Оценка абсолютного, цитозольного, свободного Ca2+ и соответствующей сократимости в изолированных лимфатических сосудах под давлением

Краткое содержание

Этот протокол описывает метод одновременного измерения цитозольного кальция, свободного кальция [Ca²⁺]_i и диаметра сосудов в сужающихся лимфатических сосудах в режиме реального времени, а затем расчета абсолютных концентраций Ca²⁺ , а также параметров сократимости/ритмичности. Этот протокол может быть использован для изучения Ca²⁺ и сократительной динамики в различных экспериментальных условиях.

Аннотация

Лимфатическая сосудистая сеть, которую в настоящее время часто называют «третьим кругом кровообращения», расположена во многих жизненно важных системах органов. Основной механической функцией лимфатической сосудистой сети является возврат жидкости из внеклеточных пространств обратно в центральные венозные протоки. Транспорт лимфы опосредован спонтанными ритмичными сокращениями лимфатических сосудов (ЛЖ). Сокращения ЛЖ в значительной степени регулируются циклическим подъемом и спадом цитозольного, свободного кальция ([Ca²⁺]_i).

В данной работе представлен метод одновременного расчета изменений абсолютных концентраций [Ca²⁺]_i и сократимости/ритмичности сосудов в реальном времени в изолированных брыжеечных ЛЖ крыс, мы изучили изменения [Ca²⁺]_i и сократимости/ритмичности в ответ на добавление препарата. В изолированные ЛЖ был загружен ратиометрический^Ca2+-чувствительный индикатор Fura-2AM, а видеомикроскопия в сочетании с программным обеспечением для детектирования краев использовалась для непрерывного захвата измерений [Ca⁺]_i и диаметра в режиме реального времени.

Сигнал «Фура-2АМ» от каждой РН был откалиброван по минимальному и максимальному сигналу для каждого судна и использован для вычисления абсолютного [Ca²⁺]_i. Измерения диаметра использовались для расчета сократительных параметров (амплитуды, конечного диастолического диаметра, конечного систолического диаметра, рассчитанного потока) и ритмичности (частоты, времени сокращения, времени релаксации) и коррелировали с абсолютными измерениями [Ca²⁺]_i .

Введение

Лимфатическая сосудистая сеть находится во многих системах органов, включая мозг, сердце, легкие, почки и брыжейку 1,2,3,4,5,6, и функционирует, продвигая жидкость (лимфу) из интерстициальных пространств в центральные венозные протоки для поддержания гомеостаза жидкости 7,8,9,10 . Он начинается с слепых лимфатических капилляров в сосудистых капиллярных руслах, которые дренируются в собирающиеся лимфатические сосуды (ЛЖ). Собирающие ЛЖ состоят из двух слоев клеток: слой эндотелиальных клеток, окруженный слоем клеток лимфатических мышц (БМК)^10,11. Транспортировка лимфатической жидкости осуществляется как за счет внешних сил (например, образования новых лимф, артериальных пульсаций, колебаний центрального венозного давления), так и за счет внутренних^сил12.

Внутренней силой для транспорта лимфы является спонтанное ритмичное сокращение собирающихся лимфатических ЛЖ, что является предметом внимания большинства исследований, изучающих лимфатическую функцию. Этот собственный лимфатический насос в основном регулируется циклическим подъемом и падением цитозольного, свободного Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i). Спонтанная деполяризация плазматической мембраны в БМО активирует потенциал-зависимые каналы Ca²⁺ «L-типа» (Ca_v1.x), вызывая приток Ca²⁺ и последующее ритмическое сокращение ЛЖ ^8,9,10. Эта роль была продемонстрирована путем блокирования Ca_v1.x специфическими агентами, такими как нифедипин, который ингибировал сокращения ЛЖ и вызывал расширение сосудов^13,14. Транзиторное повышение [Ca²⁺]_i или «спайка Ca²⁺» в БМК, опосредованное каналами Ca_v1.x, также может мобилизовать внутриклеточные запасы Ca²⁺ путем активации рецепторов инозитолтрифосфата (IP₃) и рецепторов рианодина (RyR) в саркоплазматическом ретикулуме (SR)15,16,17,18. Современные данные свидетельствуют о том, что рецепторы IP₃ вносят больше^Ca2+, необходимого для нормальных сокращений ЛЖ, по сравнению с RyRs 15,16,19,20,21; тем не менее, RyR могут играть роль во время патологии или в ответ на фармацевтическое вмешательство ^17,18. Кроме того, активация К⁺ каналов²², активированных Ca²+, и АТФ-чувствительных калиевых (K_ATФ) каналов^23,24 может гиперполяризовать мембрану БМК и ингибировать спонтанную сократительную активность.

Существует множество других ионных каналов и белков, которые могут регулировать динамику Ca2⁺ при сборе ЛЖ. Использование методов для изучения изменений Ca2⁺ и сократимости сосудов в ответ на фармакологические агенты в режиме реального времени важно для понимания этих потенциальных регуляторов. Более ранний метод с использованием Fura-2 для измерения относительных изменений LV [Ca²⁺]_i был описан²⁵. Поскольку константа диссоциации для Fura-2 и Ca²⁺ известна²⁶, можно рассчитать фактические концентрации Ca²⁺, что расширяет область применения данного метода и дает дополнительное представление о механизмах передачи сигналов Ca²⁺ , возбудимости мембраны и сократимости²⁷, а также позволяет проводить базовые сравнения между экспериментальными группами. Этот последний подход был использован для кардиомиоцитов²⁸ и, следовательно, может быть адаптирован к ЛЖ. В данной статье представлен усовершенствованный метод, сочетающий в себе эти два подхода к измерению и расчету изменений абсолютного значения [Ca⁺]_i , а также сократимости/ритмичности сосудов непрерывно в режиме реального времени в изолированных низкотемпературных НЖ под давлением. Мы также предоставляем репрезентативные результаты для ЛЖ, получаемых нифедипином.

Протокол

Самцы крыс Спрэг-Доули в возрасте от 9 до 13 недель были куплены у коммерческого продавца. После прибытия все крысы были размещены и содержались в Отделении медицины лабораторных животных (DLAM) Университета медицинских наук Арканзаса (UAMS) на стандартной лабораторной диете и подвергались 12-часовому циклу свет/темнота при температуре 25 ^°C. Все процедуры проводились в соответствии с утвержденным протоколом использования животных #4127 Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) UAMS.

1. Диссекция и канюляция брыжеечных ЛЖ

ПРИМЕЧАНИЕ: Важно настроить перфузионную камеру перед изоляцией брыжеечных ЛЖ, чтобы убедиться в отсутствии прерывания потока или утечки, которые могли бы нарушить эксперимент.

1. Подготовка перфузионной ванны
   1. Приобретите микропипетки из боросиликатного стекла (внешний диаметр 1,2 мм, внутренний диаметр 0,68 мм и внешний диаметр кончика 75-100 мкм) у коммерческого поставщика. Вырежьте и отполируйте микропипетки (также известные как канюли) примерно до 1-2 см в длину для установки в камеру перфузии изолированного сосуда.
   2. Подключите каждую установленную стеклянную канюлю в камере перфузии сосуда к независимым датчикам давления, расположенным на одной линии с независимыми регуляторами давления с гравитационной подачей с помощью полиэтиленовых трубок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет независимо манипулировать давлением притока и оттока в зависимости от дизайна исследования. На рисунке 1 подробно показана эта настройка.
   3. Заполните перфузионную камеру (5 мл), стеклянные микропипетки и независимый гравитационный регулятор давления вместе с полиэтиленовой трубкой физиологическим раствором соли (PSS; 119 мМ NaCl; 24 мМ NaHCO₃; 1,17 мМ₂PO₄; 4,7 мМ KCl; 1,17 мМ MgSO₄; 5,5 мМ C₆H₁₂O₆ (глюкоза); 0,026 мМ C₁₀H₁₆N₂O₈ (ЭДТА) и 1,6 мМ CaCl₂) лишен каких-либо пузырьков воздуха. Затем зажмите давление, чтобы канюли не оказывали давления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: pH этого раствора составляет ~7,5. В перфузионной ванне поддерживается pH 7,4 с использованием барботирования CO₂ для воздействия на буферную систему бикарбоната в PSS, как описано на шаге 1.3.7. ЭДТА используется здесь для хелатирования избытка ионов^Ca2+ .
2. Подготовка узлов
   1. Завяжите двойные верхние узлы под микроскопом с помощью плетеной шелковой шовной нити (размер 8-0). Основные шаги показаны на рисунке 2.
      1. Отделите одну нить.
      2. Используйте два щипца Dumont #5 с микропритупленными наконечниками и с помощью одного щипца сделайте двойную петлю вокруг кончика других щипцов.
      3. С помощью петлевых щипцов возьмитесь за свободный конец шва и протяните его через обе петли, следя за тем, чтобы не вытянуть узел полностью и оставить небольшое отверстие.
      4. С помощью пружинных ножниц Vanna разрежьте излишки швов с любой стороны. Используйте эти узлы позже, чтобы закрепить LV на канюлях.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте те же щипцы, которыми вы будете препарировать или канюлировать, потому что существует большая опасность повредить кончики щипцов во время завязывания узла.
3. Выделение и канюляция брыжеечных ЛЖ
   1. Глубокую анестезию животных путем введения 5% изофлурана при передозировке 1,5 л/мин_О2 и обескровливание путем обезглавливания.
   2. Изолируйте целые брыжейки для рассечения брыжеечных ЛЖ, сначала сделав продольный разрез по средней линии брюшной стенки, выведя брыжейку наружу, а затем отрезав соединение чуть ниже пилорического сфинктера и на ~2-3 см выше слепой кишки, а также соединение с прямой кишкой.
   3. Вымойте рассеченные целые брыжейки в 200 мл ледяного PSS, а затем перенесите и приколите в силиконовую (8-10 мм) чашку Петри (100 мм), содержащую ледяной PSS.
   4. Препарируйте брыжеечные ЛЖ второго порядка из окружающего жира и соединительной ткани с помощью стереомикроскопа, тонких щипцов Dumont #5 Inox и пружинных ножниц Vanna. Чтобы определить концы ЛЖ после удаления из ткани, оставьте небольшой кусочек жира на проксимальном конце ЛЖ.
   5. Перенесите рассекреченные ЛЖ в камеру перфузии сосуда для канюляции на стеклянных канюлях.
   6. Используйте два предварительно заточенных тонких щипца Dumont #5 Inox с прямым концом (0,05 x 0,01 мм) для канюляции ЛЖ дистальным концом ЛЖ на канюле P1 (приток) и проксимальным концом сосуда на канюле P2 (отток), чтобы имитировать направление лимфотока.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Канюли P1 и P2 идентичны и отличаются только тем, к какому концу ЛЖ подключена. Важно использовать щипцы, которые идеально сходятся на кончике и без повреждений, чтобы облегчить захват тонкой стенки сосуда.
      1. Наденьте один предварительно завязанный узел на каждую стеклянную канюлю, чтобы позже закрепить сосуд на канюлях.
      2. Используя небольшой кусочек жира для ориентации направления ЛЖ, сначала канюлялизируйте дистальный конец на P1.
      3. Сдвиньте узел вниз по канюле и затяните, чтобы зафиксировать LV. Следите за тем, чтобы не перетянуть и не сломать кончик канюли.
      4. Нагнетайте давление в ЛН до 4-5 мм рт.ст. в перфузионной камере.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для наших целей мы устанавливаем давление P1 и P2 равными; Однако, в зависимости от условий эксперимента, давление может быть отрегулировано на каждой канюле, чтобы вызвать напряжение сдвига или обратный поток.
      5. Повторите шаги 1.3.6.1-1.3.6.4, чтобы канюлировать проксимальный конец ЛЖ на Р2.
   7. Поместите пузырящийся камень с 7% углекислого газа (CO₂) / 93% кислорода (O₂) в камеру ванны для поддержания физиологического pH.
   8. Подключите камеру к регулятору температуры и установите ее на 37 ^°C, чтобы LV уравновесились и развили стабильные, спонтанные сокращения (примерно 30 минут).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 подробно показана эта настройка.

2. Измерение абсолютных концентраций [Ca²⁺]_i в ЛЖ

1. Фура-2АМ Окрашивание канюлированных ЛЖ
   1. После развития спонтанных сокращений (начиная с шага 1.3.8) инкубируйте ЛЖ с Фура-2-ацетоксиметиловым эфиром (Фура-2АМ; 2 мкМ или 10 мкл/5 мл) и плуроновой кислотой (ПА; 0,02% Вт/В или 5 мкл/5 мл 20% ПА) в течение 30 минут в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления Fura-2AM все оставшиеся действия необходимо выполнять в темноте.
   2. Через 30 минут замените раствор в перфузионной камере 3 раза, опорожнив весь объем ванны вакуумом отрицательного давления, заменив его соответствующим по температуре (37 ^°C) безреагентным PSS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это следует сделать быстро, чтобы свести к минимуму время нахождения РН в воздухе. Используйте обе руки, например, правую руку для вакуума, а левую руку для замены нового PSS, не содержащего реагентов.
   3. После промывки инкубируйте ЛЖ в течение 15 минут в темноте, чтобы удалить избыток индикатора и обеспечить деэтерификацию.
2. Захват Ca²⁺ флуоресценция и диаметр сосуда
   1. Перенесите камеру на инвертированный предметный столик флуоресцентного микроскопа, оснащенный светодиодным источником света, объективом 20x S S, адаптером для формирования кадрирования ячеек и быстрой системой видеокамер CMOS, которая позволяет покадрово захватывать флуоресценцию с частотой 15 Гц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Схема настройки этого рабочего процесса представлена на рисунке 3. Сигнал Ca²⁺ может быть захвачен с помощью ПЗС-камеры со скоростью не менее 15 кадров в секунду.
   2. Подключите микроскоп к компьютеру, оснащенному программным обеспечением для визуализации для записи флуоресценции и обнаружения краев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение, на которое распространяется ссылка, также позволяет одновременно регистрировать давление; Однако это здесь не включено.
   3. Включите светодиодный источник света и интерфейс люминесцентной системы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Описанные здесь инструкции по программному обеспечению относятся к указанному программному обеспечению, но для получения этих данных можно использовать и другое программное обеспечение.
   4. Откройте программное обеспечение (IonWizard).
   5. На вкладке Файл выберите Создать.
   6. На вкладке Сбор выберите Эксперимент.
   7. Загрузите нужный экспериментальный шаблон и нажмите OK.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вам нужно будет настроить экспериментальный шаблон с параметрами, которые будут измеряться. Инструкции по настройке шаблона можно найти в руководстве по программному обеспечению²⁹.
   8. Настройте трассировки на экране, чтобы увидеть диаметр сосуда, числитель (сигнал 340), знаменатель (сигнал 380) и соотношение в порядке убывания.
   9. При необходимости отрегулируйте масштаб по оси Y, чтобы визуализировать трассы.
      1. В разделе Трассировки выберите Изменить ограничения пользователей. Убедитесь, что флажок «Автоматические лимиты» снят.
      2. Выберите параметр, который требуется настроить, введите минимальное и максимальное значения для оси, а затем нажмите кнопку OK.
   10. Чтобы начать эксперимент, нажмите кнопку СТАРТ (в нижней части экрана).
   11. Для одновременного измерения диаметра ЛЖ используйте программное обеспечение для обнаружения краев, встроенное в систему визуализации, которое генерирует сократительные следы ЛЖ на частоте 3 Гц. Используйте эти измерения для анализа параметров сократительной силы и ритмичности, описанных в разделе 3 и показанных на рисунке 4.
       1. Обязательно отрегулируйте освещение так, чтобы стена LV выглядела темными линиями.
       2. Выберите область интереса (ROI), в которой нет жира и мусора. После начала эксперимента не перемещайте эту окупаемость инвестиций.
       3. Убедитесь, что порог установлен таким образом, чтобы кромка стенки сосуда обнаруживалась на протяжении всего цикла сжатия.
   12. Для измерения флуоресценции включите фотоумножитель (PMT).
   13. Возбуждайте ратиометрический индикатор Fura-2, чередуя длины волн 340 и 380 нм с экспозицией 50 мс с помощью светодиодных осветителей, и захватывайте спектры излучения на длине волны 510 нм с частотой 15 Гц по всему полю изображения.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения воспроизводимых измерений Ca²⁺ важно сохранять все оптические параметры (настройки возбуждения, эмиссионные фильтры, объектив и дихроичные зеркала) одинаковыми для всей серии экспериментов.
   14. Измерьте соотношение сигнал/фон, сначала получив флуоресценцию 340 и 380 с помощью LV в центре поля зрения (сигнала), а затем, используя сценические манипуляторы, переместите поле зрения к краю ванны без сосуда (стараясь избегать края с силиконовой подкладкой и/или удаляя любой мусор из ванны), чтобы захватить фон.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Важно каждый раз возвращаться к исходной части судна для измерений Ca²⁺ .
   15. Замените раствор ванны на реагент без PSS соответствующей температуры, чтобы удалить избыточный индикатор в ванне. Для удаления избытка Fura-2 может потребоваться несколько обменов в ванне, поэтому повторяйте эту замену до тех пор, пока соотношение сигнал/фон не станет примерно 10:1.
   16. Запишите исходный сигнал флуоресценции Fura-2 и спонтанные сокращения в течение приблизительно 30 мин с последующей кумулятивной реакцией концентрации нифедипина (NIF; 0,1-100 нМ), потенциал-зависимого антагониста Cav_1.x. Получите фоновые измерения для каждой концентрации препарата.
   17. В конце каждого эксперимента промывают ЛЖ соответствующим по температуре Ca²⁺-free PSS для получения минимального сигнала флуоресценции Fura-2 (R_min) и максимального диаметра ЛЖ при отсутствии Ca²⁺. Обязательно измерьте фон.
       ПРИМЕЧАНИЕ: ПСС без Ca²⁺ имеет тот же состав, что и PSS, но без CaCl₂, а ЭДТА заменяется на 1 мМ EGTA (C₁₄H₂₄N₂O₁₀) (pH ~ 7,5).
   18. Замените раствор ванны на согласованный по температуре PSS, содержащий 10 мМ Ca²⁺ и иономицин (10 мкМ IONO), ионофор Ca²⁺ , для получения максимального флуоресцентного сигнала Fura-2 (R_max) и минимального диаметра ЛЖ в условиях насыщения Ca²⁺. Обязательно измерьте фон.
3. Формула для измерения абсолюта [Ca²⁺]_i
   1. Используйте R_min и R_max для калибровки соотношения длин волн 340 и 380 нм и расчета абсолютной концентрации свободного цитозольного Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i).
   2. Рассчитайте абсолютную концентрацию свободного цитозольного Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) с помощью уравнения (1)²⁶:
      (1)
      Где K_d = 225 нМ (константа диссоциации для Fura-2)²⁶, отношение R = 340/380, отношение R_min = 340/380 при отсутствии Ca²⁺, отношение R_max = 340/380 при условиях насыщения Ca²⁺, S_{свободный} = 380 сигнал при отсутствии Ca²⁺,_{S связанный} = 380 сигнал при условиях насыщения Ca²⁺
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все флуоресцентные сигналы были скорректированы на фоновую флуоресценцию.
   3. На рисунке 5 показан пример трассировки Ca²⁺ с подробным описанием записываемых параметров. Определите базовую линию Ca²⁺ как самый низкий уровень Ca²⁺ в состоянии покоя до пика Ca²⁺ и пик Ca²⁺ как самый высокий уровень Ca²⁺ , достигнутый во время пика Ca²⁺ . Амплитуда — это разница между пиковым и базовым уровнем Ca²⁺. Экспортируйте все параметры непосредственно из программного обеспечения для обработки изображений, за исключением частоты скачка Ca²⁺ , которая должна быть рассчитана в автономном режиме как количество пиков Ca²⁺ в секунду. Ниже приведены ключевые шаги в рамках указанного программного обеспечения для получения этих параметров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Целые трассы могут быть экспортированы в файл .txt, а все параметры могут быть проанализированы или рассчитаны в выбранном вами программном обеспечении.
   4. Для значения R_min выделите участок трассы Numerator, соответствующий фону во время PSS без Ca²⁺. Откроется диалоговое окно, в котором будут представлены значения для этой части трассировки.
   5. В разделе Операции выберите Константы.
   6. Выберите Кальций-Числовой фон и введите фоновые номера для числителя и знаменателя из предыдущего шага. Нажмите OK.
   7. Выделите участок кривой Ratio, который соответствует наименьшему соотношению во время PSS без Ca²⁺. Это R_мин. Также обратите внимание на значение Знаменателя для этого раздела; это_{S бесплатно}.
   8. Повторите шаги с 2.3.4 по 2.3.7 для R_max и S_{, ограниченных} участком трассы, который соответствует высокому Ca²⁺ free PSS и наивысшему коэффициенту.
   9. В разделе Операции выберите Константы.
   10. Выберите Calcium-Calcium Calibration (Кальциево-кальциевая калибровка) и введите значения, перечисленные в уравнении 1. Нажмите OK.
   11. Настройте одну из кривых на экране, как описано в шаге 2.2.8, чтобы вы могли видеть кальций-числовой вычтенный кальций.
   12. Выполните анализ монотонных переходных процессов для получения остальных параметров. Инструкции по этому поводу можно найти в руководстве по программному обеспечению³⁰.
   13. Либо в разделе Экспорт выберите Текущая трассировка.
   14. Выберите папку, в которую вы хотите экспортировать файл .txt, и нажмите OK.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно нажмите на отдельную трассу, которую вы хотите экспортировать. Вы можете экспортировать всю трассировку или выбранные участки трассировки.

3. Измерение сократимости и ритмичности ЛЖ

1. Программное обеспечение для обнаружения краев, встроенное в систему визуализации, генерирует сократительные кривые для измерения диаметра LV, как описано выше. Используйте эти измерения для анализа параметров сократительной и ритмичности. На рисунке 4 приведен пример сократительной кривой с подробным описанием того, какие сократительные параметры должны быть зарегистрированы. Экспортируйте все параметры непосредственно из программного обеспечения для визуализации с помощью функции анализа монотонных переходных процессов на трассе диаметра³⁰, за исключением частоты сокращений, рассчитанного расхода и интервала, которые должны быть рассчитаны в автономном режиме.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Целые трассы могут быть экспортированы в файл .txt, а все параметры могут быть проанализированы или рассчитаны в выбранном вами программном обеспечении с использованием приведенных ниже уравнений.
2. Измерения EDD, ESD, амплитуды, частоты и расчетного расхода
   1. Измерьте максимальный и минимальный диаметры (конечный диастолический диаметр [EDD] и конечный систолический диаметр [ESD] соответственно), которые могут быть достигнуты ЛЖ во время их ритмичных и спонтанных сокращений.
   2. Рассчитайте амплитуду сокращений (АМФ) как разницу между ПДР и ЭСР.
   3. Рассчитайте частоту как количество сокращений за период измерения (в с).
   4. Рассчитаем рассчитанный расход на мкм с помощью уравнения (2):
      Расчетный расход = π/4(EDD²- ESD²)F (2)
      где EDD² = площадь поперечного сечения сосуда в расслабленном состоянии, ESD² = измерение площади поперечного сечения сосуда во время сужения, F = частота сокращений/с
3. Ритмичность: время сокращения и расслабления:
   1. Другими показателями ритмичности ЛЖ являются время сокращения и время расслабления.
   2. Определите время сокращения как время, затраченное LV на достижение ESD при каждом сокращении.
   3. Определите время релаксации как время, затраченное ЛЖ на достижение EDD для каждой релаксации, что даст общее представление о ритмичности, коррелированной с абсолютным [Ca²⁺]_i в течение определенного периода времени.
   4. Вычислите время интервала (ΔT) по уравнению (3).
      Δt = t2 _(ESD2)-t1 _(ESD1) (3)

Результаты

Сократительную способность ЛЖ и соответствующие изменения цитозольного, свободного Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) оценивали в изолированных брыжеечных ЛЖ крыс при воздействии различных концентраций нифедипина (NIF; 0,1-100 нМ) (рис. 6). Параметры, включая амплитуду спайка Ca²⁺, исходный уровень Ca²⁺ и пик Ca²⁺, демонстрировали зависящее от концентрации снижение при постепенном добавлении NIF в перфузионную камеру (рис. 7A). В то же время сократительные параметры, такие как амплитуда сокращения и расчетный поток, также продемонстрировали ступенчатое уменьшение (рисунок 7B). Наблюдалось небольшое увеличение диаметра EDD при использовании NIF (рис. 7B). Частота спайка Ca²⁺ и частота сокращения, по-видимому, являются реакцией по принципу «все или ничего». Однако этот эффект имел место при 10 нМ для одной ЛЖ, в то время как все ЛЖ прекратили сокращения на 100 нМ. Таким образом, объединенные данные генерируют графики, которые напоминают градуированную реакцию концентрации. Этот эффект согласуется с более ранними публикациями, в которых использовали NIF на ЛЖ в других препаратах (проволочная и давящая миография^13,14). Манхэттенские графики показывают индивидуальные реакции ЛЖ на измерения ритмичности, включая интервал, время сокращения и время релаксации (рис. 7C). Этот тип представления данных позволяет исследователю выявить эти реакции «все или ничего» или изменчивость в ритмах сокращения, чтобы получить дополнительное представление о лежащих в их основе механизмах. В конечном счете, уменьшение амплитуды и частоты сокращения привело к уменьшению расчетного потока через эти изолированные ЛЖ, который служит суррогатным индикатором функции in vivo. В целом, снижение сократительной способности ЛЖ коррелировало со снижением [Ca²⁺]_i. Наши результаты являются прямым доказательством того, что в диапазоне 100 нМ NIF эффективно останавливает сокращения и колебания [Ca²⁺]_i в ЛЖ, противодействуя каналам Ca_v1.x, присутствующим в клетках лимфатических мышц (БМК).

Рисунок 1: Изображение установки изолированной камеры сосуда. Для исследования перфузии сосудов использовалась изолированная камера сосуда, оснащенная терморегулятором. Для контроля давления через резервуар PSS использовалась сила тяжести. Давление контролировалось датчиками, подключенными к входным (P1) и отточным (P2) канюлям. Сокращение: ПСС = физиологический раствор соли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Подготовка узла с первого взгляда. (А) Подготовка двойной петли под микроскопом для препарирования с использованием одной нити из 3-слойной шелковой шовной нити, (В) захват свободного конца и протягивание его через обе петли, (В) вытягивание узла с обоих концов, чтобы сохранить небольшое отверстие, и (Г) разрезание излишков нити с обеих сторон и синей коробки, показывающей готовый к использованию полный двойной узел. Масштабная линейка = 1,5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Схема экспериментального рабочего процесса для сбора данных. Здоровую крысу обезболивали 5% индукцией изофлурана и провели обезглавливание для удаления крови из туловища. Был выполнен разрез по средней линии, чтобы обнажить и изолировать брыжейку. Изолированную брыжейку размазывали в ледяном растворе PSS и рассекали ЛЖ без жира для канюляции в камере перфузии изолированного сосуда. Ванна была размещена на предметном столике инвертированного микроскопа с помощью объектива с 20-кратным увеличением. Судно возбуждалось поочередно светом с длиной волны 340 и 380 нм, а спектры эмиссионных флуоресцентных излучений собирались с помощью ПЗС-камеры на длине волны 510 нм. Компьютер, подключенный к микроскопу, генерировал сократительные и^Ca2+ следы с помощью программного обеспечения для флуоресцентного захвата и визуализации с детекцией краев. Масштабная линейка = 1 мм. Сокращения: ПСС = физиологический раствор соли; LV = лимфатический сосуд; CCD = устройство с зарядовой связью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Репрезентативная сократительная кривая ЛЖ. (A) Пример регистрации изменений диаметра канюлированных ЛЖ, загруженных с помощью индикатора Ca²⁺ Fura 2 AM в PSS и (B) увеличенная кривая для отображения всех параметров, связанных с сократимостью сосуда: EDD, ESD, AMP и частота. Эти значения использовались для расчета ритмичности и потока. Сокращения: ПСС = физиологический раствор соли; LV = лимфатический сосуд; EDD = конечный диастолический диаметр; ESD = конечный систолический диаметр; AMP = амплитуда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Репрезентативная кривая визуализации ЛЖ Ca²⁺ . (A) Пример записи изменений абсолютного значения [Ca²⁺]_i в канюлированных ЛЖ, загруженных Fura-2 в PSS, и (B) увеличенная трассировка для отображения всех параметров (пика, амплитуды и базового уровня), относящихся к [Ca²⁺]_i (без коррекции фона). Сокращение: ПСС = физиологический раствор соли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Краткий обзор сократимости ЛЖ и визуализация Ca²⁺ . Репрезентативные следы, соответствующие (A) диаметру, (B) соотношению 340/380 и (C) абсолютному [Ca²⁺]_i исходному уровню PSS, нифедипину, антагонисту канала Ca_v1.x (Ca²⁺), реакции на концентрацию, включая R_min и R_max. Сокращения: ПСС = физиологический раствор соли; LV = лимфатический сосуд; NIF = нифедипин; R_min = минимальный флуоресцентный сигнал Fura-2; R_max = максимальный флуоресцентный сигнал Fura-2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 7: Осцилляция Ca²⁺ и соответствующая сократительная способность, блокируемые нифедипином в ЛЖ. (A) Ca²⁺ (n = 3) и (B) сократительные (n = 3) снижались в зависимости от концентрации при добавлении нифедипина, потенциал-зависимого антагониста канала Ca_v1.x (Ca²⁺). (C) Репрезентативные графики Манхэттена показывают средний интервал времени (Δt) между сокращениями и временами сокращения и расслабления. Данные представлены в виде среднего ± SEM. Сокращения: PSS = физиологический раствор соли; LV = лимфатический сосуд; NIF = нифедипин; EDD = конечный диастолический диаметр; AMP = амплитуда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Из-за хрупкого и миниатюрного характера ЛЖ крайне важно проявлять максимальную осторожность как в процессе диссекции, так и в процессе канюляции. Даже незначительные повреждения судна могут привести к развитию нежизнеспособной РН или вызвать аномалии в переходных процессах [Ca²⁺]_i . Согласованность настроек возбуждения одинаково важна на протяжении всей экспериментальной серии для обеспечения сопоставимости измерений [Ca²⁺]_i между контрольной и обработанной группами. Неспособность поддерживать единообразные настройки создает значительный риск завышения или занижения [Ca²⁺]_i на судах экспериментальной серии. Точно так же важно точно идентифицировать и контролировать одну и ту же область сосуда на протяжении каждого эксперимента.

Использование ратиометрического индикатора Фура-2АМ нормализует колебания флуоресценции, вызванные неравномерной толщиной ткани, распределением/утечкой флуорофора или фотообесцвечиванием, проблемами, характерными для одноволновых красителей. ³¹ Это обеспечивает непрерывный мониторинг, описанный в настоящем протоколе. Однако, поскольку Fura-2 работает за счет хелатирования Ca²⁺, возможно перегрузка LV и уменьшение [Ca²⁺]_i , доступного для сокращения или лекарственного ответа. В этих случаях могут наблюдаться всплески Ca²⁺ при отсутствии ритмичных сокращений. Изменение длины LV также может способствовать этому явлению. Хотя эти измерения^Ca2+ , вероятно, все еще могут быть действительными, может потребоваться снижение концентрации Fura-2AM в воспроизведенных установках для успешного достижения измерений как^Ca2+ , так и диаметра. Наши результаты включают только те ЛЖ, для которых на исходном уровне присутствовали как всплески Ca²⁺ , так и ритмические сокращения.

Измерение R_min и R_max является критическим шагом при вычислении абсолютного [Ca²⁺]_i. Поскольку в отсутствие Ca²⁺ _{R min} должен быть отношением Fura-2, к бесплатному Ca²⁺ PSS была добавлена высокая концентрация EGTA для обеспечения хелатирования любого остаточного Ca²⁺. Первоначальные исследования были проведены с ЭДТА в свободном от Ca²⁺ PSS, и это привело к спорадическим сокращениям сосудов с соответствующими шипами Ca²⁺. Для R_max высокая концентрация Ca²⁺ была добавлена в PSS вместе с ионофором, иономицином, чтобы максимизировать сигнал [Ca²⁺]_i. Раствор с высоким содержанием Ca²⁺ может выпасть в осадок, что может потребовать удаления ЭДТА из ПСС. Важно отметить, что эти дополнительные измерения R_min и R_max дают возможность оценить физиологически значимые изменения [Ca²⁺]_i, что может предоставить информацию о мембранной возбудимости и механизмах сократимости²⁷, а также позволяет проводить базовые сравнения между экспериментальными группами по сравнению с протоколами, которые сообщают только о соотношении 340/380 для Fura-2. Неспособность достичь адекватных значений R_min и R_max исключает возможность вычисления абсолютного [Ca²⁺]_i.

Из-за сократительной природы ЛЖ этот метод может обеспечить измерение только глобальных уровней Ca²⁺, а не локальных событий высвобождения Ca²⁺, которые могут быть измерены в парализованных сосудах³². Тем не менее, этот метод выгоден для корреляции изменений абсолютной динамики [Ca²⁺]_i с сократительной способностью по сравнению с методами с использованием парализованных сосудов или отдельных клеток^28,32. При таком подходе предполагается, что большая часть измеренного^Ca2+ происходит из клеток лимфатических мышц. Тем не менее, эндотелиальные клетки, которые также присутствуют в этих выделенных ЛЖ, могут вносить свой вклад в общий наблюдаемый сигнал^{Ca2+ 33}. Этот вклад можно оценить с помощью ЛЖ, которые были лишены эндотелия³⁴. Сокращения ЛЖ также могут привести к тому, что стенка сосуда немного смещается внутрь и вниз во время цикла сокращения. Поэтому важно использовать короткие сегменты сосуда, которые можно тянуть туго, но без растяжения сосуда.

Помимо применения в ЛЖ, этот метод может быть использован для изучения изолированных сосудов из других сосудистых русла, включая артериолы и вены, и имеет перспективы для потенциального использования в нейробиологии и других отраслях сосудистой биологии. Изучение эффектов различных агонистов или антагонистов, нацеленных на различные пути передачи сигнала, является еще одним направлением исследования основной динамики Ca²⁺ . Кроме того, этот метод также может быть использован для сравнительных исследований с использованием контрольных и обработанных образцов от соответствующих животных. Кроме того, этот подход может быть адаптирован для реализации на клеточном уровне, например, в изолированных клетках лимфатических мышц, требуя минимальной корректировки перфузионной камеры и объективов микроскопа. Таким образом, этот метод дает физиологически значимое представление о глобальной динамике Ca²⁺ , поскольку она коррелирует с сократимостью и ритмичностью в ЛЖ, а также обеспечивает надежную оценку потенциальных регуляторов динамики Ca²⁺ в сборе ЛЖ.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
20x S Fluor объектив	Olympus Corporation of the Americas (Сентер-Вэлли, Пенсильвания, США)	UPlanSApo
Микропипетки из боросиликатного стекла	Living Systems Instrumentation (Берлингтон, Вермонт, США)	GCP-75-100
Хлорид кальция (CaCl2)	Биореагенты Fisher (Уолтем, Массачусетс, США)	BP510-500
Углекислый газ (CO2)	nexAir (Мемфис, Теннесси, США)	UN3156
Щипцы для рассечения	Fine Science Tools (Фостер-Сити, Калифорния, США)	11254-20
ЭДТА (C10H16N2O8)	Биореагенты Фишера (Уолтем, Массачусетс, США)	BP118-500
EGTA (C14H24N2O10)	Биореагенты Фишера (Уолтем, Массачусетс, США)	O2783-100
Фура-2АМ	Инвитроген (Уолтем, Массачусетс, Соединенные Штаты)	F1221
Глюкоза (C6H12O6)	Биореагенты Фишера (Уолтем, Массачусетс, США)	D16-500
Регулятор давления с гравитационной подачей	изготовленный на заказ в лаборатории
Нагревательный блок	Приборы для живых систем (Берлингтон, Вермонт, США)	TC-09S
Программное обеспечение для визуализации	IonOptix (Вествуд, Массачусетс, США)
Инвертированный флуоресцентный микроскоп	Olympus Corporation of the Americas (Center Valley, PA, США)	IX73
Ionomycin	Invitrogen (Уолтем, Массачусетс, США)	I24222
IonOptix Cell Framing Adaptor	IonOptix (Вествуд, Массачусетс, США)	665 DXR
Isoflurane	Piramal Critical Care (Телангана, Индия)	NDC 66794-017-10
Изолированная перфузионная камера	для сосудов Приборы для живых систем (Берлингтон, Вермонт, США)	CH-1
	Fine Science Tools (Фостер-Сити, Калифорния, США)	11253-20
Светодиодный источник света	Olympus Corporation of the Americas (Сентер-Вэлли, Пенсильвания, США)	TL4
Сульфат магния (MgSO4)	Acros Organics (Нью-Джерси, Нью-Джерси, США)	213115000
MyoCam-S3 Fast CMOS видеосистема	IonOptix (Вествуд, Массачусетс, США)	MCS300
Nifedipine	Sigma (Сент-Луис, Миссури, США)	N7634
Офтальмологические шовные материалы
Oxygen (O2)	nexAir (Мемфис, Теннесси, США)	UN1072
Плуроновая кислота	Sigma (Сент-Луис, Миссури, США)	P2443
Хлорид калия (KCl)	Биореагенты Fisher (Уолтем, Массачусетс, США	BP366-500
	Приборы для живых систем (Берлингтон, Вермонт, США)	Преобразователь давления PM-4
	Приборы для живых систем (Берлингтон, Вермонт, США)	PT-F
Силиконовая подкладка Петри	изготовленная на заказ в лаборатории
Бикарбонат натрия (NaHCO3)	Биореагенты Фишера (Уолтем, Массачусетс, США	BP328-500
Хлорид натрия (NaCl)	Биореагенты Фишера (Уолтем, Массачусетс, США	BP358-212
Фосфат натрия (NaH2PO4)	Биореагенты Фишера (Уолтем, Массачусетс, США	BP329-500
Крысы Sprague-Dawley	Envigo RMS (Индианаполис, Индианаполис, США)	Самец	9-13 недель
Стереомикроскоп	Leica Microsystems (Вецлар, Германия)	S9D
Ваннас пружинные ножницы	Fine Science Tools (Фостер-Сити, Калифорния, США)	15000-03