Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Модели ран у мышей и приготовление суспензий из отдельных клеток

2.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66499

⸱

27 сентября 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Medical School of Chinese People's Liberation Army, 2Department of Dermatology, Southwest Hospital, Army Medical University, 3Biomedical Treatment Center, the Seventh Medical Center, Chinese PLA General Hospital, 4The 83th Affiliated Hospital, Xinxiang Medical University, 5Department of Dermatology, the Seventh Medical Center, Chinese PLA General Hospital

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании представлены два важнейших экспериментальных метода: построение модели раны мыши для оценки закрытия раны и приготовление суспензий одиночных клеток из кожи мыши для сохранения жизнеспособности клеток.

Аннотация

Лечение острых повреждений кожи полной толщины представляет собой значительную проблему в клинической практике. Сложность заживления ран, включающая в себя различные клеточные популяции и сложное раневое микроокружение, усложняет оценку эффектов лечения и их взаимодействия с использованием традиционных экспериментальных подходов. Технология секвенирования транскриптома одиночных клеток произвела революцию в понимании клеточных функций и механизмов во время заживления ран. Тем не менее, вариативность методологий создания моделей ран у мышей вносит искажающие факторы, которые могут повлиять на экспериментальные результаты. Кроме того, процесс диссоциации тканей кожи мыши представляет собой значительные технические препятствия, что подчеркивает критическую потребность в высококачественных суспензиях одиночных клеток для точного секвенирования транскриптома. Таким образом, данное исследование направлено на оптимизацию построения моделей ран у мышей для точной оценки изменений в закрытии раны при одновременном исключении переменных, которые могут повлиять на последующий результат секвенирования. Кроме того, приготовление суспензий одиночных клеток проводилось с использованием протоколов ферментного препарата и протоколов тест-наборов для оптимизации затрат и эффективности.

Введение

Мышь является широко признанной животной моделью в исследованиях из-за ее очень гомологичной генетической последовательности с человеком, быстрого размножения, экономичности и управляемого размера1. Тем не менее, существуют различия в структуре кожи у мышей и человека. Мыши имеют отчетливый слой кожной оболочки, который способствует сокращению кожи, играя решающую роль в заживлении ран у этого вида. Напротив, заживление ран человека в первую очередь включает в себя повторную эпителизацию и формирование грануляционной ткани1.

Несмотря на эти межвидовые различия в структуре кожи, мышиная модель остается предпочтительным выбором в исследованиях по восстановлению ран и сохраняет значительную важность по сравнению с другими животными моделями2,3. При использовании кожи мыши для имитации процессов заживления ран у человека необходимо тщательно учитывать различные влияющие факторы. Эти факторы включают выбор подходящих мест для хирургических процедур, учет цикла волосяных фолликулов мыши и понимание эффектов сокращения кожной мембраны4,5. Реализация соответствующих мер жизненно важна для оптимизации условий эксперимента и повышения точности результатов наблюдений.

Секвенирование РНК одиночных клеток (scRNA-seq) секвенирует клетки на гораздо более высоком уровне, чем обычное секвенирование РНК, и имеет гораздо более высокие требования к качеству образцов с минимальными внутригрупповыми различиями. Были проведены многочисленные эксперименты для уточнения стабильной модели острого дефекта кожи на всю толщину у мыши. В этих экспериментах использовалась комбинация установленных методов из литературы и инновационных подходов для всесторонней оценки заживления ран2,5. Для разработки модели заживления ран было использовано иссечение кожи мыши на всю толщину, чтобы воспроизвести физиологический процесс заживления и регенерации раны. Его цель состояла в том, чтобы оценить потенциальные изменения, вызванные различными методами лечения с использованием scRNA-seq. Диссоциация кожной ткани у мышей создает проблемы, включая низкую жизнеспособность клеток и высокую скорость агрегации, во время приготовления суспензий одиночных клеток6. Эти трудности могут привести к таким проблемам, как засорение прибора и аномальный захват клеток, что может поставить под угрозу качество данных. Учитывая значительную стоимость секвенирования одиночных клеток, проведение нескольких предварительных экспериментов имеет решающее значение для обеспечения стабильности и надежности суспензии одиночных клеток. В этом исследовании оценивалась эффективность диссоциации смешанных ферментов и метода диссоциации тканевых наборов для определения оптимального подхода к диссоциации тканей6,7. Это исследование закладывает прочную основу для дальнейших углубленных исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры были одобрены Комитетом по этике седьмого медицинского центра Китайской больницы общего профиля НОАК, Китай. Использовались самцы мышей C57/BL6 в возрасте 6 недель.

1. Модель заживления ран мыши

  1. Группировка животных
    1. Случайным образом распределите мышей по экспериментальной и контрольной группам (по 6 в каждой). Домашние мыши в специальном помещении для животных, свободных от патогенов (SPF), с температурой 23-25 °C, влажностью 50%-60% и 12-часовым циклом света и темноты.
    2. Предоставьте мышам неограниченный доступ к стандартному корму и автоклавной воде из-под крана.
  2. Предоперационная подготовка
    1. Аккуратно ограничьте мышь с помощью ограничителя или надежно удерживая мышь в положении лежа. Загрузить шприц 1% пентобарбиталом натрия, восстановленным до комнатной температуры, ввести в дозе 0,1 мл/20 г массы тела.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: 1% раствор пентобарбитала натрия следует хранить в темной среде при температуре 4 °C.
    2. Очистите брюшную полость мыши спиртовыми ватными палочками. Введите шприц под небольшим углом в область живота. Аспирация перед инъекцией для предотвращения случайного введения в мочевой пузырь или кишечник. Подождите 10 минут.
    3. После того, как мышь перестанет дергаться и больше не реагирует на раздражители, нанесите белый вазелин на оба глаза, чтобы предотвратить сухость. Используйте бритву, чтобы подстричь длинную спинную шерсть.
    4. Нанесите крем для депиляции на спину, подождите 2 минуты и аккуратно вытрите влажной марлей, чтобы не повредить кожу мыши. Следите за тем, чтобы крем для депиляции не оставался на нем в течение длительного времени.
    5. Аккуратно продезинфицируйте окружающую кожу тремя чередующимися тампонами бетадина и 70% спирта.
    6. Автоклавные перфораторы для биопсии кожи, ножницы, щипцы и другие инструменты для стерилизации. Поддерживайте стерильность рабочего места. Проводите последующую операцию на свежей хирургической салфетке.
  3. Полнослойное иссечение кожи
    ПРИМЕЧАНИЕ: Модель шины раны была использована для оценки эффективности лечения заживления ран.
    1. С помощью перманентного маркера отметьте верхнюю центральную область тыльной области мыши одним кругом диаметром 8 мм.
    2. Подтяните тыльную сторону кожи с помощью чистых щипцов и сделайте первый разрез с помощью тонких хирургических ножниц. После первого надреза удерживайте частично удаленный участок кожи с помощью щипцов и аккуратно вырежьте отмеченные круги.
    3. Используйте изготовленное по индивидуальному заказу кольцо из нержавеющей стали (внутренний диаметр 15 мм, внешний диаметр 18 мм). Сшить металлическое кольцо по периферии места разреза 5-0 нерассасывающимися нитями, предотвращая сужение кожи места разреза (Рисунок 1A). Используйте нержавеющую сталь в качестве материала кольца, чтобы предотвратить ржавчину и деформацию.
    4. Однократное подкожное введение 0,1 мл 10% разведения гидрохлорида бупренорфина рядом с раной для лечения послеоперационной боли.
    5. Снова установите мышь, чтобы очистить отдельные клетки. Поместите мышь в положение лежа. Не оставляйте мышь без присмотра, пока она не придет в сознание.
    6. Наблюдайте и фотографируйте рану мыши каждые 2 дня, чтобы измерить размер раны после анестезии, как описано в шаге 1.2.
  4. Маркировка штампа раны для получения биопсийной ткани
    1. Подготовьтесь к эксперименту, как описано в шагах 1.1 и 1.2.
    2. Создавайте индивидуальные маркировочные штампы для намотки мыши с диаметром круга 8 мм и длиной квадратной стороны 10 мм (Рисунок 1B).
    3. Расположите мышь в позе лежа и продезинфицируйте спинную сторону кожи спиртовыми ватными палочками. Обмакните штамп в чернила. Сделайте отметку штампом на верхне-средней части спины мыши.
    4. Аккуратно иссеките весь слой кожи спины по круговой отметке с помощью хирургических ножниц, обнажив мышечный слой полностью. Оставьте рану открытой без повязки, чтобы не влиять на состояние раны. Поддерживайте стерильность раны, поместив мышь в чистую и продезинфицированную среду и позволив ране естественным образом образовать струп.
    5. Однократное подкожное введение 0,1 мл 10% разведения гидрохлорида бупренорфина рядом с раной для лечения послеоперационной боли.
    6. Снова установите мышь, чтобы очистить отдельные клетки. Поместите мышь в положение лежа. Не оставляйте мышь без присмотра, пока она не придет в сознание.
    7. Наблюдайте и фотографируйте рану мыши каждые 2 дня, чтобы измерить размер раны после анестезии, как описано в шаге 1.2.
    8. Проводите лечение в соответствии с. 1.4
  5. Назначение лечения
    1. Через 4 ч после того, как мышь придет в сознание, проведите анестезию, как описано в шагах 1.2.2-1.2.3.
    2. Подкожно вводят желаемое лечение, здесь 100 мкг экзосомы, полученной из мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека (hucMSC-Exo), растворяют в 200 мкл PBS вокруг места разреза для группы лечения.
    3. Подкожно ввести 200 мкл PBS вокруг места разреза для контрольной группы.
    4. Повторяйте шаги 1.5.2 и 1.5.3 каждые два дня в течение 14 дней. Осмотрите место инъекции на предмет отека, покраснения или признаков инфекции.

2. Подготовка к секвенированию РНК одиночных клеток

  1. Забор и подготовка тканей
    1. Выполните анестезию, как описано в шагах 1.2.2-1.2.3.
    2. Подтяните спинную поверхность кожи с помощью чистых щипцов и удалите струпья. Отрежьте примерно 2см2 кожи возле раны, обрезая жировую ткань и крупные кровеносные сосуды.
    3. Перенесите биопсию кожи с помощью стерильных щипцов в лунку 6-луночного планшета, заполненного предварительно охлажденными 4 мл PBS.
    4. Промойте PBS путем последовательного переноса биопсии в новые лунки (6-луночный планшет), заполненные 4 мл PBS до тех пор, пока не исчезнет видимая кровь.
    5. Разрежьте кожу скальпелем на кусочки размером примерно 2 мм, далее промойте в DPBS, содержащем 0,04% BSA, и удалите любые загрязнения.
  2. Ферментативная диссоциация (рисунок 2)
    1. Смешайте 1 мл коллагеназы I (10 мг/мл), 1 мл коллагеназы IV (5 мг/мл), 1 мл коллагеназы D + Dispase II (15 мг/мл), 1 мл DNазы I (5 мг/мл) и 6 мл DPBS в стерильной конической пробирке для приготовления раствора для разложения. Тщательно перемешайте компоненты для обеспечения однородности.
    2. Поместите коническую трубку на водяную баню, установленную при температуре 37 °C, на 10 минут, чтобы предварительно нагреть раствор для разложения.
    3. Добавьте 2,5 мл раствора для сбраживания в ткань и варите при 37 °C в течение 70 минут, переворачивая пробирку каждые 10 минут для тщательного перемешивания.
    4. Предварительно смочите сетчатый фильтр 70 мкм с промывочным буфером (0,2% BSA в PBS). Перенесите реакционную смесь, включая диссоциированные клетки и остаточные фрагменты тканей, с помощью наконечника пипетки с широким отверстием объемом 1 мл на сетчатом фильтре.
    5. Отфильтруйте эту смесь через предварительно увлажненное сетчатое фильтр 70 μм в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
    6. Центрифугируйте реакционную смесь с переваренной тканью при температуре 300 x g, комнатной температуры в течение 5 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и оставьте гранулу (клетки) для следующего этапа диссоциации.
  3. Лизис эритроцитов
    1. Разбавьте раствор для лизиса эритроцитов (10x) в соотношении 1:10 с водой двойной дистилляции. Разбавьте клетки 1x раствором для лизиса эритроцитов в соотношении 1:10 в конической пробирке.
      2. Смесь переваривается в
    2. течение 5 с, инкубируется при комнатной температуре в течение 2 мин, а затем центрифугируется при 300 х г в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость, ресуспендируйте клетки в равном объеме DPBS и храните их на льду.
  4. фильтрация
    1. Извлеките клеточную суспензию и отфильтруйте ее через сетчатое фильтр 40 мкм в новую коническую трубку.
    2. Промойте пробирку 2 раза 4,5 мл RPMI (10% FCS), чтобы обеспечить сбор оставшихся клеток.
    3. Приступайте к центрифугированию клеточной суспензии при 300 х г при комнатной температуре в течение 5 минут.
    4. Выбросьте надосадочную жидкость, осторожно взбейте гранулу и повторно суспендируйте клетки с широкопроходными наконечниками в 50 мкл 0,04% BSA PBS. Поддерживайте клетки на льду на протяжении всего этого процесса.
  5. Удаление мертвых клеток
    1. Смешайте 20-кратный стоковый буфер набора для удаления мертвых клеток с водой, не содержащей нуклеаз, в соотношении 1:20, чтобы получить 1-кратный связывающий буфер.
    2. Центрифугируйте образец при давлении 300 x g, удалите надосадочную жидкость и добавьте 10 мкл микрогранул для удаления мертвых клеток на 60 мг образца кожи.
    3. Выдерживать 15 минут при комнатной температуре. Добавляйте стоковый буфер до тех пор, пока он не достигнет 500 μл. Загрузите образец в подготовленную колонку в наборе и прикрепите его к диссоциатору.
    4. Запустите программу-диссоциатор для разделения живых клеток. После завершения программы отфильтровать суспензию через фильтр 30 мкм и разбавить ее равным объемом D-PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если скорость капель заметно замедляется, своевременно замените колонку, чтобы загрязнения не блокировали поры и не влияли на восстановление клеток.
    5. Выполняйте окрашивание Acridine Orange/Propidium Iodide (AO/PI) и подсчет клеток с помощью автоматического счетчика клеток. Используйте следующие критерии приемлемости: жизнеспособность клеток ≥ 85%, скорость агрегации клеток < 20% и отсутствие видимых эритроцитов или фрагментов клеток.
  6. Процедура диссоциации набора для диссоциации нескольких тканей (Альтернатива)
    1. Смешайте 2,5 мл RPMI 1640, 100 мкл фермента D, 50 мкл фермента R и 12,5 мкл фермента A1 в щадящем тюбике MACS C (компоненты из набора Multi Tissue Dissociation Kit).
    2. Перенесите ткань в нежную трубку MACS C, содержащую смесь ферментов, и плотно закройте ее.
    3. Поместите трубку при температуре 37 °C на водяную баню на 90 минут с осторожной инверсией каждые 10 минут, чтобы обеспечить адекватное воздействие диссоциативного раствора на ткани.
    4. Выбросьте раствор для диссоциации и промойте ткани с помощью DPBS.
    5. Одноклеточные суспензии последовательно пропустить через сетчатые фильтры 70 мкм и 40 мкм и центрифугировать при 4 °C в течение 10 мин при 300 x g.
    6. Лизируйте эритроциты с помощью реагента для лизиса эритроцитов, следуя той же процедуре, что и на шаге 2.3.
    7. Удалите мертвые клетки с помощью набора для удаления мертвых клеток, следуя той же процедуре, что и в шаге 2.58.
    8. Выполняйте окрашивание AO/PI и подсчет клеток с помощью автоматического счетчика клеток. Используйте следующие критерии приемлемости: жизнеспособность клеток ≥ 85%, скорость агрегации клеток < 20% и отсутствие видимых эритроцитов или фрагментов клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Были изучены несколько вариантов процедуры. Протоколы с использованием штампа оказались предпочтительными, так как они минимально вмешиваются в процесс заживления ран и сохраняют целостность раны, защищая её от таких воздействий, как расчесывание и наложение швов. Это необходимо для того, чтобы избежать появления шума на уровне отдельных клеток при последующем секвенировании. Создание ран по обеим сторонам тела мыши приводило к заметным различиям в площади ран из-за естественной эластичности кожи мыши (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для успеха протокола было необходимо несколько важных шагов. Эти шаги включали в себя точную подготовку области раны путем тщательного бритья и очистки, создание стандартизированных ран определенного размера и глубины, а также тщательный уход после раны для мониторинга инфекций и проведения соответствующего лечения. Стандартизация этих процедур обеспечила согласованность во всех экспериментальных условиях, тем самым повысив надежность и воспроизводимостьрезультатов10.

Д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование финансировалось Национальным фондом естественных наук Китая (#82373494).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
75% AlcolcholLiuheJIUJING500ML
мышей C57/BL6JCharles River Laboratories
Collagenase D + Dispase IIRoche11088858001
Collagenase IRoche5349907103
Collagenase IVRoche5267439001
ватные палочкиHaishiMIANQIAN
Набор для удаления мертвых клетокMiltenyi Biotec130-090-10
DNase IRoche10104159001
gentleMAC DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235
Медицинская нейлоновая нитьJinlongHM507
Tissue Dissociation Kit 1Miltenyi Biotec130-110-201
Punch игла для биопсииIntegra Miltex
раствор для лизиса эритроцитовMiltenyi Biotec130-094-183
Хирургические ножницыJingluJIANDAO
Белый вазелинShangyuanBAIFANSHILIN
Multi

Ссылки

  1. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).
  2. Wu, J., Landén, N. X. Investigation of skin wound healing using a mouse model. Meth Mol Biol. 2154, 239-247 (2020).
  3. Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. Eur Surg Res. 49 (1), 35-43 (2012).
  4. Dunn, L., et al. Murine model of wound healing. J Vis Exp. (75), e50265(2013).
  5. Ganguli-Indra, G. Protocol for cutaneous wound healing assay in a murine model. Meth Mol Biol. 1210, 151-159 (2014).
  6. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).
  7. Levenberg, S., Ferreira, L. S., Chen-Konak, L., Kraehenbuehl, T. P., Langer, R. Isolation, differentiation and characterization of vascular cells derived from human embryonic stem cells. Nat Protoc. 5 (6), 1115-1126 (2010).
  8. Dead cell removal kit. , Available from: https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_9ndq9pouph0pvf6lmr5osgv41s?content-disposition=inline (2015).
  9. Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., Dipietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair Regen. 23 (6), 874-877 (2015).
  10. Rowland, M. B., Moore, P. E., Bui, C., Correll, R. N. Assessing wound closure in mice using skin-punch biopsy. STAR Protoc. 4 (1), 101989(2023).
  11. Gao, C., Zhang, M., Chen, L. The comparison of two single-cell sequencing platforms: Bd rhapsody and 10x genomics chromium. Curr Genomics. 21 (8), 602-609 (2020).
  12. Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).
  13. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

суспензия одиночных клетокдиссоциация тканейзаживление ранполнослойное повреждениемезенхимальные стволовые клеткивнеклеточные везикулысеквенирование одиночных клетокприготовление ферментапанч-биопсия кожи
Модели ран у мышей и приготовление суспензий из отдельных клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.