Методическая статья

Характеристика модуляторов рецепторов, активируемых протеазой, с помощью анализа мобилизации кальция с использованием планшетного ридера

DOI:

10.3791/66507

⸱

24 мая 2024 г.

 , 
1Function Therapeutics, 2Department of Chemistry, Marquette University, 3School of Medicine, Washington University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Разработан усовершенствованный протокол анализа мобилизации кальция с эндотелиальными клетками, используемый для идентификации лигандов рецепторов, активируемых протеазой (ФАР). Новый протокол сокращает общее время анализа на 90-120 минут и позволяет получать воспроизводимые кривые «концентрация-реакция».

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изменения концентрации кальция в клетках быстро контролируются с высокой пропускной способностью с использованием внутриклеточных, флуоресцентных, кальций-связывающих красителей и инструментов визуализации, которые могут измерять флуоресцентные выбросы из 1536 лунок одновременно. Тем не менее, эти приборы намного дороже и могут быть сложными в обслуживании по сравнению с широко доступными считывателями пластин, которые сканируют лунки по отдельности. Здесь описан оптимизированный анализ с помощью планшетного ридера для использования с линией эндотелиальных клеток (EA.hy926) для измерения активации протеазно-активируемого рецептора (PAR) передачи сигналов Gαq и последующей мобилизации кальция с использованием кальций-связывающего красителя Fluo-4. Этот анализ был использован для характеристики ряда лигандов PAR, включая аллостерические противовоспалительные лиганды «пармодулин», нацеленные на PAR1, идентифицированные в лаборатории Докендорфа. Этот протокол устраняет необходимость в автоматизированной системе обработки жидкости и позволяет проводить скрининг PAR-лигандов со средней пропускной способностью в 96-луночных планшетах и должен быть применим для изучения других рецепторов, которые инициируют мобилизацию кальция.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рецепторы, активируемые протеазой (PAR)1,2,3 представляют собой подсемейство рецепторов, сопряженных с белком G класса А (GPCR), которые экспрессируются в различных типах клеток, включая тромбоциты и эндотелиальные клетки 4,5,6,7. В отличие от большинства GPCR, PAR обладают уникальным внутримолекулярным режимом активации. Большинство GPCR активируются растворимыми лигандами, взаимодействующими с отчетливым связывающим карманом, но PARs активируются протеолитическим расщеплением N-конца, что приводит к образованию нового связанного лиганда, который может взаимодействовать с доменом внеклеточной петли 2 на поверхности клетки 6,8,9. Это взаимодействие активирует рецептор и может инициировать несколько сигнальных путей, способствуя таким эффектам, как воспаление и активация тромбоцитов 4,10,11,12. Различные протеазы могут активировать PARs путем расщепления в уникальных участках на N-конце, выявляя различные привязанные лиганды (TL), которые стабилизируют конформации рецепторов, инициирующие различные сигнальные пути 9,13,14,15. Например, у наиболее хорошо изученного члена подсемейства, PAR1, расщепление тромбином используется для поддержки многочисленных биологических процессов, включая активацию тромбоцитов и рекрутирование лейкоцитов в эндотелий, но может приводить к вредным эффектам при гиперэкспрессии или гиперактивации рецептора 4,16,17,18,19,20,21 . И наоборот, расщепление активированным протеином С (aPC) может способствовать противовоспалительному эффекту и поддержанию эндотелиальных барьеров 15,22,23,24,25,26,27,28,29. PARs также могут быть активированы пептидными аналогами TLs межмолекулярным образом 13,30,31. Эти пептиды обычно используются для измерения ингибирования (модуляции) PAR вместо протеаз, нацеленных на PAR, и они используются в данном протоколе.

С патологической передачей сигналов PAR1 связаны многочисленные расстройства, в том числе сепсис22,32, сердечно-сосудистые заболевания 33,34,35,36,37,38, заболевания почек 39,40,41,42, серповидноклеточная анемия 43, фиброз44, остеопороз и остеоартрит45,46, нейродегенерация 47,48,49,50,51 и рак 52,53,54,55,56,57,58,59. Антагонисты PAR1 изучаются с 1990-х годов в качестве антитромбоцитарных препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, и растущий список заболеваний, связанных с рецептором, требует идентификации новых лигандов для использования в качестве биологических зондов (инструментальных соединений) или в качестве потенциальных терапевтических средств. В настоящее время существует только один одобренный FDA антагонист PAR1, ворапаксар, который используется для лечения ишемической болезни сердца у пациентов с высоким риском 34,36,37,60. Альтернативный антагонист PAR1, пепдуцин PZ-128, завершил успешное исследование II фазы по предотвращению тромбозау пациентов с катетеризацией сердца. Группа Докендорфа сосредоточилась на медицинской химии и фармакологии отдельного класса малых молекул, лигандов PAR1, известных как пармодулины61,62. В отличие от зарегистрированных антагонистов PAR1, таких как ворапаксар, пармодулины являются аллостерическими, смещенными модуляторами PAR1, которые избирательно блокируют путь Gαq, способствуя цитопротекторным эффектам, подобным aPC. В отличие от мощных ортостерических антагонистов PAR1, таких как ворапаксар, опубликованные пармодулины также являются обратимыми 63,64,65.

Первоначально пармодулины были идентифицированы Флауменхафтом и его коллегами по их способности ингибировать экспрессию Р-селектина или секрецию гранул в тромбоцитах61,66. Тем не менее, потребовался альтернативный метод для изучения влияния пармодулинов на эндотелиальные клетки. Одним из распространенных методов мониторинга сигнализации, связанной с GPCR, является измерение внутриклеточной мобилизацииCa2+, важного вторичного посредника, который может быть измерен с помощью подходящего внутриклеточного кальцийсвязывающего красителя67,68. Были предоставлены существенные доказательства, показывающие, что мобилизация кальция, индуцированная PAR1, происходит за счет активации Gαq 69,70. После активации привязанным лигандом (или подходящим экзогенным лигандом) PAR1 претерпевает конформационное изменение, в результате которого гуанозиндифосфат (GDP), связанный с субъединицей Gαq, заменяется гуанозинтрифосфатом (ГТФ)68. Затем субъединица Gαq активирует фосфолипазу Cβ (PLC-β), которая катализирует гидролиз фосфатидилинозитол 4,5 бисфосфата (PIP2), образуя 1,4,5-инозитолтрифосфат (IP3) и диацилглицерин (DAG). Наконец, IP3 связывается с IP3-чувствительными каналамиCa2+ в мембране эндоплазматического ретикулума, позволяя Ca2+ высвобождаться в цитоплазму, где он может связываться с Ca2+-зависимыми флуоресцентными красителями, такими как Fluo-4, которые добавляются к клеткам71. Этот процесс происходит в течение нескольких секунд и может увеличить концентрацию Ca2+ в 100 раз, что приводит к резкому изменению количества связанного с кальцием красителя и сильного флуоресцентного сигнала.

В 2018 году группа Докендорфа раскрыла анализ мобилизации Ca2+ со средней пропускной способностью, который может быть использован для идентификации антагонистов пути Gαq PAR172. В анализе использовалась EA.hy92673, гибридная линия эндотелиальных клеток человека, которая может быть использована для множественных пассажей без заметного изменения экспрессии PAR1 и предназначена для измерений цитопротекторных эффектов in vitro .

В оригинальном протоколе использовались ячейки EA.hy926 в 96-луночных планшетах и с добавлением красителя Fluo-4/AM, который был выбран из-за его интенсивной флуоресценции на длине волны 488 нм и высокой проницаемости клеток. После загрузки красителя в ячейки выполнялись длительные этапы промывки с помощью автоматизированного 8-канального обработчика жидкости (более быстрые методы обработки жидкости, такие как 96-канальная промывка, были недоступны). Воспроизводимость этого анализа была лучше, чем без тщательной автоматизированной смены среды. Затем антагонисты инкубировали с клетками, PAR1 активировали путем последовательного добавления селективного агониста (16 лунок за раз), а для определения активности измеряли изменения флуоресценции, возникающие в результате мобилизации кальция и связывания красителя.

Хотя этот протокол позволяет измерить PAR1-опосредованную мобилизацию кальция, он ограничен временем, необходимым для анализа каждого 96-луночного планшета. Длительное время экспериментов проблематично не только потому, что количество соединений, которые можно проверять каждый день, ограничено, но и потому, что отток красителя происходит с течением времени, сужая окно анализа за счет увеличения базальной флуоресценции. Одним из факторов, способствующих длительному времени эксперимента, является использование 8-канального манипулятора жидкости для мытья тарелок, что добавляет более 30 минут к каждому эксперименту. Необходимые чаевые также стало трудно получить из-за проблем с цепочкой поставок. Здесь представлен обновленный протокол PAR-опосредованного анализа мобилизации кальция, который не требует работы с жидкостью и, следовательно, может выполняться с более высокой пропускной способностью. Этот протокол также должен быть пригоден для измерения передачи сигналов с другими GPCR, которые приводят к внутриклеточной мобилизации кальция. Этот обновленный протокол считывания планшетов идеально подходит для академических и небольших промышленных лабораторий, которые не располагают ресурсами для дорогостоящих приборов для визуализации клеток, но нуждаются в быстром скрининге многочисленных соединений. Пример анализа мобилизации кальция с использованием планшетного тепловизора см. Caers et al.74.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все обмены/добавления медиа, выполненные на этапах 1 и 2 следующего протокола, выполняются в стерильном колпаке. Если не указано иное, вся пластиковая посуда, используемая в стерильной вытяжке, должна быть приобретена стерилизованной и запечатанной или соответствующим образом стерилизована с помощью автоклава.

1. Инициация клеточной линии EA.hy926

  1. Приобретите элементы EA.hy926.
  2. Храните флакон (флаконы) с ячейками в паровой фазе резервуара с жидким азотом.
  3. Приготовьте готовую среду DMEM, предварительно прогрев DMEM, FBS и шприц-стрептококк (подробнее см. Таблицу материалов ) на водяной бане при температуре 37 °C в течение 15-30 минут. Добавьте 50 мл FBS и 1 мл шприц-ручки/стрептококка к 500 мл DMEM. Аккуратно перемешайте раствор путем инверсии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком энергичное перемешивание приводит к образованию чрезмерного количества пузырьков.
  4. Извлеките один флакон клеток из жидкого азота и прогрейте на водяной бане при температуре 37 °C в течение 5 минут.
  5. Простерилизовать флакон с ячейками и флакон с полной средой DMEM путем распыления спиртом, после чего переместить в стерильный колпак.
  6. С помощью пипетки объемом 1 000 мкл аккуратно перенесите клетки в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл. Добавьте 1 мл DMEM во флакон для промывки и добавьте в пробирку центрифуги.
  7. Сделайте гранулу клеток с помощью центрифуги (150 × г, 5 мин, 22 °C). Удалите среду из центрифужной пробирки путем аспирации; Будьте осторожны, чтобы не потревожить клеточную гранулу.
  8. Добавьте 3 мл полной среды DMEM в центрифужную пробирку и аккуратно разбейте гранулу, перемешивая клеточную суспензию с помощью пипетки объемом 1 000 μл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует избегать образования пузырьков при слишком энергичном перемешивании, так как это может активировать или повредить клетки.
  9. Смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл трипанового синего в микроцентрифужной пробирке с помощью пипетки с наконечниками объемом 20 мкл или 200 мкл. Добавьте 10 мкл клеточной суспензии/трипановой синей смеси в гемоцитометр и подсчитайте клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 0,1-10 мкл наконечниками пипетки может срезать клетки. Наконечники такого размера не следует использовать при работе с клеточной суспензией.
  10. Добавьте полную среду DMEM в клеточную суспензию для получения плотности 66 000 клеток/мл с помощью серологической пипетки объемом 10 или 25 мл. Пипетка 15 мл клеточной суспензии в колбу (колбы) для культур Т-75. Обеспечьте равномерное рассеивание клеточной суспензии, перемещая колбу с севера на юг и с востока на запад.
  11. Инкубируйте клетки до тех пор, пока они не достигнут слияния (обычно через 4-6 дней), что оценивается при исследовании под микроскопом. На этом этапе используйте клетки в эксперименте (начиная с раздела 2) или засейте их в новые колбы для расширения для приготовления замороженных запасов (при рекомендуемой плотности затравки 1 000 000 клеток в 15 мл полной среды на колбу Т-75).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки можно выращивать в колбах с культурами в течение 3 недель без заметной разницы в форме, здоровье или производительности в анализе. Готовый носитель следует менять каждые 3-4 дня.

2. Добавление ячеек EA.hy926 к 96-луночным планшетам

Примечание: Клетки из одной конфлюентной колбы с культурой Т-75 могут быть использованы для приготовления двух или трех планшетов для анализа или опционально расширены до 15 свежих колб Т-75. В обычный рабочий день можно провести скрининг не менее пяти пластин для анализа с использованием протокола, приведенного в разделах 4 и 5. Следующие инструкции описывают подготовку и испытание одной пластины для анализа, но дополнительные пластины могут быть подготовлены путем повторения этапов 2.2, 2.7, 2.12 и 3.2 для подготовки желаемого количества пластин для анализа. Чаще всего в день готовят четыре аналитических планшета для измерения реакции концентрации до 16 соединений, для чего требуются две колбы Т-75 с конфлюентными клетками.

  1. Прогрейте полную среду DMEM на водяной бане 37 °C в течение 15-30 минут. Простерилизуйте флакон с полной средой DMEM, распылив на нее спирт, затем переместите его в стерильную колпак.
  2. Добавьте 100 мкл стерилизованного 0,4% раствора желатина во все лунки черностенной 96-луночной пластины с прозрачным дном и крышкой. Инкубировать планшет с раствором желатина в инкубаторе (37 °C, 5%CO2) в течение 30 минут.
  3. С помощью инвертированного микроскопа подтвердите, что клетки в колбе для культуры Т-75 на 80-100% сливаются. Извлеките рабочую среду DMEM из колбы Т-75 с помощью аспирации.
  4. Промойте ячейки в колбе 10 мл PBS и аккуратно переместите колбу с севера на юг и с востока на запад. Извлеките PBS из колбы с помощью аспирации.
  5. Добавьте в колбу 5 мл раствора для диссоциации клеток и инкубируйте колбу в инкубаторе (37 °C, 5% CO2) в течение ~12 минут. Постучите по колбе через 6 минут, чтобы облегчить диссоциацию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация клеток в течение более 15 минут с использованием указанного агента для диссоциации клеток приводит к тому, что клетки начинают слипаться, что затрудняет получение точного подсчета клеток и может помешать анализу.
  6. Добавьте в колбу 5 мл предварительно подогретой среды DMEM complete и аккуратно перемешайте с раствором для диссоциации клеток/клеточной суспензией. С помощью серологической пипетки объемом 10 мл добавьте клеточную суспензию в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл. Сделайте гранулу клеток с помощью центрифуги (150 × г, 5 мин, 22 °C).
  7. Пока гранула формируется, удалите желатиновый раствор из 96-луночного планшета с помощью аспирации с помощью пипетки Пастера, подключенной к вакууму. Снимите крышку пластины с момента удаления желатина до тех пор, пока раствор не будет готов к нанесению на покрытие.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Опционально можно использовать многоканальную пипетку или стерильный коллектор, подключенный к вакууму.
  8. Удалить среду из центрифужной пробирки путем аспирации с помощью пастеровской пипетки, подключенной к вакуумной или серологической пипетке; Будьте осторожны, чтобы не потревожить клеточную гранулу.
  9. Добавьте свежую среду DMEM complete в центрифужную пробирку с помощью серологической пипетки объемом 5 или 10 мл. Аккуратно разбейте клеточную гранулу, смешав полную среду DMEM с пипеткой объемом 1 000 мкл или серологической пипеткой объемом 5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно используется восемь миллилитров DMEM, но можно добавить и большие объемы, чтобы облегчить подсчет клеток.
  10. Смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл трипанового синего в микроцентрифужной пробирке с помощью пипетки с наконечниками объемом 20 мкл или 200 мкл. Добавьте 10 мкл клеточной суспензии/трипановой синей смеси в гемоцитометр и подсчитайте клетки.
  11. Добавьте полную среду DMEM в клеточную суспензию для получения плотности 600 000 клеток/мл с помощью серологической пипетки объемом 10 или 25 мл. Это даст окончательную плотность 60 000 ячеек/лунку в 96-луночном планшете (определенная как оптимальная плотность в результате экспериментов).
    Примечание: Нормальная успешная клеточная культура дает от 12 000 000 до 15 000 000 клеток, которые могут засеять от двух до трех 96-луночных планшетов.
  12. Перемешайте клеточную суспензию, осторожно перевернув пробирку центрифуги, и добавьте ее в многоканальный резервуар для пипетки объемом 50 мл. Перемешивая суспензию в резервуаре каждые 30 с, осторожно покачивая резервуар из стороны в сторону, добавьте по 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки. Установите на место прозрачную крышку пластины и осторожно встряхните пластину, сдвинув ее по поверхности стерильного капюшона с севера на юг и с востока на запад, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Инкубируйте планшет в инкубаторе (37 °C, 5%CO2) в течение 16-24 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления дополнительных планшетов можно использовать дополнительную клеточную суспензию или повторить шаги 1.10-1.11 для продолжения клеточной линии.

3. Препарат для мобилизационного анализа кальция

  1. Приготовьте реактивы для анализа.
    1. Приготовьте раствор пробенецида (250 мМ, водный), добавив 36 мг пробенецида в микроцентрифужную пробирку и растворив его в 0,6 М NaOH (500 μл). Вихревой раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пробенецид улучшает удержание красителя в клетке за счет ингибирования органических ионных транспортеров 75,76,77.
    2. Чтобы сделать буфер для анализа HBSS-HEPES, добавьте HEPES (1,19 г) во флакон объемом 500 мл HBSS, не содержащего красных Ca/Mg/фенола (из этого получится 10 мМ раствор HEPES). Дополните буфер MgCl2 (1 М водный раствор, 500 μл) и CaCl2 (1 М водный раствор, 500 μл). Смешайте раствор и храните в холодильнике при температуре 5 °C, когда он не используется.
      1. Для каждого 96-луночного планшета добавьте 50 мл буфера для анализа HBSS-HEPES в центрифужную пробирку объемом 50 мл, добавьте 500 мкл раствора пробенецида и хорошо перемешайте. Перед использованием нагрейте буфер до комнатной температуры.
    3. Приготовьте 10% раствор Pluronic F-127 в ДМСО, добавив Pluronic F-127 (20 мг) в микроцентрифужную пробирку или флакон с ВЭЖХ и растворив его 200 мкл ДМСО.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор можно хранить при комнатной температуре, и его хватает примерно на 30 тарелок. Pluronic F-127 очень медленно растворяется при комнатной температуре, и его следует осторожно нагревать, чтобы облегчить растворение.
    4. Приготовьте буфер для загрузки красителя , сначала добавив 24 мкл ДМСО во флакон с Fluo-4/AM (50 мкг) для растворения красителя. В центрифужную пробирку объемом 15 мл, завернутую в фольгу, добавьте 6 мл буфера для анализа HBSS-HEPES и добавьте 6 мкл 10% Pluronic F-127 и 6 мл раствора Fluo-4/AM. Кратковременно перемешайте раствор и дайте постоять при комнатной температуре, вдали от света, в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить фотообесцвечивание Fluo-4, держите краситель вдали от света, обернув алюминиевой фольгой вокруг центрифужной трубки, содержащей раствор красителя, и крышки испытательной пластины.
  2. Подготовьте пробирные пластины.
    1. Извлеките пластину для анализа из инкубатора и подтвердите слияние с помощью инвертированного микроскопа. Вручную извлеките носитель DMEM complete, бросив его в раковину и промокнув верхнюю часть тарелки бумажным полотенцем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда достаточно удаляется, если держать пластину горизонтально и щелкать, а затем вращать пластину на 180° и повторять.
    2. Добавьте буфер для анализа HBSS-HEPES и раствор пробенецида в резервуар для растворителя многоканальной пипетки объемом 50 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор будет использоваться для последующих этапов стирки, его следует отложить в сторону и накрыть алюминиевой фольгой до тех пор, пока он не понадобится.
    3. Добавьте 100 мкл буфера для анализа HBSS-HEPES плюс раствор пробенецида в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки и дайте клеткам посидеть в присутствии пробенецида в течение 5 минут. Извлеките буфер для анализа HBSS-HEPES, щелкнув в раковине таким же образом, как в шаге 3.2.1.
    4. Добавьте буфер для загрузки красителя в отдельный резервуар для многоканального растворителя для пипетки объемом 50 мл. Добавьте 50 мкл буфера для загрузки красителя в каждую лунку пробирного планшета с помощью многоканальной пипетки. Инкубируйте планшет в течение 45 минут (37 °C, 5%CO2).
    5. Пока планшет находится в инкубаторе, приготовьте растворы агониста/антагониста.
      1. Растворы антагонистов хранятся в виде 31,6 мМ растворов в ДМСО. В ПЦР-пробирке разбавьте 2 мкл исходного раствора 38 мкл 0,1% БСА/вода до получения раствора 1,58 мМ. 2 мкл этого раствора дадут конечную концентрацию 31,6 мкМ в анализной пластине. Разбавьте 4 мкл 1,58 мМ раствора антагониста 36 мкл 5% ДМСО/вода (без добавления БСА) и приготовьте оставшиеся концентрации путем последовательного разведения.
      2. Приготовьте 108,3 мкМ (16,7x) раствор TFLLRN-NH2 в буфере для анализа HBSS-HEPES, который даст конечную концентрацию 6,5 мкМ при добавлении 6 мкл в каждую лунку планшета для анализа. Например, растворите 2 мг аликвоты TFLLRN-NH2 с 5,244 мл буфера для анализа HBSS-HEPES с получением 0,5 мМ исходного раствора. Смешайте 1,083 мл этого раствора с 3,917 мл буфера для анализа HBSS-HEPES с получением раствора 108,3 мкм.
        ПРИМЕЧАНИЕ: РАСТВОРЫ TFLLRN-NH2 следует хранить в морозильной камере при температуре -20 °C, когда они не используются.
    6. Извлеките планшет из инкубатора и обеспечьте поглощение красителя с помощью флуоресцентного микроскопа при подходящей настройке (обычно для зеленого флуоресцентного белка см. Рисунок 1 для примера успешной загрузки Fluo-4 в клетки). Снимите буфер загрузки красителя, щелкнув пластиной таким же образом, как в шаге 3.2.1.
    7. Промойте клетки 2 раза 50 мкл буфера для анализа HBSS-HEPES плюс раствор пробенецида (из шага 3.2.3) в каждой лунке (удалите, бросив среду в раковину).
    8. Добавьте 92 мкл буфера для анализа HBSS-HEPES в каждую лунку и снова просмотрите клетки с помощью флуоресцентного микроскопа, чтобы убедиться, что избыток красителя был полностью удален и что клетки остаются адгезивными.
    9. С помощью многоканальной пипетки добавьте 2 мкл растворов антагонистов и носителя в соответствующие лунки (репрезентативную схему планшетов см. в таблице 1 ).

4. Проведение анализа на мобилизацию кальция

  1. Установите считыватель пластин следующим образом: температура: 37 °C; длина волны возбуждения: 485 нм; длина волны излучения: 525 нм; высота измерения: 7,8 мм (оптимизированная); количество вспышек: 100; Количество повторов: 20.
  2. Инкубируйте планшет в течение 15 минут в считывателе планшетов при температуре 37 °C. Измерьте фоновую флуоресценцию в столбцах 1 и 2 (пять сканирований на лунку).
  3. Извлеките планшет из считывателя планшетов и быстро добавьте 6 мкл раствора агониста в каждую лунку в столбцах 1 и 2 из 8-пробирочной ПЦР-полоски с помощью многоканальной пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе мы используем электронный 8-канальный пипетку с наконечниками для дозатора объемом 0,1-10 мкл.
  4. Измерьте изменение флуоресценции по мере того, как в клетках происходит мобилизация кальция. Выполните по 20 сканирований каждой лунки в соответствии с настройками выше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сканирование каждой лунки в две колонки по 20 раз каждая занимает примерно 5 минут (т.е. ~15 секунд между сканированием каждой лунки).
  5. Повторите шаги 4.2-4.4 для столбцов 3-12 с шагом в два столбца.

5. Анализ данных

  1. Экспортируйте данные из анализа в виде отдельных электронных таблиц для каждой группы из двух столбцов.
  2. Найдите среднее значение базальных показаний флуоресценции с помощью функции AVG (первое сканирование: последнее сканирование). Проделайте это для каждой лунки в обеих колоннах.
  3. Найдите максимальную флуоресценцию после добавления агониста с помощью функции MAX(first scan: last scan).
  4. Рассчитайте изменение флуоресценции путем вычитания базальной флуоресценции из максимальной флуоресценции.
  5. Вычтите изменение флуоресценции, рассчитанное для отрицательного контроля (добавление автомобиля без агониста) из каждой лунки в той же колонке.
  6. Найти относительное (нормированное) изменение флуоресценции путем деления изменения флуоресценции в каждой лунке на изменение флуоресценции в носителе (0,1% ДМСО/вода) + 6,5 мкМ tfllrn-NH2 лунки.
  7. Скопируйте неконтролируемые значения в процентах в программу для статистики и построения графиков. Если вы используете указанное программное обеспечение, выберите опцию таблицы XY, выбрав Numbers в качестве оси X, и повторите значения в параллельных подстолбцах в качестве оси Y.
  8. Используйте программу для построения кривых «концентрация-реакция» (CRC) на основе данных. Если вы используете указанное программное обеспечение, выберите опцию log(inhibitor) vs. response - Variable slope (четыре параметра).

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Цель этого анализа, как правило, состоит в том, чтобы получить кривые «концентрация-реакция» (CRC) для трех-четырех новых пармодулинов. На каждой пластине для анализа часто создается дополнительный CRC для известного соединения, такого как NRD-21, который выступает в качестве проверки качества эксперимента из-за его известного IC50. Для создания CRC необходимо спланировать карту пластин, подобную той, что изображена в таблице 1 . Если вместо этого требуется одноточечная реакция на концентрацию, то соединения с конечными концентрациями 10 мкМ (или другими предпочтительными концентрациями) должны быть добавлены по меньшей мере в три лунки.

При выполнении анализа должно наблюдаться быстрое увеличение флуоресценции (увеличение должно начаться в течение первых 3-4 сканирований), отображаемое считывателем планшетов (см. Рисунок 2A для примера вывода по сравнению с неудачным выводом на Рисунке 2B). Важно отметить, что агонист должен быть добавлен быстро (в течение 15 секунд), чтобы считыватель планшетов мог точно фиксировать увеличение флуоресценции. В рабочем эксперименте сигнал флуоресценции в лунке транспортного средства должен оставаться ровным, в то время как сигнал флуоресценции в положительных контрольных лунках (носитель + 6,5 мкМ TFLLRN-NH2) должен начать увеличиваться после трех или четырех сканирований. Как только будет достигнуто максимальное значение (после ~10 сканирований), сигнал флуоресценции должен начать медленно уменьшаться. В экспериментах с высокоэффективными антагонистами лунки с самыми высокими концентрациями антагонистов должны иметь сигнал, который остается относительно ровным, подобным отрицательному контролю. Также должна быть небольшая разница между сигналом положительных контрольных лунок и лунок с низкими концентрациями антагониста (рис. 2В). Если самые низкие концентрации антагониста все еще препятствуют мобилизации кальция, отсортированные концентрации должны быть скорректированы с учетом более низких концентраций. Сгенерированные CRC должны иметь хотя бы одну точку данных ~100%, чтобы полностью показать сигмоидальную природу кривой.

Наиболее распространенным признаком того, что эксперимент не удался, является то, что положительная контрольная скважина (носитель + 6,5 мкМ TFLLRN-NH2) не показывает значительного увеличения флуоресценции (рис. 2B). Это может произойти по разным причинам: количество клеток может быть низким (если слияние не было подтверждено), раствор агониста может быть нарушен или недостаточное количество красителя могло быть поглощено клетками. Также можно ошибочно не добавлять агонист в определенные лунки.

При использовании запрограммированного метода данные выводятся в виде шести отдельных электронных таблиц, каждая из которых содержит данные для двух столбцов. Пять сканирований базальной флуоресценции находятся в отдельном ряду, а 20 сканирований, сделанных после добавления агониста, находятся в строке непосредственно ниже (репрезентативные выходные данные см. на рисунке 3 ). В качестве примера расчета будет использован столбец из эксперимента с использованием NRD-21. В экспортированном файле (рис. 3) базальная флуоресценция из каждой лунки выводится в столбцы от C до G, а данные после добавления агониста (следующие 20 сканирований) выводятся в столбцы от C до V в следующей строке. Строки 14-17 в файле содержат положительный контроль двух отдельных столбцов. Среднее значение базального ряда для одной из положительных контрольных лунок было рассчитано с помощью команды "=AVERAGE(C16:G16)", что дало значение 1 039,8. Эта команда повторялась для дополнительных базальных измерений в каждой скважине. Максимальное количество экспериментальных сканирований было рассчитано с помощью команды "=MAX(C16:V16)", которая дала значение 2,629. Опять же, команда была повторена для всех скважин. Затем базальная флуоресценция для каждой лунки была вычтена из максимального значения. В этом эксперименте данные были нормализованы путем вычитания изменения флуоресценции в отрицательном контроле из каждой лунки (которое составило 142,6 в столбце примера). Затем эти значения делили на аналогично рассчитанное значение положительного контроля. В этом столбце максимальное значение было 2 629, среднее базальное измерение — 1 039,8, а вычитаемое значение для бланка — 142,6. Таким образом, скорректированное положительное контрольное значение составляет 1 446,6 (рассчитано по уравнению). Это уравнение повторяется для каждой скважины в столбце, и рассчитанные значения делятся на 1 446,6, чтобы получить их относительное изменение флуоресценции. Затем коэффициенты были преобразованы в проценты и скопированы в аналитическое программное обеспечение. Этот процесс был повторен для остальных 11 столбцов.

Для обработки данных с помощью указанного программного обеспечения необходимо выбрать таблицу XY с возможностью трех повторных измерений в параллельных столбцах. Значения -log каждой концентрации должны быть введены в x-значения, а рассчитанные проценты добавлены к y-значениям. На основе данных должен быть проведен нелинейный регрессионный анализ, в результате которого будут построены четыре кривые «концентрация-реакция». Программа также выводит значения IC50 , количественную статистику ошибок и статистику качества соответствия.

figure-results-1
Рисунок 1: Fluo-4/AM загружен в ячейки EA.hy926. Fluo-4 селективно загружается в клетки EA.hy926 после инкубации красителя и этапов промывки. Вся флуоресценция находится внутри клеток, без утечки красителя. Изображение получено с использованием настройки GTP на камере EVOS и 20-кратным увеличением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Потенциальный результат анализа. (A) Репрезентативный выход рабочего анализа с помощью считывателя планшетов. Ряд А является отрицательным контролем и не имеет изменений флуоресценции. Строка B является положительным контролем и показывает быстрое увеличение флуоресценции. Ряды C-H являются экспериментальными лунками, с более высокими концентрациями пармодулина в пластине. (B) Пример результатов неудачного эксперимента. В строке В, которая является положительным контролем, не наблюдается увеличения флуоресценции. (C) Изменение флуоресценции с течением времени, вызванное агонистом PAR1 TFLLRN-NH2. Сканирование двух колонок 96-луночного планшета с использованием предоставленных настроек занимает ~5 мин. на считывателе планшетов PerkinElmer EnSpire (т.е. ~15 с интервалом между сканированиями каждой лунки). Различные решения NRD-21 соответствуют указаниям, «Агонист» составляет 6,5 мкМ TFLLRN-NH2, n = 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Пример вывода Excel для рабочего анализа. Базальная флуоресценция выводится в четные строки, начиная со строки 10, а результат первых 10 сканирований после добавления агониста отображается в последующих нечетных строках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Роботизированная работа с жидкостями в сравнении с «перелистыванием». Предварительное покрытие пробирных пластин желатином и ручная замена сред путем перелистывания пластины и промокания ее насухо дает кривые концентрация-реакция с меньшей вариабельностью. (A) Кривые концентрация-реакция пармодулинов ML161 и NRD-21 и 5 мкМ TFLLRN-NH2, n = 3 (автоматизированная работа с жидкостями). (B) Кривые концентрация-реакция пармодулинов ML161 и NRD-21 и 5 мкМ TFLLRN-NH2, n = 3 (покрытые желатином, флоатированные пластины). Данные являются средними ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-5
Рисунок 5: Температурные исследования. Проведение анализа при температуре 37 °C дает больше воспроизводимых данных, чем при комнатной температуре. (A) Кривые "концентрация-реакция" ML161 и 5 мкМ TFLLRN-NH2, n = 3 (комнатная температура). (B) Кривые "концентрация-реакция" ML161 и 5 мкМ TFLLRN-NH2, n = 3 (37 °C). Данные являются средними ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-6
Рисунок 6: Исследования плотности клеток. Оптимальная плотность клеток составляет 60 000 клеток/лунку при посеве за 16-24 ч до начала анализа. (A) Кривые концентрация-реакция TFLLRN-NH2 при различной плотности клеток, n = 3. (B) Кривая концентрация-реакция TFLLRN-NH2 при оптимальной плотности клеток 60 000 клеток/лунку. Данные являются средними ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-7
Рисунок 7: Объем анализа. Использование объема анализа 100 мкл позволяет получить более воспроизводимые кривые концентрация-реакция, чем анализы с использованием конечного объема 200 мкл. (A) Кривые концентрация-реакция ML161 и 5 мкМ TFLLRN-NH2, n = 3 (200 мкл конечного объема). (B) Кривые "концентрация-реакция" ML161 и 5 мкМ TFLLRN-NH2, n = 3 (100 мкл конечного объема). Данные являются средними ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-8
Рисунок 8: Генерация Z'-факторов для определения способности анализа обнаруживать пораженное соединение. Реакции на мобилизацию кальция с помощью 6,5 мкМ tfllrn-NH2 (колонка B) плюс необязательные антагонисты PAR1 10 μM NRD-21 (колонка C) или 0,316 μM ворапаксар (колонка D). (A) Анализ завершен через 16 ч после посева клеток. (B) Анализ завершен через 24 ч после посева клеток. (В) Таблица рассчитанных Z'-факторов с использованием следующего уравнения: figure-results-9, гдеσ p — стандартное отклонение положительного контроля, σn — стандартное отклонение для отрицательного контроля или пробы, μp — среднее положительного контроля, μn — среднее значение отрицательного контроля или пробы. Каждая величина рассчитывается путем обозначения носителя + 6,5 мкМ TFLLRN-NH2 в качестве положительного контроля и сравнения с указанным условием в качестве отрицательного контроля (транспортное средство) или образца (NRD-21 и ворапаксар). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-10
Рисунок 9: Мобилизация кальция из агониста PAR2 . Изменение флуоресценции с течением времени, вызванное 10 мкМ SLIGKV-NH2, n = 4. Данные являются средними ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Пример карты 96-луночных планшетов для скрининга соединений. Каждая концентрация измеряется в трех экземплярах. Строка А содержит отрицательный контроль (без антагониста; без агониста), а строка Б содержит позитивный контроль (без антагониста; агонист). Колонки с 1 по 3 содержат шесть полулогарифмических концентраций пармодулина NRD-21, которые могут быть необязательно использованы для контроля качества. PM-A, PM-B, PM-C являются безымянными пармодулинами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Сравнение ранее опубликованного протокола и нового, оптимизированного протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В то время как ранее описанный протокол72 был в целом надежным и позволил нам идентифицировать новый пармодулин свинца, NRD-21,62 был желателен более эффективный протокол. Анализ был еще больше затруднен во время нехватки поставок, вызванной пандемией COVID-19. Приобретение наконечников для автоматизированного устройства обработки жидкостей стало затруднительным, а попытки промыть, стерилизовать и повторно использовать наконечники приводили к образованию CRC со значительными отклонениями. Это способствовало проведению срочной серии экспериментов, направленных на оптимизацию улучшенного анализа мобилизации кальция, управляемого PAR.

Основным приоритетом в данном исследовании было определение действенной альтернативы использованию автоматизированного манипулятора жидкостей для этапов мойки. Во время предыдущей разработки анализа использование роботизированного манипулятора для обработки жидкостей сократило количество ошибок, вызванных ручной заменой среды. Тем не менее, это значительно увеличило время анализа, так как обмен средами с 8-канальным обработчиком жидкости увеличивал общее время каждой пробирной пластины на 30-45 минут. Несмотря на то, что ранее был опробован метод обмена средами с «перелистыванием», эти эксперименты проводились без покрытия пластин желатином перед посевом клеток. Благодаря предварительной обработке пластин желатином клетки оставались на месте независимо от силы, затрачиваемой на ручное удаление среды. КРР, полученные в ходе анализа с использованием пластин с желатиновым покрытием, имели лучшие показатели пригодности и меньшие погрешности в нескольких точках данных, чем кривые, на которых использовался автоматизированный обработчик жидкостей (рис. 4). Среднеквадратичные значения погрешности (RMSE) для пластины с использованием автоматического обработчика жидкостей составили 9,687 для кривой ML161 и 10,690 для кривой NRD-21, тогда как среднеквадратичные значения для пластины с использованием желатина и ручной замены среды составили 7,658 для кривой ML161 и 6,408 для кривой NRD-21. Более низкие значения RMSE указывают на кривую, которая лучше соответствует заданным данным. Это изменение также значительно сокращает общее время анализа. В качестве альтернативы можно использовать многоканальную автоматическую мойку пластин.

Метод присоединения агонистов был дополнительным фактором, который был изучен. Это было сделано для того, чтобы определить, можно ли добавить агонист во все лунки планшета одновременно с последующим сканированием всего планшета сразу; Это избавило бы исследователей от необходимости оставаться рядом со считывателем планшетов в течение всего чувствительного ко времени анализа для многочисленных отдельных добавлений агонистов, что могло бы значительно увеличить пропускную способность. К сожалению, добавление агониста во все лунки и сканирование всей пластины было проблематичным, потому что реакция слишком быстра, чтобы надежно измерить максимальную концентрацию кальция в каждой скважине, что дает очень вариабельные CRC. Уменьшение количества сканируемых колонок с 12 до 6 немного улучшило результаты, но наилучшие результаты были получены при сканировании только двух колонок (16 лунок) за один раз. Можно предположить, что снижение температуры анализа с 37 °C до комнатной температуры может замедлить изменение концентрации кальция настолько, чтобы обеспечить надежные измерения. Несмотря на то, что при комнатной температуре78,79 были валидированы протоколы мобилизации кальция с различными красителями или клеточными линиями, в этом конкретном анализе улучшенные результаты наблюдаются при 37 °C. Измеренные кривые концентрация-реакция антагонистов при комнатной температуре (~23°C) не были такими равномерными, как при 37°C (Рисунок 5A по сравнению с Рисунок 5B). На основании этих результатов было определено, что сканирование двух колонок одновременно при температуре 37 °C является оптимальным.

Еще одной переменной, которая была тщательно изучена для сокращения времени анализа, было время инкубации антагонистов. В предыдущем протоколе антагонисты инкубировались в течение 40 мин до присоединения агонистов, но здесь было определено, что 15 мин является достаточным временем для взаимодействия пармодулинов с PAR1. Это было проверено путем одновременного добавления растворов пармодулина в несколько колонок с последующим добавлением агониста в разные моменты времени (агонист добавлялся при t = 15 мин, 30 мин и 45 мин). Активность пармодулинов сохранялась, но не улучшалась за счет более длительной инкубации антагонистов. В результате этого открытия в новом протоколе растворы антагонистов добавляются во всю пластину за один раз, а растворы агонистов добавляются в первые колонки после инкубации в течение 15 минут. Это изменение еще больше сокращает общее время эксперимента на 30 минут. Следует отметить, что антагонисты с медленной кинетикой связывания, такие как ворапаксар, могут требовать более длительного времени инкубации80,81.

В то время как сокращение времени анализа и устранение зависимости от обработчика жидкости были основными факторами, требующими обновления протокола анализа, также был протестирован альтернативный метод культивирования клеток. Раньше пластины засевали ячейками непосредственно из замороженных запасов и давали расти в них в течение 40-48 ч после посева. Тем не менее, увеличенное время между посевными пластинами и проведением анализов ограничивало количество экспериментов, которые можно было проводить каждую неделю. Использование клеток, выращенных в культуральных колбах, резко сокращает это время. Клетки выращивали в колбах Т-75, обработанных тканевой культурой, и удаляли с поверхности колбы с помощью неферментативного агента для диссоциации клеток. Это может быть важно для того, чтобы избежать повреждения трипсином определенных рецепторов клеточной поверхности, в частности PAR2. После добавления в пластину для анализа клеткам требуется достаточное время, чтобы осесть и прилипнуть к желатину. Поскольку метод удаления среды с помощью фликинга также может привести к смещению клеток, требуется достаточно времени, чтобы позволить клеткам внедриться в желатин. Эксперимент, в котором клеткам удалось отстояться в течение двух часов, привел к значительной потере клеток, что привело к непригодному для использования анализу (данные не показаны). Время отстаивания от 2 до 12 часов ограничивает количество планшетов, которые могут быть проанализированы за один день, поэтому предпочтительна более длительная ночная инкубация. Было обнаружено, что инкубация вновь культивируемых клеток в период от 16 до 24 часов позволила клеткам полностью прилипнуть к желатину, что позволило получить воспроизводимые данные.

Переход от замороженных к культуральным клеткам, выращенным в колбе, также изменил оптимальную плотность посева клеток. Как и ожидалось, посев лунок с плотностью 25 000 клеток/лунок, которая была стандартной в предыдущем протоколе, не позволил клеткам достичь слияния с более коротким временем инкубации. Агонистические CRC были сгенерированы с восемью отдельными плотностями клеток для определения оптимальных условий (рис. 6). Ранее TFLLRN-NH2 использовали в качестве агониста PAR1 при 5 мкМ, так как это позволяло разумно противостоять пармодулинам с более низкой растворимостью. Существенной разницы в фоновом или максимальном сигнале при затравке 45 000-65 000 клеток/скважина не наблюдается, но при добавлении 60 000 клеток/лунка наблюдается снижение вариабельности. Интересно, что при большем количестве клеток не наблюдается значительного увеличения максимальной флуоресценции, поэтому в качестве оптимальной плотности было выбрано 60 000 клеток/лунка из-за снижения вариабельности. Агонистные КРР также продуцируют EC50 в 6,5 мкМ для TFLLRN-NH2, поэтому эта концентрация была выбрана в качестве новой стандартной концентрации агониста.

Еще одним фактором, который был проанализирован, были объемы, использованные в анализе. В предыдущем протоколе в каждую лунку добавляли 2 мкл агониста, чтобы получить окончательный объем анализа 200 мкл. Была выдвинута гипотеза о том, что добавление большего количества раствора агониста при сохранении постоянной конечной концентрации может помочь в перемешивании, вызывая более быстрый и надежный сигнал. Чтобы проверить эту гипотезу, сравнивали добавление 2 л, 6 л и 10 мкл tfllrn-NH2 в 100 мкл или 200 мкл HEPES-HBSS в тарелке, содержащей различные концентрации NRD-21. КРР NRD-21 из каждого состояния были сгенерированы, чтобы определить, какая комбинация объема агонистов и конечного объема анализа дает наиболее согласованные данные. В то время как добавление 2 μL и 6 μL приводило к образованию CRC с небольшой вариабельностью, то же самое нельзя сказать о кривых, полученных при добавлении 10 μL TFLLRN-NH2 (данные не показаны); увеличение флуоресценции не было последовательным в этих скважинах ни по величине, ни по времени, что приводит к образованию CRC, которые должны быть идентичными, но вместо этого кардинально отличаются. Несмотря на то, что добавление 2 мкл и 6 мкл дало сходные результаты, изменение флуоресценции происходило гораздо быстрее при добавлении 6 мкл TFLLRN-NH2, что позволило сократить общее количество сканирований в каждой лунке вдвое, с 40 до 20 сканирований. Также было определено, что при использовании конечного объема 100 мкл образуются более однородные CRC по сравнению с теми, которые генерируются с конечным объемом 200 мкл (рис. 7).

Чтобы определить, подходит ли новый протокол для анализов с более высокой пропускной способностью, были рассчитаны Z-факторы для анализа (Рисунок 8). Z'-фактор представляет собой статистический метод, измеряющий качество скринингового анализа и определяющий, будет ли анализ надежно дифференцировать активные и неактивные соединения82. Z-факторы рассчитывали для анализов, проведенных в период от 16 до 24 ч после посева в планшеты и при различных прохождениях клеток. Во всех случаях — как для режима «только агонист», так и для режима «агонист плюс антагонист» — рассчитанные Z'-факторы были больше 0,5, что указывает на превосходный анализ82. Рассчитанные коэффициенты Z также были аналогичны тем, которые были рассчитаны для предыдущего анализа, что указывает на то, что изменения, внесенные в протокол для более быстрого проведения анализа, не оказали негативного влияния на качество.

Протокол мобилизации кальция, вызванной PAR, был обновлен с помощью экспериментов по получению значений IC50 из CRC, но анализ также может быть использован для измерения эффективности антагонистов PAR1 в единичных концентрациях. Анализ также может быть использован для измерения активности лигандов PAR2; например, агонист PAR2 SLIGKV-NH2 может заменить TFLLRN-NH2 в обновленном протоколе (рис. 9); предыдущий протокол также использовался с агонистами и антагонистамиPAR2 83. Несмотря на то, что этот протокол не был специально протестирован здесь, он также должен быть применим к эндотелиальным клеткам пупочной вены человека (HUVEC), которые использовались с предыдущим протоколом, и, возможно, к другим адгезивным клеточным линиям. Ограничением использования сканирующего устройства для чтения пластин с протоколами, подобными этому, является то, что они не подходят для изучения быстрых (менее секунды) откликов, по крайней мере, не параллельно, как это возможно при использовании пластинчатого сканера.

В заключение, здесь представлен более быстрый и простой протокол для эндотелиального PAR-управляемого анализа мобилизации кальция с использованием планшетного ридера. За счет устранения необходимости в автоматизированном обработчике жидкостей, сокращения времени инкубации антагонистов и уменьшения количества сканирований для каждой лунки, общее время анализа было снижено по меньшей мере на 90-120 минут, а затраты на анализ были снижены (сравнение между ранее описанными и текущими протоколами см. в таблице 2). Это не только позволит проводить скрининг большего количества соединений каждый день, но и устранит риск уменьшения окна анализа из-за оттока красителя, что может привести к ненадежным результатам. Недавно оптимизированный анализ позволяет быстрее проводить скрининг в эндотелиальных клетках лигандов PAR1 или PAR2 или, возможно, других лигандов GPCR, которые активируют внутриклеточную мобилизацию кальция, в лабораториях, ограниченных использованием планшетных ридеров.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

К.Д. является изобретателем патентов, связанных с пармодулинами, а также основателем и акционером компании Function Therapeutics, Inc., которая разрабатывает пармодулины для клинического использования.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Ирен Эрнандес, Труди Холист, доктора Хартмута Вейлера (Институт исследования крови Версити) и доктора Легги Арнольда (Университет Висконсин-Милуоки) за предоставление пространства и косвенную поддержку этого проекта, а также доктора Джона МакКорви (Медицинский колледж Висконсина) за соответствующие советы. Мы благодарим Национальный институт сердца, легких и крови (R15HL127636), Министерство обороны США (W81XWH22101) и Национальный научный фонд (2223225) за грантовую поддержку.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Реагенты для Cell Culture Reagents
Adherent EA.hy926 клеткиATCCCRL-2922
CellStripper реагент для диссоциации клетокCorning25-056-CITrypsin можно использовать опционально, но его определенно следует избегать при анализах PAR2.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) с феноловым краснымCorning10-013-CV
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Avantor97068-091
Желатин из свиной кожиMilliporeSigmaG2500Используйте для приготовления водного 0,4% (w/v) раствора с деионизированной водой. Автоклав перед использованием для стерилизации.
Pen/Strep (100X)Corning30-002-CI
Фосфат-буферный физиологический раствор (PBS)Corning21-040-CV
Трипановый синий (0,4% w/v)Corning25-900-CI
<стронг>Кальциевые мобилизационные реагенты
4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES)Термо172571000
Бычий сывороточный альбумин (БСА)Avantor97061-420
Дигидрат хлорида кальцияThermo42352-0250
ДиметилсульфоксидThermoJ66650-AD
Fluo-4/AMInvitrogenF14201
Сбалансированный раствор соли Хэнка (Ca/Mg/фенол-красный свободен)Corning21-022-CV
Магния хлорид гексагидратMilliporeSigmaM2393
Pluronic F-127 (Poloxamer 407)Spectrum ChemicalP1166
ProbenecidTCI AmericaP1975
Гидроксид натрияVWR InternationalBDH9292
TFLLRN-NH2 (соль TFA)Приготовлено Труди Холист в Versiti Blood НИИ Институт
<прочные>Материалы
96-луночные культуральнообработанные, черностенные, прозрачные донные пробные пластиныCorning3603с прозрачными крышками
Центрифужная трубка, 15 млAvantor89039-664
Центрифужная пробирка, 50 млAvantor89039-656
Колба для культур, T-75Corning353136обработанная культура тканей
Одноразовый резервуар для реагентов, 50 млCorningRES-V-50-S
Планшетный ридер EnspirePerkin ElmerСнятая с производства
микроцентрифужная пробирка, 1,5 млAvantor20170-038
Пастеровская пипетка, 9"Fisher13-678-6Bнеобходимо стерилизовать
ПЦР-полоску с отдельной плоской пробиркой колпачки полоскиAvantor76318-802
Наконечники для пипеток, 20 & микро; LBiotix63300042стерильные, фильтрованные наконечники
Наконечники для пипеток, 200 &; LBiotix63300044стерильные, фильтрованные наконечники
Наконечники для пипеток, 1250 &; LBiotix63300047стерильные, фильтрованные наконечники
PrismGraphPadvolume 6 б/у
серологическая пипетка, 5 млTradewinds Direct  07-5005
Серологическая пипетка, 10 млTradewinds Direct  07-5010
Серологическая пипетка, 25 млTradewinds Direct  07-5025
(Английский)

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rasmussen, U. B., et al. cDNA cloning and expression of a hamster alpha-thrombin receptor coupled to Ca2+ mobilization. FEBS Lett. 288 (1-2), 123-128 (1991).
  2. Vu, T. K., Hung, D. T., Wheaton, V. I., Coughlin, S. R. Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell. 64 (6), 1057-1068 (1991).
  3. Vu, T. K., Wheaton, V. I., Hung, D. T., Charo, I., Coughlin, S. R. Domains specifying thrombin-receptor interaction. Nature. 353 (6345), 674-677 (1991).
  4. Coughlin, S. R. Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature. 407 (6801), 258-264 (2000).
  5. Adams, M. N., et al. function and pathophysiology of protease activated receptors. Pharmacol. Ther. 130 (3), 248-282 (2011).
  6. Heuberger, D. M., Schuepbach, R. A. Protease-activated receptors (PARs): mechanisms of action and potential therapeutic modulators in PAR-driven inflammatory diseases. Thromb. J. 17, 4(2019).
  7. Han, X., Nieman, M. T., Kerlin, B. A. Protease-activated receptors: An illustrated review. Res. Pract. Thromb. Haemost. 5 (1), 17-26 (2021).
  8. Gerszten, R. E., et al. Specificity of the thrombin receptor for agonist peptide is defined by its extracellular surface. Nature. 368 (6472), 648-651 (1994).
  9. Ludeman, M. J., Kataoka, H., Srinivasan, Y., Esmon, N. L., Esmon, C. T., Coughlin, S. R. PAR1 cleavage and signaling in response to activated protein C and thrombin. J. Biol. Chem. 280 (13), 13122-13128 (2005).
  10. Rezaie, A. R. Protease-activated receptor signalling by coagulation proteases in endothelial cells. Thromb. Haemost. 112 (5), 876-882 (2014).
  11. Déry, O., Corvera, C. U., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Proteinase-activated receptors: novel mechanisms of signaling by serine proteases. Am. J. Physiol. 274 (6), (1998).
  12. Peach, C. J., Edgington-Mitchell, L. E., Bunnett, N. W., Schmidt, B. L. Protease-activated receptors in health and disease. Physiol. Rev. 103 (1), 717-785 (2023).
  13. Chen, J., Ishii, M., Wang, L., Ishii, K., Coughlin, S. R. Thrombin receptor activation. Confirmation of the intramolecular tethered liganding hypothesis and discovery of an alternative intermolecular liganding mode. J. Biol. Chem. 269 (23), 16041-16045 (1994).
  14. Scarborough, R. M., et al. Tethered ligand agonist peptides. Structural requirements for thrombin receptor activation reveal mechanism of proteolytic unmasking of agonist function. J. Biol. Chem. 267 (19), 13146-13149 (1992).
  15. Schuepbach, R. A., Madon, J., Ender, M., Galli, P., Riewald, M. Protease-activated receptor-1 cleaved at R46 mediates cytoprotective effects. J. Thromb. Haemost. 10 (8), 1675-1684 (2012).
  16. Davey, M. G., Lüscher, E. F. Actions of thrombin and other coagulant and proteolytic enzymes on blood platelets. Nature. 216 (5118), 857-858 (1967).
  17. Sambrano, G. R., Weiss, E. J., Zheng, Y. W., Huang, W., Coughlin, S. R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature. 413 (6851), 74-78 (2001).
  18. Nieman, M. T., Schmaier, A. H. Interaction of thrombin with PAR1 and PAR4 at the thrombin cleavage site. Biochemistry. 46 (29), 8603-8610 (2007).
  19. Andersen, H., Greenberg, D. L., Fujikawa, K., Xu, W., Chung, D. W., Davie, E. W. Protease-activated receptor 1 is the primary mediator of thrombin-stimulated platelet procoagulant activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (20), 11189-11193 (1999).
  20. Negrier, C., Shima, M., Hoffman, M. The central role of thrombin in bleeding disorders. Blood Rev. 38, 100582(2019).
  21. Larsen, J. B., Hvas, A. -M. Thrombin: A Pivotal Player in Hemostasis and Beyond. Semin. Thromb. and Hemost. 47 (7), 759-774 (2021).
  22. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Mueller, B. M., Ruf, W. Activation of endothelial cell protease activated receptor 1 by the protein C pathway. Science. 296 (5574), 1880-1882 (2002).
  23. Riewald, M., Petrovan, R. J., Donner, A., Ruf, W. Activated protein C signals through the thrombin receptor PAR1 in endothelial cells. J. Endotoxin Res. 9 (5), 317-321 (2003).
  24. Mosnier, L. O., Griffin, J. H. Inhibition of staurosporine-induced apoptosis of endothelial cells by activated protein C requires protease-activated receptor-1 and endothelial cell protein C receptor. Biochem. J. 373, Pt 1 65-70 (2003).
  25. Mosnier, L. O., Zlokovic, B. V., Griffin, J. H. The cytoprotective protein C pathway. Blood. 109 (8), 3161-3172 (2007).
  26. Mosnier, L. O., Sinha, R. K., Burnier, L., Bouwens, E. A., Griffin, J. H. Biased agonism of protease-activated receptor 1 by activated protein C caused by noncanonical cleavage at Arg46. Blood. 120 (26), 5237-5246 (2012).
  27. Soh, U. J. K., Trejo, J. Activated protein C promotes protease-activated receptor-1 cytoprotective signaling through β-arrestin and dishevelled-2 scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (50), E1372-E1380 (2011).
  28. Birch, C. A., Wedegaertner, H., Orduña-Castillo, L. B., Gonzalez Ramirez, M. L., Qin, H., Trejo, J. Endothelial APC/PAR1 distinctly regulates cytokine-induced pro-inflammatory VCAM-1 expression. Front. Mol. Biosci. 10, 1211597(2023).
  29. Shahzad, K., Kohli, S., Al-Dabet, M. M., Isermann, B. Cell biology of activated protein. C. Curr. Opin. Hematol. 26 (1), 41-50 (2019).
  30. Hollenberg, M. D., Saifeddine, M., al-Ani, B., Kawabata, A. Proteinase-activated receptors: structural requirements for activity, receptor cross-reactivity, and receptor selectivity of receptor-activating peptides. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75 (7), 832-841 (1997).
  31. Kawabata, A., Saifeddine, M., Al-Ani, B., Leblond, L., Hollenberg, M. D. Evaluation of proteinase-activated receptor-1 (PAR1) agonists and antagonists using a cultured cell receptor desensitization assay: activation of PAR2 by PAR1-targeted ligands. J. Pharmacol. Exp. Ther. 288 (1), 358-370 (1999).
  32. Kerschen, E. J., et al. Endotoxemia and sepsis mortality reduction by non-anticoagulant activated protein. C. J. Exp. Med. 204 (10), 2439-2448 (2007).
  33. Andrade-Gordon, P., et al. synthesis, and biological characterization of a peptide-mimetic antagonist for a tethered-ligand receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (22), 12257-12262 (1999).
  34. Chackalamannil, S., et al. Discovery of a novel, orally active himbacine-based thrombin receptor antagonist (SCH 530348) with potent antiplatelet activity. J. Med. Chem. 51 (11), 3061-3064 (2008).
  35. Wiviott, S. D., et al. Randomized trial of atopaxar in the treatment of patients with coronary artery disease: the lessons from antagonizing the cellular effect of Thrombin-Coronary Artery Disease Trial. Circulation. 123 (17), 1854-1863 (2011).
  36. Tricoci, P., et al. Thrombin-receptor antagonist vorapaxar in acute coronary syndromes. N. Engl. J. Med. 366 (1), 20-33 (2012).
  37. Morrow, D. A., et al. Vorapaxar in the secondary prevention of atherothrombotic events. N. Engl. J. Med. 366 (15), 1404-1413 (2012).
  38. Kuliopulos, A., et al. PAR1 (Protease-Activated Receptor 1) Pepducin Therapy Targeting Myocardial Necrosis in Coronary Artery Disease and Acute Coronary Syndrome Patients Undergoing Cardiac Catheterization: A Randomized, Placebo-Controlled, Phase 2 Study. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 40 (12), 2990-3003 (2020).
  39. Gupta, A., Williams, M. D., Macias, W. L., Molitoris, B. A., Grinnell, B. W. Activated protein C and acute kidney injury: Selective targeting of PAR-1. Curr. Drug Targets. 10 (12), 1212-1226 (2009).
  40. Dong, W., et al. Activated Protein C Ameliorates Renal Ischemia-Reperfusion Injury by Restricting Y-Box Binding Protein-1 Ubiquitination. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (11), 2789-2799 (2015).
  41. Al-Dabet, M. M., et al. Reversal of the renal hyperglycemic memory in diabetic kidney disease by targeting sustained tubular p21 expression. Nat. Comm. 13 (1), 5062(2022).
  42. El Eter, E. A., Aldrees, A. Inhibition of proinflammatory cytokines by SCH79797, a selective protease-activated receptor 1 antagonist, protects rat kidney against ischemia-reperfusion injury. Shock. 37 (6), 639-644 (2012).
  43. Sparkenbaugh, E. M., et al. Thrombin activation of PAR-1 contributes to microvascular stasis in mouse models of sickle cell disease. Blood. 135 (20), 1783-1787 (2020).
  44. Lin, C., et al. High endogenous activated protein C levels attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J. of Cell. Mol. Med. 20 (11), 2029-2035 (2016).
  45. Zhang, Y., Wang, H., Zhu, G., Qian, A., Chen, W. F2r negatively regulates osteoclastogenesis through inhibiting the Akt and NFκB signaling pathways. Int. J. Biol. Sci. 16 (9), 1629-1639 (2020).
  46. Chandrabalan, A., Firth, A., Litchfield, R. B., Appleton, C. T., Getgood, A., Ramachandran, R. Human osteoarthritis knee joint synovial fluids cleave and activate Proteinase-Activated Receptor (PAR) mediated signaling. Sci. Rep. 13 (1), 1124(2023).
  47. Festoff, B. W., et al. Neuroprotective effects of recombinant thrombomodulin in controlled contusion spinal cord injury implicates thrombin signaling. J. Neurotrauma. 21 (7), 907-922 (2004).
  48. Zhong, Z., et al. Activated protein C therapy slows ALS-like disease in mice by transcriptionally inhibiting SOD1 in motor neurons and microglia cells. J. Clin. Investig. 119 (11), 3437-3449 (2009).
  49. Griffin, J. H., Mosnier, L. O., Fernández, J. A., Zlokovic, B. V. Scientific Sessions Sol Sherry Distinguished Lecturer in Thrombosis: Thrombotic Stroke: Neuroprotective Therapy by Recombinant-Activated Protein C. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 36 (11), 2143-2151 (2016).
  50. Yoon, H., et al. Blocking the Thrombin Receptor Promotes Repair of Demyelinated Lesions in the Adult Brain. J.Neurosci. 40 (7), 1483-1500 (2020).
  51. Kanki, H., et al. β-arrestin-2 in PAR-1-biased signaling has a crucial role in endothelial function via PDGF-β in stroke. Cell Death Dis. 10 (2), 100(2019).
  52. Even-Ram, S., et al. Thrombin receptor overexpression in malignant and physiological invasion processes. Nat. Med. 4 (8), 909-914 (1998).
  53. Kamath, L., Meydani, A., Foss, F., Kuliopulos, A. Signaling from protease-activated receptor-1 inhibits migration and invasion of breast cancer cells. Cancer Res. 61 (15), 5933-5940 (2001).
  54. Shi, X., Gangadharan, B., Brass, L. F., Ruf, W., Mueller, B. M. Protease-activated receptors (PAR1 and PAR2) contribute to tumor cell motility and metastasis. Mol. Cancer Res. 2 (7), 395-402 (2004).
  55. Yang, E., et al. Blockade of PAR1 signaling with cell-penetrating pepducins inhibits Akt survival pathways in breast cancer cells and suppresses tumor survival and metastasis. Cancer Res. 69 (15), 6223-6231 (2009).
  56. McEachron, T. A., Pawlinski, R., Richards, K. L., Church, F. C., Mackman, N. Protease-activated receptors mediate crosstalk between coagulation and fibrinolysis. Blood. 116 (23), 5037-5044 (2010).
  57. Adams, G. N., et al. Protease-activated receptor-1 impedes prostate and intestinal tumor progression in mice. J. Thromb. Haemost. 16 (11), 2258-2269 (2018).
  58. Arakaki, A. K. S., Pan, W. -A., Lin, H., Trejo, J. The α-arrestin ARRDC3 suppresses breast carcinoma invasion by regulating G protein-coupled receptor lysosomal sorting and signaling. J. Biol. Chem. 293 (9), 3350-3362 (2018).
  59. Schweickert, P. G., et al. Thrombin-PAR1 signaling in pancreatic cancer promotes an immunosuppressive microenvironment. J. Thromb. Haemost. 19 (1), 161-172 (2021).
  60. Chackalamannil, S., et al. Discovery of potent orally active thrombin receptor (protease activated receptor 1) antagonists as novel antithrombotic agents. J. Med. Chem. 48 (19), 5884-5887 (2005).
  61. Dockendorff, C., et al. Discovery of 1,3-Diaminobenzenes as Selective Inhibitors of Platelet Activation at the PAR1 Receptor. ACS Med. Chem. Lett. 3 (3), 232-237 (2012).
  62. Gandhi, D. M., et al. The parmodulin NRD-21 is an allosteric inhibitor of PAR1 Gq signaling with improved anti-inflammatory activity and stability. Bioorg. Med. Chem. 27 (17), 3788-3796 (2019).
  63. Aisiku, O., et al. Parmodulins inhibit thrombus formation without inducing endothelial injury caused by vorapaxar. Blood. 125 (12), 1976-1985 (2015).
  64. De Ceunynck, K., et al. PAR1 agonists stimulate APC-like endothelial cytoprotection and confer resistance to thromboinflammatory injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 115 (5), E982-E991 (2018).
  65. Aisiku, O., Peters, C. G., Gunnink, S., Dilks, J. R., Dockendorff, C., Flaumenhaft, R. Effects of Biased PAR1 Ligands On Platelets and Endothelial Cells. Blood. 122 (21), 23(2013).
  66. Dowal, L., et al. Identification of an antithrombotic allosteric modulator that acts through helix 8 of PAR1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (7), 2951-2956 (2011).
  67. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).
  68. Ma, Q., Ye, L., Liu, H., Shi, Y., Zhou, N. An overview of Ca2+ mobilization assays in GPCR drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 12 (5), 511-523 (2017).
  69. Baffy, G., Yang, L., Raj, S., Manning, D. R., Williamson, J. R. G protein coupling to the thrombin receptor in Chinese hamster lung fibroblasts. J. Biol. Chem. 269 (11), 8483-8487 (1994).
  70. McLaughlin, J. N., Shen, L., Holinstat, M., Brooks, J. D., Dibenedetto, E., Hamm, H. E. Functional selectivity of G protein signaling by agonist peptides and thrombin for the protease-activated receptor-1. J. Biol. Chem. 280 (26), 25048-25059 (2005).
  71. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
  72. Gandhi, D. M., et al. Characterization of Protease-Activated Receptor (PAR) ligands: Parmodulins are reversible allosteric inhibitors of PAR1-driven calcium mobilization in endothelial cells. Bioorg. Med. Chem. 26 (9), 2514-2529 (2018).
  73. Ahn, K., Pan, S., Beningo, K., Hupe, D. A permanent human cell line (EA.hy926) preserves the characteristics of endothelin converting enzyme from primary human umbilical vein endothelial cells. Life Sci. 56 (26), 2331-2341 (1995).
  74. Caers, J., et al. Characterization of G protein-coupled receptors by a fluorescence-based calcium mobilization assay. J. Vis. Exp. (89), e51516(2014).
  75. Robbins, N., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovasc. Toxicol. 12 (1), 1-9 (2012).
  76. McKinney, S. E., Peck, H. M., Bochey, J. M., Byham, B. B., Schuchardt, G. S., Benemid Beyer, K. H. p-(Di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; toxicologic properties. J. Pharmacol. Exp. Ther. 102 (3), 208-214 (1951).
  77. Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Silverstein, S. C. Inhibition of Fura-2 sequestration and secretion with organic anion transport blockers. Cell Calcium. 11 (2-3), 57-62 (1990).
  78. Liu, K., et al. A multiplex calcium assay for identification of GPCR agonists and antagonists. Assay Drug Dev. Technol. 8 (3), 367-379 (2010).
  79. Klein, A. K., et al. Investigation of the Structure-Activity Relationships of Psilocybin Analogues. ACS Pharmacol. Transl. Sci. 4 (2), 533-542 (2021).
  80. Hawes, B. E., et al. In vitro pharmacological characterization of vorapaxar, a novel platelet thrombin receptor antagonist. Eur. J. Pharmacol. 762, 221-228 (2015).
  81. Bokoch, M. P., et al. Entry from the Lipid Bilayer: A Possible Pathway for Inhibition of a Peptide G Protein-Coupled Receptor by a Lipophilic Small Molecule. Biochemistry. 57 (39), 5748-5758 (2018).
  82. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  83. Majewski, M. W., Gandhi, D. M., Rosas, R., Kodali, R., Arnold, L. A., Dockendorff, C. Design and Evaluation of Heterobivalent PAR1-PAR2 Ligands as Antagonists of Calcium Mobilization. ACS Med. Chem. Lett. 10 (1), 121-126 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PAR1Fluo 4Gq96

Похожие статьи