Анализ комплементации на основе Escherichia coli для изучения шаперонной функции белка теплового шока 70

Summary

Этот протокол демонстрирует шаперонную активность белка теплового шока 70 (Hsp70). Клетки E. coli dnaK756 служат моделью для анализа, поскольку они содержат нативный, функционально ослабленный Hsp70, что делает их восприимчивыми к тепловому стрессу. Гетерологичное введение функционального Hsp70 спасает дефицит роста клеток.

Abstract

Белок теплового шока 70 (Hsp70) является консервативным белком, который способствует сворачиванию других белков в клетке, что делает его молекулярным шапероном. В то время как Hsp70 не является необходимым для клеток E. coli , растущих в нормальных условиях, этот шаперон становится незаменимым для роста при повышенных температурах. Поскольку Hsp70 обладает высокой консервативностью, одним из способов изучения шаперонной функции генов Hsp70 различных видов является их гетерологическая экспрессия в штаммах E. coli , которые либо испытывают дефицит Hsp70, либо экспрессируют нативный Hsp70, который функционально скомпрометирован. Клетки E. coli dnaK756 не способны поддерживать λ ДНК бактериофага. Кроме того, их нативный Hsp70 (DnaK) проявляет повышенную активность АТФазы, демонстрируя при этом пониженное сродство к GrpE (фактор нуклеотидного обмена Hsp70). В результате клетки E. coli dnaK756 адекватно растут при температуре от 30 °C до 37 °C, но погибают при повышенных температурах (>40 °C). По этой причине эти клетки служат моделью для изучения шаперонной активности Hsp70. Здесь мы опишем подробный протокол применения этих клеток для проведения анализа комплементации, позволяющего изучить функцию шаперона в целлюлоне Hsp70.

Introduction

Белки теплового шока играют важную роль в качестве молекулярных шаперонов, облегчая сворачивание белков, предотвращая агрегацию белков и обращая вспять неправильное сворачивание белков ^1,2. Белок теплового шока 70 (Hsp70) является одним из наиболее известных молекулярных шаперонов, играющих центральную роль в белковом гомеостазе ^3,4. DnaK является гомологом E. coli Hsp70⁵.

Различные биофизические, биохимические и клеточные анализы были разработаны для изучения активности шаперона Hsp70 и скрининга ингибиторов, нацеленных на этот шаперон ^6,7,8. Hsp70 является высококонсервативным белком. По этой причине сообщалось, что несколько Hsp70 эукариотических организмов, таких как Plasmodium falciparum (основной возбудитель малярии), замещают функцию DnaK у E. coli ^6,9. Таким образом, был разработан анализ комплементации на основе E. coli, включающий гетерологичную экспрессию Hsp70 у E. coli для изучения их цитопротекторной функции. Как правило, этот анализ включает в себя использование клеток E. coli, которые либо испытывают дефицит ДНКК, либо экспрессируют нативный ДНКК, который функционально скомпрометирован. В то время как ДНКК не является необходимым для роста кишечной палочки в нормальных условиях, она становится необходимой, когда клетки выращиваются в стрессовых условиях, таких как повышенные температуры или другие^{формы стресса.}

Штаммы E. coli, которые были разработаны для изучения функции Hsp70 с помощью анализа комплементации, включают E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) и E. coli dnaK756. Клетки E. coli dnaK103 продуцируют усеченный DnaK, который не функционирует, и поэтому клетки адекватно растут при 30 °C, в то время как штамм чувствителен к холоду и тепловому стрессу^12,13. Аналогично, штамм E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) не поднимается выше 40 °C^14,15. Штамм E. coli dnaK756 экспрессирует мутантный нативный DnaK (DnaK756), характеризующийся тремя заменами глицина на аспартат в положениях 32, 455 и 468, что приводит к нарушенным протеостатическим результатам. Следовательно, этот штамм устойчив к бактериофагу λ ДНК¹⁴. Кроме того, E. coli dnaK756 проявляет повышенную активность АТФазы, в то время как ее сродство к фактору нуклеотидного обмена, GrpE, снижено¹⁶. Кишечная палочка Мутантные штаммы DnaK служат идеальными моделями для исследования активности шаперона Hsp70 с помощью комплементационного подхода. Поскольку ДНКК необходим только в стрессовых условиях, анализ комплементации обычно проводится при повышенных температурах (рис. 1). Некоторые преимущества использования E. coli для этого исследования включают ее хорошо охарактеризованный геном, быстрый рост и низкую стоимость культивирования и содержания¹⁷.

В этой статье мы подробно опишем протокол, предполагающий использование клеток E. coli dnaK756 для изучения функции Hsp70. Hsp70, которые мы использовали в анализе, представляют собой DnaK дикого типа и его химерное производное KPf (состоящее из АТФазного домена DnaK, слитого с С-концевым субстрат-связывающим доменом Plasmodium falciparum Hsp70-1 ^6,18). KPf-V436F был гетерологически экспрессирован как отрицательный контроль, поскольку мутация, по сути, блокирует его от связывания субстратов, тем самым отменяя его шаперонную активность⁹.

Protocol

1. Трансформация

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильную стеклянную посуду для закваскивания, наконечники пипеток и свежеприготовленные и автоклавные среды. Приготавливают культуры клеток E. coli в 2х дрожжевых триптоне (YT) [1,6% триптон (w/v), 1% экстракт дрожжей (w/v), 0,5% NaCl (w/v), 1,5% агар (w/v)] агаре. Общие реактивы, используемые в протоколе, и их источники приведены в Таблице материалов.

1. Маркируют пробирки для микроцентрифуг объемом 2,0 мл и аликвотируют 50 мкл компетентных клеток E. coli dnaK756, удерживая клетки на льду.
2. В пробирки микроцентрифуг объемом 2,0 мл с компетентными клетками в отдельные пробирки помещают 10-50 нг плазмидной ДНК⁹ pQE60/DnaK, pQE60/KPf и pQE60/KPf-V436F.
3. Пробирки микроцентрифуги объемом 2,0 мл, содержащие компетентные клетки и плазмидную ДНК, держать на льду в течение 30 минут.
4. Подвергают тепловому шоку компетентную смесь клеток и ДНК в течение 60 с при 42 °C и возвращают пробирки микроцентрифуг обратно на лед в течение 10 минут.
5. Добавьте 950 мкл свежего бульона 2x YT (предварительно инкубированного при 37 °C) и инкубируйте при 37 °C, встряхивая при 150 оборотах/мин в течение 1 ч. Оставьте клетки расти гораздо дольше, чтобы стимулировать их восстановление в случае необходимости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте сильного встряхивания клеток.
6. Пипетку 100 мкл клеток и распределите их на 2 пластины из агара YT, содержащие 50 мкг/мл канамицина, 10 мкг/мл тетрациклина для соответствующего штамма и 100 мкг/мл ампициллина (см. таблицу материалов) для выбора плазмиды.
7. Центрифугируйте остальные ячейки (объем которых теперь составляет примерно 900 мкл) в течение 1 мин при 5000 x g (при 4 °C) с помощью настольной микроцентрифуги.
8. Сцедите около 800 мкл бульона и используйте оставшуюся среду для ресуспендирования гранулированных клеток.
9. Выложите восстановленные клетки на пластину с агаром 2x YT.
10. Инкубируйте обе пластины с агаром в течение ночи (или примерно 17 ч) при температуре 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти клетки растут очень медленно и, возможно, нуждаются в инкубации в течение гораздо более длительного времени. Будьте осторожны, чтобы заметить колонии, которые могут быть очень маленькими. Пластина, содержащая ресуспендированные клетки после центрифугирования (шаг 1.7), служит резервом на случай, если эффективность трансформации клеток будет низкой, и в этом случае гранулированные клетки могут улучшить восстановление любых трансформированных клеток. Однако, если эффективность трансформации превосходна, агаровая пластина, на которую были нанесены концентрированные клетки, может характеризоваться разросшейся культурой при инкубации, что затрудняет идентификацию одиночных колоний. В этом случае другая агаровая пластина может быть той, на которой растут хорошо расположенные колонии.

2. Покрытие ячеек

1. Возьмите одну колонию из трансформантов и инокулируйте ее в 10 мл бульона 2x YT с добавлением 50 мкг/мл канамицина, 10 мкг/мл тетрациклина для отбора клеток E. coli dnaK756 и 100 мкг/мл ампициллина для выбора плазмиды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте колбы (≥50 мл) для обеспечения аэрации при перемешивании культуры. Инкубируйте посевной материал в течение ночи (17 ч) при температуре 37 °C, встряхивая со скоростью 150 оборотов/мин.
2. На следующее утро измерьте коэффициент поглощения при OD₆₀₀.
3. Очистите поверхность верстака, используя 75% этанол, чтобы промыть поверхность для подготовки к обнаружению пятен на клетках.
4. Используя пробирку для микроцентрифуги объемом 2 мл, стандартизируйте культуру до показателя OD₆₀₀ 2,0, используя бульон 2x YT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что показания наружного диаметра сняты правильно, так как этот шаг важен для стандартизации плотности ячеек в различных образцах.
5. Используя пробирки микроцентрифуги объемом 2 мл, готовят последовательные разведения клеток от 10⁰ до ^10-5.
6. Инкубируйте агаровые пластины, которые будут использоваться для размещения клеток, в духовке, установленной при температуре 40 °C, чтобы дать пластинам высохнуть, с частично открытыми крышками, чтобы обеспечить выход водяного пара.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы убедиться, что ячейки находятся на равномерном расстоянии друг от друга, нарисуйте линии на листе бумаги, на котором будет напечатан шаблон пятнистых участков.
7. Нанесите 2 мкл последовательно разбавленных клеток на агаровые пластины, добавив 50 мкг/мл канамицина, 10 мкг/мл тетрациклина, 100 мкг/мл ампициллина и 0,5 мМ IPTG (для индукции экспрессии рекомбинантных белков) (см. таблицу материалов).
8. Поместите каждый образец на две отдельные чашки (одну для инкубации при 37 °C, а другую при 43,5 °C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прокалывания агаровой пластины.
9. Размещайте контрольные образцы на той же пластине, что и экспериментальные образцы, чтобы свести к минимуму воздействие на окружающую среду.
10. Проводите пятнистость быстро, чтобы убедиться, что процесс завершен до того, как клетки начнут расти, так как это может привести к искажению моделей роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно избегать аэрозолей при пятнах, так как они могут загрязнить пластины. Также важно держать пластины закрытыми в промежутках между пятнами, чтобы избежать загрязнения.
11. Инкубируйте одну чашку при 37 °C (допустимая температура роста), а другую при недопускающей температуре роста 43,5 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубируйте пластины вверх дном, чтобы избежать скопления пара на крышке, так как конденсированная вода смоет пятнистые колонии с их позиций.
12. Поместите все тарелки в инкубаторы одновременно и не открывайте инкубатор до следующего утра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не рекомендуется открывать дверцу инкубатора несколько раз во время инкубации планшетов. Это связано с тем, что доступ воздуха в инкубатор может привести к колебаниям температуры, которые отрицательно влияют на рост клеток.

3. Подтверждение экспрессии рекомбинантных белков

1. С помощью стерильной петли подбирают часть оставшихся клеток из той же колонии трансформированных клеток E. coli dnaK756.
2. Инокуляцию клеток в 10 мл YT-бульона с добавлением 50 мкг/мл канамицина, 10 мкг/мл тетрациклина и 100 мкг/мл ампициллина. Инкубировать в течение ночи (17 ч) при 37 °C при встряхивании со скоростью 150 об/мин.
3. Перенесите культуру в 90 мл стерильного бульона 2x YT, содержащего необходимые антибиотики, как указано в шаге 3.2. Дайте клеткам вырасти до середины логарифмической фазы (OD₆₀₀ = 0,4-0,6).
4. Возьмите 2 мл образца культуры перед индукцией (0 ч индукционной пробы).
5. Добавьте IPTG до конечной концентрации 1 мМ, чтобы индуцировать выработку белка и повторно инкубировать клетки при 37 °C.
6. Возьмите вторую пробу объемом 2 мл через 6 ч после индукции.
7. Собирают клетки центрифугированием при 5000 x g в течение 10 мин. Поддерживайте температуру центрифуги на уровне 4 °C.
8. Выбросьте надосадочную жидкость.
9. Повторно суспендировать гранулы в буфере PBS (137 мМ NaCl, 27 мМ KCl, 4,3 мМ_Na2HPO₄, 1,4 мМ KH₂PO₄) и хранить при -20 °C.

4. SDS-PAGE и вестерн-блоттинг

1. Приготовьте 2x 10% геля SDS, как описано выше¹⁹.
2. Сохраните один из гелей SDS-PAGE для последующего окрашивания с помощью красителя Coomassie для просмотра белковых полос. Используйте второй гель SDS-PAGE для проведения вестерн-блоттинг-анализа.
3. Аликвотируют 80 мкл ресуспендированных образцов и смешивают с 20 мкл 4-кратного загрузочного буфера Laemmli SDS.
4. Кипятить суспензию при 100 °С в течение 10 мин. Затем загрузите 10 мкл каждого образца в сборный гель SDS (см. таблицу материалов).
5. Проводят электрофорез при комнатной температуре в течение 1 ч с использованием напряжения 120 В в 1х растворе СДС прогонного буфера (25 мм Трис, 250 мм глицина, 0,1% (по массе) СДС).
6. Окрашивают гель красителем Кумасси (см. таблицу материалов) в течение 1 ч с последующим обесцвечиванием с использованием обесцвечивающего буфера (50% (v/v) метанола, 10% (v/v) уксусной кислоты в дистиллированной воде) в течение 2 ч.
7. Визуализируйте белковые полосы, присутствующие в геле, с помощью системы визуализации геля (см. таблицу материалов). Повторно запустите другой гель SDS-PAGE с теми же образцами, следуя вышеупомянутому протоколу.
8. Когда электрофоретический прогон заканчивается, возьмите гели SDS-PAGE для проведения вестерн-блоттинг-анализа, как описано ранее¹⁹.
9. Промыть нитроцеллюлозную мембрану, на которую белки переносились три раза, в промывочном буфере (TBS-Tween, pH 7,4 [50 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 1% (v/v) Tween]).
10. Используйте α-DnaK (см. таблицу материалов) для обнаружения DnaK и α-PfHsp70-1⁷ для обнаружения KPf и его мутанта KPf-V436F), соответственно.
11. Используйте антитела в разведении 1:2000 в 5% обезжиренном молоке. Инкубируют при 4 °C при встряхивании при 60 оборотах/мин в течение 1 ч.
12. Удаляют неспецифически связанные антитела, промывая нитроцеллюлозную мембрану в TBS-Tween 3 раза в течение 15 мин.
13. Инкубируют мембрану во вторичном антителе (α-кролик, см. таблицу материалов) в тех же условиях, что и на предыдущем этапе. Затем следует последующая промывка в тех же условиях, что и первичное антитело.
14. Устраните полосы с помощью реагента для обнаружения улучшенной хемилюминесценции (ECL).
15. Визуализируйте полосы с помощью гелевого имидж-сканера.

Results

На рисунке 2 представлено изображение отсканированного агара, содержащего клетки, которые были обнаружены и культивированы при допустимой температуре роста 37 °C и 43,5 °C соответственно. В правой части рисунка 2 вырезанные компоненты вестерн-блоттинга представляют экспрессию DnaK, KPf и KPf-V436F в клетках E. coli dnaK756. Как и ожидалось, все клетки E. coli dnaK756, культивируемые при допустимой температуре роста 37 °C, успели вырасти. Однако в условиях непермиссивного роста при 43,5 °С удалось вырасти только клеткам, гетерологически экспрессирующим DnaK и KPf, о чем сообщалось ранее ^6,9,20 (рис. 2). С другой стороны, клетки, экспрессирующие KPf-V436F, росли только при 37 °C, но не могли расти при 43,5 °C. Это свидетельствует о том, что DnaK и KPf способны восстанавливать дефект роста клеток E. coli dnaK756 в условиях теплового стресса. Неспособность клеток, гетерологически экспрессирующих KPf-V436F, поддерживать рост клеток при 43,5 °C, демонстрирует отсутствие шаперонной функции этого белка. В этом отношении KPf-V436F служит идеальным белком отрицательного контроля.

Рисунок 1: Принцип проведения анализа комплементации с использованием клеток E. coli dnaK756 для изучения шаперонной функции гетерологически экспрессируемых белков. E. coli dnaK756 экспрессирует нативный белок DnaK756, который не способен защитить клетки от теплового стресса. Введение функционального гетерологичного Hsp70 спасает клетки от гибели при воздействии теплового стресса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Анализ комплементационных пластин, демонстрирующий возможности DnaK и KPf для защиты клеток E. coli dnaK756 от теплового стресса. Трансформированные клетки культивировали при 37 °C (разрешающая температура роста) и 43,5 °C (непермиссивная температура роста). Клетки были стандартизированы и покрыты в виде серийных разведений. Буква «N» символизирует «аккуратный», представляя собой первое пятно, состоящее из неразбавленных клеток. В крайнем правом углублении находятся западные блоттинги, представляющие экспрессию трех белков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Протокол демонстрирует полезность клеток E. coli dnaK756в исследовании шаперонной функции гетерологически экспрессируемого Hsp70. Этот анализ может быть использован для скрининга ингибиторов, нацеленных на функцию Hsp70 в целлюло. Однако одним из ограничений этого метода является то, что Hsp70, неспособные заменить DnaK в E. coli, несовместимы с этим анализом. Отсутствие посттрансляционной модификации²¹ некоторых ненативных Hsp70 может объяснить отсутствие у них функции в системе E. coli . Анализ комплементации на основе дрожжей²² может устранить некоторые недостатки анализа на основе E. coli.

Несколько ключевых шагов имеют решающее значение для обеспечения воспроизводимых результатов. Они включают в себя обеспечение того, чтобы во время нанесения покрытия использовались только клетки, преобразованные соответствующей плазмидной конструкцией. Кроме того, важно избегать загрязнения культуры на протяжении всех этапов. Кроме того, поскольку подверженные стрессу клетки E . coli DnaK восприимчивы к чрезмерной филаментации¹⁰, важно избегать сильного встряхивания во время культивирования, так как это физическое напряжение способствует обширной филаментации. Чрезмерно филаментированные клетки дают более высокие ложные показания кажущегося роста при OD₆₀₀, что приводит к завышенной оценке роста культуры и отрицательно влияет на стандартизацию клеток перед нанесением покрытия. Хотя Hsp70 не является необходимым для роста кишечной палочки в нормальных условиях, клетки, лишенные этого белка,^{восприимчивы к} стрессу. По этой причине клетки E. coli dnaK756 растут гораздо медленнее после трансформации или во время их восстановления из запасов глицерина. Кроме того, они чрезвычайно чувствительны к колебаниям температуры. Поэтому важно не открывать дверцу инкубатора после того, как пластины с агаром с покрытием помещены внутрь, до тех пор, пока не придет время рассмотреть пластины.

Данные вестерн-блоттинга важны для подтверждения экспрессии соответствующих рекомбинантных белков Hsp70 в клетках E. coli dnaK756. Неспособность экспрессировать соответствующий белок приводит к ложноотрицательному результату для клеток, растущих при непермиссивной температуре роста.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-β-Меркаптоэтанол	Sigma-Aldrich	8,05,740	Компонент для загрузки образца красителя
Уксусная кислота	Labchem	101005125	Компонент дестазинера
Акриламид	Sigma-Aldrich	8008300100	Компонент SDS
Агар	Merck	HG000BX1.500	Компонент среднего и жидкого анализа роста
Agarose	Clever Scientific	14131031	Сертифицированная молекулярная биология агарозный
персульфат аммония	Sigma-Aldrich	101875295	Компонент для SDS-PAGE гель
Ampicillin	VWR International	0339—EU— 25G	Селективный антибиотик
Bis	Sigma-aldrich	1015460100	Компонент SDS
Бромофенол	Sigma-Aldrich	0449-25G	Компонент для загрузки образца красителя
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4	Для компетентного препарата
клеток Coomassie brilliant blue	VWR International	443293X	SDS-PAGE краситель
Двухосновной фосфат натрия	Сигма-Олдрич	RB10368	Составная часть буфера
PBS ECL	Thermofischer Scientific	32109	Реагент для детекции вестерн-блоттинга
Бромид этидия	Thermofischer Scientific	17898	Интеркалирующий краситель
ДНК Глицерин	Merck	SAAR2676520L	Компонент для загрузки образца краситель
Глицин	VWR International	10119CU	Компонент SDS
IPTG	Glentham life sciences	162IL	индуктор
Kanamycin	Melford	K0126	Селективный антибиотик
Хлорид магния	Merck	SAAR4123000EM	Компонент среднего и жидкого анализа роста
Methanol	Labchem	113140129	Компонент дестазинга
Одноосновной фосфат калия	Merck	1,04,87,30,250	Составная часть буфера PBS
Пептон	Merck	HG000BX4.250	Компонент среднего и жидкого анализа роста
Хлорид калия	Merck	SAAR5042020EM	Компонент буфера PBS
мембрана PVDF	Thermofischer scientific	PB7320	Западный блот-мембрана
Хлорид натрия	Merck	SAAR5822320EM	Компонент среднего и жидкого анализа роста
Додецилсульфат натрия	VWR International	108073	Для растворения экспрессированных белков
Spectramax iD3	Separations	373705019	Автоматизированный планшетный ридер
TEMED	VWR international	ACRO420580500	Компонент геля SDS
Тетрациклин	Duchefa Biochemies	T0150.0025	Селективный антибиотик
Tris	VWR International	19A094101	Компонент геля
SDS Tween20	Merck	SAAR3164500XF	Компонент для западного промывочного буфера
Западная передаточная камера	Thermofisher Scientific	PB0112	Перенос белка на нитроцеллюлозную мембрану
Дрожжевой экстракт	Merck	HG000BX6.500	Составная часть среднего и жидкого анализа роста
;-DnaK антитела	Inqaba	BK CAC09317	Первичное антитело
&альфа;-кроличье антитело	Thermofischer scientific	31460	Вторичное антитело