Методическая статья

Трехмерные модели клеточных культур для исследования эпителиального барьера при эозинофильном эзофагите

1.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66503

⸱

10 мая 2024 г.

 , 
1Department of Biomedicine, University of Basel, 2Department of Gastroenterology and Hepatology, University Digestive Healthcare Center, Clarunis

В этой статье

Краткое содержание

Здесь представлен протокол культивирования органоидов пищевода человека и культуры границы раздела воздух-жидкость. Культура воздушно-жидкостного интерфейса органоидов пищевода может быть использована для изучения влияния цитокинов на эпителиальный барьер пищевода.

Аннотация

Плоский эпителий пищевода подвергается непосредственному воздействию окружающей среды, постоянно сталкиваясь с чужеродными антигенами, включая пищевые антигены и микробы. Поддержание целостности эпителиального барьера имеет решающее значение для предотвращения инфекций и предотвращения воспаления, вызванного безвредными антигенами пищевого происхождения. В данной статье представлены упрощенные протоколы получения органоидов пищевода человека и культур воздушно-жидкостных границ раздела из биопсии пациента для изучения эпителиального компартмента пищевода в контексте тканевого гомеостаза и заболевания. Эти протоколы стали важными научными вехами за последнее десятилетие, описывая трехмерные органоподобные структуры из первичных клеток, полученных от пациента, органоидов и культур воздушно-жидкостных границ раздела. Они дают возможность исследовать функцию специфических цитокинов, факторов роста и сигнальных путей в эпителии пищевода в трехмерной структуре, сохраняя при этом фенотипические и генетические свойства донора. Органоиды предоставляют информацию о микроархитектуре тканей путем оценки транскриптома и протеома после цитокиновой стимуляции. В отличие от этого, культуры на границе раздела воздух-жидкость позволяют оценить целостность эпителиального барьера с помощью трансэпителиального сопротивления (TEER) или измерения потока макромолекул. Объединение этих органоидов и культур воздушно-жидкостных границ раздела является мощным инструментом для продвижения исследований в условиях нарушенного эпителиального барьера пищевода.

Введение

Воспаление пищевода нарушает целостность эпителиального барьера 1,2,3,4,5, что наблюдается при эозинофильном эзофагите (ЭоЭ), хроническом воспалительном заболевании пищевода с преобладанием Th26. EoE был впервые описан в 1990-х годах как 7,8 и индуцируется преимущественно пищевыми антигенами 9,10,11,12,13. Наиболее часто встречающимися симптомами ЭоЭ у взрослого населения являются дисфагия и пищевая имперация14. У детей ЭоЭ обычно проявляется отставанием в росте, отказом от пищи, рвотой и болью в животе15. Полногеномные ассоциативные исследования (GWAS) выявили гены риска EoE, участвующие в целостности эпителиального барьера, переместив эпителий в центр исследований EoE 16,17,18. Транскриптомика EoE также показала, что нарушение процесса дифференцировки и гиперплазия реактивной базальной зоны вызывают нарушение барьерной функции эпителия пищевода 3,5,19,20,21,22. Раннее понимание того, что ЭоЭ является Th2-опосредованнымзаболеванием6, привело к открытию IL-13 в качестве движущего медиатора, нарушающего целостность эпителия 3,4,21,23. Экспериментальные системы, позволяющие препарировать цитокин-опосредованные эффекты на целостность эпителия от нарушения внутреннего барьера через генетическую предрасположенность, дают возможность изучить сложное взаимодействие между иммунными клетками и эпителием в ЭоЭ. Пищеводные органоиды человека и культуры воздушно-жидкостного интерфейса (ОПЛ) были предложены в качестве ценных инструментов для анализа влияния цитокиновой стимуляции на целостность эпителия5.

Первый протокол для получения взрослых тканеспецифических стволовых клеток (ASC) пищеводных органоидов был разработан через пять лет после первых опубликованных сообщений о кишечных органоидах в 2009 году с использованием кишечных Lgr5+ ASC, повторяющих эпителиальный компартмент тонкой кишки24. ДеВард и др. первыми получили органоиды из эпителиальных клеток пищевода мышей25. В 2018 году Kasagi et al. получили органоиды пищевода человека из иммортализованной клеточной линии плоского эпителия пищевода человека EPC2-hTERT и первичных клеток, полученных от пациента26. В том же году Zhang et al. успешно получили индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), полученные из органоидов пищевода. Они определили значение ингибирования TGFβ и костного морфогенетического белка (BMP) для развития клеток-предшественников пищевода (EPC) и решающую роль передачи сигналов Notch в дифференцировке стратифицированного плоского эпителия26,27. Трисно и его коллеги дополнили эти результаты, определив Sox2 в качестве ингибитора Wnt, который направляет судьбу развития в сторону дифференцировки пищевода. Последующее усовершенствование протоколов, состава среды и условий культивирования увеличило скорость образования органоидов и сделало возможным субкультивирование и восстановление органоидов после криоконсервации 26,29,30,31,32. Несмотря на то, что эти органоиды являются мощными инструментами для изучения архитектуры тканей и экспрессии потенциальных генов-мишеней после стимуляции цитокинами, органоиды пищевода не дают возможности измерить трансэпителиальную резистентность (TEER) или поток макромолекул в качестве прямых измерений целостности барьера. Как ранее было описано Шерриллом и коллегами22, культуры ALI, моделирующие дифференцировкуэпителия4, позволяют напрямую оценить целостность эпителия. Объединение органоидов, полученных от пациента, и культур ALI является мощным инструментом для исследования архитектуры тканей и целостности эпителиального барьера в EoE.

Ниже приведены процедуры с инструкциями по выделению жизнеспособных клеток из биопсии пищевода и созданию органоидов пищевода и культур ОПЛ, которые в дальнейшем могут быть использованы для изучения влияния цитокинов на целостность барьера.

Протокол

Процедуры были одобрены комитетом по этике Северо-Западной и Центральной Швейцарии (EKNZ; Идентификатор проекта 2019-00273). Все пациенты предоставили письменное информированное согласие на экспериментальное использование биопсии до проведения эндоскопического исследования. Реагенты и оборудование, использованные в исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Выделение клеток для органоидов пищевода, полученных от пациента

Примечание: Список составляющих среды для культивирования органоидов пищевода человека приведен в таблице 1.

  1. Получите биопсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании две биопсии из одного сегмента пищевода получены во время эзофагогастродуоденоскопии с использованием биопсийных щипцов с использованием гастроскопа с рабочим каналом 2,8 мм.
  2. Перенос биопсии в коммерчески доступную среду без кератиноцитарной сыворотки (KSFM; Ca2+ 0,09 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Биопсия может храниться на льду в течение нескольких часов до использования.
  3. Замените среду KSFM 1 мл Dispase I (10 Ед/мл) и инкубируйте биопсию в течение 10 минут при комнатной температуре.
  4. Центрифугируйте биопсию при комнатной температуре 300 x g в течение 2 минут.
  5. Аспирируйте диспазу с помощью пипетки объемом 1000 μл, не касаясь биопсии и гранул клеточного мусора.
  6. Промойте биопсию 1 мл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS).
  7. Центрифугируйте биопсию при комнатной температуре 300 x g в течение 2 минут.
  8. Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1000 μл.
  9. Биопсию инкубируют с 500 мкл трипсина-ЭДТА (0,05%) при 37 °C в течение 10 минут, встряхивая при 800 об/мин.
  10. Выполняйте механическое разрушение путем многократного пипетирования вверх и вниз до получения одноклеточной суспензии.
  11. Отфильтруйте ячейки через сетчатый фильтр 70 мкм с помощью резиновой головки поршня туберкулинового шприца.
  12. Промойте ситечко 2-4 мл ингибитора соевого трипсина (250 мкг/мл).
  13. Отфильтруйте клетки через сетчатое фильтр 35 μм с защелкивающейся крышкой на полистирольной трубке объемом 5 мл с круглым дном.
  14. Переложите раствор одиночных клеток в коническую пробирку объемом 15 мл.
  15. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  16. Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1000 μл.
  17. Ресуспендируйте клетки в 100 мкл среды КСФМ.
  18. Смешайте 10 μL трипанового синего с 10 μL клеточной суспензии.
  19. Подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек.

2. Культура органоидов, полученных от пациента

  1. Добавьте 1-2 мл КСФМ в клеточную суспензию после подсчета.
  2. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  3. Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1000 мкл, не повреждая клеточную гранулу.
  4. Ресуспендируйте клеточную гранулу в гидрогелевой матрице экстракта базальной мембраны (BME) (40 μL BME на 20 000 клеток).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления BME держите клетки на льду, чтобы предотвратить преждевременное затвердевание BME.
  5. Отрежьте наконечник пипетки объемом 200 мкл, чтобы аспирировать вязкую смесь суспензии BME-клеток.
  6. Сформируйте капли объемом 40 мкл в предварительно нагретой (37 °C) суспензионной клеточной культуральной тарелке.
  7. Инкубируйте планшет без среды в течение 20-30 минут при 37 °C для обеспечения затвердевания капель BME.
  8. Добавьте предварительно подогретую среду КСФМ-С с добавлением 10 мкМ Y27632 (ингибитор ROCK) в течение первых двух дней посева.
  9. Заменяйте среду на новую среду KSFM-C (без интересующего Y27632 и +/- цитокина) через день.
  10. Отсадите среду и соскребите капли с помощью наконечника пипетки, непрерывно добавляя в лунку 1 мл Dispase II (1,5 Ед/мл).
  11. Перелейте смесь BME-dispase в центрифужную пробирку объемом 15 мл и инкубируйте ее в течение 20 минут при 37 °C на водяной бане для расщепления BME.
  12. Центрифугируйте при 250 x g в течение 3 мин при 4 °C и аспирируйте Dispase II.
  13. Действуйте в соответствии с протоколом интересующего вас считывания (например, выделение РНК, выделение белка или фиксация 4% PFA для гистологии).

3. Выделение клеток для культур воздушно-жидкостного интерфейса пациента (ALI)

  1. Получите биопсию. Во время эзофагогастродуоденоскопии с использованием гастроскопа с рабочим каналом 2,8 мм берутся две биопсии из одного сегмента пищевода с помощью биопсийных щипцов.
  2. Поместите биопсию в коммерчески доступную среду без кератиноцитарной сыворотки (KSFM; Ca2+ 0,09 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE) и хранить на льду в течение нескольких часов до использования.
  3. Замените КСФМ на 1 мл диспазы (10 Ед/мл). После этого инкубируйте биопсию в течение 10 минут при комнатной температуре.
  4. Центрифугируйте биопсию при комнатной температуре 300 x g в течение 2 минут.
  5. Удалите Dispase с помощью пипетки объемом 1000 μл, не касаясь биопсии и гранул клеточного мусора.
  6. Промойте биопсию 1 мл DPBS.
  7. При комнатной температуре биопсию можно замедлить при 300 x g в течение 2 минут.
  8. Отсадите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1000 мкл.
  9. Инкубируйте биопсию в 500 мкл Trypsin-EDTA (0,05%) при 37 °C в течение 10 минут и непрерывно перемешивайте при 800 об/мин во время инкубации.
  10. Механическое прерывание биопсии с помощью повторяющегося пипетирования вверх и вниз до получения суспензии одиночных клеток.
  11. Пропустите диссоциированные клетки через клеточный фильтр 70 мкм с резиновой головкой поршня из туберкулинового шприца и соберите клетки в коническую трубку объемом 50 мл.
  12. Промойте ситечко 2-4 мл ингибитора соевого трипсина (250 мкг/мл), чтобы удалить оставшиеся клетки из ситечка.
  13. Отфильтруйте ячейки с помощью защелкивающегося колпачка из сетчатого фильтра 35 мкм в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл.
  14. Перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл.
  15. Центрифуга при 300 x g при 4 °C в течение 5 минут.
  16. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1 000 мкл.
  17. Ресуспендировать клеточную таблетку в 4 мл среды КСФМ (Ca2+ 0,09 мМ), в том числе 10 мкМ Y27632.
  18. Перенесите клетки в колбу для клеточных культур T25.
  19. Чтобы увеличить первичные кератиноциты, культивируйте клетки до слияния 60%-80% в течение примерно 1 недели.
    Примечание: Пассаж (P)0 образует островковые клеточные конгломераты и не является монослоем. Первичные кератиноциты образуют монослои, начиная с P1.
  20. Пассаж при конфлюенции 60%-80% и повторный посев P1 в 2-3 колбы T25 или 1-2 колбы с клеточными культурами T75.
  21. Пассаж Р1 снова, когда кератиноциты образуют монослой с конфлюенсацией 60%-80%.

4. Культура воздушно-жидкостного интерфейса пациента (ALI)

  1. Посев первичных кератиноцитов P2 на трансвелловые вкладыши для культуры ALI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Засейте 400 000 клеток в 12 луночных вставок (200 000 кератиноцитов на 0,6 см2) в 500 мкл KSFM (Ca2+ 0,09 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE).
    1. Засемените 150 000 клеток в 24 луночные вставки (155 000 кератиноцитов на 0,5 см2) в 100 мкл KSFM (Ca2+ 0,09 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE).
    2. В качестве альтернативы можно заморозить в среде KSFM (Ca2 + 0,09 мМ + 10% ДМСО) при температуре -80 °C в течение 24 часов, а затем перенести замороженные элементы в жидкий азот для последующего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании замороженных флаконов проведите еще раз после размораживания перед использованием клеток для культуры ALI.
  2. Добавьте среду в нижнюю лунку под вставкой транслуночной питательной пластины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для 12-луночных планшетов: 1,5 мл KSFM (Ca2+ 0,09 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE). Для 24-луночных планшетов: 600 мкл KSFM (Ca2+ 0,09 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE).
  3. Замените KSFM со средним и высоким содержанием кальция (Ca2+ 1,8 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE) через 2 дня.
  4. Меняйте среду с высоким содержанием кальция КСФМ через день до 7 дня.
  5. На 7-й день выполните эрлифтинг, отасунув среду из верхней камеры и заменив среду в нижней камере на KSFM с высоким содержанием кальция (Ca2+ 1,8 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE), содержащим 10 нг/мл KGF (=FGF7), 75 мкг/мл аскорбиновой кислоты (АК).
    1. Необязательно: Добавьте в среду интересующий цитокин в желаемой концентрации.
  6. Меняйте носитель каждый второй день до 14 дня.

5. Измерение трансэпителиального электрического сопротивления (TEER)

  1. Простерилизовать электрод измерителя TEER, погрузив его в лунку 24-луночного планшета с 5% гипохлоритом натрия на 10-15 мин.
  2. Смойте 5% гипохлорит натрия, погрузив электрод в 4 последовательные лунки со стерильным ddH,2O и дав электроду высохнуть на воздухе.
  3. Установите заготовку, поместив один электрод в лунку, а второй электрод в транслунную вставку, заполнив ее PBS и измерив TEER.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые объемы для измерений TEER: Для планшета с 12 лунками (1900 μL в лунке и 900 μL во вкладыше). Для 24-луночного планшета (750-1000 μL в лунке и 250 μL во вкладыше).
  4. Замените среду культур ALI стерильной PBS комнатной температуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите среду из нижнего луночного отверстия и, на втором этапе, из вкладыша через колодец. Аналогичным образом добавьте PBS сначала во вкладыш, а затем в нижнюю лунку, чтобы предотвратить отслоение культуры ALI от трансвелловой мембраны.
  5. Поместите электроды счетчика TEER в экспериментальные лунки с культурами ALI и выполните измерение TEER1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте измерения TEER каждые два дня перед сменой среды.

6. Макромолекулярный поток

  1. Разбавить исходный раствор ФИТК-декстрана (3-5 кДа) до рабочей концентрации 1 мг/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда защищайте FITC-Dextran от воздействия света.
  2. Подготовьте ряд для разбавления с уменьшающейся концентрацией FITC (от 1000 мкг/мл до 0,25 мкг/мл) в качестве стандарта для считывания.
  3. Добавьте 500 мкл раствора FITC-декстрана (1 мг/мл) в верхнюю камеру трансвелла и 1,5 мл среды (+/- интересующий цитокин) в нижний отсек и поместите планшет в инкубатор.
  4. Соберите 120 мкл среды из нижнего отсека в соответствующие моменты времени (например, 0 мин, 15 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин, 120 мин, 150 мин и 180 мин).
  5. Пипетка дублирует (50 мкл/лунку) каждого временного момента в черную 96-луночную прозрачную пластину с плоским дном.
  6. Возбуждайте FITC-декстран на длине волны 490 нм и считывайте излучение на длине волны 520 нм с помощью считывателя пластин.
  7. Рассчитайте количество потока высокомолекулярных соединений в соответствии со стандартом.

Результаты

Органоиды пищевода будут расти из первичных клеток, извлеченных из биопсии пациента в соответствии с инструкциями предоставленного протокола, как задокументировано с помощью инвертированного светлопольного микроскопа (Рисунок 1). Эпителиальные ASC начинают образовывать клеточные кластеры самоорганизующимся образом в течение первых двух дней культивирования после посева выделенных клеток в экстракт базальной мембраны, служащий каркасом. Размер и количество клеточных кластеров, заметных с помощью инвертированного светлопольного микроскопа, непрерывно увеличиваются в течение первой недели (рис. 2). Однако на этом этапе в клеточных кластерах отсутствует луковичная структура, характерная для многослойного плоского эпителия пищеводного органоида, полученного из ASC. На 9-й день культивирования становится очевидной луковичная многослойная структура и растущее ороговевшее ядро в центре органоида (рис. 2А). Органоидная культура может сохраняться до 21 дня26. Тем не менее, было продемонстрировано, что органоиды достигают полного созревания и максимального размера между 11 и 14 днями. Начиная с 11-го дня процесс культивирования преимущественно характеризуется прогрессированием кератинизации и снижением метаболически активных, жизнеспособных клеток 5,26. Таким образом, оптимальное время для извлечения органоидов для экспериментов зависит от желаемой стадии дифференцировки и составляет от 5 до 11 дней.

Возможно до 3 пассажей, прежде чем органоиды перестанут расти, потому что увеличение кератинового ядра уменьшает количество жизнеспособных клеток. Органоиды могут быть собраны для выделения РНК или белка в желаемые дни для анализа экспрессии генов/белков или для гистологии и биобанкинга.

Начальные этапы выделения клеток для ALI и органоидной культуры идентичны. Прежде чем культура ALI может быть создана, свежевыделенные первичные клетки должны быть расширены в отличие от органоидного протокола. После второго пассажа первичные кератиноциты засеивают на трансвелловые вкладыши и культивируют в среде с низкой концентрацией кальция для индуцирования образования монослоя и предотвращения преждевременной дифференцировки выделенных первичных кератиноцитов. Через 48 ч, когда образуется сливающийся монослой, концентрация кальция в среде повышается до 1,8 мМ, вызывая дифференцировку и расслоение эпителиального слоя. Через 7 дней апикальная сторона многослойного эпителия подвергается воздействию воздуха, что вызывает кератинизацию. Культуры ALI обычно можно поддерживать до 14 дней (рисунок 2B). Измерения TEER и эксперименты с макромолекулярным потоком будут контролировать функциональность эпителия. Здесь измерения TEER были проведены в культурах ALI из первичных кератиноцитов пищевода, в культурах ALI первичных кератиноцитов с питательным слоем фибробластов NIH/3T3 на дне каждой лунки и в первичных кератиноцитарных культурах ALI с питательным слоем фибробластов NIH/3T3 на каждой вставке (рис. 2C).

figure-results-1
Рисунок 1: Процесс культивирования органоидов пищевода, полученных от пациента. Схема, иллюстрирующая процедуру сбора образцов, выделения клеток, культивирования органоидов и потенциальных экспериментальных применений органоидов пищевода, полученных от пациентов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Формирование и дифференцировка органоидов пищевода, полученных от пациента. (A) Репрезентативные светлопольные изображения органоидов пищевода, культивируемых из первичных клеток, полученных с помощью биопсии пациента. (B) Репрезентативные светлопольные изображения культур пищевода ОПЛ, культивируемых из первичных клеток, полученных с помощью биопсии, на 14-й день. Масштабные линейки: 50μM. (C) Измерения трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) в указанные дни в культурах воздушно-жидкостного интерфейса (ALI) из первичных кератиноцитов пищевода, ALI, культивируемых из первичных кератиноцитов с питательным слоем фибробластов NIH/3T3 на дне каждой лунки, и ALI, культивируемых из первичных кератиноцитов с питающим слоем фибробластов NIH/3T3 на каждой вставке под слоем кератиноцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

ТерпимаяКСФМКСФМ-К
Основная средаКератиноциты-SFMКератиноциты-SFM
ДобавкиПенициллин/стрептомицин1%1%
Экстракт гипофиза крупного рогатого скота (BPE)50 мкг/мл50 мкг/мл
Эпидермальный фактор роста (EGF)1 нг/мл1 нг/мл
Хлорид кальция (CaCl2)0,09 мМ0,6 мМ
Y-27632 (ROCK-ингибитор)-10 μМ

Таблица 1: Первичные клеточные органоидные среды пищевода. Список составляющих среды для культивирования органоидов пищевода человека. SFM: Бессывороточная среда.

Обсуждение

Проводимые процедуры позволяют культивировать органоиды и культуры ОЛ пациентского происхождения с высокими перспективами успеха. Протокол на основе органоидов был взят из первого опубликованного протокола, в котором сообщалось о создании органоидов пищеводачеловека26, и из недавно опубликованногопротокола32. Шерилл и его коллеги описали модельALI 22. Органоиды и модели культур ALI помогают друг другу в изучении влияния цитокинов и других медиаторов на эпителиальный барьер пищевода в контексте заболеваний пищевода, таких как EoE 5,26.

Одним из преимуществ протокола на основе органоидов является его простота в процессе культивирования и составе среды для культивирования клеток. В отличие от других протоколов на основе ASC и PSC, которые в основном требуют добавления нескольких дорогостоящих добавок и факторов роста 24,25,27,28,33, среда KSFM относительно недорога. Для этого требуется только добавление человеческого рекомбинантного эпителиального фактора роста (hEGF) и экстракта гипофиза крупного рогатого скота (BPE). КСФМ является базовой средой, оптимизированной для культивирования кератиноцитов и устраняет необходимость в слое питателя фибробластов34. Необходимо титровать концентрациюCa2+ в КСФМ от 0,09 мМ до 0,6 мМ с использованием CaCl2 для получения среды КСФМ-С, используемой для культивирования органоидов. Для культур ALI требуется более высокая концентрация Ca2+ — 1,8 мМ, чем для органоидной модели. Высокая концентрацияCa2+ имеет важное значение для инициирования дифференцировки кератиноцитов, что впоследствии способствует формированию типичной луковичной конфигурации многослойного плоского эпителия, присутствующего в органоидах пищевода 26,34,35, и стратификации эпителия в культурах ALI22.

Предотвращение преждевременной дифференцировки кератиноцитов, генерации органоидов и культур ALI требует избегания высоких концентрацийCa2+ во время изоляции клеток. Ранняя дифференцировка уменьшает образование колоний и препятствует самоорганизующемуся образованию органоидов и образованию сливающегося монослоя недифференцированных кератиноцитов в качестве основы культур ALI. Использование сывороточных сред для остановки ферментативной активности трипсина во время выделения клеток ухудшает успешное образование органоидов, вызывая преждевременную дифференцировку, аналогично использованию среды, обогащеннойCa2+, во время выделения клеток36. Вместо этого рекомендуется использовать ингибитор трипсина сои или любой другой ингибитор трипсина, не содержащий сыворотки крови, чтобы остановить ферментативную реакцию после биопсийного разложения трипсина. В питательную среду добавляют ингибитор рокиназы (ROCK) Y27632 в течение первых двух дней культивирования для увеличения скорости образования колоний. Ингибирование ROCK оказывает антиапоптотическое действие, предотвращает старение кератиноцитов и, таким образом, улучшает скорость образования органоидов37,38.

Рекомендуется засеять примерно 20 000 клеток в каплю BME объемом 40 мкл для обеспечения процветающей органоидной культуры и от 150 000 до 400 000 клеток для культуры ALI. Адекватное количество посева клеток гарантирует достаточный материал для последующей транскриптомики, протеомики и гистологии. При использовании клеточных линий, таких как эпителиальная клеточная линия пищевода человека EPC2-hTERT, количество посевных клеток может быть уменьшено из-за повышенной скорости образования органоидов, демонстрируемой этой клеточной линией26. Это явление, вероятно, объясняется однородностью и превосходной синхронностью клеточного цикла, демонстрируемой клеточными линиями по сравнению с первичными клетками, полученными с помощью биопсии. Иммортализированная клеточная линия EPC2-hTERT также сохраняет свою пролиферативную способность, обеспечивая бесконечное прохождение органоидов.

И наоборот, человеческие органоиды, полученные из биопсии пищевода, не могут сохраняться для долгосрочного культивирования26,28. Снижение количества делящихся, жизнеспособных клеток в полностью развитых органоидах пищевода и уменьшение скорости образования органоидов с каждым пассажем26 указывает на то, что потеря пролиферативной способности в органоидах, происходящих из первичных клеток, обусловлена терминальной дифференцировкой и кератинизацией клеток-предшественников. Предыдущие попытки сохранить пролиферативную способность путем добавления в культуральную среду Noggin, Wnt3a или A83-01 не увенчались успехом 26,28,32. Следовательно, долгосрочное биобанковирование органоидов пищевода, полученных от пациентов, остается проблемой, которую необходимо решить в будущих исследованиях.

Появление органоидной культуры принесло новые экспериментальные возможности, которые в значительной степени позволили обнаружить ключевые медиаторы воспаления и факторы окружающей среды, ответственные за эпителиальные изменения в EoE 5,39,40,41,42. Тем не менее, важно отметить, что органоиды пищевода, полученные из ASC и PSC, имеют ограничения, поскольку они не полностью повторяют все клеточные компартменты пищевода. Органоиды, полученные из ASC, повторяют эпителиальный компартмент 24,26,27,33, в то время как органоиды, полученные из PSC, повторяют эпителиальный, эндотелиальный и мезенхимальный компартменты 28,43,44. Однако во всех современных моделях органоидов отсутствует иммунологическое микроокружение. В недавнем исследовании органоиды пищевода человека и культуры ALI стимулировались цитокинами из семейства цитокинов IL-20 для расшифровки нового аспекта дисфункции эпителиального барьера в EoE5. Комбинация обеих трехмерных моделей культур оценивала косвенные и прямые измерения целостности эпителиального барьера. В других публикациях, вероятно, будут использоваться пищеводные органоиды в сочетании с культурами ALI для выяснения влияния определенных цитокинов на эпителий. В то время как этот подход снижает сложность перекрестных взаимодействий между иммунной системой и эпителием для выявления функции специфических медиаторов на эпителии, он пренебрегает многими другими потенциально вовлеченными факторами. Сочетание технологии органоидов и органов на чипе может обеспечить решение этой проблемы. Основанная на микрофлюидике технология «орган на чипе» может воспроизводить просветное и базолатеральное микроокружение трубчатых органов, делая возможным вход и отток иммунных клеток и других циркуляторных и просветных компонентов. Это позволяет исследовать взаимодействие между эпителием и иммунными клетками при гомеостазе и заболевании45,46. Успешное культивирование физиологически поляризованных органоидов почечных канальцев, демонстрирующих интактный эпителиальный барьер и функциональный трансэпителиальный транспорт ионов на платформе «орган-на-чипе»47, способствует более широкому использованию технологии органоидов-на-чипе, полученных от пациента. Кроме того, еще один прогресс в использовании технологии «органоид на чипе» продемонстрирован путем расширенного культивирования органоидов, происходящих из первичных клеток, путем реализации просветного потока через микрофлюидные каналы на апикальной стороне трубчатых органоидов для устранения отслаивающихся эпителиальных клеток46. Такие достижения подчеркивают потенциал этой технологии для воспроизведения сред in vivo in vitro.

Возможность культивирования 3D-органоидов, которые напоминают все, начиная от эпителиального компартмента и заканчивая почти полным мини-органом с большинством типов клеток, требует возможного клинического применения 5,26,46. Несмотря на то, что в последние годы был достигнут значительный прогресс, необходимо преодолеть дополнительные препятствия, прежде чем органоиды можно будет использовать в клинической практике. Существенным препятствием для клинической реализации органоидов является присутствие белков животного происхождения в культуральной среде и продуктах ECM. В то время как среды без животного белка для культивирования кератиноцитов уже доступны, а недавно появились варианты KSFM без BPE, производство альтернатив ECM без животного белка с аналогичными свойствами и культуральными результатами традиционных продуктов ECM представляется более сложной задачей. В последнее время сообщалось о потенциально многообещающей полностью химически синтезированной альтернативе48. Тем не менее, в настоящее время не существует коммерчески доступного продукта ECM, не содержащего продуктов животного происхождения.

Пищеводные органоиды и культуры ALI являются жизненно важными инструментами для изучения EoE. Культура органоидов и культур ALI с предоставленными здесь протоколами послужила основой для новых открытий относительно вовлечения эпителиального компартмента при эозинофильном эзофагите 5,26,39,41,42,49,50. Простая реализация этих протоколов и непрерывное развитие технологий трехмерных клеточных культур облегчают экспериментальное приближение к среде in vivo, что приводит к повышению переводимости открытий и, возможно, постепенному сокращению экспериментов на животных.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Грант SNSF 310030_219210 для J.H.N. поддержал публикацию этой рукописи без ограничений. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1250 & микро; L Griptip - ФильтрIntegra4445
300 & L Griptip - фильтрIntegra4435
70 & micro; М-клеточное ситечкоSarstedt83.3945.070
Аскорбиновая кислотаSigma-Aldrich (Merck)A4544
Экстракт гипофиза крупного рогатого скотаGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
Хлорид кальцияSigma-Aldrich (Merck)21115
Многолуночные планшеты для клеточных культур CELLSTAR для суспензионных культурGreiner Bio-One7.657 185
Экстракт базальной мембраны Cultrex (BME), тип 2, PathclearR& D Systems (Bio-Techne)3532-010-02
Диметилсульфоксид (ДМСО), >99,5% BioScience GradeCarl RothA994
Dispase ICorning354235
Dispase IISigma-Aldrich (Merck)D4693
Dulbeccos Phosphate Buffered Salt  (ДПБС)Sigma-Aldrich (Merck)D8537
EVE Автоматический счетчик клетокNanoEntekEVE-MC
EVE EVE Предметное стекло для подсчета клетокNanoEntekEVS-050
Falcon 5 мл Круглое дно Полистирольная пробирка, с клеточным фильтром Защелкивающаяся крышкаFalcon352235
флуоресцина изотиоцианат (FITC)-декстранSigma-Aldrich (Merck)FD4средний молярный вес 3000-5000
Heraeus - Megafuge  40R Thermo Fisher Scientific75004518
человеческий рекомбинантный эпидермальный фактор ростаGibco (Thermo Fischer Scientific)3700015
кератиноцит-SFMGibco (Thermo Fischer Scientific)17005042
пенициллин-стрептомицинGibco (Thermo Fischer Scientific)15140122
рекомбинантный человеческий человеческий KGF/FGF-7 белокR& D Systems (Bio-Techne)251-KG-010/CF
Пробирка с завинчивающейся крышкой, 15 млSarstedt62.554.502
Одноканальная EVOLVE 100-1000 &; Л Одноканальный процессор Integra3018
EVOLVE 20-200 и микро; Л Integra3016
Шприц 1 мл1134950
ThermoMixer CEppendorf5382000015
Ингибитор трипсина из Glycine max (соевые бобы)Sigma-Aldrich (Merck)T9128
Trypsin-EDTASAFC Biosciences (Merck)59418C
Y27632 дигидрохлоридTocris (Bio-Techne)1254

Ссылки

  1. Wu, L., et al. Filaggrin and tight junction proteins are crucial for IL-13-mediated esophageal barrier dysfunction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 315 (3), G341-G350 (2018).
  2. Davis, B. P., et al. Eosinophilic esophagitis-linked calpain 14 is an IL-13-induced protease that mediates esophageal epithelial barrier impairment. JCI Insight. 1 (4), e86355(2016).
  3. Blanchard, C., et al. Coordinate interaction between IL-13 and epithelial differentiation cluster genes in eosinophilic esophagitis. J Immunol. 184 (7), 4033-4041 (2010).
  4. Kc, K., Rothenberg, M. E., Sherrill, J. D. In vitro model for studying esophageal epithelial differentiation and allergic inflammatory responses identifies keratin involvement in eosinophilic esophagitis. PLoS One. 10 (6), e0127755(2015).
  5. Kaymak, T., et al. IL-20 subfamily cytokines impair the oesophageal epithelial barrier by diminishing filaggrin in eosinophilic oesophagitis. Gut. 72 (5), 821-833 (2023).
  6. Straumann, A., Bauer, M., Fischer, B., Blaser, K., Simon, H. U. Idiopathic eosinophilic esophagitis is associated with a T(H)2-type allergic inflammatory response. J Allergy Clin Immunol. 108 (6), 954-961 (2001).
  7. Straumann, A., Spichtin, H. P., Bernoulli, R., Loosli, J., Vogtlin, J. Idiopathic eosinophilic esophagitis: a frequently overlooked disease with typical clinical aspects and discrete endoscopic findings. Schweiz Med Wochenschr. 124 (33), 1419-1429 (1994).
  8. Attwood, S. E., Smyrk, T. C., Demeester, T. R., Jones, J. B. Esophageal eosinophilia with dysphagia. A distinct clinicopathologic syndrome. Dig Dis Sci. 38 (1), 109-116 (1993).
  9. Kelly, K. J., et al. Eosinophilic esophagitis attributed to gastroesophageal reflux: improvement with an amino acid-based formula. Gastroenterology. 109 (5), 1503-1512 (1995).
  10. Fogg, M. I., Ruchelli, E., Spergel, J. M. Pollen and eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 112 (4), 796-797 (2003).
  11. Wolf, W. A., Jerath, M. R., Dellon, E. S. De-novo onset of eosinophilic esophagitis after large volume allergen exposures. J Gastrointestin Liver Dis. 22 (2), 205-208 (2013).
  12. Moawad, F. J., et al. Correlation between eosinophilic oesophagitis and aeroallergens. Aliment Pharmacol Ther. 31 (4), 509-515 (2010).
  13. Woo, W., Aceves, S. S. The role of the allergist in the management of eosinophilic esophagitis. Curr Opin Gastroenterol. 37 (4), 390-396 (2021).
  14. Dellon, E. S., et al. Updated International Consensus diagnostic criteria for eosinophilic esophagitis: Proceedings of the AGREE conference. Gastroenterology. 155 (4), e1010 1022-1033 (2018).
  15. Liacouras, C. A., Spergel, J., Gober, L. M. Eosinophilic esophagitis: Clinical presentation in children. Gastroenterol Clin North Am. 43 (2), 219-229 (2014).
  16. Sleiman, P. M., et al. GWAS identifies four novel eosinophilic esophagitis loci. Nat Commun. 5, 5593(2014).
  17. Kottyan, L. C., et al. Genome-wide association analysis of eosinophilic esophagitis provides insight into the tissue specificity of this allergic disease. Nat Genet. 46 (8), 895-900 (2014).
  18. Kottyan, L. C., et al. Replication and meta-analyses nominate numerous eosinophilic esophagitis risk genes. J Allergy Clin Immunol. 147 (1), 255-266 (2021).
  19. Sherrill, J. D., et al. Analysis and expansion of the eosinophilic esophagitis transcriptome by RNA sequencing. Genes Immun. 15 (6), 361-369 (2014).
  20. Collins, M. H., et al. Newly developed and validated eosinophilic esophagitis histology scoring system and evidence that it outperforms peak eosinophil count for disease diagnosis and monitoring. Dis Esophagus. 30 (3), 1-8 (2017).
  21. Rochman, M., et al. Profound loss of esophageal tissue differentiation in patients with eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 140 (3), 738-749 (2017).
  22. Sherrill, J. D., et al. Desmoglein-1 regulates esophageal epithelial barrier function and immune responses in eosinophilic esophagitis. Mucosal Immunol. 7 (3), 718-729 (2014).
  23. Blanchard, C., et al. IL-13 involvement in eosinophilic esophagitis: transcriptome analysis and reversibility with glucocorticoids. J Allergy Clin Immunol. 120 (6), 1292-1300 (2007).
  24. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  25. DeWard, A. D., Cramer, J., Lagasse, E. Cellular heterogeneity in the mouse esophagus implicates the presence of a nonquiescent epithelial stem cell population. Cell Rep. 9 (2), 701-711 (2014).
  26. Kasagi, Y., et al. The esophageal organoid system reveals functional interplay between Notch and cytokines in reactive epithelial changes. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 5 (3), 333-352 (2018).
  27. Zhang, Y., et al. 3D modeling of esophageal development using human PSC-derived basal progenitors reveals a critical role for notch signaling. Cell Stem Cell. 23 (4), e515 516-529 (2018).
  28. Trisno, S. L., et al. Esophageal organoids from human pluripotent stem cells delineate sox2 functions during esophageal specification. Cell Stem Cell. 23 (4), e507 501-515 (2018).
  29. Kijima, T., et al. Three-dimensional organoids reveal therapy resistance of esophageal and oropharyngeal squamous cell carcinoma cells. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 73-91 (2019).
  30. Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 53 (1), e109(2020).
  31. Zheng, B., et al. A new murine esophageal organoid culture method and organoid-based model of esophageal squamous cell neoplasia. iScience. 24 (12), 103440(2021).
  32. Nakagawa, H., et al. Modeling epithelial homeostasis and reactive epithelial changes in human and murine three-dimensional esophageal organoids. Curr Protoc Stem Cell Biol. 52 (1), e106(2020).
  33. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  34. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. J Invest Dermatol. 81, 1 Suppl 33-40 (1983).
  35. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Gonda, M. A., Saffiotti, U. Mouse epidermal keratinocytes. Clonal proliferation and response to hormones and growth factors in serum-free medium. Exp Cell Res. 155 (1), 64-80 (1984).
  36. Bertolero, F., Kaighn, M. E., Camalier, R. F., Saffiotti, U. Effects of serum and serum-derived factors on growth and differentiation of mouse keratinocytes. In Vitro Cell Dev Biol. 22 (7), 423-428 (1986).
  37. Witkowski, T. A., et al. Y-27632 acts beyond ROCK inhibition to maintain epidermal stem-like cells in culture. J Cell Sci. 136 (17), jcs.260990 (2023).
  38. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
  39. Sasaki, M., et al. Lysyl oxidase regulates epithelial differentiation and barrier integrity in eosinophilic esophagitis. bioRxiv. , (2023).
  40. Doyle, A. D., et al. Detergent exposure induces epithelial barrier dysfunction and eosinophilic inflammation in the esophagus. Allergy. 78 (1), 192-201 (2023).
  41. Hara, T., et al. CD73(+) epithelial progenitor cells that contribute to homeostasis and renewal are depleted in eosinophilic esophagitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1449-1467 (2022).
  42. Kasagi, Y., et al. Fibrostenotic eosinophilic esophagitis might reflect epithelial lysyl oxidase induction by fibroblast-derived TNF-alpha. J Allergy Clin Immunol. 144 (1), 171-182 (2019).
  43. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  44. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  45. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nat Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  46. Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
  47. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nat Biotechnol. 37 (3), 303-313 (2019).
  48. Sorrentino, G., et al. Mechano-modulatory synthetic niches for liver organoid derivation. Nat Commun. 11 (1), 3416(2020).
  49. Azouz, N. P., et al. The antiprotease SPINK7 serves as an inhibitory checkpoint for esophageal epithelial inflammatory responses. Sci Transl Med. 10 (444), 9736(2018).
  50. Azouz, N. P., et al. Functional role of kallikrein 5 and proteinase-activated receptor 2 in eosinophilic esophagitis. Sci Transl Med. 12 (545), 7773(2020).

Перепечатки и разрешения

Теги

MAP
Трехмерные модели клеточных культур для исследования эпителиального барьера при эозинофильном эзофагите
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.