Методическая статья

Измерение стресса эндоплазматического ретикулума и развернутого белкового ответа в Т-клетках, инфицированных ВИЧ-1, и анализ его роли в репликации ВИЧ-1

3.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66522

⸱

14 июня 2024 г.

 ,  , 
1National Centre for Cell Science, SP Pune University Campus

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье мы описываем некоторые установленные методы определения стресса эндоплазматического ретикулума (ЭР) и активации развернутого белкового ответа (УПО), уделяя особое внимание инфекции ВИЧ-1. В этой статье также описывается набор протоколов для исследования влияния стресса ER/UPR на репликацию ВИЧ-1 и инфекционность вириона.

Аннотация

Вирусные инфекции могут вызывать стресс эндоплазматического ретикулума (ЭР) из-за аномального накопления белка, что приводит к развернутому белковому ответу (UPR). Вирусы разработали стратегии манипулирования UPR хозяина, но в литературе отсутствует подробное понимание модуляции UPR и ее функционального значения во время инфекции ВИЧ-1. В этом контексте в настоящей статье описываются протоколы, используемые в нашей лаборатории для измерения уровней стресса ER и UPR во время инфекции ВИЧ-1 в Т-клетках, а также влияние UPR на репликацию вируса и инфекционность.

Окрашивание тиофлавином Т (ThT) является относительно новым методом, используемым для обнаружения ER-стресса в клетках путем обнаружения белковых агрегатов. Здесь мы проиллюстрировали протокол окрашивания ThT в инфицированных ВИЧ-1 клетках для выявления и количественного определения ER-стресса. Кроме того, стресс ER также был обнаружен косвенно путем измерения уровней маркеров UPR, таких как BiP, фосфорилированный IRE1, PERK и eIF2α, сплайсинга XBP1, расщепления ATF6, ATF4, CHOP и GADD34 в инфицированных клетках ВИЧ-1, с использованием обычного иммуноблоттинга и количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Установлено, что ThT-флуоресценция коррелирует с показателями активации UPR. В данной статье также демонстрируются протоколы анализа влияния стресса ER и модуляции УПО на репликацию ВИЧ-1 с помощью нокдаун-экспериментов, а также использования фармакологических молекул. Влияние УПО на экспрессию/репликацию гена ВИЧ-1 и продукцию вируса анализировали с помощью репортерного анализа люциферазы и ИФА захвата антигена р24 соответственно, тогда как влияние на инфекционность вириона анализировали путем окрашивания инфицированных репортерных клеток. В совокупности этот набор методов обеспечивает всестороннее понимание путей ответа развернутого белка во время инфекции ВИЧ-1, раскрывая его сложную динамику.

Введение

Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) характеризуется постепенным снижением количества CD4+ Т-лимфоцитов, что приводит к прогрессирующему провалу иммунного ответа. Вирус иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1) является возбудителем СПИДа. Это оболочечный одноцепочечный РНК-вирус с двумя копиями РНК на вирион, принадлежащий к семейству ретровирид. Производство высоких концентраций вирусных белков в клетке-хозяине создает чрезмерную нагрузку на механизм сворачивания белка в клетке1. ER является первым компартментом в секреторном пути эукариотических клеток. Он отвечает за производство, изменение и доставку белков к секреторному пути и местам-мишеням внеклеточного пространства. Белки претерпевают многочисленные посттрансляционные изменения и сворачиваются в свою естественную конформацию в ЭР, включая связанное с аспарагином гликозилирование и создание внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей2. Таким образом, в просвете ER присутствуют высокие концентрации белков, которые очень склонны к агрегации и неправильному сворачиванию. Различные физиологические состояния, такие как тепловой шок, микробные или вирусные инфекции, которые требуют усиленного синтеза белка или мутации белка, приводят к стрессу ЭР из-за повышенного накопления белка в ЭР, тем самым нарушая гомеостаз просвета ЭР. Стресс ER активирует сеть высококонсервативных адаптивных путей передачи сигнала, развернутый белковый ответ (UPR)3. UPR используется для восстановления нормального физиологического состояния ER путем выравнивания его развернутой белковой нагрузки и сворачивающей способности. Это вызвано увеличением размера ER и ER-резидентных молекулярных шаперонов и фолдаз, что приводит к повышению способности ER к сворачиванию. UPR также снижает белковую нагрузку ER за счет глобального ослабления синтеза белка на трансляционном уровне и увеличивает клиренс развернутых белков из ER за счет активации ER-ассоциированной деградации (ERAD)4,5.

Стресс ER воспринимается тремя ER-резидентными трансмембранными белками: протеинкиназой R (PKR)-подобной эндоплазматической ретикулумкиназой (PERK), активирующим фактором транскрипции 6 (ATF6) и инозитол-требующим ферментом типа 1 (IRE1). Все эти эффекторы остаются неактивными за счет связывания с шапероном белка теплового шока семейства A (Hsp70) 5 (HSPA5), также известным как связывающий белок (BiP)/78-кДа глюкозорегулируемый белок (GRP78). При стрессе ЭР и накоплении развернутых/неправильно свернутых белков HSPA5 диссоциирует и приводит к активации этих эффекторов, которые затем активируют ряд нижестоящих мишеней, которые помогают в разрешении стресса ЭР и, в экстремальных условиях,способствуют гибели клеток. При диссоциации от HSPA5 PERK аутофосфорилатируется, и его киназная активность активируется7. Его киназная активность фосфорилирует eIF2α, что приводит к трансляционному ослаблению, снижая белковую нагрузку ER8. Однако в присутствии фосфо-эукариотического фактора инициации 2α (eIF2α) нетранслируемые открытые рамки считывания на определенных мРНК, таких как ATF4, становятся предпочтительно транслируемыми, регулируя стресс-индуцированные гены. ATF4 и гомологичный белок C/EBP (CHOP) являются факторами транскрипции, которые регулируют гены, вызванные стрессом, и регулируют пути апоптоза и гибели клеток 9,10. Одной из мишеней ATF4 и CHOP является белок, вызывающий остановку роста и индуцируемый повреждением ДНК (GADD34), который вместе с протеинфосфатазой 1 дефосфорилирует peIF2α и действует как регулятор обратной связи для трансляционного ослабления11. Под воздействием ER-стресса ATF6 диссоциирует от HSPA5, и его сигнал локализации по Гольджи подвергается воздействию, что приводит к его транслокации в аппарат Гольджи. В аппарате Гольджи ATF6 расщепляется протеазой сайта-1 (S1P) и протеазой сайта-2 (S2P) с высвобождением расщепленной формы ATF6 (ATF6 P50). Затем ATF6 p50 перемещается в ядро, где он индуцирует экспрессию генов, участвующих в сворачивании, созревании и секреции белка, а также в деградации белка12,13. Во время ER-стресса IRE1 диссоциирует от HSPA5, мультимеризуется и аутофосфорилируется14. Фосфорилирование IRE1 активирует его РНКазный домен, в частности, опосредуя сплайсинг 26 нуклеотидов из центральной части мРНК X-box-связывающего белка 1 (XBP1)15,16. Это приводит к образованию нового С-конца, придающего трансактивационную функцию, генерируя функциональный белок XBP1s, мощный транскрипционный фактор, контролирующий несколько генов, индуцированных стрессом ER17,18. Совместная активность этих транскрипционных факторов включается генетическими программами, направленными на восстановление гомеостаза ЭР.

Существуют различные методы определения напряжения ER и UPR. К ним относятся традиционные методы анализа маркеров УПО19,20. К различным нетрадиционным методам относятся измерение окислительно-восстановительного состояния UPR и распределения кальция в просвете ER, а также оценка структуры ER. Электронная микроскопия может быть использована для того, чтобы увидеть, насколько увеличивается просвет ER в ответ на стресс ER в клетках и тканях. Однако этот метод занимает много времени и зависит от наличия электронного микроскопа, который может быть доступен не каждой исследовательской группе. Кроме того, измерение потока кальция и окислительно-восстановительного состояния ЭР является сложной задачей из-за доступности реагентов. Кроме того, результаты этих экспериментов очень чувствительны и могут быть подвержены влиянию других факторов клеточного метаболизма.

Мощным и простым методом мониторинга выходов УПО является измерение активации различных сигнальных путей УПО, который десятилетиями использовался в различных сценариях стресса. Эти традиционные методы измерения активации УПО экономичны, осуществимы и предоставляют информацию за меньшее время по сравнению с другими известными методами. К ним относятся иммуноблоттинг для измерения экспрессии маркеров UPR на белковом уровне, таких как фосфорилирование IRE1, PERK и eIF2α, и расщепление ATF6 путем измерения P50-формы ATF6 и экспрессии белков других маркеров, таких как HSPA5, сплайсированный XBP1, ATF4, CHOP и GADD34, а также ОТ-ПЦР для определения уровней мРНК, а также сплайсинг мРНК XBP1.

В данной статье описывается валидированный и надежный набор протоколов для мониторинга стресса ER и активации УПО в инфицированных клетках ВИЧ-1, а также для определения функциональной значимости УПО в репликации и инфекционности ВИЧ-1. В протоколах используются легкодоступные и экономичные реагенты и предоставляется убедительная информация о выходах УПО. Стресс ER является результатом накопления развернутых/неправильно свернутых белков, которые склонны к образованию белковых агрегатов21. Мы описываем способ обнаружения этих белковых агрегатов в ВИЧ-1-инфицированных клетках. Окрашивание тиофлавином Т является относительно новым методом, используемым для обнаружения и количественного определения этих белковых агрегатов. Берио и Верштук описали этот метод для обнаружения и количественного определения белковых агрегатов и, следовательно, уровней стресса ER в живых клетках. Было продемонстрировано, что малая флуоресцентная молекула тиофлавина Т (ThT) избирательно связывается с белковыми агрегатами, особенно амилоидными фибриллами.

В этой статье мы описываем использование ThT для обнаружения и количественной оценки ER-стресса в инфицированных клетках ВИЧ-1 и соотносим его с традиционным методом мониторинга UPR путем измерения активации различных сигнальных путей UPR.

Поскольку также отсутствует исчерпывающая информация о роли УПО во время инфицирования ВИЧ-1, мы предоставляем набор протоколов для понимания роли УПО в репликации ВИЧ-1 и инфекционности вириона. Эти протоколы включают лентивирус-опосредованный нокдаун маркеров УПО, а также лечение фармакологическими индукторами стресса ER. В этой статье также показаны типы считывания, которые могут быть использованы для измерения экспрессии гена ВИЧ-1, вирусной продукции, а также инфекционности производимых вирионов, такие как анализ люциферазы на основе длинных терминальных повторов (LTR), иммуноферментный анализ p24 (ИФА) и репортерный анализ окрашивания β-gal соответственно.

Используя большинство из этих протоколов, мы недавно сообщили о функциональном влиянии инфекции ВИЧ-1 на УПО в Т-клетках23, и результаты этой статьи свидетельствуют о надежности описанных здесь методов. Таким образом, в данной статье представлен набор методов для получения исчерпывающей информации о взаимодействии ВИЧ-1 со стрессом ER и активацией УПО.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используются клеточные линии HEK-293T и Jurkat J6 (клеточная линия CD4+T), которые были получены из Cell Repository, NCCS, Пуна, Индия; TZM-bl, клеточная линия, полученная из HeLa, которая интегрировала копии генов β-галактозидазы и люциферазы в промотор24 длинного терминального повтора (LTR) HIV-1 и CEM-GFP (другая клеточная линия CD4+ T)25 , были получены из репозитория NIH AIDS Repository, США.

1. Подготовка и хранение запасов вируса ВИЧ-1

  1. Подготовка поголовья вируса ВИЧ-1
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во всех экспериментах, связанных с ВИЧ-1, рекомендуется применять международные рекомендации, связанные с биобезопасностью, которые доступны в руководстве Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) или Центров по контролю и профилактике заболеваний (CDC). Работа с вирусом и любые эксперименты с живым вирусом должны проводиться только в соответствующем шкафу биобезопасности, расположенном, по крайней мере, в лаборатории уровня BSL2. Производство инфекционных частиц ВИЧ-1 с использованием набора для трансфекции млекопитающих на основе фосфата кальция описано в этом разделе протокола.
    1. Посейте клетки HEK-293T в чашки диаметром 90 мм с 10 мл полного (с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллин-стрептомицина) DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) в контейнере биобезопасности класса II типа A2 и выдерживайте около 12 часов в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 °C так, чтобы слияние клеток составляло 50%-60%.
    2. На следующий день приготовьте смесь для трансфекции: приготовьте раствор А, содержащий 25 г плазмидной ДНК pNL4.3 (молекулярный клон ВИЧ-1) в стерильном буфере, 86,8 мкл 2 M CaCl 2 и оставшуюся стерильную воду, чтобы получить окончательный объем 700 мкл для каждой пластины. Приготовьте раствор В, содержащий 700 мкл 2x HEPES-буферизованного физиологического раствора (HBS) на 1 тарелку. Затем скорректируйте расчет для общего количества пластин.
    3. Теперь добавьте раствор B к решению A по каплям, непрерывно перемещая решение A. Общий объем трансфекционной смеси теперь составляет 1,4 мл на одну тарелку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точное капельное добавление раствора Б к раствору А при непрерывном вихревом приводит к образованию идеальных трансфекционных комплексов.
    4. Инкубируйте эту смесь при комнатной температуре (RT) около 20 минут. Затем медленно добавьте смесь по каплям в каждую тарелку, содержащую свежие 9 мл полного DMEM, и перенесите пластины в инкубатор CO2 . Через 8-10 ч смените имеющийся носитель на свежий 10 мл готового DMEM.
    5. Через 24 часа после смены среды соберите надосадочную жидкость (содержащую вирусные частицы) со всех планшетов в конические пробирки. Центрифугируйте при давлении 600 x g в течение 5 мин с помощью низкоскоростной настольной центрифуги (Table of Materials) для удаления клеточного мусора.
    6. Перенесите надосадочную жидкость в полиалломерные ультрацентрифужные пробирки и поместите их в поворотный ротор ультрацентрифуги (Таблица материалов). Проверьте вес держателей пробирок на предмет равновесия и при необходимости отрегулируйте с помощью стерильной среды.
    7. Ультрацентрифуга при давлении 1 41 000 x g в течение 2,5 ч при 4 °C. После этого осторожно выньте пробирки и медленно сцедите надосадочную жидкость внутрь шкафа биобезопасности.
    8. К грануле (которая сейчас является концентрированным вирусом) в каждой пробирке добавьте 1 мл неполной среды RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 и проведите энергичное пипетирование, чтобы выбить гранулу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула после ультрацентрифуги практически незаметна невооруженным глазом. Таким образом, необходимо обязательно добавить RPMI 1640 в середину трубки, чтобы гранула была правильно выбита.
    9. Затем добавьте 25 мкл 1 М HEPES pH 7,4 к 1 мл вирусной суспензии. Аквотируйте 50 мкл суспензии на 1,5 мл центрифужных пробирок и сразу же храните их в морозильной камере при температуре -80 °C для длительного хранения.
  2. Количественное определение концентрации вируса и инфекционности вирионов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчета инфекционности вируса необходимо сначала количественно определить его концентрацию, что делается с помощью p24 Antigen Capture ELISA (в соответствии с инструкциями производителя и поэтому здесь не описывается; см. Таблицу материалов). Этот процесс дает концентрацию вируса в нанограммах на микролитр (нг/л) запаса, который затем используется для определения числа инфекционного вириона в запасе с помощью следующего эксперимента в репортерных клетках26 TZM-bl.
    1. Подсчитайте и высадите 0,1 x 106 клеток TZM-bl в 24-луночный планшет, используя 500 μл полного DMEM для каждой лунки, и выдержите его в инкубаторе для клеточных культур в течение 10-12 часов.
    2. Убедитесь, что клетки на 50-60% слиты, прежде чем начать инфекцию для количественного определения вируса. Замените существующую среду на 250 мкл свежего полного DMEM в каждую лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошо держите положительный контроль, чтобы исключить любые экспериментальные неисправности.
    3. Рассчитайте количество стандартного вируса, необходимое для заражения 1 нг, 0,1 нг и 0,01 нг в дубликатах. Добавьте в лунки соответствующее количество вируса и подержите планшет в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 4 часов.
    4. Дважды промойте ячейки 500 мкл неполного DMEM, а затем добавьте 500 мкл полного DMEM.
    5. Продолжайте процедуру окрашивания β-галлонами через 36 часов после смены среды.
      1. Выбросьте имеющуюся среду и дважды промойте клетки 1 мл PBS. Зафиксируйте ячейки, добавив 500 мкл фиксирующего раствора (0,25% глутаральдегида в PBS) в каждую лунку, и инкубируйте в RT внутри шкафа биобезопасности в течение 5-7 минут.
      2. Приготовьте раствор для окрашивания, как указано в таблице 1. Держите его подальше от света, так как X-gal светочувствительна.
      3. Промойте клетки один раз 1 мл PBS. Налейте на клетки 500 μL свежеприготовленного раствора для окрашивания и инкубируйте при температуре 37 °C в темноте в течение 2-18 часов.
      4. Чтобы остановить реакцию после этого, промойте клетки 500 мкл 3% диметилсульфоксида (ДМСО) в PBS дважды, а затем держите клетки в 500 мкл свежего PBS.
      5. Подсчитайте синие инфицированные клетки (как показано на рисунке 1А) под микроскопом в 10-кратном увеличении для 5 случайных полей. Возьмите среднее значение по 5 полям и умножьте его на коэффициент поля и коэффициент разбавления. Это позволяет количественно определить количество инфекционных частиц вириона в популяции вируса.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для планшета с 24 лунками коэффициент поля равен 75.
КомпонентыПодготовкаТребуемый объем
ПБСПриготовьте 1x PBS из запаса 10x PBS14 мл
Ферри-ферроцианид калияРастворите 0,82 г феррицианида калия и 1,06 г ферроцианида калия в 25 мл 1x PBS0,75 мл
Хлорид магния1 М в 1 мл 1x PBS15 μл
Х-галРастворите 30 мг в 0,6 мл N,N-диметилформамида (темного цвета)0,3 мл
Итого = 15 мл

Таблица 1: Список компонентов, необходимых для окрашивания β-gal в ячейках TZM-bl.

2. ВИЧ-1 инфекция Т-клеточных линий

  1. Размораживание и культивирование бессмертной линии Т-клеток. В этом исследовании использовалась клеточная линия CEM-GFP, культивируемая в полной среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллин-стрептомицина и 500 мкг/мл G418.
  2. Подсчитайте и возьмите 2 миллиона клеток для каждой временной точки (Неинфицированный, 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч). Неинфицированные клетки немедленно соберите центрифугированием при 100 x g в течение 5 мин и добавьте буфер для лизиса клеток (50 мМ Tris-HCl pH 7,4, 0,12 М NaCl, 5 мМ ЭДТА, 0,5% NP40, 0,5 мМ NaF, 1 мМ DTT), дополненный коктейлем ингибиторов протеазы, 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF) и 1x ингибитора фосфатазы (50 мкл для 1-3 млн клеток) или лизом в реагенте тризол (1 мл на 1-3 млн клеток) для выделения РНК (см. таблицу материалов).
  3. Однократно промойте клетки 1 мл полной среды RPMI 1640, содержащей полибрен (5 мкг/мл) при 100 x g в течение 5 минут при RT. Повторно суспендируйте клетки в 1 мл полной среды.
    Полибрен является катионным полимером, который используется для усиления ретровирусной инфекции в клетках млекопитающих.
  4. Ресуспендируйте 8 миллионов клеток в 1 мл полибрена, содержащей полную среду. Теперь рассчитайте объем вирусного запаса, необходимый для 4 миллионов частиц вириона, добавьте запас вируса и получите общий объем до 2 мл, добавив полную среду. Таким образом, его MOI равен 0,5.
  5. Держите клетки внутри инкубатора CO2 при температуре 37 °C в течение 4 ч, с периодическим простукиванием каждые 30-45 минут.
  6. Через 4 ч раскрутите ячейки и осторожно выбросьте надосадочную жидкость внутрь шкафа биобезопасности с помощью правильных методов утилизации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, центрифугируйте клетки при 100 x g в течение 5 минут при RT.
  7. Дважды промойте ячейки 1 мл неполной среды. Ресуспендируйте клетки в 8 мл полной среды, доведя ее до 1 млн клеток/мл.
  8. В 6-луночном планшете для культивирования тканей засейте равное количество клеток в необходимое количество лунок и держите планшет в инкубаторе сCO2 при температуре 37 °C.
  9. В течение следующих 4 дней собирайте клетки каждые 24 часа, добавляя буфер для лизиса клеток. Также соберите надосадочную жидкость и сразу же перенесите ее в морозильную камеру при температуре -80 °C.
  10. Чтобы проверить, произошло ли заражение, проведите ИФА для захвата антигена p24 для всех временных точек. Делайте правильные разбавления для временных точек, т.е. меньшее разведение для начальных временных точек и большее для последующих в диапазоне от 1:50 до 1:500. Отобразите показания на графике, показывающем прогрессирование инфекции (рисунок 1B).

3. Окрашивание тиофлавином Т для определения напряжения ER

  1. Зафиксировать 1 миллион неинфицированных и 0,5 инфицированных MOI клеток CEM-GFP (взятых через 72 ч инфицированных клеток) 200 мкл 4% параформальдегида в PBS в течение 20 мин в режиме ЛТ.
  2. Гранулируйте клетки в дозе 100 x g в течение 5 минут и обрабатывайте 500 μL 0,1 M глицина в течение 5 минут, после чего дважды промывайте 500 μL PBS. Ресуспендируйте клетки в 100 мкл PBS.
  3. Соберите стеклянные предметные стекла, фильтрующие карты и камеры для образцов. Добавьте 100 μL ресуспендированных клеток в камеры для образцов и вращайте клетки при 1000 x g в течение 4 минут, чтобы приклеить клетки к предметным стеклам в цитоцентрифуге (Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования цитоцентрифугой на предметном стекле не будет обездвиженного достаточного количества клеток, если клеточная суспензия будет слишком разбавлена. Клетки могут слипаться и плохо распределяться после цитоцентрифуги, если клеточная суспензия очень концентрирована.
  4. Пермеабилизируйте клетки в течение 10 минут, используя капли 0,1% Triton-X-100 в PBS (достаточно, чтобы покрыть область, где клетки прилипли) и дважды промойте клетки, положив PBS по каплям и протерев PBS салфеткой, наклонив предметное стекло.
  5. Инкубируйте клетки с 10 мкл 5 мкМ тиофлавина Т в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не мойте после инкубации с ThT.
  6. Установите предметные стекла с использованием 5 μл монтажного материала (80% глицерина v/v, 20% PBS v/v и 8 мг/мл 1,4-диазабицикло[2.2.2]октанового числа [DABCO]), установите покровное стекло и запечатайте покровное стекло лаком для ногтей. Дайте слайдам высохнуть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На всех этих этапах следите за тем, чтобы клетки не пересыхали.
  7. Сделайте конфокальные изображения неподвижных клеток с помощью 63-кратной глицериновой иммерсионной линзы на конфокальном микроскопе (см. Таблицу материалов). Отрегулируйте следующие настройки возбуждения и излучения: GFP (Ex. 494 nm, Em. 519 nm) и ThT (Ex. 458 nm, Em. 480-520 nm).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый флуоресцентный канал должен визуализироваться последовательно, а не одновременно, чтобы избежать перекрытия каналов. GFP был принят в качестве индикатора ВИЧ-1-инфекции, поскольку клетки CEM-GFP имеют GFP под регуляцией промотора LTR, который воздействует на ВИЧ-1-инфекцию25.
  8. Преобразуйте флуоресцентные изображения в 8-битные перед количественной оценкой с помощью порогового анализа. Количественно оцените интенсивность каждой ячейки вручную с помощью программного обеспечения, такого как Image J (~50 клеток)27. Постройте график с интенсивностью каждой клетки в виде точек на оси Y по неинфицированным и инфицированным критериям.
  9. Чтобы продемонстрировать эффективность данного протокола, возьмем положительный контроль, например, лечение Тапсигаргином (известным индуктором стресса ER) в данном случае28. Обработайте 1 миллион клеток CEM-GFP, каждая с 1 мкл ДМСО (контроль транспортного средства) и 100 нМ тапсигаргина в течение 12 ч.
  10. Соберите клетки и обработайте их для окрашивания ThT, как указано для инфицированных образцов (шаги 3.1-3.8).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих образцов флуоресценция GFP не требуется. Следовательно, в конфокальной микроскопии регистрируется только флуоресценция ThT.

4. Определение активации и экспрессии различных маркеров УПО

ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения экспрессии маркеров UPR используются два метода: иммуноблоттинг и ОТ-ПЦР. Для иммуноблоттинга собирают 0,5 инфицированных MOI ВИЧ-1 клеток CEM-GFP в различные моменты времени после заражения (через 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч после заражения) и ресуспендируют клеточную гранулу в буфере для лизиса (как указано на шаге 2.2). В качестве альтернативы, для ОТ-ПЦР клеточные гранулы лизируют в реагенте Тризол (1 мл на 1-3 млн клеток) (см. таблицу материалов). Клетки, ресуспендированные в буфере для лизиса и реагенте Тризол, могут храниться при температуре -80 °C до дальнейшего использования.

  1. Иммуноблоттинг для анализа маркеров UPR.
    1. Ресуспендированные клетки держать в буфере для лизиса на льду в течение 45 минут с прерывистым перемешиванием с помощью вихря.
    2. Гранулируйте ячейки при давлении 18000 x g в течение 15 минут с помощью настольной высокоскоростной центрифуги (см. Таблицу материалов). Соберите надосадочную жидкость в свежую пробирку.
    3. Количественно оцените концентрацию белка в каждом образце с помощью реагента Брэдфорда или аналогичного реагента.
    4. Возьмите одинаковую концентрацию белка для каждого образца и приготовьте образцы белка в буфере Laemmli (6x буфер: 250 мМ Tris-Cl pH 6,8, 10% SDS, 30% глицерина и 0,02% бромофенолового синего; 5% β-меркаптоэтанол).
      Примечание: Для иммуноблоттинга для каждого маркера UPR использовали минимум 60-80 мкг белка.
    5. Отварите образцы белка при температуре 96 °C в течение 5 минут и дайте короткому отжиму.
    6. Разрешите образцы белка на 10%-12% геле SDS-PAGE и перенесите белки на мембрану из поливинилидендифторида (PVDF) (см. Таблицу материалов).
    7. Вмешайте в 5% обезжиренное сухое молоко или бычий сывороточный альбумин (БСА) в течение 1-2 ч, дважды промойте TBST (20 мМ Tris pH7,4 и 0,137 М NaCl; 0,1% Tween 20) и прозондируйте белково-специфическими первичными антителами против маркеров UPR (см. Таблицу материалов) в коромысле в течение ночи при 4 °C. На следующий день после двукратного промывания блоттинга TBST зонд с соответствующими вторичными антителами в течение 1,5 ч.
    8. Снова промойте блоттинг с помощью TBST и визуализируйте белковые полосы с помощью субстрата, детектирующего хемилюминесценцию (см. Таблицу материалов) в вестерн-блоттинге.
  2. ОТ-ПЦР
    1. Выделите общую РНК из клеток с помощью реагента Тризол (см. Таблицу материалов).
    2. Получить кДНК из равной концентрации РНК с использованием обратной транскриптазы вируса мышиного лейкоза Молони (MMLV-RT) (см. Таблицу материалов).
    3. Проанализируйте модуляцию экспрессии мРНК HSPA5, сплайсированных XBP1, ATF4, CHOP и GADD34 с помощью qRT-PCR с ген-специфичными праймерами (табл. 2). Кратко приготовьте 10 мкл реакционных смесей, содержащих матрицу кДНК (100 нг), 5 мкл красителя SYBR Green (см. Таблицу материалов) и по 10 пмоль каждой ген-специфичной пары олигонуклеотидных праймеров. Отрегулируйте громкость с помощью стерильного H2O.
    4. Запустите смеси на ПЦР-машине в реальном времени с использованием следующей программы: начальная денатурация при 95 °C в течение 3 мин и 40 циклов при 95 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с с последующим анализом кривой расплава. Рассчитайте кратное изменение экспрессии целевого гена относительно домашнего гена (например, β-Актина) следующим образом:
      Изменение складки = 2-Δ(ΔCT)
      Где ΔCT = CT (мишень) − CT (ген, отвечающий за ведение хозяйства)
      и Δ(ΔCT) = ΔCT (обработанный) -ΔCT (контроль)
    5. Для дальнейшего подтверждения сплайсинга XBP1 проведите полуколичественную ОТ-ПЦР с неинфицированными и инфицированными через 72 ч образцами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сплайсинг мРНК XBP-1 изучают с помощью ОТ-ПЦР по сайту сплайсинга.
    6. Амплифицируют кДНК праймерами XBP1 (Таблица 2) с использованием высокоточной мастер-смеси ПЦР (см. Таблицу материалов) в следующих условиях: 1 цикл при 98 °C в течение 30 с, затем 5 циклов при 98 °C в течение 15 с, 65*Δ-5 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с, а затем 30 циклов при 98 °C в течение 15 с, 55 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с, после чего следует окончательное продление до 72 °C в течение 10 мин и выдержка при 4 °C.
    7. Разделите ампликоны на 2,5% агарозном геле, содержащем 50 нг бромида этидия/мл, и визуализируйте в гелевом инструменте. Сплайсированная полоса XBP1 меньше на 26 нуклеотидов.

5. Нокдаун маркеров UPR и анализ экспрессии генов HIV-1 LTR и продукции вируса

  1. Подготовка конструкций shRNA для нокдауна UPR-маркеров
    1. Создание конструкций shRNA с использованием векторной основы pLKO.1-TRC (вектор клонирования лентивируса)29.
    2. Создайте две конструкции shRNA для каждого гена (IRE1, PERK, ATF6 и HSPA5). Смысловые и антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на мРНК соответствующего гена, разработаны консорциумом RNAi (https://www.broadinstitute.org/rnai-consortium/rnai-consortium-shrna-library) (табл. 3).
      Примечание: Аналогичным образом, конструкции shRNA могут быть созданы для других маркеров UPR.
    3. Отжигните капсюли (по 100 нМ в прямом и обратном направлении) при температуре 95 °C с последующим постепенным охлаждением до RT.
    4. Затем лигируйте его на сайты Age1 и EcoRI вектора pLKO.1 с помощью ДНК-лигазы T4 (см. Таблицу материалов). Подтвердите последовательность с помощью секвенирования ДНК.
      Примечание: Конструкция shRNA, нацеленная на ген LacZ, используется в качестве нецелевого контроля.
  2. Нокдаун PERK, ATF6, IRE1 и HSPA5 в клетках HEK-293T, анализ на люциферазу и ИФА p24
    1. Приготовьте смесь шРНК-конструкта (0,9 мкг) и трансфективного реагента, такого как полиэтиленимин (ПЭИ) (3 мкл ПЭИ на 1 мкг ДНК) (см. Таблицу материалов) в 50 мкл среды, не содержащей сыворотки, путем вортексирования и инкубируйте в течение 20 мин.
    2. Из конфлюентных клеток HEK-293T, содержащих колбу, трипсинизируют и затравливают ~0,25 x 106 клеток вместе с трансфекционной смесью в 24-луночном планшете, что составляет общий объем 125 μL и инкубируют в течение 6 часов при 37 °C в инкубаторе CO2 . Этот метод называется обратной трансфекцией, при котором клетки засеваются вместе с трансфекционной смесью.
    3. Через 6 ч добавьте в лунки 125 мкл готовой среды и повторно суспендируйте ячейки для равномерного посева.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов с нокдауном обратная трансфекция (шаги 5.2.1-5.2.3) обеспечивает лучшую эффективность как с shRNA, так и с миРНК.
    4. Через 24 ч выполните повторную трансфекцию. Приготовьте смесь конструкций pNL4-3 (100 нг), pLTR-Luc (100 нг) и pEGFP-N1 (50 нг) (pNL4-3:pLTR-Luc:pEGFPN1-1:1:0.5) с PEI (3 мкл PEI на 1 г ДНК) в 50 мкл неполной среды путем вортексирования. Инкубируйте смесь в течение 20 минут при RT. Замените существующую среду 250 μл свежей неполной среды и добавьте смесь в ячейки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Репортерный вектор для HIV-1 LTR был разработан путем субклонирования LTR из pU3RIII30,31 в pGL3basic в лабораторных условиях ранее32. Экспрессия GFP с использованием pEGFP-N1 была использована для нормализации эффективности трансфекции32.
    5. Смените среду через 6 ч после трансфекции 500 мкл полной DMEM. Забор клеток через 36 ч для иммуноблоттинга и анализа люциферазы.
    6. Для анализа люциферазы гранулируют клетки и ресуспендируют в коммерчески закупаемом субстрате люциферазы (50 мкл) (см. Таблицу материалов). Добавьте ресуспензионный лизат клеток в непрозрачную 96-луночную пластину и инкубируйте в течение 10-15 минут. Получите показания люциферазы в люминометре. Также измерьте флуоресценцию GFP в тех же образцах для нормализации показаний люциферазы в микропланшетном микромодальном считывателе планшетов (Ex: 494 нм, Em: 519 нм).
    7. Постройте график в виде единицы люциферазы/GFP по оси Y.
      Примечание: Следует проверить нокдаун соответствующих маркеров UPR, и это можно сделать либо с помощью иммуноблоттинга, либо с помощью qRT-ПЦР с использованием ген-специфических антител или праймеров, соответственно.
    8. Соберите надосадочную жидкость для обработки для p24 ELISA, как упоминалось выше.
  3. Создание стабильных клеток с нокдауном маркеров UPR и инфекцией ВИЧ-1.
    1. Частицы лентивируса получают путем трансфекции клеток HEK-293T, посеянных в 6-луночный планшет, с соответствующими конструкциями шРНК (1 мкг) вместе с pMD2.G (вектор оболочки VSV-G) (0,75 мкг) и psPAX2 (лентивирусная упаковочная плазмида) (0,25 мкг) (см. Таблицу материалов) с использованием ПЭИ в соотношении 1 мкг ДНК: 3 мкл ПЭИ. Приготовьте смесь в 100 μл неполного DMEM и инкубируйте в течение 20 мин при RT. Добавьте смесь к 1,8 мл готовой среды в высеянных клетках HEK-293T.
      Примечание: Высевайте клетки HEK-293T в 6-луночной тарелке не менее чем за 12 часов до трансплантации до тех пор, пока они не приобретут морфологию и не станут примерно на 60-70% конфлюентными.
    2. Через 24 ч после трансфекции добавьте 1 мл полного DMEM в каждую лунку.
    3. Соберите надосадочную жидкость через 48 ч, храните при температуре -80 °C в морозильной камере и выполните p24 ELISA для подтверждения наличия вируса в этих надосадочных зонтах. Используйте этот необработанный лентивирусный надосадочный агент для трансдуцирования клеток J6.
    4. Инкубируйте 2 миллиона клеток в 6-луночном планшете с равным объемом лентивирусной надосадочной жидкости (500 мкл) для каждого контрольного и ген-специфичного нокдаун-лентивируса и добавьте свежую полную среду RPMI 1640 в присутствии полибрена (5 мкг/мл) для увеличения объема до 2 мл.
    5. Через 24 ч добавьте пуромицин (1 мкг/мл) в каждую лунку, чтобы выбрать стабильные клетки. После добавления Пуромицина гранулируйте клетки каждые 24 ч и добавьте 2 мл свежей среды с Пуромицином.
    6. Делайте это до тех пор, пока не произойдет гибель клеток (~1 неделя). Выжившие клетки – это стабильные клетки с нужным нокдауном гена.
      Примечание: Нокдаун соответствующих генов может быть проверен через равные промежутки времени и, наконец, когда в пуромицин-содержащих средах видны только выжившие клетки, с помощью иммуноблоттинга или qRT-PCR.
    7. Инфицируйте LacZ и ген-специфические нокдаун-клетки 0,5 MOI ВИЧ-1, как описано в разделе 2, и собирайте клетки через 48 ч после заражения.
    8. Соберите надосадочную жидкость из каждого образца и обработайте p24-ELISA, как описано ранее, и обработайте клетки для проверки уровня нокдауна с помощью иммуноблоттинга.

6. Лечение индуктором стресса ER и анализ его влияния на репликацию ВИЧ-1

Примечание: Для определения эффекта гиперстимуляции УПО во время репликации ВИЧ-1 можно использовать молекулу фармакологического индуктора Тапсигаргин.

  1. Определение процента жизнеспособности клеток при лечении Тапсигаргином.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цитотоксичность тапсигаргина определяется реагентом МТТ (см. Таблицу материалов).
    1. Засейте 25 000-30 000 ячеек CEM-GFP на лунку в 96-луночный планшет, содержащий 100 мкл полного RPMI 1640. Добавьте 100 нМ Тапсигаргина в среду и инкубируйте при 37 °C в инкубаторе.
      Примечание: Клетки, обработанные 1 мкл ДМСО, были взяты в качестве контрольных носителей.
    2. Через 48 ч добавьте по 10 мкл МТТ (5 мг/мл) в каждую лунку и инкубируйте в темноте в течение 4 ч для образования кристаллов формазана при 37 °C с 5%CO2.
    3. Через 4 ч растворите кристаллы с помощью 100 мкл изопропанола до получения фиолетового цвета и измерьте поглощение на длине волны 570 нм с помощью спектрофотометра.
    4. Рассчитайте процент жизнеспособности клеток на основе уравнения, приведенного ниже
      % жизнеспособности клеток = (КонтрольOD570 - ЛечениеOD570) / КонтрольOD570 x 100
  2. Предварительное лечение тапсигаргином и анализ прогрессирования ВИЧ-1-инфекции методом p24 ИФА.
    1. Засейте 1 миллион клеток CEM-GFP в 12-луночный планшет, содержащий 1 мл полного RPMI 1640, и обработайте клетки 100 нМ тапсигаргина или 1 мкл ДМСО (контроль транспортного средства) в течение 12 ч в инкубаторе CO2 при температуре 37 °C. Через 12 ч промойте клетки полным RPMI 1640 и инфицируйте 0,5 MOI ВИЧ-1, как описано ранее.
    2. Собирайте клетки в разные моменты времени, например, через 24 часа, 48 часов и 72 часа после заражения, для иммуноблоттинга.
    3. Соберите надосадочную жидкость из каждого образца и проведите ИФА p24, как описано ранее.
    4. Постройте график с концентрацией p24 в образце по оси Y и соответствующими временными точками по оси X.
    5. С помощью иммуноблоттинга проанализировать индукцию стресса ER из-за лечения тапсигаргином путем измерения уровня любых маркеров UPR. В этом исследовании в качестве маркера использовался HSPA5.

7. Анализ инфекционности TZM-bl β-gal для определения влияния UPR на инфекционность вирионов

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы понять роль УПО в инфекционности вириона, надосадочная жидкость из нокдауна, а также лечение Тапсигаргином могут быть использованы для анализа инфекционности TZM-bl β-gal, как описано в разделе 1.2, на основе концентрации p24, определенной с помощью p24 ELISA.

  1. Заражайте клетки TZM-bl с равной концентрацией p24 из каждого образца и проводите окрашивание β-gal. Подсчитайте синие зараженные клетки под микроскопом в 10-кратном увеличении для 5 случайных полей.
  2. Возьмите среднее значение количества 5 полей для каждой выборки из описанных выше шагов.
  3. Рассчитайте изменение сгиба, как указано ниже:
    Изменение кратности = Среднее количество синих клеток в тестовых образцах/Среднее количество синих клеток в контрольном образце.

Результаты

В данной работе мы описали подробный протокол изучения стресса ER in vitro и активации UPR при инфицировании ВИЧ-1 в Т-клетках (рис. 2). В этом исследовании также описаны методы анализа функциональной значимости УПО в репликации ВИЧ-1 и инфекционности вирионов (рис. 3).

С этой целью мы проанализировали стресс ER, вызванный инфекцией ВИЧ-1, наблюдая за белковыми агрегатами внутри клетки при окрашивании тиофлавином Т. Как показано на рисунке 4А, интенсивность ThT представляет собой белковые агрегаты в неинфицированных и инфицированных клетках. Аналогично, в качестве положительного контроля, на рисунке 4B представлено окрашивание ThT в клетках, обработанных Тапсигаргином. Повышенная интенсивность ThT предполагает наличие большего количества белковых агрегатов, что коррелирует с усилением стресса ER.

Кроме того, для подтверждения этого наблюдения был использован более традиционный метод, который включал анализ маркеров УПО. Активация UPR первоначально анализировалась путем активации первичных эффекторов -IRE1, ATF6 и PERK. Активация IRE1 была измерена путем анализа уровней фосфо-IRE1 путем иммуноблоттинга лизатов неинфицированных и инфицированных клеток, собранных в разные моменты времени после инфицирования, как показано на рисунке 5A. Повышение уровня pIRE1/общего IRE1 предполагает активацию IRE1. Аналогичным образом, активация PERK измерялась уровнями фосфо-PERK в неинфицированных и инфицированных клетках (рисунок 5B). Активацию ATF6 количественно оценивали по уровню экспрессии формы ATF6 P50 с помощью иммуноблоттинга (рис. 5C). Еще одним важным маркером UPR является главный регулятор и шаперон ER, HSPA5. Уровень HSPA5 также анализировали с помощью иммуноблоттинга, как показано на рисунке 5D. Аналогичный протокол был использован для других маркеров УПО, таких как sXBP1, peIF2α, ATF4, CHOP и GADD34, с использованием их специфических антител (дополнительный рисунок 1). Сплайсинг мРНК XBP1 может быть проанализирован как с помощью количественной ОТ-ПЦР (рис. 5E), так и с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР. Поскольку количественная ОТ-ПЦР не могла конкретно идентифицировать сплайсинг, она была сопряжена с анализом сплайсинга, где использовалась полуколичественная ОТ-ПЦР (рис. 5F). При использовании вышеупомянутого протокола мы обнаружили, что данные qRT-PCR совпадают с данными полу-qRT-PCR. Аналогично qRT-ПЦР, выполненной для sXBP1, протокол был использован для анализа других маркеров UPR, таких как HSPA5, ATF4, CHOP и GADD34 на уровне мРНК (дополнительный рисунок 2)

Затем, чтобы исследовать роль УПО в репликации ВИЧ-1 и инфекционности вириона, мы провели нокдаун определенных маркеров УПО: PERK и HSPA5. Используя упомянутые протоколы, мы добились нокдауна этих маркеров до значимого уровня как в клетках HEK-293T (рис. 6A), так и в клетках J6 (рис. 6B). Используя эти нокдаун-клетки, мы исследовали эффект нокдауна активности гена, управляемого LTR ВИЧ-1 (рис. 6A), который представлен в виде соотношения экспрессии Luc/GFP в соответствующих образцах. Продукцию вируса измеряли с помощью p24 ИФА надосадочной жидкости, как показано на рисунке 6B. Инфекционность полученных вирионов также может быть проанализирована с использованием протокола окрашивания β-gal таким же образом, как показано на рисунке 1A.

Кроме того, с помощью химического индуктора стресса ER, тапсигаргина, можно изучить влияние чрезмерной стимуляции UPR на репликацию ВИЧ-1, продукцию вируса и инфекционность вириона. Цитотоксичность тапсигаргина в данной концентрации анализировали с помощью анализа МТТ (рис. 7А), который показывает, что цитотоксичность при желаемой концентрации незначительна. Иммуноблоттинг на HSPA5 проводили для анализа влияния препарата на стресс ER (рис. 7B). Результаты показывают, что 12-часовая предварительная обработка 100 нМ тапсигаргином индуцировала экспрессию HSPA5 в все моменты времени. ИФА p24 показывает влияние на продукцию вирусов и инфекционность производимых вирионов, которые можно проанализировать, как описано ранее.

figure-results-1
Рисунок 1: Количественная оценка инфекционности вирионов и анализ прогрессирования инфекции. (A) Количественная оценка инфекционности вирионов с помощью анализа β-gal на основе TZM-bl. Инфекционность вируса определяли путем добавления 1 нг, 0,1 нг и 0,01 нг вируса к клеткам TZM-bl с последующим окрашиванием β-gal и подсчетом количества синих клеток. Увеличение: 10x. (B) Анализ прогрессирования инфекции в клетках CEM-GFP, инфицированных MOI HIV-1, 0,5 на основе ИФА захвата антигена p24 супернатантами культур. Клетки CEM-GFP инфицировали 0,5 MOI ВИЧ-1, а надосадочную жидкость обрабатывали на p24 ИФА. Полосы погрешностей отображаются в виде средних значений ± S.E. Звездочками обозначен уровень значимости, который обозначается на рисунках как нс = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 и ****=p ≤ 0,0001 по анализу t-критерия Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Схематическое представление шагов, которые необходимо выполнить для анализа влияния инфекции ВИЧ-1 на стресс ER и UPR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Блок-схема шагов, которые необходимо предпринять для анализа влияния УПО на репликацию ВИЧ-1, производство вируса и инфекционность вириона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Анализ уровня стресса ER в Т-клетках из-за инфекции ВИЧ-1 с использованием окрашивания ThT. (A) Клетки CEM-GFP были инфицированы 0,5 MOI ВИЧ-1 и собраны через 72 ч после заражения. Клетки были зафиксированы и окрашены тиофлавином T. Экспрессия GFP указывает на инфицированные клетки CEM-GFP. На графике показана интенсивность Тиофлавина Т в случае неинфицированных и ВИЧ-1 инфицированных клеток. На графике представлены данные от ~50 клеток из n = 3 биологических репликатов. (B) Клетки CEM-GFP обрабатывали ДМСО и ТГ в течение 12 ч. Клетки фиксировали и окрашивали тиофлавином Т. На графике показана интенсивность Тиофлавина Т в случае клеток, обработанных ДМСО и ТГ. На графике представлены данные от ~50 клеток из n = 3 биологических репликатов. Полосы погрешностей отображаются в виде средних значений ± S.E. Звездочками обозначен уровень значимости, который обозначается на рисунках как нс = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 и **** = p ≤ 0,0001 по результатам анализа t-критерия Стьюдента. ООН: Неинфицированные; IN: инфицирован; ТГ: Тапсигаргин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Анализ экспрессии различных маркеров UPR в инфицированных ВИЧ-1 Т-клетках. (A-E) Инфицированные ВИЧ-1 (0,5 MOI) клетки CEM-GFP собирали до 4-го дня каждые 24 часа и обрабатывали для различных анализов, как описано ниже. (A) Активацию IRE1 анализировали с помощью иммуноблоттинга pIRE1. (B) Активацию PERK анализировали с помощью иммуноблоттинга pPERK. (C) Активацию ATF6 анализировали с помощью иммуноблоттинга формы ATF6 P50. (D) Экспрессию ER chaperone HSPA5 анализировали с помощью иммуноблоттинга HSPA5. (E) Сплайсинг XBP1 анализировали с помощью qRT-PCR sXBP1 с использованием специальных праймеров в реальном времени. (F) Для анализа сплайсинга XBP1 с помощью полу-qRT-PCR МРНК XBP-1 амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР по сайту сплайсинга, и полосы визуализировали. Полосы погрешностей отображаются в виде средних значений ± S.E. ООН: Неинфицированный. IN: Инфицирован. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Анализ роли UPR в репликации ВИЧ-1 и производстве вируса. (A) PERK (левая панель) и HSPA5 (правая панель) были подавлены в клетках HEK-293T, и был проведен анализ люциферазы для анализа активности гена, управляемого HIV-1 LTR. Иммуноблоттинг показывает нокдаунуальные уровни соответствующих белков. (B) PERK (левая панель) и HSPA5 (правая панель) были сбиты в клетках J6, а p24 ELISA был проведен с супернатантом, собранным для анализа продукции вируса. Иммуноблоттинг показывает нокдаунуальные уровни соответствующих белков. Полосы погрешностей отображаются в виде средних значений ± S.E. Звездочками обозначен уровень значимости, который обозначается на рисунках как нс = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 и ****=p ≤ 0,0001 по анализу t-критерия Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 7: Анализ влияния химического индуктора стресса ER, тапсигаргина, на прогрессирование инфекции ВИЧ-1. (А) Жизнеспособность клеток CEM-GFP при обработке 100 нМ Тапсигаргином. Жизнеспособность клеток анализируется с помощью анализа МТТ. (B) Клетки CEM-GFP, предварительно обработанные 100 нМ TG в течение 12 ч, были инфицированы 0,5 MOI ВИЧ-1 и были собраны через 24 ч, 48 ч и 72 ч после заражения. Иммуноблот показывает влияние ТГ на экспрессию HSPA5, в то время как график показывает продукцию вируса, проанализированную с помощью p24 ELISA. Полосы погрешностей отображаются в виде средних значений ± S.E. Звездочками обозначен уровень значимости, который обозначается на рисунках как нс = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 и ****= p ≤ 0,0001 по анализу t-критерия Стьюдента. ТГ: Тапсигаргин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок 1: Анализ экспрессии различных нисходящих маркеров УПО. Экспрессия (A) sXBP1, (B) фосфорилирования eIF2α, (C) ATF4, (D) CHOP и (E) GADD34 при анализе методом иммуноблоттинга. (А-Е) Клетки CEM-GFP, инфицированные 0,5 MOI ВИЧ-1, собирали через 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч после заражения и использовали для иммуноблоттинга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Анализ различных маркеров УПО на уровне мРНК методом qRT-PCR. (А-Г) Клетки CEM-GFP, инфицированные 0,5 MOI ВИЧ-1, собирали каждые 24 ч до 4-го дня и использовали для qRT-ПЦР (A) HSPA5, (B) ATF4, (C) CHOP и (D) GADD34. Полосы погрешностей отображаются в виде средних значений ± S.E. Звездочками обозначен уровень значимости, который обозначен на рисунках как нс = p ≥ 0,05, * = p ≤ 0,05, ** = p ≤ 0,01, *** = p ≤ 0,001 и **** = p ≤ 0,0001 по результатам анализа t-критерия Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

СтроитьПоследовательность праймеров от 5' до 3'
XBP1 АНАЛИЗ СРАЩИВАНИЯ FTTACGAGAGAAAACTCATGGCC
XBP1 ПРОБИРНЫЙ АНАЛИЗ RGGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC
СРАЩЕННЫЙ XBP1 FCTGAGTCCGAATCAGGTGCAG
СРАЩЕННЫЙ XBP1 RATCCATGGGGAGATGTTCTGG
HSPA5 FCACAGTGGTGCCTACCAAGA
HSPA5 RTGATTGTCTTTTTTGTCAGGGGT
АТФ4 ФAGTCCCTCCAACAACAGCAA
АТФ4 РGAAGGTCATCTGGCATGGTT
ЧОП ФCAGTGTCCCGAAGGAGAAAG
ЧОП РCAGAGCTGGAACCTGAGGAG
ГАДД34 ФATGGACAGTGACCTTCTCGG
ГАДД34 РCTGGGCTCCTCCTTAGGCT
АКТИН ФАГААААТКТГГКАККАКК
АКТИН РGGGGTGTTGAAGGTCTCAAA

Таблица 2: Список праймеров, используемых для анализа ОТ-ПЦР. F: Вперед; R: Реверс

Конструкт шРНКПоследовательность праймеров от 5' до 3'
ПЕРК SH1 FCCGGCGGCAGGTCATTAGTAATTATCTCGAGATAATTACTAATGACCTGCCGTTTTTG
ПЕРК SH1 RAATTCAAAAACGGCAGGTCATTAGTAATTATCTCGAGATAATTACTAATGACCTGCCG
ПЕРК SH2 FCCGGGCCACTTTGAACTGAGTACCGAAGTTCAAAGTTTTG
ПЕРК SH2 RAATTCAAAAAGCCACTTTGAACTTCGGTATACTCGAGTATACCGAAGTTCAAAGTGGC
АТФ6 Ш1 ФCCGGCCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTGGGTTTTTG
АТФ6 Ш1 РAATTCAAAAACCCAGAAGTTATCAAGACTTTCTCGAGAAAGTCTTGATAACTTCTGGG
АТФ6 Ш2 ФCCGGCCTAGTCCAAAGCGAAGAGTTCTCGAGAACTCTTCGCTTTGGACTAGGTTTTTG
АТФ6 Ш2 РAATTCAAAAACCTAGTCCAAAGCGAAGAGTTCTCGAGAACTCTTCGCTGGACTAGG
ИРЭ1 Ш1 ФCCGGCCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGACATTAAGCAGTTTTG
ИРЭ1 Ш1 РAATTCAAAAACCTGCTTAATGTCAGTCTACACTCGAGTGTAGACTGAGTAGACTGAGTAGTAAGCAGG
ИРЭ1 Ш2 ФCCGGCCCATCAACCTCTTCTCTCTACTCGAGTACAGAAGAGAGGTTGATGGGTTTTTG
ИРЭ1 Ш2 РAATTCAAAAACCCATCAACCTCTTCTCTCTCTCTCGAGTACAGAAGAAGAGGTTGATGGG
HSPA5 SH1 FCCGGGAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTTTTTTTG
ХСПА5 Ш1 РAATTCAAAAAGCGCATTGATACTAGAAATCTCGAGATTTCTAGTATCAATGCGCTC
HSPA5 SH2 FCCGGGTGAGTGATCACTCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCACTTTTTG
HSPA5 SH2 RAATTCAAAAGTGAGTGAGTGATCACTGGTATTAACTCGAGTTAATACCAGTGATCACTCAC
LacZ FCCGGTCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTTTAATACGATTTTTG
LacZ RAATTCAAAAATCGTATTACAACGTCGTGACTCTCGAGAGTCACGACGTTTTAATACGA

Таблица 3: Список праймеров, используемых для генерации конструкций shRNA. F: Вперед; R: Реверс

Обсуждение

Сфера применения настоящего протокола включает в себя: (i) обработку запасов вируса ВИЧ-1 и измерение концентрации вируса и инфекционности вириона, (ii) инфицирование Т-клеток ВИЧ-1 и оценку его влияния на стресс ER и различные маркеры УПО, (iii) влияние нокдауна маркеров УПО и их влияние на активность гена, управляемого LTR ВИЧ-1, продукция вируса и инфекционность вириона, а также (iv) гиперстимуляция УПО с использованием фармакологической молекулы и анализ его влияния на репликацию ВИЧ-1. Используя настоящий набор протоколов, можно получить всестороннюю информацию о взаимодействии ВИЧ-1 и УПО. Протоколы, перечисленные в этом исследовании, просты в исполнении, экономичны и очень надежны.

Поскольку UPR является чувствительным к напряжению сигнальным путем, работа над ним включает в себя довольно тонкие шаги. Во всех экспериментах мы рекомендуем избегать длинных клеток, чтобы получить стабильные результаты. Также важно поддерживать стерильные условия во всех методах культивирования клеток, чтобы избежать бактериального и дрожжевого загрязнения, поскольку они могут помешать экспериментам и получению соответствующих результатов. Кроме того, при работе с клетками во время экспериментов, включая их последующее культивирование, предотвращайте резкие или длительные изменения температуры и убедитесь, что клетки здоровы и не подвержены стрессу. В противном случае изменения могут вызвать дополнительную нагрузку на клетки, что может изменить результаты. Старайтесь сохранять временные точки как можно более фиксированными, поскольку UPR является чувствительным сигнальным путем, и небольшое изменение временных точек может изменить результаты.

Метод окрашивания ThT, который обнаруживает белковые агрегаты и используется для определения стресса ER22, очень четко показывает уровни стресса ER в инфицированных клетках ВИЧ-1. Окрашивание ThT основано на обнаружении белковых агрегатов, которые коррелируют с стрессом ER. Однако следует отметить, что активация UPR не всегда может быть коррелирована с белковыми агрегатами, поскольку отдельные сигнальные пути UPR могут быть активированы напрямую, без участия белковых агрегатов. Таким образом, несмотря на то, что этот метод окрашивания ThT дает представление об уровнях стресса ER, для глубокого анализа активации UPR он всегда должен быть валидирован дальнейшим анализом маркеров UPR. Кроме того, для дальнейшего определения субклеточной локализации окрашивания ThT могут быть использованы такие маркеры, как KDEL, в случае маркировки ER. Кроме того, во многих случаях стресс ER приводит к изменению размера и формы клеток, поэтому при количественной оценке интенсивности ThT можно также учитывать площадь клеток. Доступность высокочувствительных, надежных и экономически эффективных коммерческих ген-специфических антител произвела революцию во многих аспектах науки о жизни, позволив упростить анализ уровней белка в клетках. Кроме того, в настоящее время доступны высокочувствительные типы оборудования для визуализации белковых полос на блоттинге и делают количественное определение быстрым и простым. Таким образом, активация маркеров UPR может быть легко проанализирована с помощью иммуноблоттинга. Однако, поскольку экспрессия белков-маркеров UPR относительно низка, необходимо использовать значительную концентрацию белка для анализа их экспрессии. Кроме того, разведение первичных антител должно быть правильно оптимизировано в зависимости от экспрессии белка в используемых клетках, чтобы избежать неспецифического связывания и фонового шума в блотах. Кроме того, как показано в Рисунок 4C, антитело ATF6 является поликлональным и дает ряд неспецифических полос. Надлежащая оптимизация промывки и концентрации антител необходима для уменьшения этих неспецифических полос до некоторой степени. Блоттинги следует тщательно промывать после инкубации в блокирующем растворе, первичном антителе и вторичном антителе для уменьшения фоновых и неспецифических полос. При развитии клякс следует избегать перенасыщения полос для получения правильной визуализации рисунка в полученных результатах. Рассматривая широкую направленность этой статьи, мы не сосредоточились на подробных методах и устранении неполадок для общих методов иммуноблоттинга; тем не менее, можно обратиться к методическим статьям Махмуда и Янга33 а также Ghosh et al.34 для того же. Поскольку в настоящее время ОТ-ПЦР является очень широко используемым методом, легкодоступные праймеры и машины ОТ-ПЦР предоставляют данные для анализа определенных маркеров УПО. Тем не менее, следует соблюдать меры предосторожности при подготовке РНК и кДНК к ОТ-ПЦР, поскольку это очень чувствительный метод, и незначительные изменения в качестве образцов и пипетирования могут привести к огромным вариациям в показаниях. Любое загрязнение ДНК или белков должно быть удалено из образцов РНК. Кроме того, всегда отбирайте образцы в трех экземплярах для qRT-PCR, чтобы уменьшить погрешность пипетирования. Концентрация ДНК, используемой для qRT-PCR, должна быть оптимизирована таким образом, чтобы значение CT для каждого образца было ниже 30, поскольку все, что выше 30, не считается идеальным. Для qRT-PCR всегда следует сохранять отрицательный контроль, чтобы избежать ложноположительных результатов. Сплайсинг XBP1 может быть проанализирован как с помощью qRT-PCR, так и с помощью semi-qRT-PCR. Поскольку кОТ-ПЦР не будет точно показывать сплайсинг, полу-кОТ-ПЦР всегда следует проводить отдельно от кОТ-ПЦР для проверки данных и определения относительного соотношения сплайсированных XBP1 и несплайсированных XBP1. Поскольку разница между размером сплайсированного и несплайсированного XBP1 составляет всего 26 нт, для растворения геля следует использовать более высокий процент агарозного геля. Кроме того, полосы должны быть разрешены при низком напряжении и большей продолжительности для лучшего разделения. Еще одним методом, который в настоящее время более популярен для наблюдения за сплайсингом XBP1, является анализ сплайсинга, в котором используется Pst1 рестрикцию ферментного расщепления кДНК и обеспечивает лучшую визуализацию сплайсинга XBP135. Этот метод также может быть использован для визуализации сплайсинга XBP1 в образцах, инфицированных ВИЧ-1. Результаты, полученные с помощью иммуноблоттинга и ОТ-ПЦР, могут быть использованы для валидации результатов окрашивания ThT.

Репрезентативные результаты, показанные на рисунке 5 , свидетельствуют о том, что активация UPR при инфицировании ВИЧ-1 коррелирует с усиленным окрашиванием ThT, показанным на рисунке 4. Тем не менее, ограничения использования иммуноблоттинга и ОТ-ПЦР для анализа УПО заключаются в том, что они являются строгими, и необходимо контролировать несколько генных продуктов, поскольку отдельные гены УПО могут быть изменены независимо под воздействием стрессовых факторов, не относящихся к ЭР. Кроме того, эти методы косвенно измеряют напряжение ER, рассматривая различные маркеры UPR. Именно поэтому окрашивание ThT и анализ маркеров UPR с помощью иммуноблоттинга и ОТ-ПЦР могут быть использованы вместе для анализа влияния инфекции ВИЧ-1 на стресс ER и активацию UPR в Т-клетках.

Вторая часть этой статьи посвящена протоколам, связанным с пониманием влияния УПО на репликацию ВИЧ-1. Было обнаружено, что метод обратной трансфекции, используемый для нокдауна маркеров УПО, описанный в этой статье, дает значительное снижение экспрессии маркеров УПО. Как упоминается в протоколе, флуоресценция GFP использовалась для нормализации показаний люциферазы для анализа люциферазы. Тем не менее, во многих случаях чтение GFP также может быть нарушено из-за специфической трансфекции гена36, поэтому в этом случае можно использовать другие флуоресцентные маркеры, такие как RFP, YFP или общая концентрация белка, чтобы нормализовать показания люциферазы. Кроме того, в некоторых случаях, когда клетки трудно лизировать, например, в клетках TZM-bl, перед добавлением субстрата люциферазы может быть добавлен дополнительный реагент для лизиса. Как показано в результатах, результаты люциферазы (Рисунок 6А Левая панель) совпадают с результатами p24 ELISA в случае PERK (Рисунок 6B Левая панель), где нокдаун PERK значительно снижает активность гена ВИЧ-1 и выработку вируса. В то время как в случае HSPA5 нокдаун HSPA5 не влияет на активность гена, управляемую LTR (Рисунок 6А Правая панель) в соответствии с результатами анализа люциферазы, в то время как он влияет на продукцию вируса в соответствии с p24 ИФА (Рисунок 6B Правая панель). Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что различные маркеры UPR могут по-разному влиять на активность генов, вызванных LTR ВИЧ-1, и производство вируса. Антиген p24, измеренный в надосадочной жидкости с помощью иммуноферментного анализа, в первую очередь указывает на концентрацию вирусных частиц, высвобождаемых в супернатанте культуры. Таким образом, в обычном порядке исследователи использовали результаты ИФА по захвату антигена p24 в качестве косвенного указания на продукцию вируса в надосадочной жидкости клетки37. Таким образом, анализ люциферазы в клетках и p24 ИФА надосадочной жидкости могут быть использованы вместе для определения влияния на активность гена, управляемого HIV-1 LTR, и продукцию вируса. Кроме того, этот протокол может быть использован для анализа влияния других маркеров UPR на активность генов, вызванных LTR ВИЧ-1, и продукцию вируса с помощью ген-специфических шРНК. Для всех экспериментов, включающих считывание p24 ИФА и анализа люциферазы, важно убедиться в том, что поддерживаются надлежащие разведения и время инкубации, а также не следует учитывать значения, попадающие в категорию выброса. Например, при выполнении p24 ИФА ОД450 Значение в диапазоне 0,1-2 считается идеальным. Второй подход к исследованию роли УПО в репликации ВИЧ-1 заключается в использовании фармакологических молекул, таких как тапсигаргин, индуктор стресса ER, или TUDCA, ингибитор стресса ER. Эти препараты очень часто используются для изучения УПО в различных контекстах38,39,40,41. В данной статье мы продемонстрировали протокол лечения Тапсигаргином и проанализировали его влияние на прогрессирование ВИЧ-1-инфекции в Т-клетках. Перед использованием препарата в каком-либо эксперименте настоятельно рекомендуется проверить жизнеспособность клеток для диапазона доз используемого препарата в клеточной линии. Следует избегать концентрации, которая дает менее ~80% жизнеспособности клеток в данной клеточной линии. Кроме того, для анализа жизнеспособности клеток всегда следует брать здоровые клетки, так как клетки, которые уже находятся в состоянии стресса, не покажут должного считывания, а клеточный мусор может вызвать мутность и дать ложные показания. Протокол, упомянутый в этом исследовании, показывает влияние тапсигаргина на репликацию вируса в течение 72 ч после заражения, что обеспечивает лучшее понимание влияния препарата на репликацию вируса в течение определенного периода времени. Можно также использовать более короткие временные интервалы, такие как 12 часов, 24 часа, 36 часов, 48 часов, 60 часов и 72 часа после заражения, чтобы дополнительно проанализировать самую раннюю временную точку, в которой препарат начинает проявлять свое влияние на репликацию вируса.

Поскольку UPR также участвует в деградации белка и динамике мембран42,43, возможно, что UPR может играть роль в инфекционности вирионов. Инфекционность вирионов, производимых клетками, также может быть проанализирована с помощью данного протокола. Вышеупомянутые протоколы также могут быть использованы для определения влияния инфекции ВИЧ-1 на стресс ER и УПО, а также его функциональную значимость в ПМК человека для более биологически значимых исследований. Понимание функции ER-UPR при ВИЧ-1 инфекции имеет важное значение в связи с растущим осознанием его участия в развитии многочисленных серьезных заболеваний. Информация, полученная с помощью этого набора методов, дополнит эту неисследованную область, предложив важное понимание взаимодействия между ВИЧ-1 и УПО.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Мы благодарим Национальный центр клеточных наук Департамента биотехнологии правительства Индии за внутреннюю поддержку. AT и AD благодарны за поддержку докторских исследований, полученную от Национального центра клеточных наук, Департамента биотехнологии правительства Индии. DM выражает благодарность за Национальную стипендию JC Bose от SERB, правительство Индии.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
АкриламидBiorad, США1610107
AgaroseG-Biosciences, СШАRC1013
персульфат аммонияSigma-Aldrich, СШАA3678
антитело к ATF4Cell Signaling Technology, США11815Western blot detection Dilution-1:1000
антитело против ATF6Abcam, Великобританияab122897Вестерн-блоттинг Дилюция-1:1000
анти-CHOP антителоCell Signaling Technology, США2897Вестерн блоттинг Дислокшн Дилюция-1:1000
анти-eIF2&альфаSanta Cruz Biotechnology, СШАsc-11386Вестерн блоттинг Дилюция-1:2000 
антитело против GADD34Abcam, Великобританияab236516Западный блоттинг Дилюция-1:1000
анти-GAPDH антителоСанта-Круз Биотехнология, СШАsc-32233Вестерн блоттинг Дилюция-1:3000 
анти-HSPA5 антителоКлеточная сигнальная технология, США3177Вестерн-блоттинг детектирование Дилюция-1:1000
анти-IRE1 антителоКлеточная сигнальная технология, США3294Вестерн-блоттинг детектирование Дилюция-1:2000
Антимышиный HRP-конъюгат антител Biorad, США1706516Western blot detection Dilution - 1:4000
anti-peIF2α антителоInvitrogen, США44-728GWestern blot detection Diluation-1:1000
anti-PERK антителоCell Signaling Technology, США5683Western blot detection Dilution-1:2000
anti-pIRE1 антителоAbcam, UKab243665Western blot detection Dilution - 1:1000
Антитело против pPERKInvitrogen, СШАPA5-40294Обнаружение вестерн-блоттинга Разведение-1:2000
Конъюгированное антитело против HRPBiorad, США 1706515Обнаружение вестерн-блота Разведение- 1:4000
антитело против XBP1Abcam, Великобританияab37152Обнаружение вестерн-блоттинга Разведение-1:1000
Настольная высокоскоростная центрифугаEppendorf, США5804RРотор - F-45-30-11
Настольная низкоскоростная центрифугаEppendorf, США5702RRotor-A-4-38
Bis-AcrylamideBiorad, США1610201
Bovine Serum Albumin (BSA)MP biomedicals, США160069
реагент BradfordBiorad, США5000006
набор для трансфекции млекопитающих CalPhosClontech, Takara Bio, США631312Virus stock подготовка
CEM-GFPNIH, AIDS Repository, США3655
Clarity ECL субстратBiorad,США1705061 хемилюминесцентный детектирующий субстрат
Clarity max ECL субстратBiorad, США1705062хемилюминесцентный детектирующий субстрат
Конфокальный лазерный сканирующий микроскопOlympus, ЯпонияМодель:FV3000
Цитоспиновая центрифугаThermo Fisher Scientific, США ASHA78300003
DMEMInvitrogen, США11995073
DMSOSigma-Aldrich, СШАD2650
dNTPsPromega, СШАU1515
DTTInvitrogen, СШАR0861
EDTAInvitrogen, США12635
EtBrInvitrogen, США''15585011
Фетальная сыворотка крупного рогатого скотаInvitrogen, США16000044
G418Invitrogen, США11811023
глутаральдегид 25%Sigma-Aldrich, СШАG6257Анализ на инфекционность
GlycineThermo Fisher Scientific, СШАQ24755
HEK-293TNCCS, Индия
ВИЧ-1 инфекционный молекулярный клон pNL4-3NIH, репозиторий СПИДа, США114
Инвертированный микроскопNikon, ЯпонияМодель: Eclipse Ti2
iTaq Universal SYBR Green SupermixBiorad, США 1715124
Jurkat J6NCCS, Индия
Хлорид магнияSigma-Aldrich, СШАM8266Инфекционность
анализ MMLV-RT Invitrogen, СШАреактив 28025013
MTTSigma-Aldrich, СШАM5655Анализ жизнеспособности клеток
N,N-диметилформамидFluka Chemika40255Анализ на инфекционность
NaClThermo Fisher Scientific, СШАQ27605
NaFSigma-Aldrich, США201154
NP40Invitrogen, США85124
P24 захват антигена ИФА наборABL, США5421
PageRuler преокрашиванный белоклестница Sci-fi Biologicals, ИндияPGPMT078
параформальдегидSigma-Aldrich, СШАP6148
pEGFP-N1Clontech, США632515
пенициллин/стрептомицинInvitrogen, США151140122
Ингибитор фосфатазыSigma-Aldrich, США 4906837001
Phusion High-Fidelity PCR mastermix с GC-буферомNEB,СШАM05532
pLKO.1-TRCAddgene, США10878Лентивирусный вектор клонирования
pMD2.GAddgene, США12259VSV-G вектор оболочки
PMSFSigma-Aldrich, СШАP7626
Полиэтиленимин (ПЭИ) Polysciences, Inc., США23966
Феррицианид калияSigma-Aldrich, США244023Инфекционный анализ
Ферроцианид калияSigma-Aldrich, СШАP3289Инфекционный анализ
Ингибитор протеазыSigma-Aldrich, США 
psPAX2Addgene, США12260Лентивирусная упаковка плазмида
PuromycinSigma-Aldrich, СШАP8833Отбор стабильных клеток
PVDF мембранаBiorad, США 1620177
Случайные праймерыInvitrogen, США48190011
RPMI 1640Invitrogen, США22400105
SDSSigma-Aldrich, СШАL3771
Steady-Glo субстратPromega, СШАE2510Анализ люциферазы
T4 ДНК-лигазаInvitrogen, США15224017
TEMEDInvitrogen, США17919
ThapsigarginSigma-Aldrich, СШАT9033
Тиофлавин TSigma-Aldrich, США596200
TrisThermo Fisher Scientific, СШАQ15965
Triton-X-100Sigma-Aldrich, СШАT8787
TrizolInvitrogen, США15596018
Tween 20Sigma-Aldrich, СШАP1379
TZM-blNIH, СПИД Репозиторий, США8129
УльтрацентрифугаBeckman Optima L90K, США330049 Rotor-SW28Ti
UltraPure X-galInvitrogen, США15520-018Анализ на инфекционность
антитело кролика 5056489001

Ссылки

  1. Levy, J. A. HIV and the Pathogenesis of AIDS. 3rd. , ASM Press. (2007).
  2. Hebert, D. N., Molinari, M. In and out of the ER: Protein folding, quality control, degradation, and related human diseases. Physiol Rev. 87 (4), 1377-1408 (2007).
  3. Mori, K. The unfolded protein response: The dawn of a new field. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 91 (9), 469-480 (2015).
  4. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  5. Kaufman, R. J. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest. 110 (10), 1389-1398 (2002).
  6. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 519-529 (2007).
  7. Marciniak, S. J., Garcia-Bonilla, L., Hu, J., Harding, H. P., Ron, D. Activation-dependent substrate recruitment by the eukaryotic translation initiation factor 2 kinase PERK. J Cell Biol. 172 (2), 201-209 (2006).
  8. Harding, H. P., Zhang, Y., Ron, D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. Nature. 397 (6716), 271-274 (1999).
  9. Vattem, K. M., Wek, R. C. Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (31), 11269-11274 (2004).
  10. Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Mol Cell. 11 (3), 619-633 (2003).
  11. Novoa, I., Zeng, H., Harding, H. P., Ron, D. Feedback inhibition of the unfolded protein response by GADD34-mediated dephosphorylation of eIF2α. J Cell Biol. 153 (5), 1011-1021 (2001).
  12. Haze, K., Yoshida, H., Yanagi, H., Yura, T., Mori, K. Mammalian transcription factor ATF6 is synthesized as a transmembrane protein and activated by proteolysis in response to endoplasmic reticulum stress. Mol Biol Cell. 10 (11), 3787-3799 (1999).
  13. Ye, J., et al. ER stress induces cleavage of membrane-bound ATF6 by the same proteases that process SREBPs. Mol Cell. 6 (6), 1355-1364 (2000).
  14. Tirasophon, W., Welihinda, A. A., Kaufman, R. J. A stress response pathway from the endoplasmic reticulum to the nucleus requires a novel bifunctional protein kinase/endoribonuclease (Ire1p) in mammalian cells. Genes Dev. 12 (12), 1812-1824 (1998).
  15. Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell. 107 (7), 881-891 (2001).
  16. Calfon, M., et al. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature. 415 (6867), 92-96 (2002).
  17. Wu, J., et al. ATF6α optimizes long-term endoplasmic reticulum function to protect cells from chronic stress. Dev Cell. 13 (3), 351-364 (2007).
  18. Shoulders, M. D., et al. Stress-independent activation of XBP1s and/or ATF6 reveals three functionally diverse ER proteostasis environments. Cell Rep. 3 (4), 1279-1292 (2013).
  19. Oslowski, C. M., Urano, F. Measuring ER stress and the unfolded protein response using mammalian tissue culture system. Methods Enzymol. 490, 71-92 (2011).
  20. Gupta, S., Samali, A., Fitzgerald, U., Deegan, S. Methods for monitoring endoplasmic reticulum stress and the unfolded protein response. Int J Cell Biol. 2010, 830307(2010).
  21. Wang, M., Kaufman, R. J. Protein misfolding in the endoplasmic reticulum as a conduit to human disease. Nature. 529 (7586), 326-335 (2016).
  22. Beriault, D. R., Werstuck, G. H. Detection and quantification of endoplasmic reticulum stress in living cells using the fluorescent compound, Thioflavin T. Biochim Biophys Acta. 1833 (10), 2293-2301 (2013).
  23. Tripathi, A., Iyer, K., Mitra, D. HIV-1 replication requires optimal activation of the unfolded protein response. FEBS Lett. 597 (23), 2908-2930 (2023).
  24. Platt, E. J., Wehrly, K., Kuhmann, S. E., Chesebro, B., Kabat, D. Effects of CCR5 and CD4 cell surface concentrations on infections by macrophagetropic isolates of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 72 (4), 2855(1998).
  25. Gervaix, A., West, D., Leoni, L. M., Richman, D. D., Wong-Staal, F., Corbeil, J. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4653-4658 (1997).
  26. Augustine, T., et al. Cyclin F/FBXO1 interacts with HIV-1 viral infectivity factor (Vif) and restricts progeny virion infectivity by ubiquitination and proteasomal degradation of vif protein through SCFcyclin F E3 ligase machinery. J Biol Chem. 292 (13), 5349-5363 (2017).
  27. Shihan, M. H., Novo, S. G., Le Marchand, S. J., Wang, Y., Duncan, M. K. A simple method for quantitating confocal fluorescent images. Biochem Biophys Rep. 25, 100916(2021).
  28. Treiman, M., Caspersen, C., Christensen, S. B. A tool coming of age: Thapsigargin as an inhibitor of sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPases. Trends Pharmacol Sci. 19 (4), 131-135 (1998).
  29. Moffat, J., et al. A lentiviral RNAi library for human and mouse genes applied to an arrayed viral high-content screen. Cell. 124 (6), 1283-1298 (2006).
  30. Sodroski, J., Rosen, C., Goh, W. C., Haseltine, W. A Transcriptional activator protein encoded by the x-lor region of the human T-cell leukemia virus. Science. 228 (4706), 1430-1434 (1985).
  31. Rosen, C. A., Sodroski, J. G., Kettman, R., Haseltine, W. A. Activation of enhancer sequences in type II human T-cell leukemia virus and bovine leukemia virus long terminal repeats by virus-associated trans-acting regulatory factors. J Virol. 57 (3), 738-744 (1986).
  32. Dandekar, D. H., Kumar, M., Ladha, J. S., Ganesh, K. N., Mitra, D. A quantitative method for normalization of transfection efficiency using enhanced green fluorescent protein. Anal Biochem. 342 (2), 341-344 (2005).
  33. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  34. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
  35. Peña, J., Harris, E. Dengue virus modulates the unfolded protein response in a time-dependent manner. J Biol Chem. 286 (16), 14226-14236 (2011).
  36. Soboleski, M. R., Oaks, J., Halford, W. P. Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J. 19 (3), 440-442 (2005).
  37. Martinez, Z. S., Castro, E., Seong, C. S., Cerón, M. R., Echegoyen, L., Llano, M. Fullerene derivatives strongly inhibit HIV-1 replication by affecting virus maturation without impairing protease activity. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 5731-5741 (2016).
  38. Askari, S., Javadpour, P., Rashidi, F. S., Dargahi, L., Kashfi, K., Ghasemi, R. Behavioral and molecular effects of Thapsigargin-induced brain ER- stress: Encompassing inflammation, MAPK, and insulin signaling pathway. Life. 12 (9), 1374(2022).
  39. Jaskulska, A., Janecka, A. E., Gach-Janczak, K. Thapsigargin-from traditional medicine to anticancer drug. Int J Mol Sci. 22 (1), 4(2021).
  40. Shaban, M. S., et al. Multi-level inhibition of coronavirus replication by chemical ER stress. Nat Commun. 12 (1), 5536(2021).
  41. Marciniak, S. J., Chambers, J. E., Ron, D. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress in disease. Nat Rev Drug Discov. 21 (2), 115-140 (2022).
  42. Sriburi, R., Jackowski, S., Mori, K., Brewer, J. W. XBP1: A link between the unfolded protein response, lipid biosynthesis, and biogenesis of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 167 (1), 35-41 (2004).
  43. Siwecka, N., Rozpędek-Kamińska, W., Wawrzynkiewicz, A., Pytel, D., Diehl, J. A., Majsterek, I. The structure, activation and signaling of IRE1 and its role in determining cell fate. Biomedicines. 9 (2), 156(2021).

Перепечатки и разрешения

Теги

UPRp24
Измерение стресса эндоплазматического ретикулума и развернутого белкового ответа в Т-клетках, инфицированных ВИЧ-1, и анализ его роли в репликации ВИЧ-1
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.