Методическая статья

Разработка клинически значимой модели геморрагического шока у крыс

DOI:

10.3791/66523

⸱

22 марта 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CNRS, INSERM, l’institut du thorax, Nantes Université, 2CNRS, INSERM, l’institut du thorax, Nantes Université, CHU Nantes, 3Departement of Biochemistry, CHU de Nantes, 4Oniris

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Геморрагический шок ежегодно уносит жизни 1,9 миллиона человек во всем мире. Мелкие животные часто используются в качестве моделей геморрагического шока, но связаны с проблемами стандартизации, воспроизводимости и клинической значимости, что ограничивает их актуальность. В данной статье описывается разработка новой клинически значимой модели геморрагического шока у крыс.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние десятилетия разработка животных моделей позволила нам лучше понять различные патологии и определить новые методы лечения. Геморрагический шок, т.е. органная недостаточность из-за быстрой потери большого объема крови, связан с очень сложной патофизиологией, включающей несколько путей. Многочисленные существующие модели геморрагического шока на животных стремятся воспроизвести то, что происходит у людей, но эти модели имеют ограничения с точки зрения клинической значимости, воспроизводимости или стандартизации. Целью данного исследования было уточнение этих моделей для разработки новой модели геморрагического шока. Вкратце, геморрагический шок был вызван у самцов крыс Wistar Han (в возрасте 11-13 недель) путем контролируемого обескровливания, ответственного за снижение среднего артериального давления. Следующая фаза продолжительностью 75 минут заключалась в поддержании низкого среднего артериального давления, между 32 мм рт.ст. и 38 мм рт.ст., чтобы запустить патофизиологические пути геморрагического шока. Заключительная фаза протокола имитировала уход за пациентом с введением внутривенных жидкостей, раствора лактата Рингера, для повышения артериального давления. Показатели лактата и поведенческие показатели оценивали через 16 ч после начала протокола, а параметры гемодинамики и плазматические маркеры оценивали через 24 ч после травмы. Через 24 часа после индукции геморрагического шока среднее артериальное и диастолическое артериальное давление снизилось в группе геморрагического шока (p < 0,05). Частота сердечных сокращений и систолическое артериальное давление остались неизменными. Все маркеры повреждения органов были увеличены при геморрагическом шоке (p < 0,05). Показатели лактатемии и поведенческих показателей были повышены по сравнению с фиктивной группой (p < 0,05). В заключение мы продемонстрировали, что описанный здесь протокол является актуальной моделью геморрагического шока, которая может быть использована в последующих исследованиях, в частности, для оценки терапевтического потенциала новых молекул.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Геморрагический шок (ГС) – это шоковое состояние, характеризующееся значительной потерей объема крови, что приводит к дисоксии тканей. СГ является сложной патологией, которая связывает гемодинамические и метаболические изменения наряду с про- и противовоспалительными реакциями. Ежегодно из-за кровоизлияния и его последствий во всем мире умирает около 1,9 миллионачеловек1. Современные рекомендации по лечению в первую очередь включают внутривенное введение жидкости (с добавлением или без вазоактивных молекул) и кислородную терапию. Тем не менее, эти методы лечения являются симптоматическими и могут быть неэффективными, что объясняет, почему смертность, связанная с СГ, остаетсявысокой2. Это обосновывает важность выявления новых молекулярных и клеточных механизмов и, таким образом, методов лечения для снижения смертности.

Животные модели позволяют расшифровать патофизиологические механизмы, участвующие в заболеваниях, и протестировать новые терапевтические стратегии. В литературе существует множество животных моделей геморрагического шока. Эти модели различаются не только по используемым веществам, но и по способам индуцирования HS (например, фиксированное давление в зависимости от фиксированного объема) (Таблица 1, Таблица 2)3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Кроме того, протоколы различаются в пределах одного и того же типа модели (например, время кровотечения, целевое среднее артериальное давление) (Таблица 3)14,15,16,17,18,19,20. Учитывая большое разнообразие существующих моделей геморрагического шока и сложность репликации клинической ситуации, доклиническое изучение данной патологии остается ограниченным. Разработка воспроизводимой, стандартизированной и простой в реализации модели геморрагического шока отвечает всеобщим интересам. Это облегчило бы сравнение между различными исследованиями и, таким образом, разгадало бы сложную патофизиологию геморрагического шока. Целью данного протокола была разработка новой клинически значимой модели геморрагического шока у крыс с использованием двух последовательных фаз кровоизлияния с фиксированным объемом и последующей фиксированной фазой низкого артериального давления.

Таблица 1: Виды, использованные в качестве модели геморрагического шока 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Различные типы геморрагического шока13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Пример разнообразия экспериментальных моделей геморрагического шока у крыс, вызванного протоколом фиксированного давления. Сводка параметров для различных экспериментальных моделей геморрагического шока. Сосуды, показанные красным цветом, — это артерии, а те, которые показаны синим, — венами. Для реанимации в качестве эталона используется объем взятой крови (кровь: реанимация с объемом, идентичным объему крови, взятой во время шока; x2: реанимация с объемом, в два раза превышающим объем крови, взятой во время шока; x4: реанимация с объемом, в четыре раза превышающим объем крови, взятой во время шока). MAP: среднее артериальное давление; РЛ: Лактат Рингера 14,15,16,17,18,19,20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры были утверждены и выполнены в соответствии с требованиями регионального комитета по этике (протокол (#17858 и #32499, CEEA-Pays de la Loire, Франция) в соответствии с Директивой 2010/63/ЕС Европейского Союза. Отчетность составлена в соответствии с текущими рекомендациями ARRIVE, а также Руководством Национальных институтов здравоохранения (NIH) по уходу за лабораторными животными и их использованию (NIH Pub. No. 85-23, пересмотрено в 2011 году).

1. Этический статус и общая информация о крысах

  1. Самцы крыс Wistar Han (Шарль Ривер, Сен-Жермен-Нуэль, Франция) были доставлены в Unité Thérapeutique Expérimentale в возрасте 10 недель. Содержание крыс не менее 1 недели при стандартной температуре (21-24 °C), влажности (40%-60%) и 12-часовом цикле свет/темнота со световым периодом, начинающимся в 07:30 утра.
  2. Обеспечьте едой и водой в неограниченном количестве. Для протокола используют крыс в возрасте 11-13 недель весом 300-400 г.

2. Этапы обустройства и подготовки помещения

  1. Включите станцию анестезии, установите нагревательный коврик на 37,5 °C и накройте его нестерильной простыней.
  2. Стерилизуйте необходимые для протокола хирургические инструменты: атравматические щипцы Дебейки (1), тонкие и острые ножницы или скальпель (1), щипцы стандартного образца (2), иглодержатели (1), микродиссекционные ножницы Vannas (1), зажим (1).
  3. Подготовьте катетеры для яремной вены и бедренной артерии.
    1. Для катетера яремной вены установите полиэтиленовую (PE) трубку (PE50) на иглу 23 G с отрезанным концом на конце.
    2. Для катетера бедренной артерии подготовьте катетер, описанный в шаге 2.3.1, и прикрепите трубку PE10 к концу трубки PE50.
  4. Подготовьте датчик давления и катетеры для бедренной артерии и яремной вены, заполнив их раствором лактата Рингера, гепаринизированным в концентрации 100 ЕД/мл. Поместите шприц объемом 2 мл с раствором лактата Рингера, расточенным в концентрации 100 ЕД/мл, на конец катетеров и датчика давления. Будьте осторожны, чтобы не получить пузырьки, так как они вызывают дефекты сигнала.
  5. Включите программное обеспечение, связанное с преобразователем давления, и откалибруйте его в соответствии с инструкциями поставщика.

3. Подготовка крысы к операции

  1. Обезболить крысу с помощью индукционного бокса (параметры: севофлуран 8%, расход воздуха: 1 л/мин). После проверки глубины анестезии с помощью педального рефлекса поддерживать анестезию на уровне севофлурана 4%, со скоростью воздушного потока 0,6 л/мин. Использование анальгетиков перед операцией было исключено из-за гемодинамических эффектов этих молекул.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, глубина анестезии оценивается каждые 20 минут с помощью педального рефлекса.
  2. Взвесьте крысу, поместите ее в положение «Спина пролежня» на греющий коврик и проведите депиляцию в паховой области и области шеи.
  3. Дезинфицировать депилированные участки чередованием 10% и 4% растворов повидон-йода (по 3 раза) с использованием нестерильных марлевых салфеток.
  4. Нанесите каплю офтальмологической мази на глаза животного, чтобы предотвратить пересыхание.
  5. Поместите крысу на грелящий коврик на операционном столе (спинное пролежни). Поместите смазанный ректальный зонд для контроля температуры крысы. Поддерживайте анестезию на уровне севофлурана 4% со скоростью воздушного потока 0,6 л/мин.
  6. Смените перчатки на стерильные, наденьте стерильную простыню на крысу и разрежьте ее в паховой и шейной областях.

4. Канюляция яремной вены

  1. Найдите яремную область в нижней правой части шеи, над ключицей, по видимой пульсации. С помощью атравматичных щипцов Дебейки аккуратно захватите кожу, затем сделайте точный разрез с помощью тонких острых ножниц или скальпеля.
  2. Нанесите каплю местного анестетика (лидокаин 2%) на область разреза. Аккуратно разрежьте ткань стандартными щипцами.
  3. Найдите яремную вену и аккуратно освободите ее из мышечного отдела с помощью щипцов стандартного образца. Наложите шелковую шовную нить 4/0 и надежно перевяжите дистальную сторону (по направлению к головке). Используйте шов с иглодержателями, чтобы натянуть яремную вену.
  4. Наложите шов 4/0 на проксимальную сторону (по направлению к сердцу) и подготовьте хирургический узел, не затягивая его. Сделайте небольшой разрез в яремной вене с помощью микрорассекающих ножниц Vannas.
  5. Осторожно обхватив стенку вены небольшими щипцами, введите катетер PE50 в яремную вену вручную или с помощью щипцов стандартного образца. На этом этапе используйте стерильную марлевую салфетку, чтобы вытереть возможные капли крови, которые могут вытекать из вены.
  6. Немного продвинуте катетер (0,5 см) и проверьте его правильное расположение в вене, набрав небольшое количество крови, а затем повторно введя ее (кровь в канюле указывает на то, что она находится в вене). Затяните заранее подготовленный узел, чтобы зафиксировать катетер.
  7. Оставьте катетер на месте, присоединив его к шприцу, предварительно заполненному раствором лактата Рингера, и накройте область надреза увлажненной стерильной марлевой салфеткой.

5. Канюляция бедренной артерии

  1. С помощью атравматичных щипцов Дебейки захватите кожу треугольника Скарпа левой ноги и сделайте разрез тонкими и острыми ножницами или скальпелем. Нанесите каплю местного анестетика (лидокаин 2%) на область разреза. Аккуратно разожгите ткань с помощью щипцов стандартного образца.
  2. Определите местоположение триады бедренной кости (артерия, вена и нерв). Проденьте один щипец под триаду и, используя второй щипцы стандартного образца, очень аккуратно отделите артерию от нерва и бедренной вены.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Артерия меньшего размера, розового цвета и пульсирует. Это критически важный шаг; Вена и артерия хрупкие и могут легко разорваться.
  3. Наложите шов 4/0 и перевяжите бедренную артерию дистально (со стороны ноги). Возьмите шов с иглодержателями, чтобы натянуть бедренную артерию. Наложите шов 4/0 на проксимальную сторону (сторону сердца) и подготовьте узел, не закрывая его. Зажмите артерию (поместите зажим выше по потоку проксимального бокового шва).
  4. Надрежьте бедренную артерию поперечно микрорассекающими ножницами Vannas (из артерии должен вытекать небольшой объем крови). С помощью щипцов стандартного образца аккуратно захватите стенку артерии и канюлируйте бедренную артерию с помощью катетера (закончился PE10), удерживая ее щипцами.
  5. Осторожно разжмите зажим, чтобы проверить наличие утечек, а затем проверьте сигнал давления (подтверждает, что катетер находится в бедренной артерии) и убедитесь, что кровь не течет обратно в катетер (признак утечки из клапанов/датчика давления).
  6. Если сигнал хороший (ожидаемые значения: систолическое артериальное давление: 120 мм рт.ст., диастолическое артериальное давление: 80 мм рт.ст.) и нет признаков утечки, немного продвинуте катетер (0,5 см) и затяните ранее подготовленный хирургом узел.
  7. Гепаринизируйте животное в дозе 100 ЕД/кг и наложите на место надреза смоченную стерильную марлевую салфетку. После операции поддерживайте анестезию на уровне севофлурана 3% при скорости потока воздуха 0,6 л/мин.

6. Протокол геморрагического шока (Рисунок 1)

  1. Фаза 1: Стабилизация (5 мин).
    1. После гепаринизации подождите 10 минут, чтобы значения давления стабилизировались. Сделайте 5-минутную запись базальных гемодинамических показателей.
  2. Фаза 2: Обескровливание (5 мин):
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта фаза соответствует фазе модели с фиксированным объемом.
    1. Наберите 5 мл крови из бедренной артерии в течение 5 мин (500 мкл/30 с) с помощью шприца объемом 1 мл (ожидаемые значения: систолическое артериальное давление: 45 мм рт.ст., диастолическое артериальное давление: 30 мм рт.ст.).
    2. Приготовьте смесь из 50% раствора лактата Рингера с 50% собранной кровью комнатной температуры. Поместите смесь в шприц объемом 2 мл и поместите его на конец канюли яремной вены.
  3. Фаза 3: Геморрагический шок (75 мин)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта фаза является фазой модели с фиксированным давлением.
    1. Поддерживайте среднее артериальное давление в среднем на уровне 35 мм рт.ст. Когда среднее артериальное давление превышает или равно 38 мм рт.ст., заберите 200 мкл крови через бедренную артерию (среднее значение для n = 12 крыс: 10,2 мл).
    2. Если среднее артериальное давление падает ниже 32 мм рт.ст., введите 200 мкл смеси 50% раствора Рингера с кровью и 50% лактата через яремную вену (среднее значение для n = 12 крыс: 0,90 мл).
    3. Измерьте лактат периферической крови на капле крови с конца хвоста с помощью кончика иглы (26 G) после стерильной подготовки хвоста марлевой салфеткой в конце фазы геморрагического шока.
  4. Фаза 4: Внутривенная инфузионная терапия (20 мин)
    1. Реанимировать с помощью лактатного раствора Рингера при комнатной температуре (ОТ) в дозе 10 мл/кг в течение 20 мин (расход 10,5 мл/ч для крысы массой 350 г) с помощью шприца объемом 20 мл через яремный катетер с помощью шприцевого насоса.

7. Окончание операции и восстановление, а также послеоперационное наблюдение

  1. Зажмите яремную вену и бедренную артерию и удалите катетер. Лигатные суда. Внимательно проверьте, не вытекает ли кровь.
  2. Добавьте каплю местного анестетика в места надрезов. На надрезанные участки наложены подкожные и кожные швы с использованием стерильного шва 5-0. Дезинфицировать 10% раствором повидон-йода.
  3. Подкожно вводят бупренорфин (0,05 мг/кг, 0,3 мл/кг) с помощью шприца объемом 1 мл с иглой 26 G.
  4. Подождите, пока крыса отлучится от наркоза, контролируя температуру. Когда у крысы появятся признаки пробуждения (движение вибрисс, движения лапами), снимите ректальный зонд и поместите крысу в клетку на нагревательный коврик. Через 10 минут верните крысу в ее комнату.
  5. Бупренорфин вводят подкожно (0,05 мг/кг, 0,3 мл/кг) каждые 8 ч.
  6. Оцените частоту дыхания, поведение, температуру и лактат крови через 16 ч после индукции геморрагического шока, как описано в шаге 6.3.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Модель смешанного геморрагического шока крыс. Создано с BioRender.com Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигурки.

8. Через 24 ч после индукции геморрагического шока

  1. Обезболите животное, как описано в шаге 3.1. Поместите животное на операционный стол и вставьте ректальный зонд, как описано в шаге 3.5. Подготовьте катетер для канюляции сонной артерии, как описано для яремной вены в шагах 2.3 и 2.4.
  2. С помощью атравматичных щипцов Дебейки захватите кожу и сделайте разрез посередине шеи тонкими и острыми ножницами или скальпелем. Нанесите каплю местного анестетика (лидокаин 2%).
  3. Аккуратно разожгите ткань с помощью щипцов стандартного образца. Отделите слюнные железы, затем откройте мышцу трахеи, чтобы показать кольца трахеи.
  4. Возьмите левую сонную артерию и отделите ее от нерва щипцами стандартного образца (высока вероятность, что дыхание животного ускорится). Перевязать сонную артерию дистально (головной боком) шелковой нитью 4/0.
  5. Поместите шовную нить на проксимальную сторону (сторону сердца) и подготовьте хирургический узел, не закрывая его. Зажмите артерию (поместите зажим выше по потоку проксимального бокового шва).
  6. Надрежьте сонную артерию микрорассекающими ножницами Vannas (из артерии должен вытекать небольшой объем крови). С помощью щипцов стандартного образца аккуратно захватите стенку артерии, чтобы увеличить отверстие, и канюлировать сонную артерию с помощью прилагаемого катетера, удерживая ее щипцами.
  7. Разжмите и проверьте сигнал давления, чтобы подтвердить установку катетера, и убедитесь, что кровь не течет обратно в катетер (признак утечки из клапанов/датчика давления).
  8. Если сигнал хороший и утечки нет, немного продвинуте катетер (0,5 см) и затяните и закрепите заранее подготовленный хирургом узел.
  9. Гепаринизируйте животное в дозе 100 ЕД/кг и наложите на разрез увлажненный стерильный компресс.
  10. После операции следует поддерживать анестезию с использованием севофлурана 3% со скоростью потока воздуха 0,6 л/мин.
  11. Подождите 10 минут, чтобы зарегистрировать 24-часовые гемодинамические показатели (ожидаемые значения: систолическое артериальное давление: 120 мм рт.ст., диастолическое артериальное давление: 60 мм рт.ст.).
  12. Чтобы оценить плазматические маркеры повреждения органов, возьмите 1 мл крови из сонной артерии и центрифугируйте при 1600 х г в течение 10 минут. Аликвот и сохранить плазму для дальнейшего анализа.
  13. Немедленно после измерения гемодинамических показателей умертвите крысу через 24 ч и соберите кровь.
    Примечание: Метод эвтаназии должен быть адаптирован к конкретным параметрам или образцам, которые будут собраны впоследствии. В симуляционной группе проводится только хирургическое вмешательство (секции 1-5, 7 и 8) без процедуры геморрагического шока (секция 6). Животные были случайным образом распределены экспериментатором между группами фиктивного и геморрагического шока. Только экспериментатор знал о распределении групп на разных этапах эксперимента.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следуя описанному выше протоколу, мы оценили несколько параметров гемодинамики через 24 часа после индукции геморрагического шока. Базальное среднее артериальное давление (до начала протокола геморрагического шока) одинаково между группами симуляционного и геморрагического шока (рис. 2А). Как и ожидалось, среднее артериальное давление значительно снижается при протоколе геморрагического шока, что можно объяснить падением диастолического артериального давления (Среднее артериальное давление: Sham: 92 мм рт.ст. ± 3 мм рт.ст.; HS: 82 мм рт.ст. ± 2 мм рт.ст.; Диастолическое артериальное давление: 73 мм рт.ст. ± 3 мм рт.ст.; HS: 61 мм рт.ст. ± 2 мм рт.ст.) (Рисунок 2B, C). Геморрагический шок не влияет на систолическое артериальное давление, пульсовое давление и частоту сердечных сокращений (рисунок 2D-F). Индекс шока (отношение частоты сердечных сокращений/систолического артериального давления) и модифицированный индекс шока (MSI) (отношение частоты сердечных сокращений/среднего артериального давления) являются двумя предикторами смертности у тяжелых пациентов14,15. Чем выше значения, тем выше риск смертности. В этой модели индекс шока не изменяется между двумя группами, в то время как модифицированный индекс шока имеет тенденцию к увеличению при геморрагическом шоке (MSI: Sham: 4,24 ± 0,11; HS: 4,70 ± 0,15) (Рисунок 2G,H).

figure-results-1
Рисунок 2: Влияние геморрагического шока на показатели гемодинамики. (A) базальное среднее артериальное давление, (B) среднее артериальное давление, (C) диастолическое артериальное давление, (D) систолическое артериальное давление, (E) пульсовое давление, (F) частота сердечных сокращений, (G) индекс шока и (H) модифицированный индекс шока между животными с фикцией и геморрагическим шоком. Результаты представлены в виде среднего ± SEM. Статистическую значимость оценивали с помощью непарного t-критерия. *: p < 0,05; : p < 0,001. n = 6-12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Глобальное нарушение обмена веществ во время геморрагического шока можно оценить по лактатемии. Как и ожидалось, лактатемия увеличилась после протокола геморрагического шока и через 16 ч после (Конец протокола: Симуляция: 1,13 ммоль/л ± 0,14 ммоль/л; HS: 5,98 ммоль/л ± 0,39 ммоль/л; H+16: Бутафория: 1,95 ммоль/л ± 0,23 ммоль/л; HS: 2,95 ммоль/л ± 0,19 ммоль/л) (рис. 3A, B). Температура и частота дыхания являются двумя компонентами синдрома системной воспалительной реакции (SIRS), провоспалительной реакции, характерной для состояния шока. Ни температура, ни частота дыхания не изменяются между двумя группами через 16 ч после индукции геморрагического шока (рис. 3C, D). Мы оценили влияние геморрагического шока на некоторые поведенческие параметры, такие как поза, активность и т. д. (Дополнительный файл 1). Поведенческая оценка повышена в группе геморрагического шока через 16 ч после протокола (Sham: 0,33 ± 0,21; HS: 2,27 ± 0,69) (Рисунок 3E).

figure-results-2
Рисунок 3: Влияние геморрагического шока на лактатемию, температуру, частоту дыхания и поведенческую оценку. (А) лактатемия в конце протокола геморрагического шока, (Б) лактатемия, (В) температура, (Г) частота дыхания и (Д) поведенческая оценка через 16 часов после индукции геморрагического шока между фиктивными и геморрагическими шоковыми животными. Результаты представлены в виде среднего ± SEM. Статистическую значимость оценивали с помощью непарного t-критерия. *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001. n = 6-12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Геморрагический шок связан с дисфункцией органа. Чтобы оценить, может ли модель быть клинически значимой, мы оценили плазматические маркеры повреждения органов через 24 ч после протокола. Креатининемия (Sham: 19,13 мкмоль/л ± 0,33 мкмоль/л; HS: 28,88 мкмоль/л ± 2,69 мкмоль/л), сердечный тропонин Т (Sham: 9,38 нг/л ± 1,87 нг/л; HS: 35,62 нг/л ± 2,28 нг/л), а аспартат и аланинаминотрансфераза (ASAT: Sham: 221 ЕД/л ± 48 ЕД/л; HS: 963 UI/L ± 144 UI/L; ALAT: Бутафория: 36 UI/L ± 4 UI/L; HS: 323 ЕД/л ± 13 ЕД/л), которые отражают повреждения почек, сердца и печени соответственно, значительно увеличиваются при геморрагическом шоке (рис. 4).

figure-results-3
Рисунок 4: Модель геморрагического шока связана с дисфункцией органов. (А) креатининемия, (В) уровень сердечного тропонина Т, (В) аспартатаминотрансфераза и (D) аланинаминотрансферазы через 24 ч после индукции геморрагического шока между фиктивными и геморрагическими шоковыми животными. Результаты представлены в виде среднего ± SEM. Статистическую значимость оценивали с помощью непарного t-критерия. *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001. n = 4 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Детали поведенческого рейтинга Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы впервые описали репрезентативную модель геморрагического шока на крысах, основанную на сочетании моделей фиксированного давления и фиксированного объема. Показано, что через 24 ч после индукции удара наша модель связана с изменением гемодинамических параметров и метаболизма.

Из-за сложной патофизиологии изучение геморрагического шока требует использования интегрированных животных моделей. Действительно, подходы in vitro не могут имитировать все пути, участвующие в этом заболевании. Пробуждение животных после протокола геморрагического шока является шагом, обеспечивающим лучшее воспроизведение клинической ситуации. Из-за трудностей, связанных с пробуждением животных, очень немногие исследования включали этот этап. В редких исследованиях, которые будят животных, они приносятся в жертву через короткое время (2 ч или 6 ч), что не в полной мере отражает то, что происходит с пациентами 16,18,23,24. Несмотря на разработку моделей геморрагического шока, только в нескольких исследованиях оценивались параметры (воспаление, апоптоз, дисфункция органов) через 24 ч после индукции шока, тем самым подчеркивая сложность такого рода протокола. Развитие компьютерных и математических моделей произвело революцию в научных исследованиях. Было разработано множество математических моделей геморрагического шока, но большинство из этих моделей не учитывают весь спектр обмена жидкости в организме во время геморрагического шока и требуют улучшения до потенциальной клиническойприменимости. На сегодняшний день одной из основных задач является разработка животной модели, максимально точно имитирующей патологию у человека.

В литературе описано большое количество моделей геморрагического шока, которые различаются по сосудистым доступам, объемам забора крови или целевомудавлению. В более общем плане, модели геморрагического шока можно разделить на 3 группы: кровоизлияние фиксированного объема, кровоизлияние с фиксированным давлением и неконтролируемое кровоизлияние. Стандартизация и воспроизводимость при кровотечении фиксированного объема затруднены и объясняются соотношением объема крови к массе тела, которое линейно уменьшается с весом крысы. Широко используется кровоизлияние с фиксированным давлением, что объясняет, что настройки (целевое давление, продолжительность удара) очень варьируются от одного исследования к другому, что затрудняет перенос результатов из одной модели в другую. Также важно отметить, что гемодинамические нарушения, которые играют ключевую роль в патофизиологии геморрагического шока, не оцениваются систематически, что может увеличить расхождение в результатах между исследованиями. Наконец, модель неконтролируемого кровоизлияния, хотя и является клинически значимой, поднимает вопросы воспроизводимости и этики. Чтобы максимально совместить клиническую значимость, стандартизацию и воспроизводимость, мы разработали смешанную модель с фазами фиксированного объема и фиксированным давлением.

В описанной здесь модели температура и частота дыхания не изменяются в течение 24 часов после операции. Это можно объяснить тем, что хирургическое вмешательство проводится в стерильных условиях, что ограничивает провоспалительную реакцию. Геморрагический шок определяется как острая недостаточность кровообращения вследствие кровопотери, связанная с падением артериального давления. Как и у человека, данная модель геморрагического шока вызывает снижение среднего артериального давления, в частности из-за снижения диастолического артериального давления. Интересно, что, как было описано ранее, частота сердечных сокращений не изменяется после фазы реанимации в данной модели геморрагического шока 29,30,31. Снижение среднего артериального давления, вероятно, связано со снижением перфузии органов, что приводит к мультивисцеральной дисфункции, что можно проиллюстрировать увеличением различных плазматических маркеров в нашей модели (креатининемия, сердечный тропонин Т, ASAT и АЛТ). Нарушение снабжения кислородом приводит к анаэробному метаболизму, что вызывает повышение лактатемии32. Как было описано ранее, данная модель геморрагического шока приводит к повышению уровня лактата в крови30. Это увеличение может быть связано с ишемией, вызванной на уровне бедренной артерии. Однако, учитывая, что животные в фиктивной группе имеют физиологическую лактатемию и подверглись той же хирургической процедуре, что и в группе геморрагического шока, может показаться, что это увеличение связано с протоколом геморрагического шока. В совокупности все эти данные подтверждают, что описанный в данном исследовании протокол позволяет разработать новую актуальную модель геморрагического шока у крыс.

Ограничением этой модели является использование гепарина, который необходим для снижения естественной свертываемости крови при ее контакте с пластиковыми материалами, такими как канюли. Тем не менее, применение гепарина может повлиять на коагулопатию, связанную с травматическим геморрагическим шоком33. В этом исследовании участвуют здоровые самцы в возрасте 11-13 недель. Учитывая, что пол, возраст и сопутствующие заболевания (гипертония, диабет и т. д.) могут влиять на результаты, было бы целесообразно оценить их влияние в нашей модели. В протоколе этап реанимации выполняется путем инъекции лактата Рингера, кристаллоида, который может способствовать коагулопатии и отеку тканей34. Несмотря на то, что использование продуктов крови является оптимальным, они являются дефицитными и скоропортящимися, и может быть трудно иметь достаточный запас крови крыс для всего протокола. Модели геморрагического шока на основе продуктов крови и кристаллоидов/коллоидов являются двумя взаимодополняющими подходами.

Сильными сторонами этой модели являются: 1) ее высокая воспроизводимость (о чем свидетельствует низкая вариабельность результатов), 2) простота применения (большинство инструментов являются классическими, а сосудистые подходы известны) и 3) ее клиническая значимость, в частности, из-за пробуждения животных и множественной висцеральной дисфункции. На основе поведенческой оценки, описанной в Дополнительном файле 1, были установлены предельные баллы. Жертва будет обсуждаться, если будет достигнуто количество очков выше 9, согласно прилагаемой таблице. Если будет достигнуто 11 баллов, животное будет систематически усыплено. В этом исследовании ни одно из животных не набрало балл выше 8, и, следовательно, ни одно из них не было исключено из исследования. Это может объяснить, почему описанная здесь модель связана с уровнем смертности в 3 раза ниже, чем в другом 24-часовом исследовании (16% против 47%)25.

Критическим этапом модели является фаза геморрагического шока. Важно соблюдать диапазон давления 32-38 мм рт.ст. Фактически, мы наблюдали, что поддержание среднего артериального давления ниже 32 мм рт.ст. приводило к быстрому и резкому падению давления. И наоборот, поддержание давления выше 38 мм рт.ст. не дает модели, которая была бы достаточно близка к клинической реальности. Эти наблюдения согласуются с интервалом среднего артериального давления, заданным в других моделях13.

В заключение мы продемонстрировали, что модель геморрагического шока крыс, описанная в этом исследовании, является клинически значимой и может быть полезна как для понимания патофизиологических механизмов путем идентификации новых биологических акторов/путей, так и для определения новых терапевтических стратегий путем тестирования различных молекул-кандидатов.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в этой статье. Данные, подтверждающие результаты этого исследования, можно получить от соответствующих авторов по обоснованному запросу.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана "Société Française d'Anesthésie et de Réanimation" (Париж, Франция), "Fondation d'entreprises Genavie" (Нант, Франция), "Fédération française de cardiologie" (Франция), "Agence nationale de la recherche" (20-ASTC-0032-01-hErOiSmE) (Париж, Франция) и "Direction Générale de l'Armement" (Париж, Франция). Томас Дюпас получил гранты от Direction Générale de l'Armement (DGA), Франция и Région des Pays de la Loire во время своей докторской диссертации. Мы благодарим "Agence Nationale de la Recherche" (Париж, Франция), "Direction Générale de l'Armement" (Париж, Франция) и ассоциацию "Sauve ton coeur" (Франция) за поддержку этой работы. Благодарим за помощь и техническую поддержку Центральному центру UTE IRS-UN (СФР Бонами, Нантский университет, Нант, Франция) и основному центру IBISA Therassay (Нант, Франция).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шприц 1 млTERUMOMDSS01SE
2,5 мл шприцTERUMOSS*02SE1
20 мл шприцTERUMOMDSS20ESE
Индукционная камера анестезииTEMSEGAHUBBIV4
BD Microlance 3 23 G иглаBecton Dickinson300800
BD Microlance 3 26 G иглаBecton Dickinson304300
Датчик артериального давленияemka TECHNOLOGIESBP_T
BuprecareAxienceN/A1 мл флакон, бупренорфин 0,3 мг/мл
DE BAKEY, Атравматичные сосудистые щипцыALLGAIER instrumente medical09-543-150
Дермальный бетадин 10%MylanN/A125 мл флакон
Тонкие щипцы - изогнутые / Зубчатыенаучные инструменты11065-07
GraphPad Prism 8GraphPad by Dotmatics-Нагревательные
матыTEMSEGAOPT/THERM_MATELASSTEREORATS
Гепарин натрияPANPHARMA Н/ДФлакон 5 мл, 5 000 ЕД/мл
IOX2 программное обеспечениеemka TECHNOLOGIESIOX_BASE_4c + IOX_FULLCARDIO_4a
Ножницы для ириса - ToughCutFine Science Tools14058-11
ЛидокаинФрезениусН/Д10 мл ботинок, 8,11 мг, лидокаина гидрохлорид
MiniHub-V3.2TEMSEGAPF006
Moria 201/A Зажим для сосудов - Прямыетонкие научные инструменты18320-11
Нестерильные компрессыRaffin70189
Нестерильные простыниDutscher 30786
Olsen-Hegar Иглодержатель с ножницами Fine Science Tools12002-12
Полиэтиленовая трубка PE10PHYMEPBTPE-10
Полиэтиленовая трубка PE50PHYMEPBTPE-50
RatsCharles Rivers-MaleWISTAR HAN (10 недель)
Ректальный зондTEMSEGASONDE_TEMP_RATS
Ringer LactatesFresenius Kabi964175
Скраб Бетадин 4%MylanN/A125 мл флакон
СевофлуранAbbottN/A250 мл флакон, газ 100%
Севофлуран ВапорайзерTEMSEGASEVOTEC3NSELEC
StatStrip тест-полоски для лактатаNova Biomedical47486
Стерильные компрессыLaboratoire SYLAMED211S05-50
Стерильная простыняMö lnlycke800330
Стерильные перчаткиMEDLINEMSG7275
Шовный материалOptilene3097141
Шовный материал для сосудовSMI8150046
Шприцевой насосФлакон mé dical16010
usbAMPemkaTECHNOLOGIES-Vannas
Весенние ножницыFine Science Tools15000-00
VaselineCooperN/A10 мл флакон
с витамином А Dulcis (ALLERGAN)AllerganN/A10 г туба, ретинол
StatStrip Xpress лактатметр Nova Biomedical 47486

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cannon, J. W. Hemorrhagic Shock. New Eng J Med. 378 (4), 370-379 (2018).
  2. Fox, E. E., Holcomb, J. B., Wade, C. E., Bulger, E. M., Tilley, B. C. Earlier endpoints are required for hemorrhagic shock trials among severely injured patients. Shock. 47 (5), 567-573 (2017).
  3. Frink, M., Andruszkow, H., Zeckey, C., Krettek, C., Hildebrand, F. Experimental trauma models: an update. J Biomed Biotechnol. 2011, 797383(2011).
  4. Hauser, C. J. Preclinical models of traumatic, hemorrhagic shock. Shock. 24, Suppl 1 24-32 (2005).
  5. Kemming, G., et al. Can we continue research in splenectomized dogs? Mycoplasma haemocanis: Old problem - new insight. Eur Sur Res. 36 (4), 198-205 (2004).
  6. Carroll, R. G., Iamsa, S. G., Pryor, W. H., Allison, E. J. Single hemorrhage: A clinically relevant canine model of hemorrhagic shock. Resuscitation. 16 (2), 119-126 (1988).
  7. Cheung, A. T., Duong, P. L., Driessen, B., Chen, P. C., Jahr, J. S., Gunther, R. A. Systemic function, oxygenation and microvascular correlation during treatment of hemorrhagic shock with blood substitutes. Clin Hemorheol Microcirc. 34 (1-2), 325-334 (2006).
  8. Hannon, J. P. Hemorrhage and hemorrhagic shock in swine: A review. , Available from: https://apps.dtic.mil/sti/citations/ADA221297 (1990).
  9. Lomas-Niera, J. L., Perl, M., Chung, C. -S., Ayala, A. Shock and hemorrhage: an overview of animal models. Shock. 24, Suppl 1 33-39 (2005).
  10. Redl, H., Bahrami, S. Large animal models: baboons for trauma, shock, and sepsis studies. Shock. 24, Suppl 1 88-93 (2005).
  11. Marques-Bonet, T., Cheng, Z., She, X., Eichler, E. E., Navarro, A. The genomic distribution of intraspecific and interspecific sequence divergence of human segmental duplications relative to human/chimpanzee chromosomal rearrangements. BMC Genom. 9, 384(2008).
  12. Schlag, G., Redl, H. R., Till, G. O., Davies, J., Martin, U., Dumont, L. Anti-L-selectin antibody treatment of hemorrhagic-traumatic shock in baboons. Crit Care Med. 27 (9), 1900(1999).
  13. Fülöp, A., Turóczi, Z., Garbaisz, D., Harsányi, L., Szijártó, A. Experimental models of hemorrhagic shock: A review. Eur Surg Res. 50 (2), 57-70 (2013).
  14. Zingarelli, B., Ischiropoulos, H., Salzman, A. L., Szabó, C. Amelioration by mercaptoethylguanidine of the vascular and energetic failure in haemorrhagic shock in the anesthetised rat. Eur J Pharmacol. 338 (1), 55-65 (1997).
  15. Gonzalez, R. J., Moore, E. E., Ciesla, D. J., Nieto, J. R., Johnson, J. L., Silliman, C. C. Post-hemorrhagic shock mesenteric lymph activates human pulmonary microvascular endothelium for in vitro neutrophil-mediated injury: the role of intercellular adhesion molecule-1. J Trauma. 54 (2), 219-223 (2003).
  16. Hoppen, R. A., Corso, C. O., Grezzana, T. J. M., Severino, A., Dal-Pizzol, F., Ritter, C. Hypertonic saline and hemorrhagic shock: hepatocellular function and integrity after six hours of treatment. Acta Cir Bras. 20 (6), 414-417 (2005).
  17. Rupani, B., et al. Relationship between disruption of the unstirred mucus layer and intestinal restitution in loss of gut barrier function after trauma hemorrhagic shock. Surgery. 141 (4), 481-489 (2007).
  18. Cai, B., Dong, W., Sharpe, S., Deitch, E. A., Ulloa, L. Survival and inflammatory responses in experimental models of hemorrhage. J Surg Res. 169 (2), 257-266 (2011).
  19. Esiobu, P., Childs, E. W. A rat model of hemorrhagic shock for studying vascular hyperpermeability. Methods Mol Biol. 1717, 53-60 (2018).
  20. Sordi, R., Chiazza, F., Patel, N. S. A., Doyle, R. A., Collino, M., Thiemermann, C. Preconditioning' with low dose lipopolysaccharide aggravates the organ injury / dysfunction caused by hemorrhagic shock in rats. PLoS One. 10 (4), 0122096(2015).
  21. Liu, Y., et al. Modified shock index and mortality rate of emergency patients. World J Emerg Med. 3 (2), 114-117 (2012).
  22. Sahu, N., et al. Shock index as a marker for mortality rates in those admitted to the medical intensive care unit from the emergency department. Cureus. 12 (4), e7903(2020).
  23. Zou, L., et al. Glucosamine improves cardiac function following trauma-hemorrhage by increased protein O-GlcNAcylation and attenuation of NF-κB signaling. Am J Physiol Heart Circ Phy. 296 (2), H515-H523 (2009).
  24. Nöt, L. G., Marchase, R. B., Fülöp, N., Brocks, C. A., Chatham, J. C. Glucosamine administration improves survival rate after severe hemorrhagic shock combined with trauma in rats. Shock. 28 (3), 345(2007).
  25. Nöt, L. G., Brocks, C. A., Vámhidy, L., Marchase, R. B., Chatham, J. C. Increased O-linked β-N-acetylglucosamine levels on proteins improves survival, reduces inflammation and organ damage 24 hours after trauma-hemorrhage in rats. Crit Care Med. 38 (2), 562-571 (2010).
  26. Patel, N. M., et al. Inhibition of macrophage migration inhibitory factor activity attenuates haemorrhagic shock-induced multiple organ dysfunction in rats. Front Immunol. 13, 886421(2022).
  27. Patel, N. M., et al. Inhibition of Bruton's tyrosine kinase activity attenuates hemorrhagic shock-induced multiple organ dysfunction in rats. Ann Surg. 277 (3), e624-e633 (2023).
  28. Curcio, L., D'Orsi, L., De Gaetano, A. Seven mathematical models of hemorrhagic shock. Comput Math Methods Med. 2021, e6640638(2021).
  29. Rönn, T., Lendemans, S., de Groot, H., Petrat, F. A new model of severe hemorrhagic shock in rats. Comp Med. 61 (5), 419-426 (2011).
  30. Hussmann, B., Lendemans, S., de Groot, H., Rohrig, R. Volume replacement with Ringer-lactate is detrimental in severe hemorrhagic shock but protective in moderate hemorrhagic shock: studies in a rat model. Crit Care. 18 (1), 5(2014).
  31. Mihara, R., Takasu, A., Maemura, K., Minami, T. Prolonged severe hemorrhagic shock at a mean arterial pressure of 40 mmHg does not lead to brain damage in rats. Acute Med Surg. 5 (4), 350-357 (2018).
  32. Vincent, J. -L., De Backer, D. Circulatory shock. N Engl J Med. 369 (18), 1726-1734 (2013).
  33. Halbgebauer, R., et al. Hemorrhagic shock drives glycocalyx, barrier and organ dysfunction early after polytrauma. J Crit Care. 44, 229-237 (2018).
  34. Chipman, A. M., Jenne, C., Wu, F., Kozar, R. A. Contemporary resuscitation of hemorrhagic shock: What will the future hold. Am J Surg. 220, 580-588 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Rat ModelMean Arterial PressureBlood LossOrgan Damage MarkersLactated Ringer SolutionJugular Vein CannulationFemoral Artery CannulationBehavioral AssessmentHemodynamic Monitoring

Похожие статьи