В этом протоколе подробно описаны этапы предварительной иммуноэлектронной микроскопии с акцентом на изучение синаптических цепей и локализации белков в сетчатке.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Исследование контуров сетчатки и молекулярной локализации с помощью иммуноэлектронной микроскопии перед встраиванием
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сетчатка состоит из многочисленных клеток, образующих различные нейронные цепи, которые составляют первую стадию зрительного пути. Каждая цепь характеризуется уникальными особенностями и различными нейротрансмиттерами, определяющими ее роль и функциональное значение. Учитывая сложность типов клеток в ее структуре, сложность нейронных цепей в сетчатке создает проблемы для исследования. Чтобы лучше исследовать цепи сетчатки и перекрестные помехи, такие как связь между колбочками и палочками, а также точную молекулярную локализацию (нейротрансмиттеры или нейропептиды), такую как наличие вещества Р-подобной иммунореактивности в сетчатке мыши, мы использовали метод иммуноэлектронной микроскопии (иммуно-ЭМ) для изучения синаптических связей и организации. Этот подход позволяет нам точно определить специфические межклеточные синаптические связи и точную молекулярную локализацию, а также может сыграть ведущую роль в изучении его функции. В этой статье описывается протокол, используемые реагенты и подробные шаги, включая (1) подготовку к фиксации сетчатки, (2) предварительное иммуноокрашивание и (3) постфиксацию и встраивание.
Введение
Сложность нейронных цепей в сетчатке представляет трудности для исследования, учитывая разнообразие типов клеток в ее структуре 1,2. Начальный этап включает в себя выявление синаптических связей между различными клетками и определение клеточной локализации специфических нейротрансмиттеров или нейропептидов. По мере того, как молекулярная биология вводит новые белки, точная локализация в сетчатке становится решающей для понимания их функций и анализа цепей сетчатки и синаптических связей 3,4,5.
Из-за ограниченного разрешения световой микроскопии, электронная микроскопия (ЭМ) обычно используется для обнаружения субклеточных структур нервных клеток. ЭМ имеет различные классификации, при этом для наблюдения ультраструктур клеток используется обычная просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) 6,7,8,9. Иммуноэлектронная микроскопия (иммуно-ЭМ), сочетающая пространственное разрешение ЭМ с химической идентификацией антител, специфически связывающихся с белками10, выделяется как оптимальный и эксклюзивный метод исследования синаптических связей и локализации субклеточных белков в сетчатке 11,12.
Методы иммуно-ЭМ можно разделить на методы до встраивания и после встраивания в зависимости от порядка встраивания и инкубации антител. По сравнению с методом пост-эмбеддинга, подход с предварительным встраиванием способен проводить крупномасштабную и дальнюю идентификацию 13,14,15, предлагая оптимальный подход для изучения клеточных процессов, таких как аксоны и дендриты. Кроме того, этот метод обеспечивает сильный сигнал и широкое поле зрения, что делает его предпочтительным для всесторонних исследований экспрессии белка и молекулярной локализации в цитоплазме. Этот метод оказывается особенно ценным для обеспечения химически идентифицированных структур, видимых по всей цитоплазме, клеткам или сетчатке.
Тем не менее, метод после встраивания, хотя и имеет более низкую проникающую способность или диффузию по сравнению с методом предварительного встраивания, не так чувствителен16,17. Проще говоря, если целью является изучение локализации специфических нейротрансмиттеров в цитоплазме или синаптических окончаниях, предпочтительным методом является предварительное встраивание иммуно-ЭМ. И наоборот, для выявления локализации мембранных рецепторов более рекомендуется использовать поствстраивание иммуноголда ЭМ.
Учитывая эти соображения, мы выбираем метод предварительного встраивания иммуно-ЭМ для изучения цепей сетчатки, включая взаимодействие между колбочками и палочками, а также молекулярную локализацию, такую как распределение и синаптическая организация вещества P-подобной иммунореактивности (SP-IR) в сетчатке мыши.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Уход за животными и обращение с ними были одобрены Положением Комитета по этике Медицинского университета Вэньчжоу в соответствии с руководящими принципами ARVO. В этом исследовании были использованы взрослые мыши (C57BL/6J, самцы и самки, в возрасте от 8 до 12 недель). Оборудование и реактивы, необходимые для проведения исследования, перечислены в Таблице материалов.
1. Подготовка к фиксации сетчатки
- Соберите следующие материалы и инструменты: препарирующий микроскоп, два щипца с очень тонкими наконечниками, ножницы, иглу для шприца объемом 1 мл (размер иглы: G26) и фильтровальную бумагу.
- Глубоко обезболивайте мышей путем внутрибрюшинного введения 2,2,2-трибромэтанола в дозе 0,25 мг/г массы тела. Впоследствии обезглавить мышей и отрезать им головы16.
- Наложите на них отверстия ножницами и поместите их в стеклянную чашку, содержащую 4% параформальдегида-0,2% пикриновой кислоты в 0,1 М фосфатном буфере (PB; pH 7,4).
- Под рассекающим микроскопом проделайте отверстие в лимбе роговицы с помощью иглы шприца объемом 1 мл и отрежьте передний сегмент ножницами, следуя за отверстием. Затем снимите хрусталик с внутренней поверхности сетчатки с помощью щипцов.
- С помощью двух щипцов осторожно отслаивайте склеру до тех пор, пока сетчатка полностью не будет изолирована от наглазника (ткань сетчатки каппи, отделенная от сосудистой оболочки полностью). Впоследствии разрежьте сетчатку на четыре части.
- Зафиксируйте эти участки в 4% параформальдегид-0,2% пикриновой кислоты в 0,1 М PB (pH 7,4) в течение 2 ч при комнатной температуре (RT), а затем перенесите ткань в 4% параформальдегид в 0,1 M PB (pH 10,4) на ночь при 4 °C.
2. Предварительное иммуноокрашивание
- После промывания в 0,01 М PBS (pH 7,4) шесть раз по 10 мин каждый инкубируйте ткани сетчатки в 1% борогидриде натрия (NaBH4) в 0,01 М PBS (pH 7,4) в течение 30 мин.
- Промойте участки сетчатки в 0,01 М PBS (pH 7,4) не менее шести раз. Тем временем удалите стекловидное тело с помощью фильтровальной бумаги, а затем разрежьте сетчатку на небольшие срезы размером от 100 до 300 мкм с помощью обоюдоострого бритвенного лезвия.
- После блокирования 5% нормальной козьей сывороткой (NGS) в 0,1 М PB (pH 7,4) в течение 1 ч в режиме ЛТ, инкубируют срезы сетчатки с первичными антителами (Anti-rabbit PKCα, 1:80; Anti-Rabbit SP, 1:100) вместе с 2% NGS в 0,01 М PBS (pH 7,4) в течение 2 ч при RT на шейкере. Затем инкубировать в течение 96 ч (5 дней) при 4 °C в шейкере.
- После шести промываний в течение 10 мин каждый в 0,01 М PBS (pH 7,4) инкубируйте срезы сетчатки с вторичным антителом в точке 1:200, таким как козий антикроличий IgG, вместе с 2% NGS в 0,01 М PBS (pH 7,4) в течение 2 ч при RT на шейкере. Затем инкубируйте в течение 48 часов (2 дня) при температуре 4 °C в шейкере.
Примечание: Вторичные антитела применялись отдельно в контрольных экспериментах. - Промойте полосы сетчатки в 0,01 М PBS (pH 7,4) шесть раз по 10 мин перед инкубацией реагентом A и реагентом B из набора ABC в соотношении 1:100 в 0,01M PBS (pH 7,4) в течение 2 дней при 4°C. (Как реагент А, так и реагент В разбавляли 0,01 М PBS. Например: Раствор: 6 мкл; В раствор: 6 μл; 0,01 M PBS: 588 μл, всего 600 μл).
- Промойте полосы сетчатки в 0,05 М Трис-буфере (pH 7,2) три раза по 10 минут каждый. Затем предварительно инкубируйте полоски сетчатки с 5% реагентом 1 и 5% реактивом 3 из набора DAB в дистиллированной воде в течение 1 часа при комнатной температуре. (Соотношение например: реактив 1:50 μл; реагент 3:50 μл; дистиллированная вода: 900 μл, всего 1000 μл).
- Окрасьте полосы сетчатки DAB. Добавьте одинаковый объем раствора из трех пробирок в наборе DAB по очереди (реагент 1-реактив 2-реагент 3). Наблюдайте за состоянием окрашивания с помощью диссекционного микроскопа. Прекратите окрашивание, когда клетки станут коричневыми; Этот процесс занимает 10-20 минут.
- Промойте полосы сетчатки 0,05 М Трис буфером (pH 7,2) три раза по 10 мин каждый, а затем промойте 0,01 М PBS шесть раз по 10 мин каждый.
3. Постфиксация и встраивание
- Зафиксируйте полоски сетчатки в 2% глутаральдегиде на 1-2 ч при комнатной температуре (RT), а затем промойте в 0,01 М PBS (pH 7,4) шесть раз по 10 мин каждый.
- Инкубируйте полоски сетчатки с 1% тетраоксидом осмия (OsO4) в 0,1 М PB в течение 1 ч при RT и храните их в темном месте.
- После промывания в дистиллированной воде (ddH2O) шесть раз по 10 мин каждый инкубируйте ткани сетчатки с уранилацетатом в течение 1 ч при RT и держите их в темном месте для окрашивания этих тканей.
- Поместите ткани сетчатки в растворы ацетона (50%, 70%, 80% и 90%) на 10 мин каждый, затем в 100% два раза по 10 мин.
- Погрузите ткани сетчатки в смесь, содержащую одинаковый объем уранилацетата и эпоксидной смолы, на 1 ч при 37 °C сушильной печи, а затем в смесь, содержащую уранилацетат и смолу (1:4) на ночь при 37 °C сушильной печи.
- Аккуратно перенесите ткани сетчатки с помощью зубочистки в новую смолу на 1 ч при 45 °C в сушильном шкафу, а затем ориентированную полосу сетчатки встраивают в закладную пластину со смолой.
- Поместите образец в сушильный шкаф при температуре 45 °C на 3 часа и в сушильный шкаф при температуре 65 °C на 48 часов.
- Сформируйте закладные блоки в трапеции и разрежьте блок на участки толщиной 1 мкм с помощью ультрамикротома, окрасьте эти участки толуидиновым синим и предварительно просмотрите интересующие области под световым микроскопом.
- Соберите ультратонкие срезы (70-90 нм) на медных сетках и рассмотрите их под электронным микроскопом.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 1 приведены примеры контрольных экспериментов без инкубации первичных антител против протеинкиназы С-альфа (PKCα) или SP, в которых не было обнаружено иммунореактивности (ИР).
На рисунке 2 изображен PKCα-IR в сетчатке мыши. PKCα служит маркером для всех палочковидных биполярных клеток (эритроцитов) в сетчатке18. На уровне электронной микроскопии (ЭМ) эритроциты могут быть идентифицированы с помощью P...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой статье описаны три критических шага для успешного наблюдения синаптических цепей и локализации белка: (1) быстрая и слабая фиксация, (2) предварительное иммуноокрашивание и (3) постфиксация и встраивание.
Мы предполагаем, что фиксация является ключевым этапом для успешного подхода к предварительному встраиванию иммуно-ЭМ. Таким образом, здесь подчеркивается важность свежей фиксирующей и быстрой фиксации, называя этот принцип «принципом 4F», который имее...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не раскрывают информацию.
Благодарности
Эта работа была частично поддержана грантами Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2022YFA1105503), Государственной ключевой лаборатории нейронаук (SKLN-202103), Чжэцзянского фонда естественных наук Китая (Y21H120019).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1 мл игла для шприца | 1 | ||
| % OsO4 | Электронная микроскопия | Наука 19100 | |
| 2,2,2-трибромэтанол | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 8% Глутаральдегид | Электронная микроскопия | Наука 16020 | |
| 8% Параформальдегид | Электронная микроскопия Наука | 157-8 | |
| Ацетон | Электронная микроскопия Наука | 10000 | |
| Антикролик PKC | Sigma-Aldrich | P4334 | |
| Антикролик SP | Abcam | ab67006 | |
| DAB Субстрат Набор | MXB Биотехнологии | KIT-9701/9702/9703 | |
| Локтевые ножницы | Сучжоу66 зрение компания | 54010 | |
| Электронный микроскоп | Phillips | CM120 | |
| Эпон | смола Электронная микроскопия Наука | 14910 | |
| щипцы | Suzhou66 vision company | S101A | |
| Многопоровая фильтровальная бумага | Merck Millipore | ||
| PR05538 Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | Компонент фосфатного буфера |
| 2PO4· H2O | Sigma | 71507 | Компонент фосфатного буфера |
| Пикриновая кислота | Электронная микроскопия | Наука 19550 | |
| Борогидрид натрия (NaBH4) | Sigma | 215511 | |
| Tris | Solarbio | 917R071 | |
| Ультрамикротом | Leica | ||
| Uranyl ацетат | Электронная микроскопия Science | 22400 | |
| VACTASTAIN ABC kit, пероксидаза (кролик IgG) | Vector Laboratories | PK-4001 |
Ссылки
- Chua, N. J., et al. A complete reconstruction of the early visual system of an adult insect. Curr Biol. 33 (21), 4611-4623.e4614 (2023).
- Ravi Chander, P., Hanson, L., Chundekkad, L., Awatramani, G. B. Neural circuits underlying multi-feature extraction in the retina. J Neurosci. , JN-RM-0910-23 (2023).
- Sirivisoot, S., et al. Development and characterization of mouse anti-canine PD-L1 monoclonal antibodies and their expression in canine tumors by immunohistochemistry in vitro. Vet Q. 43 (1), 1-9 (2023).
- Raeisi, H., et al. Development and characterization of phage display-derived anti-toxin antibodies neutralizing TcdA and TcdB of Clostridioides difficile. Microbiol Spectr. 11 (5), e0531022(2023).
- Ryschich, A., Dong, Y., Schäfer, M., Ryschich, E., Karakhanova, S. DWH24: A new antibody for fluorescence-based cell death analysis. Methods Appl Fluoresc. 11 (4), (2023).
- Jastrzebska, B., et al. Functional characterization of rhodopsin monomers and dimers in detergents. J Biol Chem. 279 (52), 54663-54675 (2004).
- Huang, P., et al. Mechanism of Shenfu injection in suppressing inflammation and preventing sepsis-induced apoptosis in murine cardiomyocytes based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 322, 117599(2024).
- Maheshwari, U., et al. Inorganic phosphate exporter heterozygosity in mice leads to brain vascular calcification, microangiopathy, and microgliosis. Brain Pathol. 33 (6), e13189(2023).
- Mackiewicz, J., et al. Effect of gravity in long-term vitreous tamponade: In vivo investigation using perfluorocarbon liquids and semi-fluorinated alkanes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 245 (5), 665-675 (2007).
- Luján, R., Rubio, M. E. Editorial: Immunoelectron microscopy: Placing molecular functions within a neuronal context. Front Neuroanat. 16, 1043371(2022).
- Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
- Chadha, A., Volland, S., Baliaouri, N. V., Tran, E. M., Williams, D. S. The route of the visual receptor rhodopsin along the cilium. J Cell Sci. 132 (10), jcs.229526(2019).
- Huang, H. J., et al. Multiple nucleocapsid structural forms of shrimp white spot syndrome virus suggests a novel viral morphogenetic pathway. Int J Mol Sci. 24 (8), 7525(2023).
- Tissarinen, P., et al. Elevated human placental heat shock protein 5 is associated with spontaneous preterm birth. Pediatr Res. 94 (2), 520-529 (2023).
- Huang, Z., et al. A neural tract tracing study on synaptic connections for cortical glutamatergic terminals and cervical spinal calretinin neurons in rats. Front Neural Circuits. 17, 1086873(2023).
- Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Diamond, J. S. High-resolution quantitative immunogold analysis of membrane receptors at retinal ribbon synapses. J Vis Exp. 108, e53547(2016).
- Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur J Neurosci. 9 (11), 2219-2224 (1997).
- Greferath, U., Grünert, U., Wässle, H. Rod bipolar cells in the mammalian retina show protein kinase C-like immunoreactivity. J Comp Neurol. 301 (3), 433-442 (1990).
- Wang, F., et al. Distribution and synaptic organization of substance P-like immunoreactive neurons in the mouse retina. Brain Struct Funct. 228 (7), 1703-1724 (2023).
- van Opbergen, C. J. M., et al. 34;Orphan" Connexin43 in Plakophilin-2 deficient hearts revealed by volume electron microscopy. Front Cell Dev Biol. 10, 843687(2022).
- Li, S., et al. Safe and efficient oral allergy immunotherapy using one-pot-prepared mannan-coated allergen nanoparticles. Biomaterials. 303, 122381(2023).
- Yamashita, K., Kusakabe, M., Sano, M. A simple and rapid method of dissociating hepatocytes from fixed liver of the mouse. Stain Technol. 56 (1), 29-33 (1981).
- Tanabe, T., Shin, M., Fujiwara, K. Immunoelectron microscopy study of polyamines using a newly prepared monoclonal antibody against spermidine: use of a mixture of glutaraldehyde and paraformaldehyde as a cross-linking agent in the preparation of the antigen. J Biochem. 135 (4), 501-507 (2004).
- Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
- Yang, Q., et al. Expression of α-Synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
- Yazulla, S., Studholme, K. M., Zucker, C. L. Synaptic organization of substance P-like immunoreactive amacrine cells in goldfish retina. J Comp Neurol. 231 (2), 232-238 (1985).
- Sassoè-Pognetto, M., Wässle, H., Grünert, U. Glycinergic synapses in the rod pathway of the rat retina: cone bipolar cells express the alpha 1 subunit of the glycine receptor. J Neurosci. 14 (8), 5131-5146 (1994).
- Hartveit, E., et al. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J Comp Neurol. 348 (4), 570-582 (1994).
- Perkins, G. A. The use of miniSOG in the localization of mitochondrial proteins. Methods Enzymol. 547, 165-179 (2014).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041(2011).
- Kar, D., et al. Volume electron microscopy reveals human retinal mitochondria that align with reflective bands in optical coherence tomography [Invited]. Biomed Opt Express. 14 (10), 5512-5527 (2023).
- Johnson, J. E. Jr, et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Mol Vis. 13, 887-919 (2007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
