Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Стратегии повышения культивирования анаэробных бактерий из желудочно-кишечного тракта курицы

2.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66570

⸱

10 мая 2024 г.

 ,  ,  , 
1Institute of Animal Science, University of Hohenheim, 2HoLMiR - Hohenheim Center for Livestock Microbiome Research, University of Hohenheim

В этой статье

Краткое содержание

В протоколе представлены две методологии для улучшения выделения анаэробных кишечных бактерий. Первый фокусируется на выделении разнообразного спектра бактерий с использованием различных питательных сред. Вторая фокусируется на этапах культивирования определенной микробной группы, возможно, ассимилировавшей мио-инозитол, чтобы полностью понять его экологическое значение.

Аннотация

Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) курицы — это сложная экосистема, в которой обитают триллионы микробов, которые играют ключевую роль в физиологии хозяина, пищеварении, усвоении питательных веществ, созревании иммунной системы и предотвращении вторжения патогенов. Для оптимального здоровья и продуктивности животных крайне важно охарактеризовать эти микроорганизмы и понять их роль. В то время как ЖКТ домашней птицы содержит резервуар микроорганизмов с потенциальными пробиотическими применениями, большая часть разнообразия остается неизученной. Чтобы улучшить наше понимание разнообразия некультивируемых микроорганизмов, необходимы согласованные усилия по внедрению этих микроорганизмов в культуру. Выделение и культивирование микроорганизмов, колонизирующих ЖКТ, позволяет получить воспроизводимый материал, включая клетки, ДНК и метаболиты, что позволяет по-новому взглянуть на метаболические процессы в окружающей среде. Без культивирования роль этих организмов в их естественной среде остается неясной и ограниченной описательным уровнем. Наша цель состоит в том, чтобы реализовать стратегии выращивания, направленные на улучшение выделения разнообразного спектра анаэробных микробов из ЖКТ курицы, используя междисциплинарные знания в области физиологии животных, кормления животных, метагеномики, биохимии кормов и современных стратегий выращивания. Кроме того, мы стремимся внедрить надлежащие методы отбора проб, транспортировки и подготовки среды, которые, как известно, влияют на успех изоляции. Соответствующие методологии должны обеспечивать постоянную бескислородную среду, оптимальные атмосферные условия, надлежащую температуру инкубации хозяина и учет конкретных потребностей в питательных веществах в соответствии с его особыми потребностями. Следуя этим методологиям, выращивание не только даст воспроизводимые результаты для выделения, но и облегчит процедуры изоляции, тем самым способствуя всестороннему пониманию сложной микробной экосистемы в ЖКТ курицы.

Введение

Возрождение культивирования в изучении микроорганизмов дополнило выводы метагеномных исследований, предоставив материал для проверки метаболических гипотез, которые ранее были лишь частично описаны и количественно оценены. Культивирование кишечных бактерий дает материал для поддержки будущих исследований по взаимодействию микробов и хозяина, способствует целенаправленным исследованиям колонизации и улучшает исследования молекулярных взаимодействий 1,2,3. Полученные знания о желудочно-кишечных микроорганизмах улучшили питание и благополучие животных, повлияв на рецептуры рационов и повысив доступность питательных веществ4. Это понимание способствовало повышению эффективности использования пребиотиков и взаимодействия пробиотиков. Тем не менее, необходимы глубокие исследования, чтобы получить полное представление о том, как биохимические и физико-химические условия взаимодействуют и влияют на микробный профиль и его структуру. Для достижения этой цели культивирование остается императивом, выступая в качестве важнейшего инструмента для изучения сложной динамики микробных сообществ в желудочно-кишечной среде.

В отличие от обширных исследований микробов, связанных с исследованиями кишечника человека и клиническим культивированием5, в отчетах о микроорганизмах домашнего скота преимущественно использовался ограниченный спектр сред для выделения, что потенциально ограничивало разнообразие изолятов 2,3. Кроме того, усовершенствования в составлении сред и исследования взаимодействия фосфатов и солей с агаром, как это было выяснено Tanaka et al. и Kawasaki et al., еще не были реализованы в исследованиях кишечного микробиома 6,7,8,9.

Сообщается, что мио-инозитол (ИМ), считающийся полузаменимым веществом, играет ключевую роль в различных метаболических, физиологических и регуляторных процессах10,11. К ним относятся участие в минерализации костей, развитии мышц молочной железы, клеточной сигнализации, содействии овуляции и фертильности, модуляции нейронной сигнализации, а также в качестве регулятора гомеостаза глюкозы и регуляции инсулина у домашней птицы10,11. ИМ играет роль предшественника благодаря его взаимопревращению в ключевых биохимических процессах, включая процесс гликолиза/глюконеогенеза, цикл лимонной кислоты и пентозофосфатный путь. Кроме того, он также служит предшественником фосфатидилинозитола (ПИ), который в свою очередь участвует в метаболизме глицерофосфолипидов12. В немногих исследованиях сообщалось, что метаболизм ИМ приводит к изменениям стабильности костей и работоспособности животных. Это включает в себя повышение коэффициента конверсии корма и прироста массы тела, демонстрируя его влияние после усвоения и использования в организме животного13,14. Тем не менее, путь метаболизма ИМ и его влияние на метаболизм птицы остаются неясными15. Кроме того, несколько исследований предполагают потенциальную роль бактерий в использовании ИМ, особенно в областях с высокой метаболической активностью, таких как подвздошная кишка 16,17,18,19.

Усилия по культивированию бактерий из ЖКТ животных направлены на совершенствование геномных баз данных и расширение исследований, проверку гипотез, основанных на геноме, и понимание экологической важности этих ресурсов. Целью данной работы является совершенствование стратегий культивирования бактерий из ЖКТ курицы для увеличения изоляционного разнообразия и целенаправленной изоляции экологической группы интересов, которая ассимилирует и метаболизирует мио-инозитол.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол разделен на четыре части: отбор проб, бактериальная изоляция, идентификация и консервация полученных микроорганизмов. Одобренные разрешения на использование животных были выданы этической комиссией Regierungspräsidium Tübingen, Германия, с номерами одобрения HOH50/17 TE и HOH67-21TE.

1. Получение образцов для культивирования анаэробных бактерий

  1. Содержание животных
    1. Содержать животных на коммерческой диете на основе кукурузы (Legehennen/Junghennenfutter; см. Таблицу материалов) и содержать их на экспериментальной станции Университета Хоэнхайма.
  2. Приготовление транспортного решения
    1. За 1-2 дня до сбора образца приготовьте транспортный раствор, содержащий 1,00 г/л тиогликолата натрия, 0,10 г/л дигидрата хлорида кальция (CaCl 2,2Н 2О) и 0,5% цистеина21 и 0,1% раствор резазурина натрия.
    2. Отрегулируйте pH среды до 6,0 ± 0,2 при 25 °C и автоклавируйте при 121 °C в течение 15 минут при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм.
    3. После того как среда остынет примерно до 50 °C, замените крышку флакона со средой на стерильную завинчивающуюся крышку с отверстием и резиновой пробкой. Вставьте две стерильные иглы шприца в резиновую пробку в разных положениях и прикрепите к одной из игл гидрофобный шприцевой фильтр (0,22 мкм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замена колпачков и установка игл и фильтра должны производиться внутри ламинарного потока воздуха (LAF).
    4. Подсоедините трубку со 100% азотом (N2) к фильтру шприца и вливайте газ N2 в бутылку в течение 10 минут при давлении 1 фунт на квадратный дюйм.
    5. Затем перенесите бутылку со средой и стерильные трубки Hungate в анаэробную станцию и асептически перенесите транспортировочную среду в трубки Hungate. Полностью заполните трубки Hungate доверху, обеспечив отсутствие воздуха внутри.
  3. Убой и сбор образцов
    1. Во время процесса убоя поддерживайте аксенические условия, чтобы избежать загрязнения, используя перчатки, маску, пластиковый лабораторный фартук и стерильные хирургические инструменты на протяжении всей процедуры. Кроме того, правильно продезинфицируйте рабочий стол с использованием этанола и салфеток для поддержания стерильной среды.
    2. На экспериментальной станции обезболить 10 50-недельных кур-несушек Ломана с помощью газовой смеси в баллонах, состоящей из 35% N2, 35% CO2 и 30% O2 , и немедленно обезглавить их.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обезболивание и жертвоприношение должны проводиться лаборантом, хорошо знакомым с благополучием животных и научными процедурами. Это гарантирует, что процедура жертвоприношения соответствует этическим нормам, правовым нормам и рекомендациям по технике безопасности.
    3. Прежде чем приступить к вскрытию отдела ЖКТ, закрепите необходимый сегмент кишечника, а именно посев, подвздошную кишку и тощую кишку, с помощью стерильного гемостата Келли (также известного как зажим Келли; Рисунок 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вскрытие животного должно проводиться либо ветеринаром, либо хорошо обученным человеком, знакомым с анатомией цыплят.
    4. Переложите каждую отдельную секцию в отдельную пробирку Hungate, наполненную транспортировочной средой, и закройте крышку как следует. При необходимости добавьте в трубку дополнительную транспортировочную среду, чтобы вытеснить оставшийся воздух.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перенос секции является важным этапом, и важно свести к минимуму любую задержку или открытие секции, чтобы предотвратить длительное воздействие кислорода
  4. Транспортировка образца
    1. Обращайтесь с транспортировкой трубок Hungate с осторожностью, помещая их в коробку из пенополистирола, чтобы предотвратить риск поломки. Если температура наружного воздуха ниже 15 °C, поддерживайте температуру образца с помощью теплых компрессов. Следите за тем, чтобы время транспортировки не превышало 4 часов.
    2. Осторожно перенесите трубки внутрь анаэробной станции для дальнейшей обработки.

2. Выделение анаэробных бактерий

  1. Приготовление питательных сред
    ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный метод представляет собой различные соображения по приготовлению питательных сред. В таблице 1 приведен пример того, как разделены растворы для разнообразного выделения микроорганизмов.
    1. Разделите ингредиенты используемой среды на четыре группы растворов: источник углерода, источник азота, агар и минеральный источник. Для мультимедийных средств, таких как инфузия мозг-сердце (BHI), разделение не всегда возможно (см. пример среды 2 в таблице 1). В таких случаях обеспечьте раздельное приготовление и автоклавирование агара или дополнительных растворов.
    2. Приготовьте углеводный раствор в 1/4 от требуемого конечного объема среды, например, в 250 мл для общего объема 1 л среды. Следуя примеру среды 1 в таблице 1, растворить 2 г декстрозы и 0,5 г крахмала в 250 мл дистиллированной воды.
    3. Приготовьте белковый раствор в 1/4 от требуемого конечного объема среды, например, в 250 мл для общего объема 1 л среды. Следуя примеру среды 1 в таблице 1, растворить 10 г пептона в 250 мл дистиллированной воды.
    4. Готовят раствор агара в количестве от 45% до 48% от конечного объема среды, например, в 450-480 мл для общего объема 1 л среды. Следуя примеру медиу 1 в таблице 1, растворите 15 г агара в 450-480 мл дистиллированной воды.
    5. Приготовьте минеральный раствор в оставшемся объеме от 20 до 50 мл среды, когда конечный объем среды составит 1 л. Следуя примеру среды 1 в таблице 1, растворите 0,5 гК2HPO4 в 20-50 мл дистиллированной воды.
    6. Автоклавируйте раствор белка, раствор агара и минеральные растворы при 121 °C в течение 15 мин при давлении 21 фунт на квадратный дюйм. Автоклавируйте углеводный раствор при 110 °C в течение 30 мин при давлении 5 фунтов на квадратный дюйм.
    7. Когда все растворы станут стерильными, охладите их до 50 °C и смешайте в стерильных условиях в подходящей автоклавной стеклянной бутылке с крышкой с отверстием и резиновой пробкой. После этого выполните шаги 1.2.3 и 1.2.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смешивание растворов должно производиться внутри LAF.
    8. После того, как среда будет смешана и дегазирована, разлейте ее в стерильные чашки Петри или трубки внутри анаэробной станции.
  2. Выделение анаэробных бактерий
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая методология объясняет стратегию выделения для культивирования широкого спектра анаэробных бактерий, населяющих пищеварительный тракт курицы.
    1. Переведите образцы на анаэробную станцию, содержащую газовую смесь в баллонах, состоящую на 80% N2 (уровень качества 5,0), 15% CO2 (уровень качества 3,0) и 5% H2 (уровень качества 5,0), предоставленную коммерческим поставщиком (см. Таблицу материалов).
    2. Внутри анаэробной станции перенесите срез из хунгатной трубки в стерильную чашку Петри с помощью автоклавных щипцов.
    3. Осторожно разрежьте срез с помощью стерильных ножниц и извлеките примерно 1 г содержимого дигеста из кишечного сегмента с помощью стерильного шпателя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После забора 1 г содержимого дигеста отбракуйте и переложите оставшуюся дигестовую деформацию в соответствующую транспортировочную трубку для целевой изоляции.
    4. Проведите 10-кратное серийное разведение с использованием стерильного физиологического раствора (0,85% NaCl).
    5. Дозируйте 0,1 мл образца из разведений от 10−4 до 10−7 в стерильные и правильно маркированные чашки Петри медиа-тарелки и распределите стерильным шпателем Дригальского.
    6. Инкубируйте планшеты внутри анаэробной станции в течение 24–48 ч при 39 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При инкубации в инкубаторе перенесите чашки Петри в герметичную коробку, прежде чем вынимать чашки Петри из анаэробной станции.
  3. Целенаправленное выделение определенной группы бактерий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая методология объясняет стратегию выделения анаэробных бактерий, которые потенциально могут ассимилироваться с ИМ.
    1. Для приготовления обогащающей среды, минимальной агаровой среды и минимальной бульонной среды следуйте составу, указанному в Таблице 2 и Таблице 3, придерживаясь рекомендаций, изложенных в шаге 2.1. Добавьте 0,2 мл/л фильтр-стерильной витаминной смеси (как указано в составе) в минимальные агаровые и минимальные бульонные среды после процесса автоклавирования.
    2. Гомогенизируйте исходный образец с помощью вихревого смесителя в течение 10-15 с. Затем гомогенизированный образец переносят в пробирку, содержащую обогащающую среду, в концентрации 5% (например, если объем обогащающей среды составляет 10 мл, инокулируют 0,5 мл гомогенизированной пробы) с помощью пипетки. Инкубировать только что инокулированный образец в течение 24 ч при температуре 39 °C внутри анаэробной станции.
    3. После инкубации обогащенную пробирку тщательно перемешайте либо с помощью вихревого смесителя в течение 10-15 с, либо с помощью пипетирования. Затем перемешиваем смешанный образец в стерильную среду минимального бульона со скоростью 5%, а затем инкубируем в течение 24 ч при 39 °С.
    4. Последовательно разводите образцы в стерильном физиологическом растворе (т.е. 0,85% NaCl), начиная с разведения 1:10 и продолжая до разведения 1:1000. После каждого разведения тщательно гомогенизируйте образец при комнатной температуре с помощью вихревого смесителя в течение 10-15 с или с помощью пипетирования.
    5. В стерильных и анаэробных условиях перенесите 1 мл разведенного образца в чашку Петри. Налейте примерно 15-20 мл растопленной среды минимального агара в чашку Петри и аккуратно перемешайте горизонтально для равномерного перемешивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Температура агара должна быть около 45 °C, чтобы не было комков и чтобы образец не погиб от нагрева. Заливка среды должна производиться в анаэробных условиях.
    6. После затвердевания агара инкубировать чашки Петри в течение 24 ч при температуре 39 °C в перевернутом положении внутри анаэробной станции или в инкубаторе. После 24 ч инкубации колонии бактерий выглядят как отчетливые, маленькие точки, внедренные в среду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При инкубации чашки Петри в инкубаторе перенесите планшеты в герметичную коробку, прежде чем вынимать их из анаэробной станции.
    7. С помощью стерильной посевной петли тщательно отобрать отдельную бактериальную колонию и переложить ее в отдельные пробирки с минимальным содержанием бульона.
    8. После переноса колоний в отдельные пробирки анаэробно инкубируйте инокулированные пробирки при 39 °C в течение 24 ч. После инкубации повышенное помутнение в среде будет свидетельствовать о росте бактерий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз перед перемещением бутылок со средой внутрь анаэробной станции, их следует дегазировать, как упоминалось ранее в шаге 2.1.7. Шаги 2-8 должны выполняться внутри анаэробной станции.

3. Идентификация анаэробных бактерий

  1. Извлечь ДНК из культур в период инкубации от 24 до 48 часов, следуя протоколу ферментативного лизиса22.
  2. Центрифугируйте культуру при 3000 x g в течение 10 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
  3. Промойте гранулу 2 раза фосфатно-солевым буфером (PBS), суспензив в 2 мл PBS. Гомогенизируйте образец с помощью вихревого смесителя в течение 10-15 с. Повторите этап центрифугирования при 3000 x g в течение 10 минут при 4 °C и осторожно выбросьте надосадочную жидкость.
  4. Суспендировать клеточную гранулу в 0,2 мл PBS pH 7,4 и инкубировать при 50 °C с 1 Ед лизоцима и 1 Ед рекомбинантного мутанолизина в течение 30 мин, с последующей инкубацией в течение 30 мин при 56 °С с 5 мкл протеиназы К.
  5. Добавьте 4 μL единицы RNAseA в каждую пробирку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут. Центрифужные пробирки при 21168 х г в течение 1 мин. Восстановите надосадочную жидкость и очистите с помощью магнитных шариков.
  6. Выполните количественное определение ДНК флуориметрическим методом в соответствии с инструкциями производителя для набора для количественного определения дцДНК ( упомянутыми в Таблице материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Извлеченную ДНК можно хранить при температуре -20 °C.
  7. Используйте образцы ДНК в качестве матриц для амплификации ПЦР с использованием праймеров 27f и 1492r23 в соответствии с условиями, приведенными в таблице 4. Чтобы убедиться в успешности ПЦР-реакции, проводят электрофорез в агарозном геле по стандартному методу электрофореза в агарозном геле с использованием 1X TAE буфера и 1% агарозы.
  8. Очистите продукт ПЦР с помощью коммерческого набора для очистки ПЦР, чтобы избавиться от праймеров, нуклеотидов и других загрязнений.
  9. Отправьте продукт ПЦР для секвенирования по Сэнгеру к подходящему поставщику услуг секвенирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наряду с секвенированием, поставщики услуг также могут предоставлять услуги, включающие очистку продукта ПЦР за дополнительную плату. Продукты ПЦР можно хранить при температуре 4 °C или при -20 °C.
  10. После получения результатов секвенирования в формате FASTA вместе с файлом хроматограммы (обычно в формате ABI или SCF) проанализируйте последовательности с помощью инструментов биоинформатики. Используйте программное обеспечение для анализа последовательностей для открытия и визуализации файла хроматограммы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общее качество хроматограммы проверялось на основе четких и отчетливых пиков без чрезмерного шума
  11. Сравните ампликоны и выровняйте их с близкородственными видами в неизбыточной базе данных рибосомальной РНК GenBank 16S от Национального центра биотехнологической информации (NCBI) с использованием инструмента24 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) и базы данных генома Refseq.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании NCBI BLAST скопируйте всю последовательность FASTA в строку поиска.

4. Сохранение чистых бактериальных культур

  1. Соберите бактериальные клетки из хорошо выращенной культуры в течение 24-48 часов либо центрифугированием (3000 x g в течение 10 минут), либо путем сбора биомассы из аксенической культуры на планшете.
  2. Суспензируйте бактериальную культуру в подходящем изотоническом стерильном растворе (NaCl 0,85%) и промойте путем центрифугирования бактериального раствора при 3000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
  3. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте бактериальную гранулу в небольшом объеме стерильного изотонического раствора (0,5 мл). Чтобы убедиться в удалении остатков питательной среды, повторите 1 раз.
  4. Ресуспендировать гранулу в 0,8 мл на 1 мл концентрата стерильной питательной среды и гомогенизировать либо с помощью вихревого смесителя в течение 5-10 с, либо путем аккуратного пипетирования.
  5. Перенесите 0,5 мл клеточной суспензии в стерильный и правильно маркированный 1 мл криовиала и добавьте 0,5 мл автоклавированного 50% раствора глицерина. Гомогенизируйте криовиал с помощью вихревого миксера и храните в морозильной камере при температуре -80 °C (Рисунок 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги перед переводом криоприемников на температуру -80 °C должны выполняться внутри анаэробной станции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мониторинг анаэробной обстановки при транспортировке
Благодаря добавлению резазурина натрия изменение цвета транспортного раствора на розовый перед переносом образца в пробирку свидетельствует о нарушении или несоблюдении анаэробных условий. Следовательно, трубки, показывающие изменение цвета, не использовались во время транспортировки, и использовались только трубки, показывающие отсутствие изменения цвета, как видно на рисунке 2.

Анал...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Целью данной методики является повышение эффективности культивирования анаэробных кишечных бактерий за счет улучшения качества условий отбора проб, обработки проб, а также составления и подготовки сред. Физико-химические условия образцов (pH, доступность углерода, азота и кофакторов) должны учитываться при составлении питательных сред. По сравнению с коллекциями бактериальных культур, полученных от свиней, людей илимышей,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет никаких конкурирующих финансовых или личных интересов, связанных с произведением, представленным в этом сценарии.

Благодарности

Авторы выражают признательность партнерской программе Реховот-Хоэнхайм и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SE 2059/7-2. Этот проект разрабатывался в рамках исследовательского блока P-FOWL (FOR 2601).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Уксусная кислотаVWR20104.334
АгарVWR97064-332
Хлорид аммонияCarlRoth P726.1
Анаэробная станцияDon Whitley ScientificA35 HEPA
масляная кислотаMerck8.0045.1000
Кальция хлорид дигидрат VWR97061-904
ЦентрифугаEppendorf5424R
Лизоцим курицы (Мурамидаза)VWR1.05281.0010
ЦистеинVWR97061-204
ДекстрозаVWR90000-908
Ди-калий гидрофосфатКарл РотP749.1
ЭДТА КарлРот8043.2
Legehennen/ JunghennenfutterDeutsche Tiernahrung Cremer GmbH & Co. KG, Dü ссельдорф, Германия-
MagAttract HMW DNA KitQiagen67563
Хлорид магнияCarl Roth2189.1
Смешанный газ (80% N<суб>2 (уровень качества 5,0), 15% CO<суб>2 (уровень качества 3,0) и 5% H<суб>2 (уровень качества 5,0))Westfalen Gase GmbH,Германия-мутанолизин
, рекомбинантный (лиофилизат)А и Биотехнология1017-10L
Мио-инозитолКарл Рот4191.2
PBS 1XChemSolute8418.01
Дигидрофосфат калияКарл Рот3904.2
Пропионовая кислотаКарл Рот6026.1
QuantiFluor dsDNA SystemPromegaE2671
RNAse A QIAGEN Ribonuclease A (РНКаза A) 19101
Хлорид натрияVWR27800.291
Резазурин натрияVWR85019-296
Тиогликолят натрияСигма-Олдрич102933
Соевый пептон, без ГМО, без животного происхожденияVWR97064-186
ТермоамплификаторBio-RadT100
ТриптонКарл Рот8952.1
Tween80Carl Roth9139.2
Витаминная смесь (добавка)VWR968290NL
VortexStar Lab07127/92930
Дрожжевой экстрактCarl Roth9257.05
β-D-фруктозаVWR53188-23-1

Ссылки

  1. Wylensek, D., et al. A collection of bacterial isolates from the pig intestine reveals functional and taxonomic diversity. Nat Comm. 11 (1), 6389(2020).
  2. Medvecky, M., et al. Whole genome sequencing and function prediction of 133 gut anaerobes isolated from chicken caecum in pure cultures. BMC Geno. 19 (1), 561(2018).
  3. Zenner, C., et al. Early-life immune system maturation in chickens using a synthetic community of cultured gut bacteria. mSystems. 6 (3), 1110-1128 (2021).
  4. Borda-Molina, D., et al. Effects on the ileal microbiota of phosphorus and calcium utilization, bird performance, and gender in japanese quail. Animals. 10 (5), 885(2020).
  5. Bonnet, M., Lagier, J. C., Raoult, D., Khelaifia, S. Bacterial culture through selective and non-selective conditions: The evolution of culture media in clinical microbiology. New Micro New Infect. 34, 100622(2020).
  6. Tanaka, T., et al. A hidden pitfall in the preparation of agar media undermines microorganism cultivability. Appl Environ Microbiol. 80 (24), 7659-7666 (2014).
  7. Kawasaki, K., Kamagata, Y. Phosphate-catalyzed hydrogen peroxide formation from agar, gellan, and κ-carrageenan and recovery of microbial cultivability via catalase and pyruvate. Appl Environ Microbiol. 83 (21), e01366-e01417 (2017).
  8. Kato, S., et al. Isolation of previously uncultured slow-growing bacteria by using a simple modification in the preparation of agar media. Appl Environ Microbiol. 84 (19), e00807-e00818 (2018).
  9. Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nat Rev Microbiol. 19 (4), 225-240 (2021).
  10. Su, X. B., Ko, A. L. A., Saiardi, A. Regulations of myo-inositol homeostasis: Mechanisms, implications, and perspectives. Adv Biol Regul. 87, 2212-4926 (2023).
  11. Monastra, G., Dinicola, S., Unfer, V. Physiological and pathophysiological roles of inositols in A clinical guide to inositols. , Elsevier. (2023).
  12. Kanehisa, M. Toward understanding the origin and evolution of cellular organisms. Prot Sci. 28 (11), 1947-1951 (2019).
  13. Lee, S. A., Nagalakshmi, D., Raju, M. V., Rao, S. V. R., Bedford, M. R. Effect of phytase superdosing, myo-inositol and available phosphorus concentrations on performance and bone mineralisation in broilers. Animal Nutri. 3 (3), 247-251 (2017).
  14. Farhadi, D., Karimi, A., Sadeghi, G., Rostamzadeh, J., Bedford, M. Effects of a high dose of microbial phytase and myo-inositol supplementation on growth performance, tibia mineralization, nutrient digestibility, litter moisture content, and foot problems in broiler chickens fed phosphorus-deficient diets. Poultry Sci. 96 (10), 3664-3675 (2017).
  15. Weber, M., Fuchs, T. M. Metabolism in the niche: A large-scale genome-based survey reveals inositol utilization to be widespread among soil, commensal, and pathogenic bacteria. Microbio Spect. 10 (4), e02013-e02022 (2022).
  16. Kawsar, H. I., Ohtani, K., Okumura, K., Hayashi, H., Shimizu, T. Organization and transcriptional regulation of myo-inositol operon in Clostridium perfringens. FEMS Microbiol Lett. 235 (2), 289-295 (2004).
  17. Hellinckx, J., Heermann, R., Felsl, A., Fuchs, T. M. High binding affinity of repressor IolR avoids costs of untimely induction of myo-inositol utilization by Salmonella Typhimurium. Sci Rep. 7 (1), 44362(2017).
  18. Yebra, M. J., et al. Identification of a gene cluster enabling Lactobacillus casei BL23 to utilize myo-inositol. Appl Environ Microbiol. 73 (12), 3850-3858 (2007).
  19. Zhang, W. Y., et al. Comparative analysis of iol clusters in Lactobacillus casei strains. World J Microbiol Biotechnol. 26, 1949-1955 (2010).
  20. Labeda, D. P. Bergey's manual of systematic bacteriology. , Springer. (2001).
  21. Peterson, L. R. Effect of media on transport and recovery of anaerobic bacteria. Clin Infect Dis. 25, 134-136 (1997).
  22. Ulrich, R. L., Hughes, T. A. A rapid procedure for isolating chromosomal DNA from Lactobacillus species and other Gram-positive bacteria. Lett Appl Microbiol. 32 (1), 52-56 (2008).
  23. Relman, D. Universal bacterial 16s rRNA amplification and sequencing. Diag Mol Microbiol. , 489-495 (1993).
  24. Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: A new generation of protein database search programs. Nuc Acid Res. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  25. Rios-Galicia, B., et al. Novel taxonomic and functional diversity of eight bacteria from the upper digestive tract of chicken. Int J Syst Evol Microbiol. 74 (1), 006210(2024).
  26. Lagier, J. C., et al. Microbial culturomics: Paradigm shift in the human gut microbiome study. Clin Microbiol Infect. 18 (12), 1185-1193 (2012).
  27. Lagkouvardos, I., et al. The mouse intestinal bacterial collection (mibc) provides host-specific insight into cultured diversity and functional potential of the gut microbiota. Nat Microbiol. 1 (10), 1-15 (2016).
  28. Gilroy, R., et al. Extensive microbial diversity within the chicken gut microbiome revealed by metagenomics and culture. PeerJ. 9, e10941(2021).
  29. Huang, P., et al. The chicken gut metagenome and the modulatory effects of plant-derived benzylisoquinoline alkaloids. Microbiome. 6 (1), 1-17 (2018).
  30. Zhang, Y., et al. Improved microbial genomes and gene catalog of the chicken gut from metagenomic sequencing of high-fidelity long reads. GigaScience. 11, 116(2022).
  31. Segura-Wang, M., Grabner, N., Koestelbauer, A., Klose, V., Ghanbari, M. Genome-resolved metagenomics of the chicken gut microbiome. Front Microbiol. 12, 726923(2021).
  32. Borrelli, R. C., Fogliano, V., Monti, S. M., Ames, J. M. Characterization of melanoidins from a glucose-glycine model system. Euro Food Res Technol. 215, 210-215 (2002).
  33. Ferrario, C., et al. Untangling the cecal microbiota of feral chickens by culturomic and metagenomic analyses. Environ Microbiol. 19 (11), 4771-4783 (2017).
  34. Crhanova, M., et al. Systematic culturomics shows that half of chicken caecal microbiota members can be grown in vitro except for two lineages of clostridiales and a single lineage of bacteroidetes. Microorganisms. 7 (11), 496(2019).
  35. Rubio, L., et al. Lactobacilli counts in crop, ileum and caecum of growing broiler chickens fed on practical diets containing whole or dehulled sweet lupin (lupinus angustifolius) seed meal. British Poult Sci. 39 (3), 354-359 (1998).
  36. Bjerrum, L., et al. Microbial community composition of the ileum and cecum of broiler chickens as revealed by molecular and culture-based techniques. Poult Sci. 85 (7), 1151-1164 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Микробиота кишечника цыпляткультивирование бактерийизоляция микробовсерийное разведениеанаэробная станцияметаболизм мио-инозитоламинимальный агаровыйtсредаизоляция бактериальных колоний
Стратегии повышения культивирования анаэробных бактерий из желудочно-кишечного тракта курицы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.