Методическая статья

Прижизненная двухфотонная микроскопия пересаженного легкого мыши

2.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66566

⸱

19 апреля 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University in St. Louis, 2Division of Thoracic Surgery, University of Maryland, 3Division of Infectious Diseases, Washington University in St. Louis

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье мы представляем протокол внутрижизненной визуализации трансплантированного левого легкого мыши с помощью двухфотонной микроскопии. Это представляет собой ценный инструмент для изучения клеточной динамики и взаимодействий в режиме реального времени после трансплантации легких мышей.

Аннотация

Осложнения после трансплантации легких в значительной степени связаны с реакцией иммунной системы хозяина на трансплантат. Такие иммунные реакции регулируются перекрестными помехами между донорскими и реципиентными клетками. Лучшее понимание этих процессов зависит от использования доклинических моделей на животных и помогает возможность изучать транспортировку иммунных клеток внутри трансплантата в режиме реального времени. Прижизненная двухфотонная микроскопия может быть использована для получения изображений тканей и органов на глубине до нескольких сотен микрон с минимальными фотоповреждениями, что дает большое преимущество перед однофотонной конфокальной микроскопией. Селективное использование трансгенных мышей с экспрессией промотор-специфичных флуоресцентных белков и/или адоптивный перенос флуоресцентных клеток, меченных красителем, во время прижизненной двухфотонной микроскопии позволяет динамически изучать одиночные клетки в их физиологической среде. Наша группа разработала метод стабилизации легких мышей, который позволил нам визуализировать клеточную динамику в наивных легких и ортотопически трансплантированных легочных трансплантатах. Этот метод позволяет детально оценить поведение клеток в сосудистой сети и в интерстиции, а также изучить взаимодействия между различными клеточными популяциями. Эта процедура может быть легко изучена и адаптирована для изучения иммунных механизмов, регулирующих воспалительные и толерогенные реакции после трансплантации легких. Она также может быть расширена до изучения других патогенных легочных заболеваний.

Введение

Трансплантация легких является последним вариантом для многих пациентов, страдающих терминальной стадией легочной болезни; Тем не менее, долгосрочная выживаемость после трансплантации легких является низкой по сравнению с другими трансплантациями солидных органов. Выживаемость в 5 лет составляет всего ~60%-70%1, по сравнению с 80%-90% в сердцах2 и 85%-90% в почках3. Многие осложнения после трансплантации легких, такие как первичная дисфункция трансплантата, антитело-опосредованное отторжение и хроническая дисфункция аллотрансплантата легкого, обусловлены иммунным ответом хозяина на аллотрансплантат. Например, наша группа показала, что нейтрофилы быстро рекрутируются в легочный аллотрансплантат после ишемии-реперфузионного повреждения, вызванного трансплантацией, и образуют динамические кластеры, окружающие моноциты крови4. Перекрестная связь между донорскими и реципиентными клетками ответственна за вредные аллоиммунные реакции 5,6,7, и возможность изучения этих динамических клеточных взаимодействий на живой животной модели бесценна.

Двухфотонная микроскопия позволяет получить прижизненную визуализацию с высоким разрешением на глубинах до нескольких сотен микрон с минимальным фотообесцвечиванием тканей 8,9. Он используется в различных тканях и анатомических участках, включая неокортекс10,11, кожу12,13 и почки14,15. В последнее время он был адаптирован к нестатическим органам, таким как легкие и сердце 4,16,17. В этом протоколе мы описываем технику визуализации стабилизированных, вентилируемых и перфузированных легочных трансплантатов после трансплантации левого легкого мышиной ортотопии. Ключевым преимуществом модели трансплантации является возможность генетически манипулировать донором и реципиентом по отдельности. Отдельные клеточные популяции могут быть визуализированы с помощью трансгенных линий мышей с экспрессией флуоресцентных белков, адоптивным переносом флуоресцентно меченных клеток5 или внутривенным введением флуоресцентно меченных антител для связывания клеточно-специфических маркеров 4,16,17,18.

Для того чтобы стабилизировать легкое во время визуализации, этот протокол включает в себя приклеивание легкого к покровному стеклу, в то время как другие группы описали стабилизацию всасывания с помощью изготовленного на заказ обратимого вакуумного устройства19. Наш протокол имеет ряд преимуществ, в том числе большую площадь визуализации и относительную простоту настройки с использованием общедоступных материалов в лаборатории микроскопии (включая покровное стекло и клей). Поскольку этот метод склеивания ограничивает легкое на верхней поверхности, ожидается, что он уменьшит вентиляционное движение и позволит проводить более глубокую визуализацию. Этот прижизненный метод визуализации позволяет подробно наблюдать за поведением и взаимодействием иммунных клеток в режиме реального времени, что способствует изучению иммунных механизмов, регулирующих воспалительные и толерогенные реакции после трансплантации легких.

Протокол

Все процедуры обращения с животными проводились в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения и использования лабораторных животных и одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию в Медицинской школе Вашингтонского университета.

1. Анестезия и интубация

ПРИМЕЧАНИЕ: Ортотопическая трансплантация левого легкого у мышей выполняется, как описано ранее20,21. Легкие от мышей с массой 20-25 г C57BL/6 (B6) трансплантируются реципиентам B6 соответствующего пола и возраста. В6. Мыши-репортеры LysM-GFP используются в качестве реципиентов для отдельных экспериментов по визуализации инфильтрации нейтрофилов в легочные трансплантаты. Мыши-реципиенты могут быть визуализированы сразу после трансплантации легких.

  1. Повторное обезболивание мышей с помощью внутрибрюшинного введения кетамина (80−100 мг/кг) и ксилазина (8−10 мг/кг). Вводите бупренорфин с пролонгированным высвобождением (0,5-1,0 мг/кг) подкожно для дополнительного контроля боли. Подтвердите достаточную глубину анестезии щипцом для лапы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если время между трансплантацией легких и плановой прижизненной визуализацией составляет менее двух часов, можно повторно дозировать анестетик с 50% от начальной дозы кетамина.
  2. Удалите волосы со всей левой части груди с помощью электрической машинки для стрижки и протрите грудь, чтобы удалить лишние подстриженные волоски.
  3. Нанесите немедикаментозную офтальмологическую мазь на глаза мыши, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
  4. Повторно интубируйте мышь оротрахеально с помощью ангиокатетера 20 G, как описано ранее21.
  5. Проветривание комнатным воздухом со скоростью 120 вдохов/мин и дыхательным объемом 0,5 куб. см.
  6. Подавайте 1% изофторана эндотрахеально в течение всей процедуры.
  7. Для визуализации кровеносных сосудов во время визуализации введите 20 мкл нецелевых квантовых точек (q-точек) с длиной волны 655 нм в 50 мкл фосфатно-солевого буфера внутривенно не менее чем за 5 минут до визуализации.

2. Хирургическая подготовка левого легкого к визуализации

  1. Поместите мышь в положение правого бокового пролежня (см. рисунок 1A).
  2. Продезинфицируйте кожу груди смесью 0,75% йода и 70% этанола, три раза.
  3. Повторно откройте левую торакотомию (после трансплантации легкого мыши) через третье межреберье (см. рисунок 1A).
  4. Удалите часть кожи и мягких тканей над левым местом торакотомии размером 1,5 см х 1,5 см (см. рисунок 1В).
  5. Перед резекцией ребер сначала зажмите ребра на ~10 с, чтобы тромбировать любой микроциркуляторный русло и достичь гемостаза (см. Рисунок 1C, D).
  6. Резецируйте части3-5-го ребер, чтобы создать окно визуализации, достаточно большое для выхода легкого (~0,8 см краниокаудально и ~1,0 см в переднезаднем направлении, рис. 1D, E).
  7. Остановите любое дополнительное кровотечение из краев ребер с помощью электрокаутеризации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно добиться гемостаза в разрезанном крае ребер, чтобы избежать чрезмерной кровопотери в период визуализации.
  8. Подложите небольшую шишку (марлю размером 4 см х 4 см, сложенную в продольном направлении в 3 раза) под правую грудную клетку (см. рисунок 1Е).
  9. С помощью ватных палочек приподнимите легочный трансплантат из грудной клетки и поместите нижнюю часть легкого на полоску марли, пропитанной солевым раствором, размером 1 см x 3 см (см. рисунок 1F).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта полоска марли, пропитанной солевым раствором, предотвращает скольжение легкого, поддерживает влажную среду для легких, защищает легкое от острых краев резецированных ребер и отделяет легкое от сердечной деятельности. После того, как камеру круговой визуализации наложат на легкое (рис. 1G, H, описанные в разделе 3), потери тепла и жидкости из открытой грудной полости должны быть минимальными в течение периода визуализации.

3. Подготовка камеры визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: Камера визуализации изготавливается по индивидуальному заказу (см. Рисунок 2A). Эта камера визуализации состоит из опорной пластины и верхней пластины, между которыми размещается мышь и фиксируется на месте подпружиненными болтами с обеих сторон (рис. 2B). Верхняя пластина содержит круглый вырез диаметром ~2 см. В это отверстие на передней стороне верхней пластины помещено черное уплотнительное кольцо соответствующего размера, которое защищает линзу объектива (рис. 2C). Защитное стекло размером 24 мм x 50 мм приклеивается к задней части верхней пластины с помощью высоковакуумной смазки, которая создает водонепроницаемое уплотнение. Это покровное стекло будет служить окном для визуализации, прилипая к легкому внизу и удерживая среду визуализации (т.е. воду) над ней. Следите за тем, чтобы вакуумная смазка не попадала внутрь круглого окна изображения. Покровное стекло будет заменяться для каждого нового эксперимента с визуализацией. Опорная плита нагревается до 35-37 °C с помощью термопарного датчика температуры (рис. 2A).

  1. Поместите интубированную мышь на опорную пластину камеры визуализации открытой левой грудной клеткой вверх (см. рис. 1G, H). Закрепите мышь шелковой лентой на морде, передних лапах и хвосте (см. рисунок 1H и рисунок 2A).
  2. Нанесите клей на нижнюю сторону покровного стекла, прикрепленного к верхней пластине (серый круг на рисунке 2C, низ), оставив в центре круг без клея размером 0,8-1,0 см.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует компромисс между размером бесклеевого круга и количеством артефакта движения; Таким образом, рекомендуется, чтобы круг не превышал 1,0 см в диаметре.
  3. Опустите верхнюю пластину до тех пор, пока покровное стекло не соприкоснется с легким, при этом клей коснется поверхности легкого (см. Рисунок 1G).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Левое легкое будет приклеено к покровному стеклу с чистым, не содержащим клея кругом посередине, который является областью, которая будет изображена.
  4. Приложите покровное стекло к легкому и надуйте легкое на 1-2 с, чтобы участок клея прилип к окружающим тканям. Выполните надувание легких, окклюзируя трубку оттока от эндотрахеальной трубки мыши к аппарату искусственной вентиляции легких.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не надувайте легкое дольше 1-2 секунд, так как это может вызвать чрезмерную баротравму.
  5. Слегка отступите от верхней пластины, чтобы уменьшить давление на легочную ткань. Следите за тем, чтобы область легкого в пределах окна визуализации не перемещалась при вентиляции.
  6. Закрепите оба конца верхней пластины, закрепив гайку с накатанной головкой на каждом болте (см. рис. 2B).

4. Двухфотонная визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Для прижизненной микроскопии следует использовать вертикальный микроскоп с неподвижным истоликом и объективом для погружения в воду с 20-кратной или 25-кратной >1,0-кратной числовой апертурой (NA). Ниже приведена конфигурация, использованная в этом исследовании для B6 - B6. Трансплантат левого легкого LysM-GFP с мечением кровеносных сосудов q-точкой 655 нм. При применении этого протокола настройка микроскопа, лазеров и дихроичных фильтров может быть адаптирована в зависимости от потребностей конкретного эксперимента и используемых флуоресцентных репортеров.

  1. Поместите всю камеру визуализации вместе с интубированной мышью-реципиентом (левое легкое B6, пересаженное в B6. LysM-GFP с q-точками с длиной волны 655 нм) на предметный столик микроскопа (см. рис. 2A).
  2. Используйте дихроичные фильтры с длинами волн 480 нм, 560 нм и 635 нм, которые будут соответствующим образом отделять сигналы от репортера GFP, q-точек и сигнала генерации второй гармоники (ГВГ) (445 нм), генерируемого коллагеном. Эти фильтры могут быть адаптированы в зависимости от конкретного эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал ГСП, генерируемый коллагеном, разграничивает темные кратерообразные структуры, которые представляют собой альвеолярные воздушные пространства (см. белые стрелки на рисунке 3).
  3. Установите титан-сапфировый фемтосекундный импульсный лазер на 890 нм (в ближнем инфракрасном диапазоне) для возбуждения. Используйте минимально возможную мощность лазера для достижения достаточного сигнала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки лазера должны быть отрегулированы в соответствии с конкретным экспериментом, чтобы максимизировать разделение сигнала.
  4. Нанесите ~1 мл воды, чтобы полностью покрыть защитное стекло на верхней пластине, которое будет удерживаться на месте с помощью уплотнительного кольца и вакуумного уплотнения защитного стекла на верхней пластине (см. Рисунок 1G и Рисунок 2C).
  5. Используйте 20-кратный объектив для погружения в воду >1.0 NA на микроскопе. Убедитесь, что объектив адаптирован в соответствии с конкретным экспериментом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Больший NA позволяет собирать больше света, повышать контрастность и детализировать изображения. Цели погружения в воду предпочтительны, так как вода или буфер более совместимы с биологическими тканями.
  6. Опустите объектив микроскопа в воду и сфокусируйтесь на поверхности легкого.
  7. Активируйте нагреватель опорной плиты и поддерживайте температуру на уровне 35-37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть опасения по поводу неспособности поддерживать температуру тканей или адекватной перфузии легкого, можно подключить два дополнительных резистера для нагрева верхней пластины в дополнение к опорной пластине (см. дополнительный рисунок 1).
  8. Приобретайте стеки изображений с помощью программного обеспечения для сбора изображений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что во время съемки в комнате полностью темно, что может включать в себя использование плотных штор/жалюзи и стратегическое покрытие всех источников света.

5. Получение видео

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие параметры могут быть адаптированы в зависимости от конкретного эксперимента. Шаги 5.1-5.3 описывают конкретные параметры, используемые для B6 - B6. Трансплантация левого легкого мышам Lysm-GFP, которую можно использовать в качестве справочного руководства.

  1. С помощью двунаправленного сканера со скоростью передачи видео установите размеры сканирования x-y на 512 x 512 пикселей.
  2. С помощью шагового блока xyz можно получить покадровую запись 21-шагового z-стека с 10-кадровым усреднением на шаг. Для получения каждого стека требуется около 20 секунд, что включает в себя время, необходимое для усреднения кадров, шагового двигателя для перемещения и проверки его положения, а также задержку в 100 мс.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Двунаправленный сканер на микроскопе, использованном в этом исследовании, работает со скоростью видео 30 кадров в секунду. Это может отличаться в зависимости от конкретной конфигурации микроскопа.
  3. Получите 80 последовательных z-стеков для получения покадровой визуализации миграции лейкоцитов в тканевой паренхиме. Это занимает около ~27 минут при 20 с/стек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер стека, усреднение кадров, мощность лазера и общая продолжительность покадровой записи должны быть сведены к минимуму, чтобы предотвратить чрезмерное воздействие лазера на ткани. Если используемые флуоресцентные репортеры яркие (т.е. GFP) и мощность лазера низкая, то повторение 21-ступенчатого z-стека со средним значением 10 кадров, 512 x 512 пикселей, с интервалом 20 секунд в течение ~27 мин, хорошо переносится мышью. Если требуется более длительная визуализация, время сбора данных на стек должно быть увеличено, чтобы общая лазерная экспозиция оставалась неизменной (т.е. 1 мин на стек в течение ~1,5 ч). Эти настройки необходимо будет оптимизировать в зависимости от используемых флуоресцентных репортеров.
  4. Усыпьте мышь в конце получения изображения. Для усыпления мышь обезболивают кетамином (80−100 мг/кг) и ксилазином (8−10 мг/кг) с последующим вывихом шейки матки. Обычные препараты для визуализации легко сохраняют жизнеспособность мыши в течение 2 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы продлить этот период, может потребоваться дополнительный прием жидкости, анестезия изофлураном и внимание к регулированию температуры.
  5. Полный рендеринг видео с помощью Imaris. Также можно использовать другое программное обеспечение для обработки изображений (например, ImageJ).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения могут быть обработаны после получения изображения с использованием повышения контрастности, сглаживания и арифметики каналов для устранения перекрестных помех каналов.

Результаты

После 1 ч хранения холодом при температуре 4 °C мы ортотопически пересадили левое легкое от мыши B6 в B6. LysM-GFP мышь4, а затем была проведена прижизненная двухфотонная визуализация, как описано выше. Мы проводили визуализацию в два временных момента после трансплантации - через 2 ч (рис. 3А) и через 24 ч (рис. 3Б). Кровеносные сосуды помечаются красным цветом с помощью точек добротности, вводимых непосредственно перед визуализацией. Кроме того, мы можем визуализировать моноциты, которые заняли q-точки в 24 часа4 минуты. Нейтрофилы, полученные от реципиентов с зеленой меткой, можно увидеть инфильтрирующими легочный трансплантат на соответствующем видео через 24 ч после трансплантации (Дополнительное видео 1). Альвеолы можно визуализировать в виде темных кратеров из-за ГВГ коллагена (белые стрелки на рисунке 3). Мы наблюдаем, что через 24 ч после трансплантации в легких больше нейтрофилов по сравнению с 2 ч после трансплантации (рис. 3).

figure-results-1
Рисунок 1: Подготовка мыши к двухфотонной визуализации. (A) Кожа вновь открылась над левой торакотомией. (Б) Кожа и мягкие ткани иссекаются над левой грудью. (К,Г) Ребра зажимаются на 10 с перед разделением. (E) Левые 3-5-е ребра резецированы, чтобы создать окно размером ~0,8 см краниокаудально x 1,0 см в переднезаднем направлении. (F) Левое легкое приподнято из левой грудной клетки и помещено на полоску марли. (G) Камера визуализации с окном для визуализации находится над левым легким. (Н) Камера визуализации помещается на предметный столик микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Установка камеры визуализации. (A) Камера визуализации установлена на предметном столике микроскопа. (B) Увеличенный вид подпружиненного болтового механизма для крепления верхней пластины над левым легким. (C) Передняя и задняя часть верхней пластины с нанесенным уплотнительным кольцом и покровным стеклом. Белыми линиями обозначена область, на которую наносится вакуумная смазка для приклеивания защитного стекла к верхней пластине. Серый круг представляет собой кольцо клея для нанесения на покровное стекло. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Двухфотонная прижизненная визуализация трансплантата левого легкого мыши из B6 в B6. Мышь LysM-GFP с хранением в холодно-ишемическом состоянии в течение 1 часа. Визуализация проводится через (А) через 2 ч и (В) через 24 ч после трансплантации. Красным цветом обозначены точки q. Зеленым цветом обозначены нейтрофилы из B6. Получатель LysM-GFP. Синий цвет представляет ГВГ из богатых коллагеном альвеол. Белыми стрелками обозначены альвеолярные воздушные пространства. Масштабная линейка представляет собой 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Верхняя пластина с двумя прикрепленными резисторами для обеспечения дополнительного нагрева. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео 1: Двухфотонная покадровая съемка пересаженного левого легкого мыши из B6 в B6. Мышь LysM-GFP с 1 ч холодового ишемического хранения, выполненная через 24 ч после трансплантации. Красным цветом обозначены точки q. Зеленым цветом обозначены нейтрофилы реципиента LysM-GFP. Синий цвет представляет собой второе гармоническое поколение богатых коллагеном альвеол. Масштабная линейка представляет собой 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Двухфотонное возбуждение было впервые описано в ее докторской диссертации Марией Гёпперт-Майер в 1931 году, которая позже получила Нобелевскую премию по физике за описание структуры ядерной оболочки22,23. Традиционная флуоресцентная микроскопия основана на однофотонном возбуждении, при этом длины волн возбуждения короче и имеют более высокую энергию, чем длина волны излучения. В отличие от однофотонной микроскопии, двухфотонная микроскопия предполагает одновременное возбуждение двумя фотонами, каждый из которых имеет большую длину волны, чем длина волны излучаемого флуоресцентного сигнала 24,25,26. Поскольку для возбуждения одной фокальной точки в ткани два отдельных фотона должны быть совместно локализованы, двухфотонное возбуждение происходит пространственно до небольшого объема образца, что позволяет осуществлять оптический срез 24,25,26 и имеет меньшее фотообесцвечивание выше и ниже плоскости, содержащей фокальную точку27. Вероятность одновременного возбуждения двумя фотонами очень мала, поэтому для достижения интенсивности возбуждения, необходимой для сигнала флуоресцентного излучения 25,26,27, необходим фемтосекундный импульсный лазер. Возбуждение лазера находится в ближнем инфракрасном диапазоне (700-1100 нм), преимуществом которого является меньшее рассеяние, что позволяет свету глубже проникать в ткани28. Глубина визуализации зависит от скорости колебаний и мощности лазера24. В пределах легкого глубина визуализации ~500-600 мкм может быть достигнута17. Таким образом, сочетание глубины визуализации и низкого уровня фотообесцвечивания делает двухфотонную микроскопию очень подходящей для прижизненной визуализации органов.

Двухфотонная микроскопия использовалась в различных тканях и анатомических участках, таких как кожа12,13, лимфатические узлы29, венозный эндотелий30, кора головного мозга10,11, почки14,15 и печень31,32. Например, в дерме мышей прижизненная двухфотонная визуализация была использована для описания роения нейтрофилов после стерильной физической травмы. На модели венозного тромбоза моноциты крови и нейтрофилы были визуализированы, ползущими по эндотелию нижней полой вены30. Человеческая микроглия была успешно визуализирована in vivo после ксенотрансплантации в органоидную модель человеческого мозга33. Благодаря постоянному прогрессу в области двухфотонной микроскопии прижизненная визуализация возможна на больших глубинах и даже в нестатических органах. Например, глубины до 1000 мкм были визуализированы в неокортексе у мышей с использованием регенеративного усилителя34 Ti:Al2O3.

Одной из проблем прижизненной визуализации в органах грудной клетки является стабилизация изображения. Из-за движения бьющегося сердца и дыхания легких артефакты движения могут значительно снизить качество изображения. Было разработано несколько методов стабилизации для визуализации сердца и легких, включая склеивание органа 4,7, аспирацию-стабилизацию 19,35,36,37 и коррекцию движениясзади 38. Наша техника визуализации легких основана на приклеивании поверхности легкого к стабилизированному покровному стеклу. Мы поддерживаем перфузию, вентиляцию легких и нормотермию, что имитирует условия, обнаруженные in vivo. По сравнению с методом аспирации-стабилизации, описанным Looney et al.19, этот протокол имеет ряд преимуществ. Во-первых, мы не требуем создания специализированного аспиратора. Вместо этого наша камера визуализации и верхняя пластина могут быть изготовлены из материалов, легко доступных в лаборатории микроскопии. Кроме того, по сравнению с аспирационным устройством (которое имеет внутренний диаметр 4 мм), техника склеивания, используемая в этом исследовании, позволяет получить большую площадь поверхности визуализации (до 10 мм). При кольцевом склеивании область легкого в пределах круга клея адекватно ограничена, а вентиляционное движение сведено к минимуму. По сравнению с методом отсасывания, подход с использованием защитного стекла предотвращает выпуклую деформацию поверхности легких, которая может повлиять на субплевральный капиллярный кровоток. К недостаткам нашей системы можно отнести невозможность снять покровное стекло без повреждения плевропаренхиматозного соединения. Таким образом, невозможно получить изображение легкого во второй раз с помощью используемого здесь метода клея, в то время как метод отсасывания позволяет проводить серийную визуализацию. Кроме того, использование торакотомии требует потери нормального отрицательного внутригрудного давления, что в сочетании с вентиляцией с положительным давлением не является физиологическим. Дополнительные ограничения, ограничения двухфотонной визуализации обсуждаются ниже.

Пока грудная клетка открыта во время прижизненной визуализации, крайне важно поддерживать ее как можно ближе к физиологической среде. Опорная пластина, на которой лежит мышь, поддерживается при температуре 35-37 °C. При нагревании только опорной пластины мы обнаружили, что температура ядра мыши (измеренная с помощью ректального зонда) хорошо регулируется в течение нескольких часов. По нашему опыту, подвижность и поведение клеток заметно изменяются только тогда, когда температура опускается ниже 32 °C, что маловероятно при такой конфигурации. Если возникают трудности в поддержании нормотермии тканей или перфузии легких во время первоначальной настройки этой камеры визуализации, можно прикрепить два дополнительных резистера для нагрева верхней пластины в дополнение к опорной пластине (дополнительный рисунок 1). После того, как камера визуализации оптимизирована, нет необходимости регулярно контролировать внутреннюю температуру мыши во время каждого эксперимента по визуализации. Кроме того, мы обнаружили, что комбинация пропитанной солевым раствором марли, помещенной на открытую грудную полость, и окклюзионного кольца клея вокруг области легкого, подлежащей визуализации, эффективна для минимизации потерь жидкости во время визуализации.

Важным техническим фактором является достижение хорошего гемостаза во время резекции ребер при создании окна торакальной визуализации. Части левых ребер с3-го по5-е резецируются, и продолжающееся кровоизлияние из этих разрезанных ребер поставит под угрозу выживание мыши во время визуализации. Чтобы бороться с этим, мы рекомендуем сначала зажимать ребра проксимально к месту, где они должны быть резецированы, на 10 с для тромбоза микроциркуляторного русла (см. Рисунок 1C, D). Затем, после резекции ребер, срезанные края ребер следует обильно коагулять с помощью электрокаутеризации. Наконец, очень важно поместить левое легкое поверх полоски марли, пропитанной физиологическим раствором (см. Рисунок 1F) во время визуализации, чтобы предотвратить прокол легкого острыми краями ребер. Благодаря такому сочетанию технических соображений мы можем снимать четкие видео перемещения иммунных клеток в паренхиме легких с минимальным артефактом движения в течение нескольких часов без повреждения легких или потери нормальных паттернов перфузии.

Двухфотонная микроскопия использовалась в легких для изучения моделей инфекционных заболеваний и стерильного воспаления. Одна группа использовала двухфотонную визуализацию для изучения подвижности В-клеток резидентной памяти и миграции после повторных вызовов легких мышей вирусом гриппа39. Кроме того, двухфотонная микроскопия использовалась при трансплантации кожи, почек и островков поджелудочной железы 40,41,42,43. С помощью модели трансплантации донор и реципиент могут быть генетически изменены для изучения соответствующих клеточных популяций. Насколько нам известно, наша группа была первой, кто выполнил прижизненную двухфотонную визуализацию при трансплантации легких у мышей4. Мы наблюдали быстрый набор и кластеризацию нейтрофилов после трансплантационно-опосредованного ишемии-реперфузионного повреждения, которое уменьшалось при фармакологическом истощении моноцитов крови4. В последующих работах мы показали, что моноциты селезенки-реципиента способствуют экстравазации нейтрофилов за счет продукции IL-1B44. Прижизненная визуализация в этих исследованиях позволила нам выявить восходящие регуляторы экстравазации нейтрофилов в качестве возможных терапевтических мишеней для снижения посттрансплантационной воспалительной реакции45. Кроме того, мы также выполнили прижизненную визуализацию в бьющемся сердце мышей после гетеротопической трансплантации16. Мы визуализировали рекрутирование нейтрофилов в миокард и обнаружили, что гибель ферроптозных клеток сердечного трансплантата инициирует воспаление после трансплантации сердца46. Мы применили аналогичную технику стабилизации к трансплантированным дугам аорты для визуализации моноцитарного транспорта в атеросклеротические бляшки47. Эти исследования продемонстрировали осуществимость и полезность прижизненной визуализации нестатических трансплантированных органов грудной клетки.

Наконец, стоит обсудить методы визуализации различных типов клеток и паренхимы легких. Для мечения клеток используются два основных метода - 1) трансгенные линии мышей с мутациями флуоресцентных белков и 2) меченые флуоресцентными антителами к окрашиванию клеток. Обычно используемые трансгенные линии мышей для идентификации иммунных клеток с помощью двухфотонной микроскопии включают LysM-GFP для нейтрофилов48, CX3Cr1-GFP для различных интерстициальных популяций макрофагов49,50, CCR2-GFP для классических моноцитов51, CD19-tdTomato для В-клеток52 и Foxp3-GFP для регуляторных Т-клеток5. Примечательно, что одного CX3Cr1 недостаточно для однозначной идентификации клеток, но этому может способствовать морфология и расположение клеток, согласующиеся с интерстициальными макрофагами. Альвеолярные макрофаги могут быть визуализированы без мечения благодаря их автофлуоресценции53,54, отличительной морфологии и поведению (т.е. отсутствию подвижности при временном разрешении покадровых записей). По сравнению с эозинофилами, которые также являются автофлуоресцентными, альвеолярные макрофаги крупнее и значительно ярче с возбуждением 890 нм54. В альтернативном варианте, альвеолярные макрофаги также могут быть помечены на основе их фагоцитарной функции путем внутрилегочного введения агрегатов красителей54.

Визуализация иммунных клеток у реципиентов трансплантата также может быть достигнута путем внутрисосудистого адоптивного переноса флуоресцентно меченых клеток или путем инъекции флуоресцентно меченных антител против клеточно-специфических поверхностных маркеров18,55. Еще одним неотъемлемым преимуществом двухфотонной микроскопии является ГВГ через определенные двулучепреломляющие структуры в ткани, такие как коллаген56. Это явление особенно полезно для визуализации легких из-за высокого содержания коллагена в альвеолярных мешочках, который действует как внутренний индикатор альвеолярной структуры без дополнительных флуоресцентных красителей. Кроме того, альвеолы также ограничены альвеолярными капиллярами, помеченными q-точками с длиной волны 655 нм. Наконец, кровеносные сосуды могут быть помечены с помощью внутривенной инъекции q-dots (как описано в этом протоколе) или родамина B-декстрана. При планировании эксперимента с прижизненной двухфотонной микроскопией мы рекомендуем использовать не более четырех различных каналов излучения, чтобы свести к минимуму риск просачивания и плохой дифференциации между каналами.

Одним из основных ограничений описанной нами методики стабилизации клея является невозможность удаления покровного стекла из легкого без потенциального повреждения тканей и остатков клея на поверхности легких. Таким образом, легкое может быть визуализировано только один раз, а не в несколько временных точек в течение нескольких дней. Чтобы устранить это ограничение, одна группа ученых описала полупостоянное окно торакальной визуализации, которое позволяет проводить серийную визуализацию легкого57. Однако, по нашему опыту, такой подход не позволяет обеспечить адекватную стабилизацию легких в течение длительных периодов визуализации. Этот метод дает возможность визуализировать легкое в течение нескольких часов, что дает ключевую информацию о врожденных и адаптивных иммунных реакциях после трансплантации.

К другим ограничениям двухфотонной визуализации относятся высокие первоначальные затраты на настройку и опыт, необходимые для обслуживания системы. Поля сканирования относительно невелики по сравнению с иммунофлуоресцентной визуализацией. Термические и фотоповреждения могут быть значительными без тщательной оптимизации параметров сбора. Функция двухфотонного разброса точки возбуждения широкая, что несколько ограничивает разрешение, особенно в z-измерении. Кроме того, двухфотонная визуализация требует, чтобы интересующие клетки были флуоресцентно помечены, а некоторые клетки не могут быть однозначно помечены одним клеточным маркером. Количество сигналов, которые могут быть отображены одновременно, часто ограничено четырьмя или меньше. Наконец, анестезия, хирургическое вмешательство и визуализация могут вызвать дополнительное воспаление и физиологические изменения в дополнение к трансплантату легких, которые могут исказить экспериментальные результаты и интерпретации, несмотря на все усилия по поддержанию физиологической среды. Будущие направления включают разработку минимально инвазивных методов прижизненной визуализации (например, с помощью меньшей торакотомии или бронхоскопического доступа).

В заключение следует отметить, что прижизненная двухфотонная микроскопия является бесценным инструментом в изучении множественных патологических процессов. В данной статье мы описываем надежную методику иммобилизации легких и двухфотонной визуализации, которая позволяет проводить прижизненное наблюдение за переносом клеток и динамическими взаимодействиями между различными клеточными популяциями после трансплантации легких мышей. Этот метод расширил наше понимание иммунного ландшафта после трансплантации и будет оставаться незаменимым инструментом в изучении трансплантации легких и других процессов легочных заболеваний.

Раскрытие информации

Авторы не сообщают о каких-либо соответствующих разоблачениях.

Благодарности

Эта работа поддержана грантами NIH 1P01AI11650 и Фонда Барнс-Еврейской больницы. Мы благодарим Центр визуализации In Vivo в Медицинской школе Вашингтонского университета.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,75% повидон-йодAplicareNDC 52380-0126-2Для дезинфицирующего средства
1-дюймовый катетер 20G для внутривенного введения TerumoSROX2025CAДля эндотрахеальной трубки (ETT)
1-дюймовая шелковая лентаDurapore3M ID 7100057168Для фиксации мыши в положении
20-кратного погружения в воду длиннофокусная линзаOlympusN20X-PFH
3M клейVetbondMedi-Vet.com10872Для приклеивания покровного стекла к легкому
655 нм нецелевые квантовые точкиThermoFisherQ21021MPДля маркировки кровеносных сосудов
70% этанолSigma AldrichEX0281Для дезинфицирующего средства
Argent High Temp Fine Tip Cautery PenMcKesson231
Черное уплотнительное кольцо (2 см)Хозяйственный магазинН/ДДля визуализации на заказ
камера Болт (2)Хозяйственный магазинН/ДДля изготовленной на заказ камеры визуализации
Латунная гайка с накатанной головкой (2)Магазин скобяных изделийН/ДДля изготовленной на заказ камеры
визуализации Бупренорфин 1,3 мг/млFidelis Animal HealthNDC 86084-100-30Для обезболивания
Хамелеон титан-сапфировый фемтосекундный импульсный лазерКогерентныйН/Д
Защитное стекло (24 мм x 50 мм)Thomas Scientific1202F63Для камеры визуализации на заказ
Изогнутый зажим для комаров (1)Fine Science Tools13009-12
Двухканальный контроллер нагревателяWarner InstrumentsTC-344B
Тонкие ножницы (1)Fine Science Tools15040-11
Вертикальный микроскоп с неподвижным столикомOlympusBX51WI
Марля (обрезанная до 1 см х 3 см)McKesson476709Поместить под левое легкое
Высоковакуумная смазкаDow CorningN/AНаклеить защитное стекло на верхнюю пластину
Изофлуран 1%Sigma Aldrich26675-46-7Для анестезии
Кетамина гидрохлорид 100 мг/мл VedcoNDC 50989-996-06Для анестезии
Металлический лист (3 см x 7 см)Хозяйственный магазинН/ДДля изготовленной на заказ камеры для визуализации
Аппликаторы с заостренным ватным наконечникомSolon56225Для манипуляций с легкими и для тупого рассечения
Power Pro Ultra машинка для стрижкиOster078400-020-001
Puralube Vet глазная мазьMedi-Vet.com11897Для предотвращения высыхания глаз
Аппарат искусственной вентиляции легких для мелких животныхHarvard Аппарат55-0000
Прямые щипцы (1)Fine Science Tools91113-10
Трехканальный драйвер затвораUniblitzVMM-D3Резонансный сканер
x.y.z оптический шаговый моторPrior ScientificOptiScan II
Xylazine 20 мг/млAkornNDC 59399-110-20Для обезболивания

Ссылки

  1. Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-eighth adult lung transplantation report - 2021; Focus on recipient characteristics. J Heart Lung Transplant. 40 (10), 1060-1072 (2021).
  2. Khush, K. K., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: 37th adult heart transplantation report-2020; focus on deceased donor characteristics. J Heart Lung Transplant. 39 (10), 1003-1015 (2020).
  3. Wang, J. H., Skeans, M. A., Israni, A. K. Current status of kidney transplant outcomes: Dying to survive. Adv Chronic Kidney Dis. 23 (5), 281-286 (2016).
  4. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  5. Li, W., et al. Bronchus-associated lymphoid tissue-resident Foxp3+ T lymphocytes prevent antibody-mediated lung rejection. J Clin Invest. 129 (2), 556-568 (2019).
  6. Kurihara, C., et al. Crosstalk between nonclassical monocytes and alveolar macrophages mediates transplant ischemia-reperfusion injury through classical monocyte recruitment. JCI Insight. 6 (6), e147282(2021).
  7. Spahn, J. H., et al. DAP12 expression in lung macrophages mediates ischemia/reperfusion injury by promoting neutrophil extravasation. J Immunol. 194 (8), 4039-4048 (2015).
  8. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (5574), 1869-1873 (2002).
  9. Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light. Nat Rev Immunol. 2 (11), 872-880 (2002).
  10. Svoboda, K., Helmchen, F., Denk, W., Tank, D. W. Spread of dendritic excitation in layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex in vivo. Nat Neurosci. 2 (1), 65-73 (1999).
  11. Helmchen, F., Svoboda, K., Denk, W., Tank, D. W. In vivo dendritic calcium dynamics in deep-layer cortical pyramidal neurons. Nat Neurosci. 2 (11), 989-996 (1999).
  12. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J Invest Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  13. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
  14. Ashworth, S. L., Sandoval, R. M., Tanner, G. A., Molitoris, B. A. Two-photon microscopy: visualization of kidney dynamics. Kidney Int. 72 (4), 416-421 (2007).
  15. Zhang, K., et al. In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9(+) cell to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment. J Biol Chem. 295 (34), 12203-12213 (2020).
  16. Li, W., et al. Intravital 2-photon imaging of leukocyte trafficking in beating heart. J Clin Invest. 122 (7), 2499-2508 (2012).
  17. Nava, R. G., et al. Two-photon microscopy in pulmonary research. Semin Immunopathol. 32 (3), 297-304 (2010).
  18. Li, W., et al. Necroptosis triggers spatially restricted neutrophil-mediated vascular damage during lung ischemia reperfusion injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (10), e2111537119(2022).
  19. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  20. Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nat Protoc. 4 (1), 86-93 (2009).
  21. Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7 (6), 1672-1679 (2007).
  22. Grzybowski, A., Pietrzak, K. Maria Goeppert-Mayer (1906-1972): two-photon effect on dermatology. Clin Dermatol. 31 (2), 221-225 (2013).
  23. Göppert-Mayer, M. Uber Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Ann Phys. 401 (3), 273-294 (1931).
  24. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  25. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  26. Diaspro, A., et al. Multi-photon excitation microscopy. Biomed Eng Online. 5, 36(2006).
  27. Williams, R. M., Piston, D. W., Webb, W. W. Two-photon molecular excitation provides intrinsic 3-dimensional resolution for laser-based microscopy and microphotochemistry. FASEB J. 8 (11), 804-813 (1994).
  28. Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  29. Chtanova, T., et al. Dynamics of neutrophil migration in lymph nodes during infection. Immunity. 29 (3), 487-496 (2008).
  30. von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
  31. Stanciu, S. G., et al. Experimenting liver fibrosis diagnostic by two photon excitation microscopy and Bag-of-Features image classification. Sci Rep. 4, 4636(2014).
  32. Hsiao, C. Y., et al. Improved second harmonic generation and two-photon excitation fluorescence microscopy-based quantitative assessments of liver fibrosis through auto-correction and optimal sampling. Quant Imaging Med Surg. 11 (1), 351-361 (2021).
  33. Schafer, S. T., et al. An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes. Cell. 186 (10), 2111-2126 (2023).
  34. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 microm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  35. Headley, M. B., et al. Visualization of immediate immune responses to pioneer metastatic cells in the lung. Nature. 531 (7595), 513-517 (2016).
  36. Presson, R. G., et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  37. Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nat Protoc. 15 (3), 1041-1065 (2020).
  38. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infect Immun. 82 (2), 864-872 (2014).
  39. MacLean, A. J., et al. Secondary influenza challenge triggers resident memory B cell migration and rapid relocation to boost antibody secretion at infected sites. Immunity. 55 (4), e718 718-733 (2022).
  40. Abdulreda, M. H., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (31), 12863-12868 (2011).
  41. Camirand, G. New perspectives in transplantation through intravital microscopy imaging. Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 6-12 (2013).
  42. Camirand, G., et al. Multiphoton intravital microscopy of the transplanted mouse kidney. Am J Transplant. 11 (10), 2067-2074 (2011).
  43. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat Med. 17 (6), 744-749 (2011).
  44. Hsiao, H. M., et al. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. J Clin Invest. 128 (7), 2833-2847 (2018).
  45. Li, W., et al. Resolvin D1 prevents injurious neutrophil swarming in transplanted lungs. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (31), e2302938120(2023).
  46. Li, W., et al. Ferroptotic cell death and TLR4/Trif signaling initiate neutrophil recruitment after heart transplantation. J Clin Invest. 129 (6), 2293-2304 (2019).
  47. Li, W., et al. Visualization of monocytic cells in regressing atherosclerotic plaques by intravital 2-photon and positron emission tomography-based imaging-Brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 38 (5), 1030-1036 (2018).
  48. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
  49. Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Analyses of microglia effector function using CX3CR1-GFP knock-in mice. Methods Mol Biol. 1041, 307-317 (2013).
  50. Kim, Y. M., Jeong, S., Choe, Y. H., Hyun, Y. M. Two-photon intravital imaging of leukocyte migration during inflammation in the respiratory system. Acute Crit Care. 34 (2), 101-107 (2019).
  51. Bajpai, G., et al. Tissue resident CCR2- and CCR2+ cardiac macrophages differentially orchestrate monocyte recruitment and fate specification following myocardial injury. Circ Res. 124 (2), 263-278 (2019).
  52. Adamo, L., et al. Myocardial B cells are a subset of circulating lymphocytes with delayed transit through the heart. JCI Insight. 5 (3), e134700(2020).
  53. Lohmeyer, J., Friedrich, J., Rosseau, S., Pralle, H., Seeger, W. Multiparameter flow cytometric analysis of inflammatory cells contained in bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 172 (1), 59-70 (1994).
  54. Neupane, A. S., et al. Patrolling alveolar macrophages conceal bacteria from the immune system to maintain homeostasis. Cell. 183 (1), e111 110-125 (2020).
  55. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330 (6002), 362-366 (2010).
  56. Zipfel, W. R., et al. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  57. Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung. J Vis Exp. (173), e62761(2021).

Перепечатки и разрешения

Теги

Интравитальная визуализациятрансплантация легкихтрансплантат легкого мышитрафик иммунных клетокортотопическая трансплантация легкихинфильтрация нейтрофиловрегуляторные Т-клеткиимплантационное окнолегочный аллотрансплантат
Прижизненная двухфотонная микроскопия пересаженного легкого мыши
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.