Методическая статья

Распутывание гликан-белковых взаимодействий: на помощь приходит ядерный магнитный резонанс (ЯМР)

2.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66530

⸱

17 мая 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1CIC bioGUNE, Basque Research and Technology Alliance (BRTA), 2lkerbasque, Basque Foundation for Science, 3Centro de Investigacion Biomedica En Red de Enfermedades Respiratorias

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол, подробно описывающий получение, обработку и анализ серии экспериментов ЯМР, направленных на характеристику белково-гликановых взаимодействий в растворе. Описаны наиболее распространенные методологии, основанные на лигандах и белках, которые, несомненно, вносят вклад в области структурной гликобиологии и исследований молекулярного распознавания.

Аннотация

Взаимодействие гликанов с белками модулирует многие события, связанные со здоровьем и болезнями. На самом деле, установление этих событий узнавания и их биологические последствия тесно связаны с трехмерными структурами обоих партнеров, а также с их динамическими особенностями и представлением в соответствующих клеточных компартментах. Методы ЯМР уникальны для распутывания этих характеристик, и, действительно, были разработаны и применены различные методологии на основе ЯМР для мониторинга событий связывания гликанов с их ассоциированными рецепторами. В этом протоколе описываются процедуры сбора, обработки и анализа двух наиболее мощных методологий ЯМР, используемых в области ЯМР-гликобиологии, экспериментовпо титрованию 1 H-Saturation Transfer difference (STD) и 1 H,15N-гетеронуклеарной одиночной квантовой когерентности (HSQC), которые дополняют друг друга информацией с точки зрения гликана и белка соответственно. Действительно, в сочетании они предлагают мощный инструментарий для прояснения как структурных, так и динамических аспектов процессов молекулярного узнавания. Этот комплексный подход расширяет наше понимание гликан-белковых взаимодействий и способствует продвижению исследований в области химической гликобиологии.

Введение

Молекулярное распознавание гликанов имеет важное значение для многих процессов, связанных со здоровьем и болезнями. Специфичность и селективность биологических рецепторов (лектинов, антител, ферментов) к гликанам в значительной степени зависят от корректировки нарушенного баланса между различными компонентами энтальпии (CH-π и Ван-дер-Ваальса, водородные связи, электростатика) и энтропии (гидрофобность, динамика, сольватация-десольватация)1.

Учитывая большое химическое разнообразие и динамическую природу гликанов, методы ЯМР широко используются для анализа взаимодействий гликанов уже более 25лет2, поскольку эти методологии предоставляют превосходную информацию о событиях молекулярного распознавания с точными деталями при атомном разрешении 3,4, даже когда требуемые доказательства взаимодействия не могут быть получены с помощью других методологий. Ключевым моментом является то, что ЯМР универсален и позволяет изучать динамические события на атомном уровне, в различных временных масштабах, что на сегодняшний день является лучшим методом для изучения структуры, конформации и динамики гликанов в растворе. Тем не менее, распутывание этой информации может быть довольно сложным процессом, требующим использования четко определенных стратегий в сочетании с тщательным анализом данных.

Методы ЯМР разнообразны, и, действительно, существует множество методологий, которые могут быть использованы для раскрытия гликан-белковых взаимодействий6. В данной работе мы описываем два основных подхода к ЯМР, которые в настоящее время используются для расшифровки гликан-рецепторных взаимодействий 7,8, уделяя особое внимание тому, как распутать презентацию ключевого эпитопа гликанов, а также сайта связывания белка9.

При любом событии молекулярного узнавания, когда рецептор связывается с данным лигандом, происходит процесс химического обмена, который влияет на многие параметры ЯМР участников связывания10. Таким образом, с точки зрения ЯМР, взаимодействие можно контролировать либо с точки зрения гликанового лиганда, либо с точки зрения белкового рецептора11. Вообще говоря, белковый рецептор представляет собой крупную биомолекулу (медленное вращательное движение, со скоростями в масштабе ns и, следовательно, быструю поперечную релаксацию), в то время как взаимодействующий гликан можно рассматривать как молекулу малого и среднего размера (быстрое вращательное движение, со скоростями в масштабе ps и медленная поперечная релаксация)12. Со стандартной точки зрения, сигналы ЯМР гликана узкие, в то время как сигналы рецептораширокие13.

Методы ЯМР на основе лигандов основаны на резком изменении, которое претерпевают многие параметры гликанового ЯМР при переходе из свободного состояния в связанное14. ЗППП-ЯМР является наиболее часто используемым экспериментальным методом ЯМР для оценки различных особенностей связывания гликана15, от вывода о существовании связывания в состоянии раствора до определения эпитопа связывания гликанов; То есть, атомы лиганда, которые находятся в контакте с белковым рецептором16.

В качестве альтернативы, методы ЯМР на основе рецепторов отслеживают изменения, происходящие в сигналах белкового рецептора в присутствии гликана по сравнению с теми, которые регистрируются для состояния апо17. Они в основном сосредоточены на скрининге химических сдвигов, возмущений белковых сигналов между обоими состояниями. Наиболее часто используемым экспериментом является 1 H-15N HSQC или его альтернативы TROSY18.

Комбинация обоих подходов позволяет применять ЯМР ко многим разнообразным системам, которые проявляют широкий спектр сродства. Однако для методов ЯМР, основанных на рецепторах, в отличие от методов на основе лиганда, должно быть доступно относительно большое количество растворимого, неагрегированного, меченного стабильным изотопом (15N) белка.

Здесь мы опишем оба метода, выделив их сильные и слабые стороны. Обратите внимание, что основные шаги, описанные в протоколе, служат примерами использования спектрометров Bruker. Следовательно, имена команд и параметров совпадают с теми, которые используются в TopSpin (программное обеспечение для управления спектрометрами Bruker).

Протокол

1. Разность передачи насыщения ЯМР (STD-ЯМР)

ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих строках описываются основные процедуры сбора, обработки и анализа экспериментов ЗППП-ЯМР. Эти шаги служат для иллюстрации полезности метода для обнаружения связывания лиганда и для выяснения эпитопа связывания лиганда. Для более глубокого понимания структуры и приобретения ЯМР-экспериментов обратитесь к соответствующему руководству производителя, прилагаемому к прибору ЯМР.

  1. Приобретение
    1. Подготовьте образец с белок-лигандным комплексом. Используйте молярное соотношение гликан:лектин от 10:1 до 100:1 с концентрацией белка в диапазоне от 0,01 до 0,2 мМ. Для взаимодействия hгалектина-7 с LacNAc используйте соотношение белок: лиганд 50:1 в дейтерированном фосфатно-солевом буфере при pH 7,4.
      Примечание: Белковый рецептор должен быть чистым и растворимым в выбранном буфере (в случае экспериментов STD-NMR предпочтительны дейтерированные версии соответствующего буфера для уменьшения возможной интерференции сигнала NMR в 1H). Концентрацию белка заранее проверяют с помощью спектрофотометра для измерения поглощения при длине волны 280 нм.
    2. Из приготовленного раствора перенесите общий объем 0,6 мл в ЯМР-пробирку 5 мм с помощью пипетки.
    3. Подготовьте прибор для ЯМР при необходимой температуре (обычные температуры эксперимента находятся в диапазоне от 10 °C до 45 °C). Откройте монитор контроля температуры с помощью команды edte и установите нужную температуру. Для исследования сиспользованием галектина-7/LacNAc температура была установлена на уровне 25 °C.
    4. Сгенерируйте новый набор данных, содержащий последовательность импульсов zg.
      1. Для простой операции откройте существующий эксперимент и введите команду edc . Появится диалоговое окно, определяющее название, характеристики (характеристики образца, растворитель) и некоторые параметры эксперимента.
      2. Если требуется изменение исходной последовательности импульсов, перейдите по окнам ased (параметры) и AcquPars (параметры сбора). На этом этапе выберите нужную программу импульсов из библиотеки спектрометра.
      3. Для стандартного ЯМР-спектра 1Н выберите последовательность импульсов zg из доступного списка.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В случае образцов с повышенным содержанием воды может потребоваться использование схем подавления воды для увеличения отношения сигнал/шум. Желательно использование последовательностей импульсов, таких как zgesgp, которые возбуждают моделирующие модули, обеспечивающие превосходное подавление, но контролирующие фазу остальных сигналов. Пожалуйста, обратитесь к руководству производителей по ЯМР для получения дополнительной информации о типах схем водяного подавления и их основных характеристиках.
    5. Введите образец ЯМР в зонд, активировав воздух для подъема пробы. Используйте команду ej, поместите образец на верхнюю часть магнита и отключите подъем образца с помощью команды ij.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы ввести образец в магнит с помощью автосамплера, используйте команду sx , за которой следует номер позиции n, соответствующий положению ЯМР-пробирки в лотке автосамплера.
    6. Зафиксируйте сигнал растворителя, введя команду lock и выбрав соответствующий растворитель в меню.
    7. После того, как образец будет вставлен в зонд, завершите процесс настройки и согласования с помощью автоматического модуля atma или ручного модуля atmm.
    8. Запустите автоматический шимминг с помощью команды topshim gui. Откроется графический интерфейс, в котором будет выбран и запущен размер прокладки 1D.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму нестабильность шимминга из-за тонких изменений поля или температуры, можно активировать автопрокладку для получения данных эксперимента. Это можно выполнить, зайдя в окно управления BSMS и нажав на автопрокладку. Превращение в зеленую подсветку указывает на то, что автопрокладка была активирована. Имейте в виду, что при использовании автопрокладки потенциальные проблемы с нестабильностью образца должны оставаться незамеченными. Поэтому при использовании автопрокладок рекомендуется соблюдать осторожность.
    9. Определите пульс1 ч 90°. Это может быть выполнено автоматически с помощью импульсной команды.
    10. Изменяйте различные параметры в окне AcquPars. Для обычного спектраЯМР 1 Н установите количество сканирований (NS) на 32, а желаемое спектральное окно (SW) на ок. 12 ppm.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность импульсов zgesgp включает в себя модуль подавления растворителем для устранения остаточного сигнала HDO, который должен быть центрирован в середине спектра. Для этого O1 должен быть точно определен в AcquPars.
    11. Установите усиление ресивера, чтобы избежать переполнения, с помощью автоматической команды rga.
    12. Теперь получите стандартный спектр ЯМР 1Н с помощью команды zg.
    13. После завершения сбора данных обработайте спектр с помощью команды efp. Примените коррекцию базовой линии и фазы с помощью строки меню TopSpin.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдаются 1Н ЯМР-сигналы, исходящие от гликана и белка (Рисунок 1). Для проведения эксперимента ЯМР ЗППП рекомендуется провести детальный анализ полученного ЯМР-спектра, как указано в разделе 1.1.14.
    14. Создайте новый набор данных и загрузите последовательность импульсов ЯМР STD, которая будет использоваться таким же образом, как описано для эксперимента 1H NMR в разделе 1.1.4. В приборах Bruker в каталоге импульсных программ доступны различные последовательности импульсов, все они называются stddiffXXX. Самый простой из них (stddiff) не включает в себя никакой схемы подавления воды или фильтра для подавления белка.
      1. Для образцов со значительным содержанием H2O выберите последовательности stddiffgp19 или stddiffesgp, которые включают модуль уотергейта или модуля формирования возбуждения. В случае спектра с интенсивными белковыми ЯМР-сигналами в качестве фона выберите последовательности stddiffXXX.3. В каждом случае оптимизируйте соответствующие конкретные параметры для каждого модуля водяного подавления (т.е. d19 в схемах уотергейта).
    15. Определение резонансных и резонансных частот для эксперимента STD NMR. Список частот можно найти в параметрах AcquPars окна ased под записью FQ2LIST. Определенные резонансные и внерезонансные частоты в герцах должны быть вручную записаны в список и сохранены под новым именем. Этот новый список будет использоваться в эксперименте STD-NMR.
      1. Выберите резонансную частоту в спектральной области, лишенной гликановых сигналов, обычно около δ(1H) 0 или 6,6 ppm, для типичных гликанов (рис. 1). Установите частоту выключения резонанса в области, в которой нет лиганда или белкового протона. Его можно смело устанавливать на +18000 или -18000 Гц.
    16. Определите форму импульса, который будет использоваться во время насыщения, в параметрах AcquPars окна ased .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существует множество возможностей. Можно безопасно использовать формы Гаусса или Эбурпа с шириной селективного импульса 90° 50 мс.
    17. Задайте соответствующие параметры в разделе AcquPars.
      1. Установите длину импульса 1H 90°.
      2. Установите значение мощности для сформированного импульса (оценено с помощью инструмента shape).
      3. Установите общее время насыщения. Значения от 1 с до 4 с могут использоваться регулярно.
      4. Установите задержку релаксации на 3 с.
      5. Установите количество сканирований (NS) кратным 8. Обычно он устанавливается на 256, 512 или 1024, чтобы получить правильное отношение сигнал/шум в наборах по 2 на каждой частоте.
      6. Установите количество фиктивных сканирований (DS) равным 8.
      7. Установите количество очков в F2 на 16k, 32k или 64k.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение количества точек в F2 приведет к улучшению разрешения и соотношения сигнал/шум. По этой причине настоятельно рекомендуется использовать минимум 16 тыс. точек данных.
      8. Установите количество очков в F1. Это количество частот, которые должны использоваться, в данном случае 2 (включенный резонанс и внерезонансный).
        ПРИМЕЧАНИЕ: По соглашению, F2 относится к прямому размеру, размеру, вдоль которого непосредственно дискретизируется затухание свободной индукции (FID), в то время как F1 обозначает косвенное измерение.
      9. Установите коэффициент усиления приемника (RG), чтобы избежать переполнения, с помощью автоматической команды rga.
    18. Рассчитайте время общего эксперимента с помощью команды expt.
    19. Отправьте эксперимент на получение с помощью команды zg.
    20. Всегда проверяйте, правильно ли проводится эксперимент через несколько минут.
  2. Обработка
    ПРИМЕЧАНИЕ: Псевдо-2D спектр получается после применения описанного выше протокола. Количество строк соответствует количеству используемых частот, обычно двух: резонансной и внерезонансной.
    1. Обработайте fid для первого эксперимента.
      1. Произведите преобразование Фурье fid числа 1 (через команду efp) и выберите место назначения обрабатываемых спектров (выберите число procno). В качестве альтернативы используйте команду rser 1 для чтения первого fid.
      2. Затем отрегулируйте коэффициент уширения линии с помощью команды lb (обычно 3-5 Гц) и фазу. Чтобы вручную выполнить фазирование, перейдите на вкладку «Процесс», а затем настройте подменю «Стадия». Выполняйте коррекции нуля и первого порядка, нажимая и перетаскивая соответствующую кнопку. Сохраните результаты фазирования. Кроме того, выполните коррекцию базовой линии с помощью команды abs.
    2. Прочтите fid для второго эксперимента и выполните преобразование Фурье (с помощью команды efp) с тем же коэффициентом уширения линии. Настройте фазу с теми же параметрами фазы и коррекцией базовой линии и сохраните обработанный спектр с другим кодом.
    3. Считывание двух обработанных спектров с помощью множественной функции (команда: .md) и вычитание их (off-resonance - on-резонанс) с помощью кнопки, имеющейся в множественной визуализации (Δ). Новый спектр — это спектр ЯМР ЗППП, который сохраняется с другим кодом.
    4. Произведите наложение спектра ЯМР СТД на спектр внерезонансного спектра.
      1. Откройте спектр внерезонансного сигнала (fid 1) и введите команду .md , чтобы открыть окно с несколькими дисплеями. Затем загрузите спектр STD.
      2. Сравните частоты и интенсивности (автоматически отображаются в правом верхнем углу) сигналов в спектре ЯМР STD. Это дает желаемую информацию о тех протонах, которые близки к белку и их относительной близости. Чем выше относительная интенсивность, тем ближе они к белку (рисунок 2).
    5. Измерьте интенсивности (интегралы) в эксперименте с внерезонансным резонансом с помощью соответствующего программного обеспечения. В TopSpin перейдите в раздел «Анализ > Интеграция». Определите области и запишите интегралы в файл (I0).
    6. Измерьте интенсивности (интегралы) в эксперименте STD NMR с использованием тех же параметров и запишите их в файл (ISTD).
    7. Рассчитайте значение STD для каждого протонного сигнала по следующей формуле:
      STD = (ISTD)/I0.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование интегрирования сигналов для вычисления значений STD требует, чтобы протонные сигналы были достаточно разделены. Когда происходит перекрытие сигнала, например, в случае с олигосахаридами, значения STD могут быть определены путем оценки отношения интенсивности сигнала между спектрами STD и внерезонансного спектра.
    8. Рассчитайте относительный STD в процентах. Для этого присвойте 100% значение протону, который демонстрирует максимальную разницу между интенсивностями в спектре внерезонансного и ЯМР ЗППП. Рассчитайте относительную интенсивность STD для других протонов соответственно.
      Примечание: Надлежащий анализ данных ЗППП, особенно для определения эпитопа связывания лиганда, требует полного присвоения сигналов1 Н лиганда. Поэтому настоятельно рекомендуется выполнить эту задачу до получения спектров STD.

2. 1эксперимент H-15N HSQC

Примечание: В следующих строках подробно описывается использование экспериментов с 1 H-15N HSQC для мониторинга изменений химических сдвигов резонансов 1 Н и 15Н ЯМР рецептора (лектина) в ответ на присутствие возрастающих количеств лиганда (олигосахарида)19. Анализ химических возмущений сдвига (CSP), основанный на извлеченных данных, очень ценен для идентификации партнеров по связыванию, а также для картирования интерфейса связывания белка и определения аффинности связывания. Для более глубокого понимания структуры и приобретения ЯМР-экспериментов обратитесь к соответствующему руководству производителя, прилагаемому к прибору ЯМР.

  1. Сбор и обработка
    1. Подготовьте образец с интересующим вас лектином. Убедитесь, что рецептор полностью помеченN-меткой в каждом аминокислотном остатке, как в основной цепи, так и в боковых цепях. Как правило, для обнаружения водообменных перекрестных пиков HN в спектре используют смесь H2O: D 2 O в соотношении90:10 для приготовления буферного раствора. Требуемые концентрации лектинов находятся в диапазоне от 0,05 до 0,2 мМ, в зависимости от наличия рецептора, меченного 15N, и необходимого соотношения сигнал/шум.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Белок должен быть стабильным в течение всего экспериментального времени без видимого образования осадка в ЯМР-трубке. Более того, он должен быть чистым и растворимым в выбранном буфере. Полное присвоение кросс-пиков HSQC на 1H и 15N должно было быть предварительно выполнено таким образом, чтобы каждый перекрестный пик в спектре HSQC был идентифицирован меткой, соответствующей конкретному аминокислотному остатку.
    2. Из этого препарата перенесите общий объем 0,6 мл в 5-миллиметровую ЯМР-пробирку.
    3. Установите прибор ЯМР на необходимую температуру. Смотрите шаг 1.1.3 и выполните те же операции.
    4. Создайте новый набор данных. Смотрите шаг 1.1.4 и повторите операции.
    5. Вставьте образец ЯМР в зонд, как описано в шаге 1.1.5.
    6. Зафиксируйте на сигнале растворителя. Чтобы начать процедуру блокировки, воспользуйтесь командой lock и выберите в меню подходящий растворитель. Сигнал блокировки можно отследить в окне блокировки. Установите усиление блокировки так, чтобы сигнал блокировки был виден в окне блокировки.
    7. Завершите процесс настройки и согласования автоматически (с помощью команды atma) или вручную (команда atmm откроет окно управления ATM для корректировки кривой колебания).
    8. Установите оптимальные прокладки с помощью инструмента TopShim. Используйте команду topshim gui. Смотрите инструкции в шаге 1.1.8.
    9. Определите длину импульса 1H 90° (как описано в шаге 1.1.9) и частоту смещения (команда o1calib запустит интерактивную процедуру калибровки O1, извлекая частоту смещения). Этот последний параметр чрезвычайно важен при проведении экспериментов со схемами подавления растворителей.
    10. Создайте новый набор данных, как описано в разделе 1.1.4. Чтобы уменьшить или устранить помехи сигнала H2O, используйте последовательность импульсов zgesgp.
    11. Настройте эксперимент, изменив различные параметры в окне AcquPars.
      1. Введите длину импульса 1ч 90° и смещение (o1), как было определено ранее, и установите количество сканирований (NS) на 32, а спектральное окно (SW) на уровне около 12 ppm.
      2. Определите уровень мощности сформированного импульса с помощью инструмента «Форма», доступного в строке меню Topspin.
      3. Установите усиление ресивера с помощью автоматической команды rga.
    12. Получите результаты эксперимента с помощью команды zg и обработайте полученный FID для получения спектра ЯМР 1H.
    13. Создайте новый набор данных, который будет использоваться для получения данных эксперимента1 H-15 N HSQC ЯМР. На вкладке AcquPars выберите пульсовую программу hsqcetfpf3gp, доступную в каталоге импульсных программ.
    14. Настройте эксперимент. Загрузите фигуры, степени и время по умолчанию с помощью команды getprosol. Затем обновите значения длительности импульса 1H 90° и смещения.
    15. Определите следующие параметры.
      1. Установите задержку релаксации на 1-5 с.
      2. Установите количество сканирований кратным 4. Обычно устанавливается значение 8, 16, 32 или 64, чтобы получить правильное соотношение сигнал/шум.
      3. Установите количество фиктивных сканирований равным 128.
      4. Установите количество точек в F2 на 1k, 2k или 4k.
      5. Установите количество точек в F1: количество приращенийt1 , которые будут использоваться. В зависимости от спектрального окна это находится в диапазоне от 128 до 256.
      6. Настройте центр спектрального окна в размерности 15Н на δ 117 ppm и установите соответствующую спектральную ширину на 36 ppm. Эти значения необходимо оптимизировать для каждой конкретной системы.
      7. Установите усиление ресивера, чтобы избежать переполнения (с помощью команды rga )
    16. Рассчитайте время общего эксперимента. Типичное время эксперимента составляет около 1 часа.
    17. Введите zg , чтобы отправить эксперимент на сбор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда проверяйте, правильно ли проводится эксперимент через несколько минут.
    18. Обработайте FID с помощью команды xfb. Выполните коррекцию базовой линии с помощью команды abs2 и коррекции фазы на вкладке Процесс. Чтобы вручную фазировать фазу, нажмите на подменю настройки фазы, а затем выберите несколько перекрестных пиков 2D-спектров. После этого последовательно примените нулевые поправки и поправки первого порядка к строкам и столбцам, щелкнув и перетащив соответствующую кнопку. Сохраните результаты фазирования.
    19. Сохраните полученный 2D-спектр.
    20. Приготовьте высококонцентрированный стоковый раствор лиганда. Типичные значения составляют 50-100 мМ.
    21. Из высококонцентрированного исходного раствора гликана перенесите соответствующий объем (несколько микролитров) в ЯМР-трубку, содержащую рецептор, чтобы получить нужное соотношение белок: моляры лиганда и записать спектры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе инициируется серия титрования, в ходе которой лиганд титруется в образец белка. Соответствующее соотношение белка к лиганду должно быть определено для каждого конкретного случая. Если аффинность связывания полностью неизвестна, рекомендуется использовать субстехиометрические количества лиганда в начальных точках.
    22. Выполните шаги с 2.1.1 по 2.1.19 для вновь подготовленного образца.
    23. Повторите шаги 2.1.21 и 2.1.22 для образцов с возрастающим отношением белка к лиганду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точная подгонка данных ряда титрования требует проведения нескольких экспериментов 1 H-15N-HSQC, охватывающих широкий диапазон соотношений белка к лиганду, включая те, которые необходимы для достижения насыщения белком.
  2. Анализ
    1. Визуализируйте обработанный спектр 2D HSQC для видов апо с помощью соответствующего программного обеспечения: TopSpin, MestReNova и CCPNMR являются подходящими программами для обработки данных ЯМР.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это спектр отпечатков пальцев белка. Наблюдаемые химические сдвиги 1H и 15N зависят от соответствующего химического окружения каждой аминокислоты, которое сильно зависит от трехмерной структуры белка. Этот спектр называется белковым спектром отпечатков пальцев. Хорошо диспергированный спектр 2D 1 H-15N HSQC, в котором все перекрестные пики демонстрируют равномерную интенсивность, убедительно свидетельствует о присутствии хорошо свернутого белка19.
    2. Сгенерируйте список частот 1H и 15N для всех перекрестных пиков. Использование дополнительного программного обеспечения, такого как программа CCPNMR20, может помочь в этом процессе.
    3. Наложите спектр для первой или второй точек титрования на спектр для апобелка.
      1. Для этого откройте 2D-спектр, соответствующий состоянию apo, нажмите на вкладку «Множественное отображение», а затем добавьте второй 2D-спектр. Визуальный осмотр обоих спектров дает информацию о существовании взаимодействия между лигандом и белком.
        Примечание: С точки зрения белка, существование связывания обеспечивает изменения в химическом окружении аминокислот, непосредственно участвующих в событии узнавания, с сопутствующими химическими сдвиговыми возмущениями (CSP).
    4. Повторите шаги 2.2.2 и 2.2.3 для каждой точки титрования, создавая списки частот 1H и 15N для всех перекрестных пиков в различных спектрах, соответствующих различным молярным соотношениям белок-лигандов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Химические сдвиги в каждой точке титрования могут быть измерены без необходимости выполнения какого-либо нового назначения перекрестных пиков. В случае режима быстрого обмена, обычно наблюдаемого при лектин-гликановых взаимодействиях, можно просто следить за поступательным движением пиков на протяжении титрования.
    5. Убедитесь, что для последней точки титрования в основном отсутствуют химические возмущения сдвига по отношению к предыдущему сложению. Этот факт свидетельствует о том, что сайт связывания белка был насыщен лигандом, который находится в большом избытке.
    6. Рассчитайте максимальные возмущения химического сдвига (maxCSP), используя уравнение ниже:
      figure-protocol-1
      ΔH и ΔδN — разность химических сдвигов в частотах 1H и 15N между состоянием апо и последней точкой титрования, соответственно.
    7. Постройте график максимальных возмущений химического сдвига (maxCSP) по вертикальной оси y 2D-графика по отношению к соответствующему аминокислотному остатку (по горизонтальной оси x).
    8. Проведите визуальный осмотр аминокислотных остатков, которые демонстрируют максимальный CSP между связанным и апо-состояниями белка. Высока вероятность, что они относятся к месту связывания или являются его соседями.
    9. Если 3D-структура белка доступна, откройте соответствующий PDB с помощью соответствующего программного обеспечения, такого как PyMOL или BIOVIA Discovery studio. Эти программы молекулярной визуализации широко используются в приложениях структурной биологии. Выберите остатки с наибольшим значением maxCSP (выше двукратного стандартного отклонения) с определенным цветом, чтобы локализовать предполагаемый сайт связывания.
    10. В случае режима быстрого обмена оцените константу диссоциации (KD) по нелинейной аппроксимации по методу наименьших квадратов наблюдаемого CSP для перекрестныхпиков 1 H-15N HSQC в каждой точке (Δδobs) по отношению к конкретной концентрации белка [P] и лиганда [L] в этой точке:
      figure-protocol-2
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это уравнение может быть применено к тем перекрестным пикам, которые показывают четкие изолированные сигналы. Полученные значения усредняются для оценки KD.

Результаты

В данной работе мы представляем протокол использования экспериментов 1H-STD ЯМР и 1 H-15N HSQC для раскрытия деталей связывающего взаимодействия между лектинами и малыми олигосахаридами. Включены результаты, полученные при анализе молекулярного распознавания LacNAc по hGalectin-7 (hGal-7), которые служат наглядным примером успешной реализации протокола и эффективности данных методологий ЯМР для изучения мелких деталей процесса молекулярного узнавания. На рисунке 3 показан спектр ЯМР 1h-std для взаимодействия LacNAc с hGal-7. Наличие сигналов ЯМР ЗППП указывает на связывание (рис. 3А). Более того, проявляются только те сигналы, которые принадлежат протонам в тесном контакте с белком, что позволяет очертить связывающий эпитоп (рис. 3B). На рисунке 4 показано, как спектр 1 H-15N HSQC белка может быть использован в качестве отпечатка пальца, а на рисунке 5 показано применение экспериментов по титрованию 1 H-15N гетероядерной одиночной квантовой когерентности (HSQC) для определения химического сдвига амидных групп h-галектина-7 при связывании LacNAc. Эти данные не только выявляют существование взаимодействия, но и очерчивают интерфейс связывания лектина. На рисунке 6 показано, как анализ данных титрования позволяет оценить аффинность связывания LacNAc с помощью hгалектина-7, который находится в высоком микромолярном диапазоне. Этот вывод согласуется с результатами, полученными с использованием альтернативных методов.

figure-results-1
Рисунок 1: Показан выбор резонансной частоты. 1H-ЯМР спектра соотношения LacNAc:hGal-7 50:1 в дейтерированном фосфатно-солевом буфере при pH 7,4. Сигналы лиганда (LacNAc) ограничены в области 2,0-5,2 ppm. Частота насыщения тщательно подбирается, чтобы обеспечить отсутствие протонов лиганда в диапазоне 1-2 ppm, что позволяет селективно облучать протоны белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Эксперимент ЯМР ЗППП. Схематическое изображение эксперимента STD: первый спектр (внерезонансный) служит эталонным, а во втором (он-резонансном) выполняется насыщение белком. Насыщение эффективно распространяется по всему белку и передается протонам лиганда, находящимся в тесном контакте с белком. Полученный разностный спектр (спектр STD) дает только те резонансы, которые испытали насыщение. Анализ эксперимента с ЗППП позволяет составить эпитопное картирование связывающего сахара. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Анализ связывания с точки зрения лиганда. (A) Наложение спектров внерезонансного и 1H STD-ЯМР для взаимодействия LacNAc с hGal-7. В спектре ЗППП проявляются только те сигналы, которые принадлежат протонам, находящимся в тесном контакте с белком. Аннотация резонансов 1Н лиганда представлена в спектре внерезонансного спектра. (B) Относительная интенсивность ЗППП была цветной картой в химической структуре LacNAc. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Спектр 1 H-15N HSQC белка представляет его отпечаток пальца. (A) 1 H-15N HSQC спектр 100 мкМ hGal-7 в форме апо. Спектр был зарегистрирован при 25 °C. Некоторые кросс-пики NH были аннотированы меткой соответствующей аминокислоты. (B) Каждая пара NH демонстрирует уникальный химический сдвиг, который зависит от химической среды и, следовательно, от трехмерной структуры белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Анализ связывания с точки зрения белка. (A) Показано наложение спектров 1 H-15N HSQC, записанных для титрования LacNAc в раствор hGal-7. Изучение спектров, в которых несколько перекрестных пиков испытывают изменения химического сдвига, ясно указывает на взаимодействие. (B) График максимальных возмущений химического сдвига (maxCSP) амидных сигналов основной цепи, выведенный из титрования LacNAc (15 эквивалентов) с hGal-7. (C) Наиболее возмущенные аминокислоты hGal-7, согласно анализу CSP, отображены в структуру 5gal PDB. В 3D-модели красная окраска относится к значению CSP более 2σ, а розовая — к значениям от 1σ до 2σ. Цветная область, вероятно, представляет собой место связывания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Определение KD на основе экспериментов по титрованию 1 H-15N HSQC. (A) Представление схемы титрования на основе 1 H-15N HSQC в зависимости от скорости обмена химических веществ в шкале времени ЯМР системы в исследовании (быстрый, промежуточный или медленный). Режим быстрого обмена наблюдался в случае взаимодействия LacNAc/hGal-7. (B) Кривая аппроксимации и оценка KD , полученные в результате анализа CSP при различных концентрациях лигандов для модельной системы hGal-7 и дисахарида LacNAc. Расчетный KD сообщается с соответствующей погрешностью в виде среднего значения данных по 20 различным аминокислотам; (C) Фрагменты спектров 1 H,15N-HSQC, показывающие сдвиг выбранных перекрестных пиков во время титрования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Разностный ЯМР с переносом насыщения (STD-NMR) стал наиболее используемым и универсальным методом ЯМР для изучения лиганд-белковых взаимодействий. Как показано выше, он основан на явлении переноса насыщения, а экспериментальная установка включает в себя получение двух одномерных (1D) 1H спектров: резонансного и внерезонансного спектров. В ходе резонансного эксперимента насыщение конкретных протонов белка достигается за счет подачи последовательности маломощных радиочастотных импульсов в течение определенного периода времени (время насыщения обычно колеблется от 1 до 3 с). Чтобы избежать прямого насыщения лиганда, частоту и длину импульсов насыщения оптимизируют для селективного облучения специфических протонов белка; т.е. они должны применяться на частоте, свободной от любых лигандных сигналов, и с соответствующей длиной (рис. 1). Как правило, для импульсов насыщения длительностью 50 мс следует сохранять разность в 1 ppm от области насыщения до ближайших лигандных сигналов. Как правило, селективные импульсы насыщения, применяемые на алифатической области белка, обеспечивают повышенный эффект насыщения. В качестве альтернативы можно облучать ароматические протоны (6-7 ppm), если молекула лиганда не содержит ароматических сигналов. Это очень полезно для гликанов природного происхождения, так как они не несут ароматических групп. После того, как определенная область белка селективно облучается, насыщение распространяется вдоль белка через диполярную перекрестную релаксацию 1H-1H (спиновая диффузия). В конечном счете, насыщение достигает белковых протонов в месте связывания, которое затем переносится на сахарные протоны, находящиеся в тесном контакте (r < 5 Å) с рецептором через межмолекулярные 1 H-1H NOEs. Очевидно, что интенсивность сигналов насыщенных лигандных протонов уменьшается. После получения насыщения, благодаря кинетике связывания, переходно связанные лиганды (требуется быстрый обмен) диссоциируют, и информация о насыщении накапливается в свободном состоянии. Из-за этого процесса резонансные спектры ЯМР представляют собой ослабленные сигналы (рис. 2).

Чтобы наглядно продемонстрировать возмущение этой интенсивности ядер 1Н связывающего гликана, получают контрольный протонный ЯМР-спектр (внерезонансный), в котором насыщение применяется далеко от любого рецептора или углеводного сигнала (обычно между 40-100 ppm) в тех же условиях. Вычитаемый 1D спектр между внерезонансным и он-резонансным показывает исключительно сигналы ядер 1Н лиганда, которые имеют измененную интенсивность: те, которые были достаточно близки к сайту связывания рецептора для получения намагниченности (рис. 2).

Тем не менее, не все ядра 1 Н связанного углевода получают одинаковое количество насыщения. Теоретически перенос намагниченности от рецептора к связанному лиганду зависит от расстояния (1/r6). Это означает, что интенсивности перенесенного насыщения между ядрами гликана 1Н содержат информацию о пространственных близостях между протонами лиганда и протонами рецептора, а интенсивности ЯМР ЗППП больше для тех протонов, которые находятся ближе к рецептору. Соответственно, эксперимент STD NMR также позволяет определить связывающий эпитоп углевода (рис. 2 и рис. 3), поскольку протоны лиганда, находящиеся ближе к поверхности белка, проявляют более высокую интенсивность, чем те, которые непосредственно не участвуют в связывании.

Эксперимент может быть применен к системам со слабым-средним сродством, реже к системам с сильным сродством в низком μМ или нМ диапазоне. Действительно, для этого необходимо, чтобы скорость диссоциации была высокой на шкале времени релаксации. В противном случае информация о переносе насыщения теряется из-за релаксации до того, как лиганд диссоциирует.

С другой стороны, эксперименты ЯМР на основе белков уникальны для раскрытия лиганд-белкового взаимодействия с точностью до уровня аминокислот без решения проблем структуры атомного разрешения. Он непосредственно исследует явления молекулярного узнавания в растворе без необходимости сокристаллизации. Картирование анализа CSP является исключительно мощным средством для обнаружения лигандов и картирования сайта связывания белка (Рисунок 4 и Рисунок 5). Этот метод применим к любому диапазону сродства между мМ и нМ диапазонами, даже для систем, в которых обменный курс является медленным на шкале времени химического сдвига21.

Тем не менее, этот подход, вероятно, не будет работать для белков с молекулярной массой выше 30-40 кДа из-за проблем с релаксацией. В этом случае можно использовать альтернативуTROSY 18 , которая является особенно мощной в сочетании с дейтерацией белка. Кроме того, белок должен быть равномерно помечен 15N (а другой образец должен быть дважды помечен 13C и 15N, чтобы иметь возможность выполнить необходимое назначение основной цепи). Следовательно, условия экспрессии белка, включая соответствующую систему экспрессии, должны быть оптимизированы для получения миллиграммовых количеств белка. Белки, которые проявляют склонность к олигомеризации или агрегации, также не подходят для этого анализа. Прибором, используемым в настоящем документе для регистрации данных ЯМР, является спектрометр Bruker 800 МГц, оснащенный криозондом TCI. Было бы очень сложно использовать эту методологию с приборами на частоте ниже 600 МГц или без криогенного зонда.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Agencia Estatal de Investigación из Испании за аккредитацию Центра передового опыта Северо Очоа CEX2021-001136-S, финансируемую MCIN/AEI/10.13039/501100011033, и CIBERES, инициативу Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, Madrid, Spain). Мы также благодарим Европейскую комиссию за проект GLYCOTWINNING.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
5 мм набор микротрубок ShigemiCortecNet SASS30BMS-005B
Alpha-Lactose-AgaroseSigma-Aldrich Quí mica S.L.7634-5ML
Хлорид аммония (15 N, 99%)LC-0179-N-50GTracer Tecnolog; как анальный; ticas S.L
Ампициллин (соль натрия) Melford Laboratories LTDA40040
BIOVIA Discovery studio BIOVIA, Dassault Systè mes
BL21(DE3) Химически компетентные клетки Merck Life Science, S.L.U.CMC0014-40X40UL
ЦентрифугаBeckman CoulterAllegra X-22R
D2O Кембриджские изотопные лаборатории, инк.DLM-4-1000
ИнкубаторEppendorfInnova 42
IPTG (изопропил ß-D-1-тиогалактопиранизид)VWR International Eurolab S.L.
LacNAcElicitylGLY008
Luria Bertani (LB) BrothMerck Life Science, S.L.U.3397-1KG
Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC VWR International Eurolab S.L.214-1137
PBS 10xBio-Rad1610780
PyMOLМолекулярная графическая система PyMOLверсии 2.0 Schrö dinger
SonicatorSonics & Materials, Inc.VC 505
Сверхпроводящий магнитЯМР Bruker600 МГц AVANCE III
Сверхпроводящий магнит ЯМРBruker800 МГц AVANCE III
VW437144N

Ссылки

  1. Solís, D., et al. A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code. Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).
  2. Poveda, A., Jimenez-Barbero, J. NMR studies of carbohydrate-protein interactions in solution. Chem Soc Rev. 27, 133-144 (1998).
  3. Kogelberg, H., Solís, D., Jiménez-Barbero, J. New structural insights into carbohydrate-protein interactions from NMR spectroscopy. Curr Opin Struct Biol. 13 (5), 646-653 (2003).
  4. Widmalm, G. Glycan shape, motions, and interactions explored by NMR spectroscopy. JACS Au. 4 (1), 20-39 (2024).
  5. Marchetti, R., et al. 34;Rules of Engagement" of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling. ChemistryOpen. 5 (4), 274-296 (2016).
  6. Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. The recognition of glycans by protein receptors. Insights from NMR spectroscopy. Chem Commun. 54 (38), 4761-4769 (2018).
  7. Gimeno, A., Valverde, P., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Glycan structures and their interactions with proteins. A NMR view. Curr Opin Struct Biol. 62, 22-30 (2020).
  8. Cañada, F. J., et al. Conformational and structural characterization of carbohydrates and their interactions studied by NMR. Curr Med Chem. 29 (7), 1147-1172 (2022).
  9. Valverde, P., Quintana, J. I., Santos, J. I., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Novel NMR avenues to explore the conformation and interactions of glycans. ACS Omega. 4, 13618-13630 (2019).
  10. Jiménez-Barbero, J., Asensio, J. L., Cañada, F. J., Poveda, A. Free and protein-bound carbohydrate structures. Curr Opin Struct Biol. 9 (5), 549-555 (1999).
  11. Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR. Chem Soc Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).
  12. Roldós, V., Cañada, F. J., Jiménez-Barbero, J. Carbohydrate-protein interactions: a 3D view by NMR. Chembiochem. 12 (7), 990-1005 (2011).
  13. Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J., Millet, O. NMR of glycoproteins: profiling, structure, conformation, and interactions. Curr Opin Struct Biol. 68, 9-17 (2021).
  14. del Carmen Fernández-Alonso, M., Díaz, D., Berbis, M. A., Marcelo, F., Cañada, J., Jiménez-Barbero, J. Protein-carbohydrate interactions studied by NMR: from molecular recognition to drug design. Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 816-830 (2012).
  15. Angulo, J., Nieto, P. M. STD-NMR: application to transient interactions between biomolecules-a quantitative approach. Eur Biophys J. 40 (12), 1357-1369 (2012).
  16. Mayer, M., Meyer, B. Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor. J Am Chem Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).
  17. Williamson, M. P. Using chemical shift perturbation to characterise ligand binding. Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 73, 1-16 (2013).
  18. Fernández, C., Adeishvili, K., Wüthrich, K. Transverse relaxation-optimized NMR spectroscopy with the outer membrane protein OmpX in dihexanoyl phosphatidylcholine micelles. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2358-2363 (2001).
  19. Yee, A., Gutmanas, A., Arrowsmith, C. H. Solution NMR in structural genomics. Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 611-617 (2006).
  20. Skinner, S. P., Fogh, R. H., Boucher, W., Ragan, T. J., Mureddu, L. G., Vuister, G. W. CCPNMR AnalysisAssign: a flexible platform for integrated NMR analysis. J Biomol NMR. 66 (2), 111-124 (2016).
  21. Gimeno, A., et al. Minimizing the entropy penalty for ligand binding: Lessons from the molecular recognition of the histo blood-group antigens by human Galectin-3. Angew Chem Int Ed Engl. 58 (22), 7268-7272 (2019).

Перепечатки и разрешения

Теги

HSQC
Распутывание гликан-белковых взаимодействий: на помощь приходит ядерный магнитный резонанс (ЯМР)
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.