Методическая статья

Z-критерий для оценки овариального резерва у молодых пациенток, находящихся на консервации фертильности

1.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66504

⸱

25 октября 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Obstetrics and Gynecology, Department of Clinical Science, Intervention and Technology, Karolinska Institutet, 2Department of Gynecology and Reproductive Medicine, Karolinska University Hospital, 3Applied Tumor Genomics Research Program, Faculty of Medicine, University of Helsinki, 4Department of Medical and Clinical Genetics, Medicum, Faculty of Medicine, University of Helsinki, 5Children's Hospital, Pediatric Research Centre, University of Helsinki and Helsinki University Hospital, 6NORDFERTIL Research Lab Stockholm, Department of Women's, and Children's Health, Karolinska Institutet, and Karolinska University Hospital, 7Department of Obstetrics and Gynecology, Helsinki University Hospital, University of Helsinki, 8Department of Cell and Molecular Biology, Uppsala University, 9Department of Women's and Children's Health, Uppsala University

В этой статье

Краткое содержание

В настоящем протоколе описан метод оценки овариального резерва у пациенток в возрасте до 25 лет, которым требуется сохранение фертильности путем криоконсервации ткани яичников. Этот метод включает в себя: (1) гистологическую оценку овариального резерва в образцах коры головного мозга, (2) сравнение с референсным набором данных и (3) расчет Z-баллов.

Аннотация

Женщины рождаются с невозобновляемым пулом фолликулов яичников, называемым овариальным резервом. Этот резерв состоит из примордиальных фолликулов в яичниках и может быть подвержен влиянию многих факторов, таких как генетические и эндокринные нарушения, медицинские вмешательства и эндокринные разрушители. Сохранение фертильности рекомендуется при необходимости гонадотоксического лечения. Предпочтительными вариантами для женщин являются криоконсервация ооцитов и эмбрионов. Тем не менее, у очень молодых, сексуально незрелых пациенток криоконсервация ткани яичников является единственным вариантом. Знание плотности фолликулов в криоконсервированных образцах тканей имеет важное значение в консультировании по вопросам фертильности для молодых пациентов. Этот протокол демонстрирует использование Z-показателей плотности кортикальных фолликулов в качестве инструмента для оценки качества ткани яичников у девушек и молодых женщин в возрасте 25 лет и младше, которые проходят процесс сохранения фертильности. Плотность фолликулов в образцах пациентов сравнивается с нормализованными по возрасту эталонными стандартами, разработанными Hassan et al. для оценки возможных отклонений от стандарта. Плотность фолликулов измеряется с помощью гистологической количественной оценки. Для этого небольшой кусочек кортикальной ткани яичников (~2 мм x 2 мм x 2 мм) фиксируют либо в растворе Буэна, либо в растворе формальдегида, погружают в парафин, разрезают на толщину 4 мкм, окрашивают гематоксилином и эозином и оцифровывают с помощью сканера предметных стекол. Фолликулярные стадии, присутствующие в коре головного мозга, варьируются от первичных до первичных фолликулов. Площадь коры головного мозга на гистологических срезах находилась на расстоянии 1 мм от поверхностного эпителия. Плотность фолликулов рассчитывается по модифицированной формуле, представленной Schmidt et al., а Z-оценка определяется с использованием референсного среднего и стандартного отклонения. Z-критерий показывает, насколько измеряемая величина отклоняется от референсного среднего, определяя сниженный (<-1,7 Z-критерий) овариальный резерв. С помощью этого метода плотность фолликулов может быть использована в качестве ценного показателя овариального резерва для молодых пациенток, нуждающихся в сохранении фертильности.

Введение

Яичник – динамичный, эндокринологически активный орган, состоящий из наружной коры и внутреннего мозгового вещества. В яичниках неоднородно распределены фолликулы, которые содержат гонадный ооцит, окруженный клетками стромальной гранулезы1. Все фолликулы формируются уже во время внутриутробного развития, достигая пика примерно на 20 неделе гестационного возраста, за которым следует экспоненциальное снижение. При рождении 1-2 миллиона примордиальных фолликулов остаются в коре головного мозга, и только несколько сотен тысяч фолликулов доживают дополового созревания 2. Нерастущий пул фолликулов, также называемый овариальным резервом, влияет на фертильность женщины, среди других факторов. Овариальный резерв находится в коре головного мозга и перемещается в мозговое вещество по мере роста и созревания фолликулов. Некоторые исследователи признают, что овариальный резерв состоит только из первичных фолликулов, в то время как другие включают все униламинарные фолликулы (т.е. первичные, промежуточные и первичные)3,4,5,6. В течение жизни женщины созревает и выживает только 300-400 фолликулов, чтобы в конечном итоге подвергнуться овуляции. Менопауза начинается, когда количество фолликулов падает примерно до тысячи, что обычно происходит в возрастеоколо 50 лет. В настоящее время продолжаются дебаты относительно наличия оогониальных стволовых клеток (ОСК) в яичниках взрослого человека, которые могут образовывать ооциты после ксенотрансплантации. Некоторые исследования предполагают выделение клеток, которые экспрессируют генный профиль примитивных половых клеток и дифференцируются в ооциты 8,9, в то время как другие указывают на то, что предполагаемые OSC являются периваскулярными клетками кровеносных сосудов 10,11,12.

Преждевременная недостаточность яичников (ПОИ) определяется прекращением менструального цикла с повышением уровня ФСГ в возрасте до 40лет13. Причины POI являются многофакторными и могут возникать идиопатически; Тем не менее, он часто возникает в результате медицинских состояний14. Например, некоторые врожденные генетические заболевания связаны с POI из-за сниженного овариального резерва уже при рождении, такие как синдром Тернера15. POI также может возникать в качестве побочного эффекта гонадотоксичного лечения, что особенно проблематично у очень молодых пациенток, поскольку это может привести к неспособности пройти нормальное половое созревание и резко ухудшить овариальный резерв. В зависимости от риска POI и возраста пациента доступно несколько вариантов сохранения фертильности, таких как криоконсервация зрелых ооцитов, криоконсервация эмбрионов после экстракорпорального оплодотворения и криоконсервация ткани яичников (OTC). Для пациентов препубертатного возраста безрецептурный режим является единственным возможным вариантом из-за их сексуальной незрелости16,17. В Соединенных Штатах сохранение фертильности с помощью безрецептурных препаратов в последнее время считается приемлемой клинической процедурой18. Тем не менее, безрецептурные препараты до сих пор считаются экспериментальными во многих европейских странах, и требуется этическое одобрение, особенно для аутотрансплантации. Поэтому критерии включения в безрецептурные протоколы должны быть тщательно проработаны, а для каждого пациента должен быть проведен анализ риска и пользы. Не все дети, получающие гонадотоксичную терапию, имеют право на сохранение фертильности. В Швеции только пациентам с высоким или очень высоким риском рекомендуется проходить процедуру сохранения фертильности в соответствии с рекомендациями по сохранению фертильности Северного общества детской гематологии и онкологии21. В эту группу входят (1) дети до и после полового созревания, нуждающиеся в трансплантации стволовых клеток или получающие лучевую терапию с яичником в области диапазона, и (2) дети постпубертатного возраста с высокими кумулятивными дозами алкилирующей химиотерапии. Для девочек до менархе критерии включения с очень высоким риском бесплодия включают тех, кто получает любую из следующих доз: дозу облучения яичников >10 Гр или аллогенную или аутологичную терапию гемопоэтическими стволовыми клетками (ТГСК). К критериям исключения относятся те, кто нуждается в дополнительных продуктах крови для других антикоагулянтных препаратов перед операцией или имеет количество нейтрофилов <1. Для девочек/женщин после менархе критерии включения в группу с высоким или очень высоким риском бесплодия включают тех, кто получал любую из следующих доз: доза облучения яичников >10 Гр, или аллогенная ТГСК, циклофосфамид >9 г/м², ифосфамид >60 г/м², прокарбазин или соединения нитрозомочевины (BCNU/CCNU) >360 мг/м². Критерии исключения включают тех, кто имеет повышенный риск кровотечения, повышенный риск инфекции, повышенный риск хирургических осложнений или повышенный риск проблем с болью по оценке лечащего врача.

При безрецептурных препаратах ткань яичников собирают во время операций на брюшной полости с помощью лапаротомии или лапароскопии посредством односторонней овариэктомии или биопсии. Мозговое вещество удаляют из собранной ткани яичника, а оставшуюся кору затем разрезают на более мелкие фрагменты для криоконсервации с помощью контролируемой скорости замораживания или витрификации для последующего использованияпри восстановлении фертильности. Затем образцы хранятся в жидком азоте до тех пор, пока пациентка не оправится от лечения и не захочет создать семью. В зависимости от типа рака и при отсутствии противопоказаний к трансплантации ткани яичника, ткань затем размораживается и аутотрансплантируется для восстановления гормонального фона и функции яичников. Безрецептурные препараты оказались успешными: 50% случаев наступления беременности и более 200 живорождений после пересадки криоконсервированной ткани яичников, собранной во взрослом возрасте, 23,24,25. Зарегистрированных случаев живорождения после аутотрансплантации ткани яичников, собранной в детстве, немного, и ни одного из них не было зарегистрировано после аутотрансплантации, несомненно, препубертатной ткани яичников 26,27,28,29,30. Качество тканей является предпосылкой для успешного восстановления фертильности31. Поэтому важно изучить качество собранных образцов тканей.

В настоящее время одним из способов оценки качества ткани яичников является гистологические срезы и ручной подсчет фолликулов. Однако оценка нормальности плотности фолликулов затруднена из-за естественного снижения резерва с увеличением возраста и неоднородного распределения фолликулов. Кроме того, сравнение с референсными значениями является сложной задачей, поскольку они не стандартизированы по размеру и возрасту биопсии. Другие варианты оценки, такие как уровень АМГ в сыворотке крови или окрашивание переваренной ткани кальцеином или нейтральным красным цветом, либо не очень хорошо известны, либо имеют свои собственные ограничения. Уоллес и Келси ранее опубликовали модель нормального овариального резерва с возрастом, собрав данные о количестве фолликулов из цельных яичников пациенток без известных патологийяичников. Кроме того, поскольку биопсия не является репрезентативной для всего яичника, Schmidt et al. разработали метод оценки общего количества фолликулов на основе биопсии коры головного мозга32. С помощью модифицированной версии этого метода и модели нормального овариального резерва был создан референсный набор данных по плотности фолликулов женщин в возрасте 0-25лет33.

В данной статье описана стратегия оценки нормальности плотности фолликулов на основе небольших образцов яичников путем (1) прямой количественной оценки фолликулов с помощью гистологии и (2) сравнения результатов с нормализованными по возрасту стандартными показателями с помощью Z-показателей. Использование Z-оценок описывает связь плотности фолликулов биопиколов яичников со средним значением стандартизированной референтной группы по возрасту и размеру. Это будет иметь большое значение для врачей при консультировании своих пациентов по поводу аутотрансплантации и дальнейшего лечения после сохранения фертильности.

Протокол

Все проведенные процедуры были одобрены Шведским органом по этическому надзору (пациенты Sveafertil, Dnr: 2019-03802) и Комитетом по этике Университетской больницы Хельсинки (пациенты HCH, Dnr 340/13/03/03/2015). Письменная и устная информация об исследовании была предоставлена медсестрами-исследователями, а также получено информированное согласие в соответствии с Хельсинкской декларацией. Для пациентов младше 18 лет было получено информированное согласие законных опекунов. Все образцы были переведены в анонимную форму и обработаны в соответствии с Европейским общим регламентом по защите данных (GDPR). Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Забор и обработка ткани яичников

ПРИМЕЧАНИЕ: Определите всех пациентов, отвечающих критериям для сохранения фертильности, когда есть показания к высокому или очень высокому риску бесплодия, в соответствии с местными рекомендациями (например, скандинавскими, европейскими или международными специальными рекомендациями). В Европе набирают несовершеннолетних пациентов только в рамках исследовательских программ по сохранению фертильности. Определите риск бесплодия, используя рекомендации вашей страны по сохранению фертильности.

  1. Проведите хирургическое вмешательство под общим наркозом. Введите внутривенно пропофол (2 мг/кг), суфентанил (0,5 мкг/кг) и рокурония бромид (0,6 мг/кг) для индукции анестезии.
    1. Интубируйте и проведите вентиляцию легких пациента с дыхательным объемом 6-8 мл/кг и положительным давлением выдоха 6-8 см отН2О. Подайте севофлуран в 1-2% через эндотрахеальную трубку для поддержания ингаляционной анестезии.
    2. Поддерживайте нервно-мышечную блокаду с помощью рокурония бромида (0,15 мг/кг) во время хирургической процедуры для обеспечения адекватного расслабления мышц и проведения лапароскопии при более низком внутрибрюшном инсуффляционном давлении.
    3. Используйте биспектральный индекс для определения глубины анестетика, чтобы способствовать быстрому пробуждению при уменьшенной дозе анестетика. Противодействовать остаточному нервно-мышечному блоку сугаммадексом (2-4 мг/кг).
  2. Используя трехпортовую технику, введите троакар диаметром 10 мм в брюшную полость в области пупка, чтобы ввести оптическую линзу с прикрепленной камерой, и два троакара диаметром 5 мм в левую и правую подвздошные области (на 2 см выше и на 2 см медиально по отношению к соответствующему переднему верхнему подвздошному отделу позвоночника) под прямым наблюдением для хирургического инструментария и забора тканей. Осмотрите органы малого таза, включая оба яичника, чтобы подтвердить норму.
    1. Определите яичник, к которому легче всего получить доступ, затем возьмитесь за него. Отрежьте объем, который составляет примерно одну треть яичника (или как указано в вашем этическом разрешении), затем при необходимости используйте диатермию для обеспечения гемостаза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите биопсию только в том случае, если нет противопоказаний, таких как факторы риска чрезмерного внутри- или послеоперационного кровотечения или повышенный риск инфекции. Четко укажите и следуйте критериям включения и исключения страны. Весь яичник может быть взят, если риск бесплодия очень высок и/или риск разрезания только части считается слишком высоким (например, из-за кровотечения). Избегайте использования диатермии перед сбором образца, так как это может повредить ткань.
  3. Находясь в операционной, поместите ткань в пробирку, содержащую 5 мл 1 фосфатного буферного раствора Дульбекко (PBS) с CaCl2, MgCl2, 1 г/л D-глюкозы, 36 мг/л пирувата, либо подогретую до 37 °C, если образец немедленно обрабатывается в лаборатории (в течение 30 минут), либо при длительной транспортировке (до 24 часов) при температуре 4 °C.
    Примечание: Решения для транспортировки включают в себя ряд коммерчески доступных решений для транспортировки/перфузии органов, а также простые буферы, такие как PBS и MEM34.
  4. Отрежьте небольшой кусочек ткани яичника (2 мм х 2 мм х 2 мм) от поверхности яичника. Эта часть содержит кору головного мозга, которая является внешней частью яичника, где находятся фолликулы яичников35.
    ВНИМАНИЕ: Обрабатывайте человеческие ткани, такие как яичник, используя методы и процедуры уровня биобезопасности 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Специализированное отделение репродуктивной медицины клинически криоконсервирует остальную ткань яичников для потенциального будущего использования в восстановлении фертильности пациентов.
  5. Поместите салфетку в раствор Буэна с концентрацией 350 мкл при комнатной температуре на 2 ч или в 350 мкл 4% формальдегида при температуре 4 °C на ночь, убедившись, что ткань полностью погружена в воду. После инкубации промойте ткань с 70% этанолом три раза.
    1. Для раствора Буина умывайтесь до исчезновения желтого цвета. Погрузите ткань в парафин36. Вырежьте минимум 30 серийных участков ткани толщиной 4 мкм и поместите их на предметные стекла.
      ВНИМАНИЕ: Обрабатывайте раствор Буэна и формальдегид в химическом колпаке и с надлежащими защитными средствами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Формальдегид может привести к образованию артефактов в ткани, связанных с усадкой. Таким образом, решение Буэна является предпочтительным выбором для сохранения гистологии. Тем не менее, решение Буэна несет в себе дополнительные риски, что приводит к тому, что некоторые учреждения предпочитают использовать формальдегид37.

2. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)

  1. Взвесьте 5 г порошка эозина Y в автоклавный стеклянный флакон объемом 100 мл. Добавьте 800 мл 95% этанола и 200 мл деионизированной воды, чтобы получить 0,5% исходный раствор эозина. Приготовьте рабочий раствор 0,25% эозина, разбавив 200 мл 0,5% стокового раствора эозина 160 мл 100% этанола, 1 мл уксусной кислоты и 40 мл деионизированной воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Порошок должен раствориться не полностью. Отфильтруйте раствор перед использованием, чтобы уменьшить количество осадков.
  2. Разместите горки в стеллажах. Погрузите стеллаж с предметными стеклами в соответствующие емкости в следующем порядке: 15 мин в ксилол, 5 мин в 100% этанол, 10 раз опустить в 70% этанол, 10 раз опустить в 50% этанол, а затем 10 раз опустить в деионизированную воду.
    1. Погрузите стеллаж с предметными стеклами в раствор гематоксилина на 3 мин, затем переложите стеллаж с предметными стеклами в емкость с дистиллированной водопроводной водой на 30 с, чтобы смыть излишки пятна гематоксилином.
    2. Поместите стеллаж со слайдами в емкость с дифференцирующим раствором (1 мл 37% HCl добавлено к 100 мл 70% этанола) на 1 мин, затем переложите стеллаж со слайдами в емкость с дистиллированной водопроводной водой на 30 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что срезы ткани погружены в жидкость. При необходимости добавьте в контейнер еще реагента. Меняйте ксилол через каждые 5 использований при окрашивании больших количеств. Приготовьте 50% этанол путем разбавления 70% этанола (например, добавьте 35 мл 70% этанола к 15 мл DPBS, чтобы получить 50 мл 50% этанола).
      ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с ксилолом в капюшоне и с надлежащими защитными средствами.
  3. Поместите решетку со слайдами в водопроводную воду Скотта (также известную как раствор воронения) на 30-60 с, затем переложите решетку с горками в емкость с дистиллированной водой из-под крана на 30 с. Погрузите штатив со слайдами в рабочий раствор эозина на 1 мин.
    1. Обезвоживайте предметные стекла, поместив их в следующие реагенты: 100% этанол на 30 с, второй контейнер со 100% этанолом на 30 с, а затем дважды опустите в ксилол. После извлечения решетки из раствора ксилола дайте ей высохнуть в стеклянной емкости, чтобы ксилол не капнул внутрь вытяжки.
    2. Закрепите слайд с помощью 2 капель монтажного раствора. Осторожно установите защитные стекла, чтобы избежать образования пузырей и дать монтажному раствору высохнуть.
      ВНИМАНИЕ: Обращайтесь с ксилолом в капюшоне и с надлежащими защитными средствами.
  4. Оцифруйте слайды, по возможности отсканировав их с помощью сканеров слайдов. Если такой вариант недоступен, используйте обычный инвертированный микроскоп с 20-40-кратным увеличением для прямого подсчета фолликулов. Обязательно сделайте снимок всей биопсии, чтобы облегчить измерение площади в программном обеспечении для анализа изображений.

3. Подсчет фолликулов

  1. Если слайды были оцифрованы, откройте файлы с помощью соответствующего программного обеспечения (например, программного обеспечения с открытым исходным кодом QuPath38). Если анализ не оцифрован, выполните его непосредственно с помощью инвертированного микроскопа и соответствующего программного обеспечения.
    1. Перетащите файл в главное окно QuPath. Установите тип изображения на Brightfield H&E (см. рис. 1A). Определите эпителий на расстоянии 1 мм от поверхности (один слой кубовидных клеток, выстилающих поверхность) с помощью масштабной линейки. Нажмите на инструмент «Эллипс» и аннотируйте фолликулы (см. Рисунок 1B).
    2. Подсчитайте количество фолликулов в пределах этой области размером 1 мм, от примордиальной до первичной стадии. Определить стадию каждого фолликула (первичная – слой уплощенных гранулезных клеток, окружающих ооцит; промежуточная стадия – смесь уплощенных и кубовидных гранулезных клеток; первичная – один полный слой кубовидных гранулезных клеток, окружающих ооцит).
    3. Введите идентификатор образца, возраст, количество фолликулов для каждого предметного стекла, толщину среза иn-й срез, подсчитанный в лист с именем Фолликул в мм3 в файле Excel калькулятора Z-оценки фолликулов (см. Дополнительный файл 1 и Рисунок 2A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за диаметра фолликулов (самых маленьких фолликулов >35 мкм) один и тот же фолликул может появляться на последовательных участках. Соблюдайте особую осторожность при подсчете участков, расстояние между которыми меньше диаметра фолликула. Предпочтительно подсчитывать фолликулы из каждого10-го отдела (например, из отдела #10, #20, #30). Поверхностный эпителий может отслаиваться во время обработки тканей и может присутствовать на предметных стеклах лишь частично. Подсчитывают только фолликулы с видимой цитоплазмой. Для контроля качества попросите двух человек независимо друг от друга посчитать фолликулы и определить, насколько хорошо их количество совпадает. Рассчитайте согласованность между наблюдателями с помощью простой корреляционной функции между количеством фолликулов каждого наблюдателя для одного и того же образца.
  2. Определите самые большие 10% фолликулов в каждом подсчитанном участке с помощью глазного яблока. Измерьте средний диаметр этих ооцитов, щелкнув по инструменту «Линия », проведя две перпендикулярные линии через мембрану ооцита и выбрав «Измерить», а затем «Показать измерения аннотации » (см. рисунок 1C).
    1. Запишите измерения в столбце Длина μм (см. Рисунок 1D). Введите средний диаметр всех ооцитов в поле Средний диаметр ооцитов (мкм) для каждого слайда в файле Excel калькулятора Z-оценки фолликулов (Фолликул в мм3, см. Дополнительный файл 1 и Рисунок 2A).
  3. Поместите изображение в центр экрана в QuPath, затем нажмите на значок ImageJ . Выберите Send snapshot to ImageJ (см. рис. 3A). В ImageJ разграничьте границу на расстоянии 1 мм с помощью инструмента «Кисть ». Нажмите на изображение, затем на Type и выберите 8-бит (см. рисунок 3B).
    1. Нажмите на инструмент «Линия », нарисуйте линию на масштабной линейке в левом нижнем углу экрана (см. Рисунок 3C). Нажмите « Анализ», затем «Установить масштаб», введите длину, указанную на масштабной линейке в поле «Известное расстояние», и нажмите « ОК» (см. рисунок 3C). Нажмите на Изображение, затем Настройка, Яркость/Контрастность и выберите Авто (см. Рисунок 3D).
    2. Нажмите на Изображение, затем Настройка, Порог и выберите Авто (см. Рисунок 3E). Кликните по инструменту-палочке , выделите область, затем нажмите Ctrl + M (см. Рисунок 3F). Введите значение площади в файл Excel калькулятора Z-оценки фолликула (фолликул в мм3, см. дополнительный файл 1 и рисунок 2A).

4. Расчет плотности фолликулов, объема коры головного мозга и Z-оценки

  1. Используйте прилагаемый файл Excel калькулятора Z-оценки фолликулов для автоматического выполнения расчетов, описанных ниже. Результаты появятся на листе «Z-score (фолликул на мм³)» в калькуляторе Excel (см. Дополнительный файл 1) при условии, что данные, указанные в разделе 3, будут внесены в лист «фолликулы в мм³».
  2. Для расчета плотности фолликулов в этих срезах используйте модифицированную формулу, представленную Schmidt et al.32. Во-первых, примените поправочный коэффициент α для учета двойного подсчета одного и того же фолликула. Модифицированная формула выглядит следующим образом:
    figure-protocol-1
    figure-protocol-2
    Примечание: В этой формуле t — толщина среза, d — диаметр ооцита, а q — частное от диаметра фолликула, деленное на толщину среза.
  3. Экстраполируйте общее количество фолликулов (n фолликулов) в коре головного мозга из количества фолликулов в срезе по следующей формуле33:
    figure-protocol-3
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта формула также учитывает все невычисляемые разделы. Здесь γ представляет собой количество секций, которые не были рассчитаны (например, γ = 10, если учитывается каждый10-й секция), α — поправочный коэффициент, рассчитанный в 4,1, N — количество подсчитанных секций, а n i — общее количество фолликулов в подсчитанных секциях.
    1. Экстраполируйте весь объем коры головного мозга (V) из подсчитанных областей по следующей формуле33:
      figure-protocol-4
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь Ai — это площадь разреза, а ti — толщина ткани. Пожалуйста, проверьте шаг 4.2 на предмет γ и N.
    2. Используйте следующую формулу33 для расчета плотности фолликулов:
      figure-protocol-5
  4. Определить, есть ли сниженный (<-1,7 Z-score) овариальный резерв, рассчитав Z-показатель по формуле33:
    figure-protocol-6
    ПРИМЕЧАНИЕ: Z-оценка автоматически рассчитывается на листе «Z-оценка (фолликул на мм³)» в калькуляторе Excel (см. Дополнительный файл 1) на основе информации, представленной в разделе 3 (Подсчет фолликулов) (Рисунок 2B). В этой формуле Z представляет Z-оценку, x — расчетную плотность фолликулов (фолликулы/см3) исследуемой выборки (шаг 4.4), M — среднюю плотность фолликулов соответствующей возрастной группы, а SD — стандартное отклонение соответствующей возрастной группы. Референсные значения для женщин в возрасте от 0 до 25 лет были установлены в работе Hassan et al.33. Средние значения и стандартные отклонения плотности фолликулов соответствующих возрастных групп можно найти в файле Excel калькулятора Z-оценки фолликулов (Дополнительный файл 1) и использовать для расчета Z-оценки.

Результаты

Фолликулы яичников количественно оцениваются после успешного разрезания, окрашивания и сканирования предметных стекол. Различаются различные стадии и состояние фолликулов и дополнительно анализируются. На рисунке 4А показан окрашенный HE поперечный срез фиксированного по Буэну яичника взрослого человека с примерами корковой и медуллярной ткани. На рисунке 4В показано репрезентативное изображение яичника ребенка с примером поверхностного эпителия. Овариальный резерв (т.е. нерастущий пул фолликулов) и малые растущие фолликулы находятся в коре головного мозга. С помощью виртуального микроскопа фолликулы увеличиваются и классифицируются, чтобы обеспечить включение только овариального резерва. На рисунке 5 представлены стадии фолликулов, обнаруженных и подсчитанных в формальдегид-фиксированных (рис. 5A) и формальдегид-фиксированных (рис. 5B) тканях коры яичников: (1) примордиальные фолликулы (около 40 мкм в диаметре), (2) промежуточные и (3) первичные. Фолликулы 4-6 являются примерами фолликулов, которые должны быть исключены из подсчета из-за невозможности правильно определить им стадию созревания. На рисунке 6 представлены репрезентативные изображения тканей коры яичников с отсутствием или низким числом фолликулов (рисунок 6A) и тканей яичников со средним или высоким числом фолликулов (рисунок 6B). На рисунке 7 представлены репрезентативные изображения участков ткани, которые должны быть исключены из-за наличия только медуллярной ткани (рисунок 7A) или низкого качества ткани (рисунок 7B). На рисунке 2 показаны скриншоты файла Excel калькулятора Z-оценки Follicula. Вычисленные числа и связанные с ними Z-баллы автоматически вычисляются на основе введенных данных. Z-критерий <1,7 указывает на снижение овариального резерва на основе площади под кривой операционной характеристики приемника (AUC-ROC) у пациентов с синдромом Тернера16.

figure-results-1
Рисунок 1: Скриншоты использования программного обеспечения QuPath. (A) Отображение процесса открытия файла изображения в QuPath и установка типа изображения. (B) Аннотирование фолликулов с помощью инструмента эллипса в программном обеспечении. (К,Г) Измерение среднего диаметра ооцитов на аннотированных изображениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Скриншоты файла калькулятора Z-оценки фолликула Excel. (A) Лист «Фолликулы в мм³» показывает поля, в которые будут введены данные (зеленые клетки) для ID образца, возраста,N-го раздела, конечного количества фолликулов, площади, среднего диаметра ооцита, толщины участка и каждого подсчитанного N-го раздела. Плотность фолликулов (фолликулов/мм³) рассчитывается автоматически при вводе всех необходимых данных; Он остается пустым, если какие-либо данные неполные. (B) Лист "Z-score (Follicles per mm³)" связывает данные ID, age и follicle/mm³ с листа "Follicles in mm³" и автоматически вычисляет Z-score для образца. Соответствующие справочные значения отображаются в таблице справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Скриншоты использования программного обеспечения ImageJ. (A) Перенос изображения из QuPath в ImageJ. (B) Установка типа изображения в ImageJ. (C) Установление шкалы для измерения. (Д,Э) Автоматическая регулировка яркости/контрастности и порога изображения. (F) Измерение площади в пределах скорректированного изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Репрезентативные изображения ткани яичников. (A) Изображение яичника взрослого человека, перенесшего операцию по смене пола. Кора головного мозга, которая имеет более высокую плотность соматических клеток и содержит овариальный резерв, видна вместе с мозговой тканью, которая характеризуется меньшей плотностью и более крупными соматическими клетками и часто содержит больше сосудов. (В) Изображение яичника ребенка, находящегося в процессе сохранения фертильности. Кора определяется путем измерения на расстоянии 1 мм от поверхностного эпителия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Репрезентативные изображения фолликулов в яичниках, зафиксированные различными растворами. (А) фолликулы, зафиксированные раствором Буэна и (Б) 4% формальдегидом на различных стадиях: (1) фолликул первичной стадии, (2) фолликул промежуточной стадии, (3) фолликул первичной стадии. Фолликулы (4) - (6) исключены из-за отсутствия видимой цитоплазмы. К артефактам, распространенным при фиксации формальдегида, относятся отделение базальной мембраны от ткани (обозначено зелеными стрелками) и клетки пикнотической гранулезы (обозначены желтыми точками). Масштабные линейки представляют собой 50 мкм. Этот рисунок адаптирован из Björvang et al.39. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Репрезентативные изображения кортикальной биопсии яичника ребенка. (А) биопсия, показывающая отсутствие или низкое количество фолликулов и (Б) биопсия, показывающая среднее или высокое количество фолликулов. Фолликулы отмечены звездочкой (*). Синей пунктирной линией обозначен эпителий на расстоянии 1 мм от поверхности, а черной линией — поверхностный эпителий. Масштабные линейки представляют собой 500 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-7
Рисунок 7: Репрезентативное изображение участков ткани, которые необходимо исключить. (А) Кусочек яичника, в котором был взят мозговой мозг, а не кора головного мозга. Этот участок характеризуется как мозговое вещество из-за отсутствия поверхностного эпителия и низкой плотности клеток. (В) Участок ткани низкого качества, выявленный по ссадинам в ткани. Масштабные линейки представляют собой 500 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Калькулятор Z-оценки фолликулов. Этот файл облегчает расчет Z-показателей фолликулов. Необходимо ввести данные (идентификатор образца, возраст, количество фолликулов на предметном стекле, толщину среза, количество подсчитанных срезов и площадь) в лист «Фолликулы в мм³». Затем Z-оценка автоматически рассчитывается и суммируется в таблице «Z-оценка (фолликулы на мм³)». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Женщины рождаются с ограниченным пулом ооцитов, который не может быть восполнен. Овариальный резерв является ключевым фактором, определяющим репродуктивный потенциал женщины. В данной статье представлен метод гистологической количественной оценки плотности фолликулов и сравнения его с референсными стандартами с использованием Z-показателей плотности фолликулов коры яичников у молодых пациенток и женщин в возрасте до 25 лет.

В этом протоколе ткань яичников получают от девочек и женщин с высоким или очень высоким риском бесплодия, проходящих безрецептурные препараты для сохранения фертильности, или от пациенток, перенесших операцию по смене пола. Небольшой кусочек ткани яичника используется для оценки криоконсервированного материала. Поскольку овариальный резерв изменяется с возрастом, преобразование плотности фолликулов в Z-показатели позволяет сравнивать с нормированными по возрасту референсными значениями от рождения до половой зрелости (Hassan et al.33). Использование Z-критериев обеспечивает стандартизированный по возрасту, не зависящий от когорты метод оценки нормальности выборки овариального резерва. Устанавливается среднее значение референтной группы на основе возраста, которое затем используется для расчета Z-оценки отдельной выборки. Такой подход позволяет проводить оценку нормальности независимо от возрастного распределения в исследуемой популяции. Стандартизированная по возрасту оценка овариального резерва позволяет объединить данные пациентов с похожим генетическим фоном или воздействием химиотерапии в различных исследуемых популяциях, что облегчает проведение крупномасштабных метаанализов.

У этого метода есть ограничения. Количество фолликулов в тканях яичников у пациенток без известной патологии яичников ограничено. Установленные референтные стандарты основаны на небольшом количестве выборок, особенно при рассмотрении различных возрастных групп, и применимы только к женщинам в возрасте до 25 лет, проходящим безрецептурные препараты. Следовательно, данное средство не применимо к женщинам старше 25 лет. Кроме того, возможно, что небольшой фрагмент корковой ткани может не содержать фолликулов даже у женщин репродуктивного возраста из-за неравномерного распределения фолликулов по всей кореголовного мозга. Кроме того, ориентация ткани в процессе встраивания может затруднить правильную идентификацию коры головного мозга. Биопсия часто бывает очень маленькой, а метод сбора биопсии не стандартизирован, что приводит к возможности получения ткани яичника, которая в основном является медуллярной, что делает ее непригодной для оценки Z-критерия.

Более того, исследования до сих пор не подтвердили использование биопсии яичников для диагностики остаточной фертильности. Важно отметить, что этот метод учитывает только плотность фолликулов, а не здоровье фолликулов. Использование фиксированной формальдегидом ткани, известной тем, что вызывает тканевые артефакты (как показано на рисунке 5B), усложняет определение того, является ли аномальная морфология результатом атрезии фолликулов или процедуры фиксации. Эта проблема может быть решена в будущем с помощью безметочных методов визуализации с высоким разрешением, таких как количественная фазовая микроскопия41 или альтернативные фиксаторы37. Кроме того, весь процесс, от забора биопсии до ручного подсчета фолликулов, является инвазивным, трудоемким и трудоемким, что делает оценку плотности фолликулов с помощью гистологии непрактичной для некоторых групп пациентов.

Кроме того, остается неясным, какие фолликулы предназначены для созревания и как химиотерапия влияет на размер и функциональность овариального резерва. Необходимы дальнейшие исследования с использованием этого метода в более широких масштабах и в течение более длительного периода времени, прежде чем можно будет установить какую-либо корреляцию с успехом трансплантации ткани яичников.

Тем не менее, этот метод имеет значительную ценность как в исследованиях биологии яичников, так и в клиническом консультировании по вопросам фертильности. Использование Z-оценок улучшает интерпретацию овариального резерва человека путем сравнения его с эталонным стандартом. Это способствует всестороннему изучению размера и нормальности овариального резерва в различных группах пациентов и исследуемых популяциях. Например, этот метод может быть использован для оценки связи между овариальным резервом и различными воздействиями, такими как химические вещества окружающей среды или гонадотоксичныеметоды лечения. В некоторых клиниках обычно проводятся небольшие биопсии для гистологической оценки во время подготовки тканей к криоконсервации. В таких случаях этот метод может оказаться полезным для определения нормальности овариального резерва до криоконсервации. Таким образом, плотность фолликулов может быть использована для оценки размера овариального резервана уровне популяции, что делает этот метод ценным инструментом для эпидемиологических исследований, а также консультирования по вопросам фертильности.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить медицинских работников, которые помогли нам с набором участников и сбором тканей, а также всех пациентов, которые пожертвовали свои ткани яичников. Мы также выражаем признательность Фонду борьбы с детским раком (PR2020-0096) и доктору философии Каролинского института, финансирующим KID, чье финансирование сделало эту работу возможной. Мы также хотели бы поблагодарить центр морфологического анализа фенотипов за подготовку гистологических препаратов. Выражаем признательность Николе Байерс за редактирование этой рукописи.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1x Фосфат Дульбекко Буферизованный Термо Фишер14190144
1x Фосфат Буферизованный Физраствор с CaCl<суб>2, MgCl<суб>2, 1 г/л D-глюкозы, 36 мг/л пирувата Thermo Fisher14287-080
37% Соляная кислотаSigma-Aldrich1.09057.1000
70% этанолHistolabs01370.01L
95% этанолFisher Scientific10572143
Абсолютный этанолHistolabs01399.01L
Раствор БуинаSigma-AldrichHT10132-1L
Эозин Y Свободная кислотаSigma-AldrichE4009-5G 
ФормальдегидThermo Fisher28908
раствор гематоксилина по DelafieldSigma-Aldrich03971-250ML
ImageJ
Microsoft Excel
Microtome 
Монтажное решение Pertex Histolabs00840-05
Пропофол БакстерХолдинг Б.В.N01AX10ATC-код указан вместо каталожного номера
QuPathhttps://qupath.github.io/
Rocuronium bromide;B. Braun Melsungen AG M03AC09Атх-код указан вместо каталожного номера
концентрата заменителя водопроводной воды Scott'sSigma-AldrichS5134-6x100ml
SevofluraneBaxter Medical AB N01AB08ATC-код указан вместо каталожного
номера Сканер слайдов 
SufentanilHameln Pharma gmbhN01AH03ATC-код указан вместо каталожного номера
SugammadexBaxter Holding B.V.V03AB35ATC-код указан вместо каталожного номера
SuperFrost plus white;Гистлабс  06400 
Предметные стекла микроскопа SuperFrost Plus WhiteHistolabs  06400 
XyleneSaveen Werner131769.1611

Ссылки

  1. Richards, J. A. S. The ovarian cycle. Vitam Horm. 107, 1-25 (2018).
  2. Wallace, W. H. B., Kelsey, T. W. Human ovarian reserve from conception to the menopause. PLoS One. 5 (1), 1-9 (2010).
  3. Monniaux, D., et al. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: What is the link. Biol Reprod. 90 (4), 1-11 (2014).
  4. Gougeon, A. The early stages of follicular growth in biology and pathology of the oocyte. Trounson, A., Gosden, R., Eichenlaub-Ritter, U. , Cambridge University Press. 50-61 (2013).
  5. Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Ann Endocrinol. 71 (3), 132-143 (2010).
  6. Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. Ovarian primordial and non-growing follicle counts according to the stages of reproductive aging workshop (STRAW) staging system. Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).
  7. Gold, E. B. The timing of the age at which natural menopause occurs. Obstet Gynecol Clin North Am. 38 (3), 425-440 (2011).
  8. Alberico, H., et al. Workflow optimization for identification of female germline or oogonial stem cells in human ovarian cortex using single-cell RNA sequence analysis. Stem Cells. 40, 523-536 (2022).
  9. White, Y. A. R., et al. Oocyte formation by mitotically active germ cells purified from ovaries of reproductive-age women. Nat Med. 18 (3), 413-422 (2012).
  10. Wagner, M., et al. Single-cell analysis of human ovarian cortex identifies distinct cell populations but no oogonial stem cells. Nat Commun. 11, 1147(2020).
  11. Yoshihara, M., et al. In reply: Revisiting claims of the continued absence of functional germline stem cells in adult ovaries. Stem Cells. 41 (2), 205-206 (2023).
  12. Yoshihara, M., et al. The continued absence of functional germline stem cells in adult ovaries. Stem Cells. 41, 105-110 (2023).
  13. Van Kasteren, Y. M., Schoemaker, J. Premature ovarian failure: A systematic review on therapeutic interventions to restore ovarian function and achieve pregnancy. Hum Reprod Update. 5 (5), 483-492 (1999).
  14. McGlacken-Byrne, S. M., Conway, G. S. Premature ovarian insufficiency. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 81, 98-110 (2022).
  15. Viuff, M., Gravholt, C. H. Turner syndrome and fertility. Ann Endocrinol. 83 (4), 244-249 (2022).
  16. Poirot, C., et al. Ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in 418 girls and adolescents up to 15 years of age facing highly gonadotoxic treatment: Twenty years of experience at a single center. Acta Obstet Gynecol Scand. 98 (5), 630-637 (2019).
  17. Jensen, A. K., et al. Cryopreservation of ovarian tissue for fertility preservation in a large cohort of young girls: Focus on pubertal development. Hum Reprod. 32 (1), 154-164 (2017).
  18. The Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Fertility preservation in patients undergoing gonadotoxic therapy or gonadectomy: A committee opinion. Fertil Steril. 112 (6), 1022-1033 (2019).
  19. ART Fact Sheet. , European Society of Human Reproduction and Embryology. https://www.eshre.eu/Press-Room/Resources (2020).
  20. Antonouli, S., et al. A comprehensive review and update on human fertility cryopreservation methods and tools. Front Vet Sci. 10, 1151254(2023).
  21. Nordic Society of Pediatric Hematology and Oncology (NOPHO). , http://www.nopho.net (2013).
  22. Bahroudi, Z., et al. Review of ovarian tissue cryopreservation techniques for fertility preservation. J Gynecol Obstet Hum Reprod. 51 (2), 102290(2022).
  23. Jensen, A. K., et al. 86 successful births and 9 ongoing pregnancies worldwide in women transplanted with frozen-thawed ovarian tissue: Focus on birth and perinatal outcome in 40 of these children. J Assist Reprod Genet. 34 (3), 325-336 (2017).
  24. Donnez, J., Dolmans, M. -M. Fertility preservation in women. N Engl J Med. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  25. Dolmans, M. M., Falcone, T., Patrizio, P. Importance of patient selection to analyze in vitro fertilization outcome with transplanted cryopreserved ovarian tissue. Fertil Steril. 114 (2), 279-280 (2020).
  26. Demeestere, I., et al. Live birth after autograft of ovarian tissue cryopreserved during childhood. Hum Reprod. 30 (9), 2107-2109 (2015).
  27. Ernst, E., Kjærsgaard, M., Birkebæk, N. H., Clausen, N., Andersen, C. Y. Case report: Stimulation of puberty in a girl with chemo- and radiation therapy-induced ovarian failure by transplantation of a small part of her frozen/thawed ovarian tissue. Eur J Cancer. 49 (4), 911-914 (2013).
  28. Rodriguez-Wallberg, K. A., et al. Successful pregnancies after transplantation of ovarian tissue retrieved and cryopreserved at time of childhood acute lymphoblastic leukemia - a case report. Haematologica. 106 (10), 2783-2787 (2021).
  29. Matthews, S. J., Picton, H., Ernst, E., Andersen, C. Y. Successful pregnancy in a woman previously suffering from β-thalassemia following transplantation of ovarian tissue cryopreserved before puberty. Minerva Ginecol. 70 (4), 432-435 (2018).
  30. Kristensen, S. G., et al. Use of cryopreserved ovarian tissue in the Danish fertility preservation cohort. Fertil Steril. 116 (4), 1098-1106 (2021).
  31. Donfack, N. J., et al. Expectations and limitations of ovarian tissue transplantation. Zygote. 25 (4), 391-403 (2017).
  32. Schmidt, K. L. T., Byskov, A. G., Andersen, A. N., Müller, J., Andersen, C. Y. Density and distribution of primordial follicles in single pieces of cortex from 21 patients and in individual pieces of cortex from three entire human ovaries. Hum Reprod. 18 (6), 1158-1164 (2003).
  33. Hassan, J., et al. Reference standards for follicular density in ovarian cortex from birth to sexual maturity. Reprod Biomed Online. 47, 103287(2023).
  34. Vilela, J. deM. V., Dolmans, M. M., Amorim, C. A. Ovarian tissue transportation: A systematic review. Reprod Biomed Online. 42 (2), 351-365 (2021).
  35. Gibson, E., Mahdy, H. Anatomy, abdomen and pelvis, ovary. , StatPearls Publishing. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK545187/ (2023).
  36. Nagaraj, A. S., et al. Establishment and analysis of tumor slice explants as a prerequisite for diagnostic testing. J Vis Exp. (141), e58569(2018).
  37. Adeniran, B. V., Bjarkadottir, B. D., Appeltant, R., Lane, S., Williams, S. A. Improved preservation of ovarian tissue morphology that is compatible with antigen detection using a fixative mixture of formalin and acetic acid. Hum Reprod. 36 (7), 1871-1890 (2021).
  38. Bankhead, P., et al. QuPath: Open-source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 1-7 (2017).
  39. Björvang, R. D., et al. Persistent organic pollutants and the size of ovarian reserve in reproductive-aged women. Environ Int. 155, 106589(2021).
  40. Kwok, R., Johnson, N. P. Ovarian biopsy has no role as a routine diagnostic test of ovarian reserve: A systematic review. Reprod Biomed Online. 24, 492-495 (2012).
  41. Ahmad, A., et al. High-throughput spatial sensitive, quantitative phase microscopy using low spatial and high temporal coherent illumination. Sci Rep. 11 (1), 1-13 (2021).

Перепечатки и разрешения

Теги

Оценка Z-показателякриоконсервация ткани яичниковплотность фолликуловгистологический количественный анализпримордиальные фолликулыкриоконсервация ооцитовкриоконсервация эмбрионовреференс с поправкой на возраст
Z-критерий для оценки овариального резерва у молодых пациенток, находящихся на консервации фертильности
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.