с использованием программного обеспечения для трехмерной реконструкции. Это программное обеспечение представляет собой мощный инструмент, способный получать надежные структурные данные, которые способствуют проведению разнообразных исследований. На протяжении всего процесса есть несколько критически важных шагов, которые делают этот протокол менее методологической нагрузкой и улучшают общий объем данных. Метод маркировки дендритных шипиков является одной из первых вещей, которые исследователи должны рассмотреть, прежде чем приступать к этому протоколу. Проблемы с количественной оценкой позвоночника могут возникнуть из-за недостаточных методов маркировки. Окрашивание определенных белков, экспрессируемых на низких уровнях в шипах, может привести к сигналам, которые слишком слабы для программного обеспечения. Следует также отметить, что смещение может быть внесено путем отслеживания самых ярких флуоресцентных дендритов. Хотя неясно, имеют ли различные флуоресцентные дендриты разные физиологические свойства, это все же является ограничением протокола, которое следует учитывать. Кроме того, в некоторых трансгенных линиях, таких как линия THY1-YFP-H, флуоресценция в дендритных шипах не проявляется примерно до P21. Это делает эту линию непригодной для исследований более ранних временных точек развития. Рассмотрение метода, используемого для маркировки шипов для направления исследования, не является тривиальным аспектом, так как без достаточной флуоресценции программное обеспечение снижает удобство использования. Точно так же необходимо рассмотреть аппаратное обеспечение для получения изображений. Некоторые типы файлов оказываются менее совместимыми с программным обеспечением для анализа, чем другие. В частности, файлы ND2 были определены как проблемные типы файлов для эффективного использования программного обеспечения. Поставщики программного обеспечения рекомендуют преобразовывать файлы в такие типы файлов, как JPEG2000 случае возникновения проблем.

Подготовка тканей и получение изображений также являются важными этапами для высококачественной количественной оценки позвоночника. Правильная фиксация, срез и монтаж тканей обеспечивают долговечность образца с минимальными артефактами, которые могут помешать анализу данных. Визуализация ткани также не сводится к получению z-стековых изображений всего среза мозга. Во время визуализации целью всегда должно быть получение стеков, содержащих дендриты, для количественного определения позвоночника. Акцент должен быть сделан на получении z-стеков, содержащих дендриты, которые будет легко отследить. Более толстый z-стек обычно приводит к большему количеству фоновых дендритов. Это затрудняет эффективную трассировку дендритов с помощью программного обеспечения. Дополнительное время во время визуализации для поиска лучших кандидатов для отслеживания сэкономит больше времени во время количественного анализа позвоночника. Кроме того, убедитесь, что изображения z-стека включают в себя все дендриты, которые необходимо трассировать. Если дендриты только частично видны в z-стеке, трассировка дендритов и идентификация позвоночника окажутся сложными и неточными из-за неполного 3D-рендеринга.

Процесс трассировки дендритов и получения точного профиля идентифицированных дендритных шипиков может быть трудоемким процессом. В этом есть доля нюансов. Во время трассировки дендритов функция, управляемая пользователем, иногда может не работать должным образом. В некоторых случаях направленные ядра не заполняются определенным сегментом или начинают заполняться нежелательным сегментом. Один из способов обойти эту проблему — начать с меньшей типичной ширины процесса. Это делает дендрит более заметным в программном обеспечении, что упрощает отслеживание. Если направленное ядро не может быть заполнено полностью, щелчок левой кнопкой мыши по дендриту установит его вручную. Он дойдет до очень маленькой точки и не заполнит дендрит, но это можно исправить с помощью регулировки толщины, как описано в шаге 3.8 протокола. В то время как дендриты могут быть отслежены вручную, если программное обеспечение окажется неадекватным, ручная трассировка шипов не является возможностью программного обеспечения. Будут случаи, когда будет виден четкий шип, но независимо от того, насколько высока чувствительность детектора, программное обеспечение не сможет его обнаружить. Одна вещь, которую следует проверить, это то, находится ли подозреваемый позвоночник за пределами диапазона. Если он находится в пределах досягаемости, но все еще не идентифицируется программным обеспечением, то этот шип будет исключен из анализа. Хотя это может происходить редко, это ограничение, которое следует учитывать. Как и в любом анализе, требующем пороговых значений и ручного компонента классификации, существует вероятность введения систематической ошибки. Эта проблема может еще больше усугубиться при сравнении данных, созданных несколькими пользователями. Полуавтоматический характер этого анализа направлен на то, чтобы свести к минимуму появление этой предвзятости, но она не устраняется полностью. В нашей лаборатории расхождение между исследователями на стандартном наборе данных в 10% было разумным при достаточной практике и обучении. Несмотря на то, что были предприняты усилия для минимизации систематической ошибки, по-прежнему важно учитывать межисследовательскую систематическую ошибку при оценке данных, полученных с помощью этого протокола.

Принимая во внимание незначительные недостатки программного обеспечения, результаты анализа дендритного позвоночника с использованием этого метода очень надежны. Как было описано ранее, существует множество показателей, которые могут быть экстраполированы на основе точной трассировки дендритного сегмента и идентификации позвоночника. Возможность получения информации о подтипах позвоночника обеспечивает ценную информацию на более глубоком уровне, чем основные метрики. Эти данные важны из-за взаимосвязи между структурой и функцией. Каждый подтип шипа имеет определенную функцию. Тонкие колючки являются преобладающим подтипом, претерпевающим обильный оборот21. Тонкие колючки также имеют потенциал для развития в грибовидные колючки38. Это согласуется с тем, что колючки грибов тесно связаны с обучением и памятью38,39. Кроме того, считается, что короткие колючки являются компонентом обучения, возможно, в виде остатков грибных колючек40. Филоподии, хотя и не преобладают во многих тканях взрослого человека, являются предшественниками позвоночника, которые представляют ключевой интерес для развития41,42. 3D-электронная микроскопия остается золотым стандартом для наиболее точной классификации подтипов позвоночника. Несмотря на свою ценность, этот метод ограничен трудоемкой ручной сортировкой и классификацией, которые подвержены человеческим ошибкам. Полуавтоматический дизайн этого анализа сокращает количество случаев, когда может возникнуть субъективная предвзятость. Несмотря на то, что в этом протоколе могут быть недостатки с точки зрения абсолютного разрешения и интенсивности флуоресценции, необходимых для создания идеальных классификаций, он все же обеспечивает методологически менее обременительную альтернативу 3D-электронной микроскопии и ручной классификации. Кроме того, полный дендритный анализ множественных дендритных ветвей из более широкого спектра областей мозга возможен с использованием анализа, описанного в этой работе. Это не относится к электронной микроскопии. Благодаря использованию этого протокола можно решать структурно-центрированные вопросы в различных дисциплинах, включая, помимо прочего, синаптическую пластичность, развитие, неврологические и психиатрические расстройства, надежным и воспроизводимым образом.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выражаем благодарность за техническую помощь Кэролин Смит (Carolyn Smith), Саре Уильямс Аврам (Sarah Williams Avram), Теду Усдину (Ted Usdin) и NIMH SNIR (NIMH SNIR). Кроме того, мы хотели бы выразить признательность Исследовательской группе биомедицинских исследований Университета Колгейт в Бетесде. Эта работа поддерживается Внутренней программой NIMH (1ZIAMH002881 to Z.L.).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
518F Иммерсионное маслоZeiss444960-0000-000
КриостатLeicaCM3050SДля подготовки срезов
Тонкие щипцыFST11150-10
Щипцы для гемостатаFST13020-12
Большие хирургические ножницыFST14002-16
LSM 880 Конфокальный микроскопZeissLSM 880
Крышка микроскопа СтеклоFisherbrand12-541-035
Мини-перистальтический насос IIГарвардский аппарат70-2027Для перфузии
Neurolucida 360MBF Biosciencev2022.1.1Программное обеспечение для анализа позвоночника
Neurolucida ExplorerMBF Biosciencev2022.1.1Программное обеспечение для анализа позвоночника
OCT CompoundSakura Finetek4583Для секционирования криостата
Параформальдегид (37%)FisherbrandF79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 Масло DICZeiss440762-9904-000
Лезвие скальпеляFST10022-00
Малые хирургические ножницыFST14060-09
Шпатель FST10091-12
СахарозаFIsherbrandS5-500
Superfrost Plus МикрослайдыДиагностикаES4951+
Vectashield HardSet Монтаж MediumVector LaboratoriesH-1400-10

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Electron microscopy of synaptic contacts on dendrite spines of the cerebral cortex. Nature. 183, 1592-1593 (1959).">Gray, E. G. Electron microscopy of synaptic contacts on dendrite spines of the cerebral cortex. Nature. 183, 1592-1593 (1959).
  2. Sobre la fibras nerviosas de la capa molecular del cerebelo. Rev Trim Histol Norm. 1, 33-49 (1888).">Ramón Y Cajal, S. Sobre la fibras nerviosas de la capa molecular del cerebelo. Rev Trim Histol Norm. 1, 33-49 (1888).
  3. Changes in the numerical density of synaptic contacts with long-term potentiation in the hippocampal dendate gyrus. J Comp Neurol. 253, 466-475 (1986).">Desmond, N. L., Levy, W. Changes in the numerical density of synaptic contacts with long-term potentiation in the hippocampal dendate gyrus. J Comp Neurol. 253, 466-475 (1986).
  4. Dendritic spine chances associated with hippocampal long-term synaptic plasticity. Nature. 399, 66-70 (1999).">Engert, F., Bonhoeffer, T. Dendritic spine chances associated with hippocampal long-term synaptic plasticity. Nature. 399, 66-70 (1999).
  5. Spine expansion and stabilization associated with long-term potentiation. J Neurosci. 28 (22), 5740-5751 (2008).">Yang, Y., Wang, X. B., Frerking, M., Zhou, Q. Spine expansion and stabilization associated with long-term potentiation. J Neurosci. 28 (22), 5740-5751 (2008).
  6. Heterosynaptic structural plasticity on local dendritic segments of hippocampal ca1 neurons. Cell Rep. 10 (2), 162-169 (2015).">Oh, W. C., Parajuli, L. K., Zito, K. Heterosynaptic structural plasticity on local dendritic segments of hippocampal ca1 neurons. Cell Rep. 10 (2), 162-169 (2015).
  7. Persistent synapse loss induced by repetitive ltd in developing rat hippocampal neurons. PLoS One. 5 (4), e10390(2010).">Shinoda, Y., Tanaka, T., Tominaga-Yoshino, K., Ogura, A. Persistent synapse loss induced by repetitive ltd in developing rat hippocampal neurons. PLoS One. 5 (4), e10390(2010).
  8. Neocortical synaptogenesis, aging, and behavior lifespan development in the motor-sensory system of the rat. Exp Neurol. 96 (2), 262-278 (1987).">Markus, E. J., Petit, T. L. Neocortical synaptogenesis, aging, and behavior lifespan development in the motor-sensory system of the rat. Exp Neurol. 96 (2), 262-278 (1987).
  9. Age-related dendritic and spine changes in corticocortically projecting neurons in macaque monkeys. Cereb Cortex. 13 (9), 950-961 (2003).">Duan, H., Wearne, S. L., Rocher, A. B., Macedo, A., Morrison, J. H., Hof, P. R. Age-related dendritic and spine changes in corticocortically projecting neurons in macaque monkeys. Cereb Cortex. 13 (9), 950-961 (2003).
  10. Spatiotemporal dynamics of dendritic spines in the living brain. Front Neuroanat. 8, 28(2014).">Chen, C. C., Lu, J., Zuo, Y. Spatiotemporal dynamics of dendritic spines in the living brain. Front Neuroanat. 8, 28(2014).
  11. Dendritic spine changes associated with normal aging. Neuroscience. 251, 21-32 (2013).">Dickstein, D. L., Weaver, C. M., Luebke, J. I., Hof, P. R. Dendritic spine changes associated with normal aging. Neuroscience. 251, 21-32 (2013).
  12. Dendritic spine pathology in schizophrenia. Neuroscience. 251, 90-107 (2013).">Glausier, J. R., Lewis, D. A. Dendritic spine pathology in schizophrenia. Neuroscience. 251, 90-107 (2013).
  13. Dendritic spine dysgenesis in autism related disorders. Neurosci Lett. 601, 30-40 (2015).">Phillips, M., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in autism related disorders. Neurosci Lett. 601, 30-40 (2015).
  14. Analyzing dendritic spine pathology in alzheimer's disease: Problems and opportunities. Acta Neuropathol. 130 (1), 1-19 (2015).">Dorostkar, M. M., Zou, C., Blazquez-Llorca, L., Herms, J. Analyzing dendritic spine pathology in alzheimer's disease: Problems and opportunities. Acta Neuropathol. 130 (1), 1-19 (2015).
  15. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in parkinson's disease: From homeostasis to maladaptive plasticity. J Neural Transm (Vienna). 125 (3), 431-447 (2018).">Villalba, R. M., Smith, Y. Loss and remodeling of striatal dendritic spines in parkinson's disease: From homeostasis to maladaptive plasticity. J Neural Transm (Vienna). 125 (3), 431-447 (2018).
  16. Fluorescent labeling of dendritic spines in cell cultures with the carbocyanine dye "dii". Front Neuroanat. 8, 30(2014).">Cheng, C., Trzcinski, O., Doering, L. C. Fluorescent labeling of dendritic spines in cell cultures with the carbocyanine dye "dii". Front Neuroanat. 8, 30(2014).
  17. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of gfp. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).">Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of gfp. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  18. Staining neurons with golgi techniques in degenerative diseases of the brain. Neural Regen Res. 10 (5), 693-695 (2015).">Baloyannis, S. J. Staining neurons with golgi techniques in degenerative diseases of the brain. Neural Regen Res. 10 (5), 693-695 (2015).
  19. SpineJ: A software tool for quantitative analysis of nanoscale spine morphology. Methods. 174, 49-55 (2020).">Levet, F., Tonnesen, J., Nagerl, U. V., Sibarita, J. B. SpineJ: A software tool for quantitative analysis of nanoscale spine morphology. Methods. 174, 49-55 (2020).
  20. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. Am J Anat. 127 (4), 321-356 (1970).">Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. Am J Anat. 127 (4), 321-356 (1970).
  21. Chronic 2p-sted imaging reveals high turnover of dendritic spines in the hippocampus in vivo. Elife. 7, e34700(2018).">Pfeiffer, T., et al. Chronic 2p-sted imaging reveals high turnover of dendritic spines in the hippocampus in vivo. Elife. 7, e34700(2018).
  22. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).">Harris, K. M. Structure, development, and plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).
  23. Dendritic spines: Structure, dynamics, and regulation. Nat Rev Neurosci. 2 (12), 880-888 (2001).">Hering, H., Sheng, M. Dendritic spines: Structure, dynamics, and regulation. Nat Rev Neurosci. 2 (12), 880-888 (2001).
  24. Filopodia, spines, and the generation of synaptic diversity. Neuron. 27 (1), 11-14 (2000).">Jontes, J. D., Smith, S. J. Filopodia, spines, and the generation of synaptic diversity. Neuron. 27 (1), 11-14 (2000).
  25. Dendritic spines shape analysis-classification or clusterization? Perspective. Front Synaptic Neurosci. 12, 31(2020).">Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. Dendritic spines shape analysis-classification or clusterization? Perspective. Front Synaptic Neurosci. 12, 31(2020).
  26. Spine dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).">Berry, K. P., Nedivi, E. Spine dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
  27. Automated three-dimensional detection and shape classification of dendritic spines from fluorescence microscopy images. PLoS One. 3 (4), e1997(2008).">Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated three-dimensional detection and shape classification of dendritic spines from fluorescence microscopy images. PLoS One. 3 (4), e1997(2008).
  28. Automated 4D analysis of dendritic spine morphology: Applications to stimulus-induced spine remodeling and pharmacological rescue in disease model. Mol Brain. 4, 38(2011).">Swanger, S. A., Yao, X., Gross, C., Bassell, G. J. Automated 4D analysis of dendritic spine morphology: Applications to stimulus-induced spine remodeling and pharmacological rescue in disease model. Mol Brain. 4, 38(2011).
  29. Quantitative 3-D morphometric analysis of individual dendritic spines. Sci Rep. 8 (1), 3545(2018).">Basu, S., et al. Quantitative 3-D morphometric analysis of individual dendritic spines. Sci Rep. 8 (1), 3545(2018).
  30. Spinetool is an open-source software for analysis of morphology of dendritic spines. Sci Rep. 13 (1), 10561(2023).">Ekaterina, P., Peter, V., Smirnova, D., Vyacheslav, C., Ilya, B. Spinetool is an open-source software for analysis of morphology of dendritic spines. Sci Rep. 13 (1), 10561(2023).
  31. Current best practices for analysis of dendritic spine morphology and number in neurodevelopmental disorder research. ACS Chem Neurosci. 14 (9), 1561-1572 (2023).">Li, B. Z., Sumera, A., Booker, S. A., Mccullagh, E. A. Current best practices for analysis of dendritic spine morphology and number in neurodevelopmental disorder research. ACS Chem Neurosci. 14 (9), 1561-1572 (2023).
  32. Automatic dendritic spine quantification from confocal data with Neurolucida 360. Curr Protoc Neurosci. 77, 1-21 (2016).">Dickstein, D. L., et al. Automatic dendritic spine quantification from confocal data with Neurolucida 360. Curr Protoc Neurosci. 77, 1-21 (2016).
  33. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).">Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).
  34. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Front Neuroanat. 15, 627368(2021).">Parajuli, L. K., Koike, M. Three-dimensional structure of dendritic spines revealed by volume electron microscopy techniques. Front Neuroanat. 15, 627368(2021).
  35. Distance-dependent regulation of NMDAR nanoscale organization along hippocampal neuron dendrites. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24526-24533 (2020).">Ferreira, J. S., et al. Distance-dependent regulation of NMDAR nanoscale organization along hippocampal neuron dendrites. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24526-24533 (2020).
  36. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal ca1 pyramidal cells. Neuroscience. 102 (3), 527-540 (2001).">Megias, M., Emri, Z. s, Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal ca1 pyramidal cells. Neuroscience. 102 (3), 527-540 (2001).
  37. Synapse distribution suggests a two-stage model of dendritic integration in ca1 pyramidal neurons. Neuron. 63 (2), 171-177 (2009).">Katz, Y., et al. Synapse distribution suggests a two-stage model of dendritic integration in ca1 pyramidal neurons. Neuron. 63 (2), 171-177 (2009).
  38. Do thin spines learn to be mushroom spines that remember. Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 381-386 (2007).">Bourne, J., Harris, K. M. Do thin spines learn to be mushroom spines that remember. Curr Opin Neurobiol. 17 (3), 381-386 (2007).
  39. Dendritic spine plasticity: Function and mechanisms. Front Synaptic Neurosci. 12, 36(2020).">Runge, K., Cardoso, C., De Chevigny, A. Dendritic spine plasticity: Function and mechanisms. Front Synaptic Neurosci. 12, 36(2020).
  40. Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses. Nat Neurosci. 17 (5), 678-685 (2014).">Tonnesen, J., Katona, G., Rozsa, B., Nagerl, U. V. Spine neck plasticity regulates compartmentalization of synapses. Nat Neurosci. 17 (5), 678-685 (2014).
  41. Filopodia: Molecular architecture and cellular functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (6), 446-454 (2008).">Mattila, P. K., Lappalainen, P. Filopodia: Molecular architecture and cellular functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (6), 446-454 (2008).
  42. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).">Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Dendritic Spine QuantificationThree Dimensional Neuron ReconstructionDendritic Spine AnalysisSpine DensitySpine Head VolumeSpine Subtype ClassificationSynaptic PlasticityNeurolucida 360Hippocampal DendritesSpine Morphology

Related Articles