Методическая статья

13МечениеC6-глюкозы, ассоциированное с LC-MS: идентификация первичных органов растений в синтезе вторичных метаболитов

1.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66578

⸱

22 марта 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2College of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Pharmacy, Ya'an People's Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Разработанный метод мечения 13C6-Glucose в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения жидкостной хроматографии является универсальным и закладывает основу для будущих исследований первичных органов и путей, участвующих в синтезе вторичных метаболитов в лекарственных растениях, а также комплексной утилизации этих вторичных метаболитов.

Аннотация

В данной работе представлен новый и эффективный метод сертификации первичных органов, участвующих в синтезе вторичных метаболитов. В качестве важнейшего вторичного метаболита у Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Рука. -Mzt. (PPY), сапонин парижский (PS) обладает разнообразной фармакологической активностью, и PPY пользуется все большим спросом. В этом исследовании было установлено, что листья, корневище и стеблево-сосудистый пучок 13C6-глюкозы с кормлением и без кормления точно сертифицируют первичные органы, участвующие в синтезе парижских сапонинов VII (PS VII). Комбинируя жидкостную хроматографию-масс-спектрометрию (ЖХ-МС), были быстро и точно рассчитаны соотношения 13C/12C листьев, корневища, стебля и корня при различных обработках, а также были обнаружены четыре типа соотношений изотопических ионов PS (M-): (M+1) −/M−, (M+2) −/M−, (M+3) −/M− и (M+4) −/M−. Результаты показали, что соотношение 13С/12С в корневищах при лечении стволовым сосудистым пучком и корневищем было значительно выше, чем при лечении без кормления. По сравнению с обработкой без кормления, соотношение молекул PS VII (M+2) -/M− в листьях значительно увеличивалось при обработке листьев и стеблевых, сосудисто-пучковых пучков. В то же время, по сравнению с обработкой без подкормки, соотношение молекул PS VII (М+2) −/М− в листьях при обработке корневищем не показало существенной разницы. Кроме того, соотношение молекул PS VII (M+2) -/M− в стебле, корне и корневище не показало различий между четырьмя обработками. По сравнению с обработкой без подкормки, соотношение молекулы парижского сапонина II (PS II) (M+2) -/M− в листьях при листовой обработке не показало существенной разницы, а соотношение (M+3) -/M− молекул PS II в листьях при листовой обработке было ниже. Данные подтвердили, что первичным органом для синтеза PS VII являются листья. Это закладывает основу для будущей идентификации первичных органов и путей, участвующих в синтезе вторичных метаболитов в лекарственных растениях.

Введение

Пути биосинтеза вторичных метаболитов в растениях сложны и разнообразны, в них задействованы высокоспецифичные иразнообразные органы накопления. В настоящее время специфические места синтеза и органы, ответственные за вторичные метаболиты во многих лекарственных растениях, четко не определены. Эта неопределенность представляет собой серьезное препятствие для стратегического продвижения и внедрения методов выращивания, разработанных для оптимизации как урожайности, так и качества лекарственных материалов.

Молекулярная биология, биохимия и методы мечения изотопов широко используются для раскрытия путей синтеза и сайтов вторичных метаболитов в лекарственных растениях 2,3,4,5, и каждая из этих методологий демонстрирует уникальные сильные стороны и ограничения, такие как различия в эффективности и точности. Подходы молекулярной биологии, например, обеспечивают высокую точность в определении сайтов в биосинтетических путях, но требуют значительного времени. Их полезность еще больше ограничена для видов, у которых отсутствуют общедоступные геномные последовательности, что делает эти методы менее жизнеспособными длятаких случаев. В противоположность этому, методы мечения изотопов, использующие изотопные соотношения, такие как 3C/12C, 2H/1H и 18O/16O, обеспечивают быстрые и доступные средства для исследования механизмов синтеза, транспортировки и хранения вторичных метаболитов 7,8. Они могут выявить пространственное распределение органических соединений и стабильных изотопов в листьях, тем самым позволяя реконструировать условия окружающей среды, с которыми сталкиваются листья на протяжении всего ихжизненного цикла. Кроме того, применение внешних изотопных меток, таких как 13C6-Glucose 10 и 13C 6-Phenylalanine11, позволяет генерировать меченные углеродом вторичные метаболиты, улучшая наше понимание их производства и функции.

Традиционные методы мечения изотопов углерода сталкиваются с трудностями в определении конкретных органов, ответственных за синтез вторичных метаболитов, из-за высокой видоспецифичной природы их биосинтетических путей и механизмов транспортировки. Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ-МС) приобрела известность в качестве ключевого аналитического инструмента в этой области, предлагая надежный метод отслеживания экзогенных изотопов в химическом синтезе лекарств и исследования in vivo таких процессов, как абсорбция, распределение, метаболизм и экскреция. Превосходная чувствительность, прямолинейность и надежность ЖХ-МС делают его идеальным выбором для мониторинга производства вторичных метаболитов на предприятиях13. В последнее время LC-MS становится все более предпочтительным для его применения в методах мечения внешними изотопами, что позволяет оценить эффективность мечения для различных образцов. Данная методология дает критическое представление о первичных органах, участвующих в синтезе вторичных метаболитов лекарственных растений, служа неоценимым дополнением к биологическим методам идентификации органов синтеза этих соединений14,15. Следовательно, такой подход не только облегчает сравнение эффективности мечения среди различных образцов, но и проливает свет на ключевые органы, участвующие в образовании вторичных метаболитов растений, тем самым улучшая наше понимание их биосинтеза.

Мы представили новый метод, который сочетает мечение изотопов углерода с обнаружением LC-MS для идентификации первичных органов, ответственных за синтез вторичных метаболитов в лекарственных растениях. Парижский сапонин (ПС) обладает различными фармакологическими свойствами, такими как противоопухолевое, иммуномодулирующее и противовоспалительное16, а ППИ пользуется все большим спросом17. Таким образом, мы использовали проростки PPY в качестве объектов исследования и расшифровали, что листья являются основным органом для синтеза парижского сапонина VII (PS VII) (рис. 1B) с помощью мечения 13C6-Glucose, связанного с методом LC-MS. Наш подход включал в себя четыре различных метода лечения, включающих подачу 13С-6-глюкозы в листья, корневище и стеблево-сосудистые пучки, а также контроль без кормления. Выбор 13С-6-глюкозы является стратегическим, так как она быстро метаболизируется в ацетилкоэнзим А посредством дыхания, что в свою очередь способствует синтезу ФС. Используя естественное содержание 13C, мы использовали систему газовой хроматографии и масс-спектрометра стабильных изотопных отношений (GC-IRMS) для оценки соотношений 13C/12C в различных органах растений и для анализа изотопных ионных пиковых отношений в молекулах PS VII и парижских сапонинов II (PS II) (рис. 1B). Наша методология, в которой используются 13меченых С предшественников вторичных метаболитов растений и передовые методы масс-спектрометрии, предлагает более простую и точную альтернативу традиционным методам мечения изотопами углерода. Этот новый подход не только углубляет наше понимание органов, участвующих в синтезе вторичных метаболитов в лекарственных растениях, но и закладывает прочную основу для будущих исследований биосинтетических путей этих соединений.

Протокол

1. Подготовка к эксперименту

  1. Убедитесь, что во время роста растений относительная влажность воздуха в теплице составляет 75%, дневная/ночная температура составляет 20 °C/10 °C, фотопериод состоит из 12 часов дня и 12 часов ночи, а интенсивность света составляет 100 моль·м-2·с-1. Обеспечьте излучение с помощью светодиодных (LED) ламп, соблюдая расстояние 30 см между светодиодной лампой и пологом растения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фотопериод и интенсивность света зависят от количества солнечных часов в течение вегетационного периода в Юньнани. Интенсивность излучения обычно измеряется квантовым датчиком (см. Таблицу материалов). Внесите необходимые изменения параметров окружающей среды в соответствии с особенностями лекарственного растения. После того, как эти условия окружающей среды были тщательно откалиброваны на основе характеристик растения и регионального профиля солнечного света, крайне важно поддерживать постоянство этих условий на протяжении всего эксперимента. Произвольные изменения параметров окружающей среды после их первоначального установления могут поставить под угрозу целостность эксперимента и достоверность результатов.
  2. Используйте гидропонный подход18 , чтобы убедиться в точности и специфичности нашего эксперимента. Убедитесь, что промытые 2-летние саженцы PPY (собранные в Вэньшане, провинция Юньнань (104°11′ в.д., 23°04′ с.ш.) погружены в 1/4 стандартной концентрации питательного раствора Hoagland на 3 дня для адаптации.
    1. Приготовьте питательный раствор Хогланда (см. Таблицу материалов) в соответствии с инструкцией; добавьте 1,26 г порошка Hoagland и 0,945 г порошка нитрата кальция в 4 л очищенной воды. Приготовьте раствор 13C6-Glucose (см. Таблицу материалов), как описано в стандартном руководстве; добавьте 0,2 г порошка 13C6-Glucose в 100 мл очищенной воды или питательного раствора Hoagland.
    2. Подготовьте гидропонный баллон и кислородный насос (Рисунок 2; см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В гидропонной установке использование раствора 13C6-Glucose для мечения позволяет обойти влияние почвенных микроорганизмов, тем самым гарантируя, что раствор напрямую способствует быстрому синтезу вторичных метаболитов в лекарственных растениях. Для оптимизации условий усвоения растениями 13С6-глюкозы необходимо регулировать расход кислородного насоса в диапазоне от 4 до 8 л/мин. Этот контролируемый расход имеет решающее значение для предотвращения того, чтобы рассада плавала на поверхности воды, что может значительно затруднить ее способность эффективно поглощать 13C6-глюкозу. Поддержание погружения рассады на правильную глубину позволяет эффективно поглощать меченый состав, тем самым обеспечивая успех процесса синтеза метаболитов в гидропонной системе.

2. Проведение эксперимента по мечению углекислого газа

  1. Разработайте четыре метода лечения и проследите органы синтеза и пути синтеза PS VII и PS II в PPY, чтобы продемонстрировать, что листья являются основным органом для синтеза PSY.
    1. При обработке 1 рассада PPY не подкармливается; при обработке 2 опрыскать листья рассады PPY 0,2% 13C6-Glucose; в обработке 3 подкормить корневища проростков PPY 0,2% 13C6-глюкозой; в обработке 3 подкормите рассаду PPY в месте разреза стебля 0,2% 13C 6-глюкозой (рис. 2A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение 1 установлено в качестве контрольной группы. Обработка 2 организована для демонстрации того, что листья могут синтезировать PS. Обработка 3 и 4 предназначена для демонстрации того, что корневища могут поглощать 13C6-глюкозы.
    2. При обработке 1 и 2 выращивайте рассаду PPY в обычном питательном растворе Hoagland. Распылите 5 мл 0,2% раствора 13C6-Glucose один раз утром, днем и вечером на листья Обработки 2.
    3. При обработке 3 и 4 выращивайте рассаду PPY в питательном растворе Hoagland, содержащем 0,2% 13C 6-глюкозы. В Обработке 4 с помощью скальпеля (см. Таблицу материалов) отрежьте стебли рассады PPY от середины, но не отрывайте сосудистые пучки.
    4. Оставьте маркировку на каждой обработке в течение 3 дней и меняйте питательный раствор каждые 1,5 дня. Проведите эксперимент с использованием рандомизированного блочного дизайна и повторите каждую обработку 3 раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При опрыскивании листьев важно поместить абсорбирующую бумагу позади опрыскиваемых листьев. Это предотвращает попадание капель воды в расположенный ниже питательный раствор, что в противном случае могло бы повлиять на результаты эксперимента. Надрезы на стеблях не все удалены, но к ним прикреплены кабелепроводы, которые видны невооруженным глазом.

3. Методы отбора проб и подготовки

  1. Соберите листья, стебли, корневища и корни от каждой обработки отдельно в конце 3-дневного эксперимента с 13C6-Glucose. Тщательно промойте собранные органы растения, чтобы удалить поверхностные загрязнения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отсутствие концентрации 13C может быть обнаружено с помощью анализа раствора для стирки с помощью LC-MS, который доказывает, что стирка является чистой19.
  2. Используйте электрическую печь для доменной сушки с постоянной температурой (см. Таблицу материалов) для сушки промытых органов растения. Начните с 105 °C в течение 30 минут, а затем установите при 60 °C до постоянного веса. Измельчите высушенные органы растений в порошок с помощью полностью автоматической скоростной мельницы для образцов (см. Таблицу материалов).
    Примечание: Порошок используется для количественного анализа соотношений PS VII, II и 13C/12C в различных органах растений.
  3. Используйте электронные аналитические весы (см. Таблицу материалов), чтобы точно взвесить 30 мг порошка для каждого образца и поместить его в 2 мл 75% v/v этанол-воды. Используйте ультразвуковой очиститель с ЧПУ (см. Таблицу материалов) и выполните ультразвуковую экстракцию при 25 °C в течение 20 мин (60 кГц), повторите 2 раза; Соедините экстракционные растворы и приготовьте три параллельных образца20.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Погрешности в весе образца должны быть сведены к минимуму.
  4. С помощью азота высушите экстракционный раствор феном, затем растворите в хроматографическом метаноле до объема 1 мл. Перед впрыском используйте для фильтрации фильтр с органической фазой 0,22 мкм (см. Таблицу материалов) (Рисунок 2B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не выдувайте экстракт при сушке феном с помощью газообразного азота; Экстракт должен быть пропущен через микропористую мембрану, чтобы примеси минимально мешали.

4. Настройка и эксплуатация LC-MS

  1. Настройка MS
    1. Активируйте вакуумный насос, переведя его переключатель в положение «включено». Откройте главный клапан на баллоне с аргоном, затем отрегулируйте клапан частичного давления, чтобы достичь целевого давления около 0,3 МПа. После этого убедитесь, что клапан газообразного азота также открыт.
    2. Запустите управляющее программное обеспечение MS (см. Таблицу материалов). Нажмите на нагреваемый источник ионизации электроспрея (HESI Source) в панели программного обеспечения, и введите параметры, в том числе капиллярное напряжение (3,0 кВ для отрицательной моды), температуру капилляра (350 °C), расход газа оболочки (N2) расход (35 условных единиц), расход вспомогательного газа (N2) расход (15 условных единиц)), путем полного сканирования на основе молекулярной массы PS (работает от m/z 100-1,500). Нажмите на кнопку «Применить», чтобы активировать источник ионов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подождите не менее 8 часов, чтобы обеспечить достаточную степень вакуума для экспериментальных условий. Перед анализом убедитесь, что давление газа аргона и азота достаточно высокое.
  2. Предварительный прогон LC
    1. Приготовьте подвижную фазу А, смешав 0,1% муравьиной кислоты с водой, и используйте ацетонитрил для подвижной фазы В (см. Таблицу материалов). Дегазируйте обе фазы в ультразвуковой ванне в течение 15 минут для удаления растворенных газов. Затем подключите подвижную фазу A к соответствующему проходу жидкости и проделайте то же самое с подвижной фазой B. Наконец, смешайте раствор метанола и воды в соотношении 1:9 в для очистки жидкости и вручную заполните бутылки насоса и инжектора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Частота ультразвукового ультразвукового аппарата для ванны составляет 40 кГц.
  3. Установление метода LC
    1. Нажмите кнопку «Настройка инструмента», чтобы получить доступ к окну редактирования метода.
    2. Нажмите кнопку "Создать", чтобы начать создание нового метода инструмента LC-MS.
    3. Задайте общее время выполнения для метода LC. Затем введите необходимые значения для предела давления, общего расхода, градиента потока, температуры образца, температуры колонки и готовой температурной дельты в окне редактирования метода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки метода прибора ЖХ-МС подбираются в зависимости от исследуемого аналита и типа используемой колонки жидкостной хроматографии. Для получения оптимальных результатов используйте расход 0,3 мл/мин при поддержании температуры 40 °C в колонке BEH C18 (см. Таблицу материалов). Градиентное элюирование настраивается следующим образом: начинайте с 10% В, линейно увеличивая до 30% В в течение 8 мин, затем до 45% В от 8 до 16 мин, до 50% В от 16 до 24 мин и до 70% В от 24 до 30 мин. Сразу после этого верните градиент к исходному состоянию 10% B в течение 0,1 минуты, удерживая его там еще 2,9 минуты. Для каждого анализа вводите образец объемом 5 мкл. Настройки метода прибора ЖХ-МС зависят от конкретного анализируемого вещества и типа используемой колонки жидкостной хроматографии21.
  4. Приобретение MS
    1. На вкладке Параметры выберите тип эксперимента Общий MS или MSn для конфигурации метода MS. Введите необходимые значения для настройки времени регистрации, полярности (положительной или отрицательной), диапазона масс, номера отводящего клапана и длительности отводного клапана. После ввода этих данных нажмите на кнопку «Сохранить», чтобы завершить и сохранить эти настройки в качестве метода инструмента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки по умолчанию без столбца хроматографии следующие: время сбора, 2 мин; полярность, положительная или отрицательная; диапазон масс, от 100 до 1 500.
  5. Выполнение многоступенчатой масс-спектрометрии по традиционным методам.
    1. Всегда используйте режим сбора данных в зависимости от данных (DDA) для сбора данных в многоступенчатой масс-спектрометрии. В режиме DDA масс-спектрометр идентифицирует пять наиболее интенсивных ионов во время каждого сканирования на первом этапе тандемной МС, которые впоследствии фрагментируются и исследуются на втором этапе тандемной масс-спектрометрии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Собранные данные MS и MS/MS могут быть использованы для последующего анализа и поиска в базе данных.

5. Ручной сбор, анализ и расчет данных

  1. Сбор и анализ данных
    1. Дважды щелкните по необработанным файлам, чтобы открыть все масс-спектры из MS. Вручную рассчитайте значения разницы m/z между ионом и соответствующими ионами фрагмента.
    2. Импортируйте файлы исходных данных контрольных и образцовых обработок и заготовок в программное обеспечение для масс-спектрометрического анализа для идентификации PS путем точного расчета массы и фрагментов PS.
      Примечание: PS VII и PS II идентифицируются путем сравнения сроков хранения и элюирования аутентичных стандартных решений. LC-MS обнаруживает ряд небольших пиков в положениях пиков молекулярных ионов. Соотношение пиков изотопных ионов каждого ряда является постоянным. Когда даются экзогенные изотопы 13С, общее содержание 13С в растении увеличивается, а соотношения ряда изотопных ионных пиков вторичных метаболитов растений изменяются. Максимальный допуск погрешности массы установлен на уровне 5 ppm.
    3. Отсканируйте диапазон масс m/z 500-1,500, чтобы определить основной пик. Определите точную молекулярную массу с точностью до 4 знаков после запятой, в соответствии с точной молекулярной массой и временем удержания целевой молекулы. Поиск пиковой площади потока ионов серийных изотопов и получение значений для M−, (M+1) −, (M+2) −, (M+3) − и (M+4) −. Когда подвижная фаза содержит муравьиную кислоту, к отрицательным ионам также относятся (M+COOH) −, (M+COOH+1) −, (M+COOH+2) −, (M+COOH+3) − и (M+COOH+4) −.
      Примечание: Выбор пиков в диапазоне масс m/z 500-1500 повышает точность идентификации пиков молекулярных ионов для PS VII и PS II. Например, масс-спектр отрицательных ионов PS VII (C51H82O21, 1030.5349) в основном ионизируется ионами COOH− в смеси муравьиной кислоты и воды. Наблюдаемые серийные изотопные ионы включают 1029,53−, 1030,54−, 1031,54−, 1032,55−, 1033,55−, а также простираются до 1079,56−.
  2. Расчет данных
    1. Чтобы уменьшить влияние естественной распространенности 13°C, рассчитайте отношения меченых и немеченых ионных токов для каждого органа при различных обработках, уделяя особое внимание соотношениям (M+1)−/ M−, (M+2)−/M−, (M+3)−/ M− и (M+4)−/ M−. Чтобы дифференцировать меченые и встречающиеся в природе изотопы для точной оценки включения 13C, рассчитайте эти отношения для n = 1, 2, 3, 4 с помощью уравнения (1).
      Отношение = А (М+2) −/ АМ− (1)
      PS: (M+2) − включают (M+2+COOH) − и (M+2) −; M− включают (M+COOH) - и M−.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь M− относится к объединенным пиковым областям ионных токов для (M+COOH) − и M −, в первую очередь ионизированных COOH− в воде с муравьиной кислотой. A представляет собой область пика. Например, формулы для расчета коэффициентов PS VII проиллюстрированы следующим образом:
      Передаточное число+1= (A1030.54+A1076.55)/(A1029.53+A1075.55)
      Передаточное число+2= (A1031.54+A1077.55)/(A1029.53+A1075.55)
      Соотношение+3= (A1032.55+A1078.56)/(A1029.53+A1075.55)
      Соотношение+4= (A1033.55+A1079.56)/(A1029.53+A1075.55)

Результаты

Чтобы подтвердить, что поступление 13С-6-глюкозы в корневища было успешным, мы дополнительно проанализировали соотношения изотопов 13С/12С в корневищах. Соотношение изотопов 13C/12C в Обработке 3 и 4 было намного выше, чем в Обработке 2 (Рисунок 1A). Результаты показали, что 13С6-глюкоза из лечения 3 и 4 попала в корневища при проглатывании.

Отношения пиков изотопов 13C, таких как (M+1) −/M−, (M+2) −/M−, (M+3) −/M− и (M+4) −/M−, обычно остаются постоянными. Соединения, меченные экзогенно добавленным 13С, имеют ту же молекулярную структуру, аналогичную молекулярную массу, физико-химические свойства и время удержания, что и их немеченные аналоги. Однако, когда эти меченые соединения были проанализированы с помощью масс-спектрометрии, отношения их изотопного ионного пика изменились. В нашем исследовании мы использовали LC-MS для обнаружения PS VII и PS II в четырех различных органах PPY при различных методах лечения (рис. 3). По сравнению с обработкой 1, результаты показали значительное увеличение соотношения PS VII (M+2)-/M− в листьях PPY, обработанных экзогенным 13C (рис. 3B). В частности, в обработке 2, где листья PPY опрыскивали 13C 6-глюкозой, был синтезирован PS VII, помеченный двумя атомами 13C. Тем не менее, в обработке 4 соотношение молекул PS VII (M+2) −/M− в листьях не имело существенной разницы между корневищем и обработкой без питания, а соотношение молекул PS VII (M+1) −/M−, (M+3) −/M−, (M+4) −/M− в стебле, корневище и корне во всех четырех обработках не показало существенных различий (рисунок 3A, С,Г). Кроме того, соотношение молекул PS II (M+2) −/M− медленно увеличивалось при лечении 2 (рисунок 3F). Не было выявлено заметных различий в соотношении молекул PS II (M+1) −/M− и (M+4) −/M− в листьях между обработками 1 и 2 (рис. 3E, H), в то время как соотношение молекул PS II (M+3) −/M− показало заметное уменьшение количества листьев в обработке 2 по сравнению с обработкой 1 (рис. 3G). Эти результаты свидетельствуют о том, что синтез PS VII действительно происходит в листьях, обработанных 13C6-глюкозой, что согласуется с известным путем биосинтеза PS.

Наш подход предполагает, что лист является первичным органом для синтеза PS VII при PPY, в отличие от синтеза PS II. Примечательно, что меченый 13C PS VII отсутствовал в корневище после обработки листьев 13C 6-глюкозой, что подразумевает медленный транспорт PS VII из листьев в корневища. Напротив, меченный 13С-меченным PS II был обнаружен в корневище после лечения ствол-сосудистый пучок и мечение корневища, что указывает на возможный синтез корневища на этой стадии и требует дальнейшего изучения мест синтеза PS II. Обнаружение исключительного соотношения (M+2) −/M− для молекул PS VII в листьях согласуется с метаболической судьбой 13C6-глюкозы; после абсорбции он метаболизируется с помощью гликолиза с образованием ацетил-КоА с двумя изотопами 13С. Рассматривая PS как изопреноидное соединение, его биосинтез из ацетил-КоА происходит либо по пути мевалоновой кислоты (MVA), либо по пути 2-C-метил-D-эритритол-4-фосфата (MEP) (рис. 4), что приводит к образованию (M+2) −/M− PS VII. Таким образом, в нашем исследовании лист является определяющим органом для синтеза PS VII в PPY.

figure-results-1
Соотношение изотопов 13С/12С в корневищах четырех обработок. (А) Соотношение изотопов 13С/12С в корневищах Обработок 4 и 3 было намного выше, чем в Обработках 1 и 2, что указывает на то, что 13С/6-глюкоза в значительной степени проникла в корневища через питание корнями. Каждый столбец представляет среднее значение (± SE) трех реплик. Буквы в столбцах означают значительно различающееся соотношение изотопа 13С/12С в четырех обработках (p < 0,05). Сокращение: PS = Парижские сапонины. (B) Масс-спектрометрия высокого разрешения PS VII (C51H82O21, 1030.5349) обнаружила его отрицательный ион с временем удержания 16,83 минуты. Из-за естественной распространенности 13C (с точной молекулярной массой 13,003, по сравнению с 12C при 12,000), ряд изотопных пиков, включая (M-), в основном (M+1)−, (M+2)−, (M+3)− и (M+4)−, появляются в то же время удержания, что и пик молекулярных ионов PS VII M−. Эти пики были в основном обусловлены ионизацией COOH в воде с муравьиной кислотой. Увеличенная гистограмма выделяет эти изотопные пики. Были рассчитаны коэффициенты ионных токов (M+1)−/M−, (M+2)−/M−, (M+3)−/M− и (M+4)−/M−. Анализируя изменения в этих соотношениях, мы могли отслеживать и делать выводы о биосинтезе сапонинов. Здесь M− представляет собой объединенные пиковые площади ионного тока для (M+COOH)- и M−. Рисунок 1B был изменен по Wen et al.24. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Рабочий процесс маркировки 13C6-Glucose и интеграции данных. Рассаду маркировали путем опрыскивания и подкормки 0,2% 13С 6-глюкозой в течение 3 дней; затем экстракты из каждого органа были изотопно проанализированы с помощью LC/MS и GC/IRMS и объединены с пиковой интеграцией и данными для органоспецифичного анализа синтеза PS. (А) Схематическая диаграмма, иллюстрирующая питание глюкозой в различных органах. Обработки 1-4 были непитательными, подавались в лист, стебель-сосудистый пучок и корневище соответственно. (B) Этапы анализа LC-MS экстрагированной жидкости, полученной из высушенной ткани PPY с помощью инструмента для измельчения и продувки азотом. Сокращения: LC/MS = жидкостная хроматография-масс-спектрометрия; PPY = Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Рука. -Мзт.; PS = Парижский сапонин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Отслеживание биосинтеза парижского сапонина VII и парижского сапонина II посредством питания 13C6-глюкозой органов растений. (А-Г) Соотношение молекул PS VII (M+1) −/M−, (M+2) −/M−, (M+3) −/M−, (M+4) −/M− в каждом органе из четырех обработок. Соотношение молекул PS VII (М+2) −/М− значительно увеличилось в листьях Обработки 2 и Обработки 3. В стебле, корне и корневище соотношение молекул PS VII (M+2) −/M− не показало явных различий между четырьмя обработками. (Э-Х) Соотношение молекул PS VII (M+1) −/M−, (M+2) −/M−, (M+3) −/M−, (M+4) −/M− в каждом органе из четырех обработок. По сравнению с обработкой 1, соотношения молекул PS II (М+2) −/М- в листьях не различались при обработке 2. В обработке 2 соотношение молекул PS II (M+1) −/M− и (M+4) −/M− не имеет явных различий в листьях по сравнению с обработкой 1. Соотношение молекул PS II (M+3) -/M− в листьях уменьшилось по сравнению с Лечением 1. Парис сапонин VII, ПС VII. Каждый столбец представляет среднее значение (± SE) трех реплик. «*» указывает на значительную разницу от лечения без кормления (t-критерий при p < 0,01). Сокращение: PS = Парижские сапонины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Описание PS VII, генерируемого экзогенным 13C6-глюкозой, поступающим в путь MVA. Принципиальная диаграмма метаболизма 13C 6-меченного ацетилкоэнзима А с целью получения молекул PS VII (M+2) −/M− по пути MVA. Маркированный углерод показан красным цветом; Немаркированный углерод имеет серый цвет. Под действием гликолиза 13С6-Глюкоза расщепляется до двух молекул ацетилкоэнзима А(М+2)-, который затем генерирует изопентенилпирофосфат и диметилпропенилпирофосфат по пути MVA, а затем генерирует циклический атенол путем каталитической генерации геранилгеранилпирофосфатсинтазы, фарнезилпирофосфатсинтазы, скваленсинтазы, скваленэпоксигеназы, циклоатенолсинтазы циклоартенола, затем окисление, декарбоксилирование, восстановление и другие реакции с получением холестерина, холестерина через ряд ферментов цитохрома Р450, гликозилтрансфераз и фуростаноидной сапонин-26-О-β-глюкозидазы поздней модификации с образованием молекул ПС VII, содержащих два меченых углерода. (М+2) - указывает, что COOH- двух атомов углерода ионизируется в этой точке, и количество меток для двух углеродов может быть получено с помощью (M+2) −/M−. С помощью стандартных протоколов изотопное тело идентифицируется по отдельности и ионные токи разделяются для получения данных маркировки изотопов. Величина M' стабильна. Сокращение: PS = парижские сапонины; PS VII = Парижский сапонин VII; MVA = Мевалонатный путь; GPPS = геранилгеранилпирофосфатсинтаза; FPPS = фарнезилпирофосфатсинтаза; SQS = скваленсинтаза; SQE = сквалэпоксигеназа; CYPs = ферменты цитохрома Р450; UGTs = глюкуроновая трансфераза; F26G = фуростаноидный сапонин 26-O-β-глюкозидаза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Успешная реализация этого протокола зависит от всесторонних исследований физиологических свойств растений, тканей, органов и вторичных метаболитов. Подход к планированию эксперимента, изложенный в протоколе, закладывает прочную основу для исследования путей биосинтеза вторичных метаболитов растений. Решающими факторами в этом эксперименте являются (1) определение возраста многолетних саженцев и (2) выбор правильного времени для мечения изотопов и их обнаружения. Лекарственные растения подразделяются на многолетние и однолетние, каждое из которых имеет различные модели синтеза и накопления вторичных метаболитов. Данный эксперимент направлен на уточнение первичных синтетических органов вторичных метаболитов в лекарственных растениях путем анализа скорости синтеза этих метаболитов. Поэтому важно тщательно выбирать годы и стадии роста, которые соответствуют этим схемам и темпам синтеза.

ППИ является многолетним лекарственным растением, и содержание ПС накапливается год от года. Однако было показано, что скорость синтеза ФС не отличается от таковой у многолетних растений PPY22. В то же время меньший размер 2-летних саженцев по сравнению со старыми способствует гидропонике. Так, в этом исследовании использовались 2-летние саженцы PPY. Это гарантирует, что выбранные растения демонстрируют самую высокую скорость синтеза вторичных метаболитов. Крайне важно признать различия в скорости синтеза и транспортировки вторичных метаболитов у разных видов23. По этим показателям определяется оптимальная продолжительность периода маркировки-детекции. Исследования показывают, что содержание сахара и полистирола в листьях ППИ снижается в течение 3 дней24, что свидетельствует о медленном процессе транспортировки ПС из-за их значительной молекулярной массы, который вряд ли будет завершен в течение этого срока. Продолжительность лечения короче нескольких часов может привести к неадекватному синтезу и трудностям обнаружения меченого PS 5,25. И наоборот, продление лечения более чем на 3 дня может привести к перемещению PS из листьев в корневище, что может исказить экспериментальные результаты. Таким образом, для минимизации вмешательства органов выбирается 3-дневный промежуточный период мечения, особенно для методов распыления листьев и мечения корневища, что обеспечивает более точные экспериментальные результаты.

Предыдущие исследования изотопного мечения Nicotiana tabacum26,27 и Brassica napus28 показали успешное поглощение 13C6-глюкозы и интеграцию в растительные ткани. В нашем исследовании мы сосредоточились на выращенных на гидропонике 2-летних саженцах PPY, применяя обработку 13C6-Glucose для листьев, корневищ и стеблевых сосудистых пучков, наряду с контрольной обработкой без подкормки. Используя обнаружение LC-MS, мы обнаружили, что на третий день после мечения соотношение 13C/12C в корневищах при лечении стволовым сосудистым пучком и корневищем было значительно выше, чем в контрольной группе, не получавшей питания, что подтверждает эффективную ассимиляцию 13C6-глюкозы и успех нашего подхода к мечению (рис. 2). В нашем исследовании мы одновременно проанализировали четыре типа изотопных ионных пиковых отношений для молекул PS VII и PS II в четырех различных органах PPY: (M+1) −/M−, (M+2) −/M−, (M+3) −/M− и (M+4) −/M−. Важно отметить, что при обработке листьев соотношения молекулы PS VII (M+2) −/M− в листьях были заметно выше, чем при обработке без подкормки. Соотношение молекул PS VII (M+2)−/M− в листьях под корневищем и без обработки без разницы (рис. 3B). Кроме того, по сравнению с обработкой без подкормки, соотношение молекулы парижских сапонинов II (PS II) (M+2) −/M− в листьях при обработке листовой подкормкой не имело существенной разницы, а соотношение молекул PS II (M+3) −/M− в листьях при обработке листовой подкормкой было ниже (рис. 3G). Лечение мечением ствол-сосудистый пучок и корневище показало значительные различия в соотношении молекул PS II (M+1) −/M− и (M+4) −/M− в корневищах по сравнению с лечением без кормления (рис. 3E, H).

При адаптации этого подхода к другим лекарственным растениям крайне важно подбирать маркерные соединения, адаптированные к предшественникам первичных вторичных метаболитов растения, обеспечивая маркерную специфичность. Если целевое соединение в первую очередь синтезируется в стебле, то меченое соединение должно быть способно эффективно транспортироваться в стебель и метаболизироваться в нем. Провести повторную оценку пути синтеза при отсутствии ожидаемых изотопных соотношений, таких как (M+2)-/M− для PS VII, что подтверждает пригодность меченых соединений. Концентрация меченого соединения в питательном растворе может потребовать корректировки для обеспечения адекватного поглощения и интеграции в целевые соединения в пределах желаемого органа. Параметры детектирования ЖХ-МС могут потребовать оптимизации для эффективного обнаружения специфических меченых метаболитов, представляющих интерес. Это может включать в себя корректировку настроек масс-спектрометрии, таких как режим ионизации, для повышения чувствительности и специфичности соединений, уникальных для исследуемых видов растений и органов. Если соотношение 13С/12С не обнаружено в корневищах в результате лечения мечением ствол-сосудистый пучок и корневище, концентрацию 13С-6-глюкозы в питательном растворе Хогланда и продолжительность мечения следует увеличить до тех пор, пока не станет возможным обнаружение. Методы кормления 13С-6-глюкозой и аналитические техники, разработанные в этом исследовании, должны направлять анализ и интерпретацию результатов для идентификации органов синтеза вторичных метаболитов в различных лекарственных растениях.

Лечение листьев, корневищ и стволовых пучков 13C6-Glucose в этом эксперименте обеспечивает большую специфичность в идентификации органов синтеза вторичных метаболитов по сравнению с традиционными методами мечения изотопов углерода. Тем не менее, проблемы остаются. Одним из ключевых ограничений является отсутствие универсальных временных рамок для маркировки и обнаружения, подходящих для всех лекарственных растений. Выбор оптимальных временных рамок повышает эффективность маркировки. Кроме того, использование соотношений для анализа результатов усложняет дифференциацию расположения функциональных групп в больших сложных изомерах. Таким образом, перед применением данной методологии рекомендуется провести тщательный обзор литературы и предварительные эксперименты. Эта стратегия не только обеспечивает точность и эффективность, но и имеет значительные последствия для биологии и фармакологии растений. Интеграция этого метода с спектроскопией ядерного магнитного резонанса, ведущим методом анализа структур органических соединений, позволяет точно идентифицировать места мечения 13C. Этот метод открывает путь к исследованию путей биосинтеза вторичных метаболитов растений, представляя подробный и эффективный подход к определению специфичности органов при синтезе вторичных метаболитов в лекарственных растениях.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа финансировалась Национальным фондом естественных наук Молодежной программы Китая (No 82304670).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,1 % Вода муравьиной кислотыФабрика химических реактивов Chengdu Kelong44890
13C6-глюкозный порошокMERCK110187-42-3
АцетонитрилChengdu Kelong Chemical Reasset Factory44890
AUTOSAMPLER VIALSBiosharp Biotechnology Company44866
BEH C18 колоннаУотерс, Милфор, Массачусетс1,7μ m,2,1 * 100 мм
ультразвуковой очиститель с ЧПУKunshan Ultrasound Instrument Co., LtdKQ-600DE
Compound DiscovererTM  программное обеспечениеThermo Scientific, Fremont,CA3
Compound DiscovererTM  программное обеспечение Thermo Scientific, Fremont, CA3
Электрическая печь для доменной сушки с постоянной температуройDHG-9146A
Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory44955
Полностью автоматический быстрый измельчитель образцовShanghai Jingxin TechnologyTissuelyser-48
Газовая хроматография-Стабильное изотопное соотношение Масс-спектрометрThermo FisherDelta V Advantage
Hoagland solutionSigma-AldrichH2295-1L
Гидропонный резервуарJRD1020421
Программное обеспечение IsodatThermo Fisher Scientific3
жидкостная хроматография, масс-спектрометрия высокого разрешенияAgilent Technology Agilent 1260 -6120 
Прибор для производства азотаPEAK SCIENTIFICGenius SQ 24
Органический фазовый фильтрTianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd44890
Кислородный насосMagic DragonMFL
Квантовый датчикHighpointUPRtek
ScalpelHandkit11-23
Посыпание можетCHUSHIWJ-001
Xcalibur  программное обеспечениеThermo Fisher Scientific4.2
Электронные аналитические весы Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd SOP Ethanol , , ,

Ссылки

  1. Erb, M., Kliebenstein, D. J. Plant secondary metabolites as defenses, regulators, and primary metabolites: The blurred functional trichotomy. Plant Physiol. 184 (1), 39-52 (2020).
  2. Li, Y., Kong, D., Fu, Y., Sussman, M. R., Wu, H. The effect of developmental and environmental factors on secondary metabolites in medicinal plants. Plant Physiol Biochem. 148, 80-89 (2020).
  3. Liu, S., et al. Genetic and molecular dissection of ginseng (panax ginseng mey.) germplasm using high-density genic snp markers, secondary metabolites, and gene expressions. Front Plant Sci. 14, 1165349(2023).
  4. Chen, X., Wang, Y., Zhao, H., Fu, X., Fang, S. Localization and dynamic change of saponins in cyclocarya paliurus (batal.) iljinskaja. PloS One. 14 (10), e0223421(2019).
  5. Yuan, M., et al. Ex vivo and in vivo stable isotope labelling of central carbon metabolism and related pathways with analysis by lc-ms/ms. Nat Protoc. 14 (2), 313-330 (2019).
  6. Cavalli, F. M. G., Bourgon, R., Vaquerizas, J. M., Luscombe, N. M. Specond: A method to detect condition-specific gene expression. Genome Biol. 12 (10), 101(2011).
  7. Epron, D., et al. Pulse-labelling trees to study carbon allocation dynamics: A review of methods, current knowledge and future prospects. Tree Physiology. 32 (6), 776-798 (2012).
  8. Varman, A. M., He, L., You, L., Hollinshead, W., Tang, Y. J. Elucidation of intrinsic biosynthesis yields using 13c-based metabolism analysis. Microb Cell Fact. 13 (1), 42(2014).
  9. Meng-Meng, G., Zhen-Yu, Z., Yu, Z., Qiu-Lin, Y., Ying, W. Systematic extraction and stable isotope determination of different biomarkers from single leaf of reticulate vein plants. Journal of Shaanxi University of Science & Technology. 41 (01), 72-79 (2023).
  10. Zhang, H., et al. A convenient lc-ms method for assessment of glucose kinetics in vivo with d-[13c6]glucose as a tracer. Clin Chem. 55 (3), 527-532 (2009).
  11. Chassy, A. W., Adams, D. O., Waterhouse, A. L. Tracing phenolic metabolism in vitis vinifera berries with 13c6-phenylalanine: Implication of an unidentified intermediate reservoir. J Agric Food Chem. 62 (11), 2321-2326 (2014).
  12. Lozac'h, F., et al. Evaluation of cams for 14c microtracer adme studies: Opportunities to change the current drug development paradigm. Bioanalysis. 10 (5), 321-339 (2018).
  13. Sulyok, M., Stadler, D., Steiner, D., Krska, R. Validation of an lc-ms/ms-based dilute-and-shoot approach for the quantification of > 500 mycotoxins and other secondary metabolites in food crops: Challenges and solutions. Anal Bioanal Chem. 412 (11), 2607-2620 (2020).
  14. Serra, F., et al. Inter-laboratory comparison of elemental analysis and gas chromatography combustion isotope ratio mass spectrometry (gc-c-irms). Part i: Delta13c measurements of selected compounds for the development of an isotopic grob-test. J Mass Spectrom. 42 (3), 361-369 (2007).
  15. Jung, J. -Y., Oh, M. -K. Isotope labeling pattern study of central carbon metabolites using gc/ms. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 101-108 (2015).
  16. Ding, Y. G., et al. The traditional uses, phytochemistry, and pharmacological properties of paris l. (liliaceae): A review. J Ethnopharmacol. 278, 114293(2021).
  17. Cunningham, A. B., et al. Paris in the spring: A review of the trade, conservation and opportunities in the shift from wild harvest to cultivation of paris polyphylla (trilliaceae). J Ethnopharmacol. 222, 208-216 (2018).
  18. Madikizela, L. M., Ncube, S., Chimuka, L. Uptake of pharmaceuticals by plants grown under hydroponic conditions and natural occurring plant species: A review. Sci Total Environ. 636, 477-486 (2018).
  19. Tagami, K., Uchida, S. Online stable carbon isotope ratio measurement in formic acid, acetic acid, methanol and ethanol in water by high performance liquid chromatography-isotope ratio mass spectrometry. Anal Chim Acta. 614 (2), 165-172 (2008).
  20. Li, Y., et al. The combination of red and blue light increases the biomass and steroidal saponin contents of paris polyphylla var. Yunnanensis. Ind Crops Prod. 194, 116311(2023).
  21. Wang, G., et al. Tissue distribution, metabolism and absorption of rhizoma paridis saponins in the rats. J Ethnopharmacoly. 273, 114038(2021).
  22. Peng, S., et al. Progress in the study of differences in the types and contents of steroidal saponins in paris. Polyphylla smith var. Chinensis (franch.) hara. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 24 (05), 2014-2025 (2022).
  23. Alami, M. M., et al. The current developments in medicinal plant genomics enabled the diversification of secondary metabolites' biosynthesis. Int J Mol Sci. 23 (24), 15932(2022).
  24. Wen, F., et al. The synthesis of paris saponin vii mainly occurs in leaves and is promoted by light intensity. Front Plant Sci. 14, 1199215(2023).
  25. Siadjeu, C., Pucker, B. Medicinal plant genomics. BMC Genomics. 24 (1), 429(2023).
  26. Tian, C., et al. Top-down phenomics of arabidopsis thaliana: Metabolic profiling by one- and two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy and transcriptome analysis of albino mutants. J Biol Chem. 282 (25), 18532-18541 (2007).
  27. Masakapalli, S. K., et al. Metabolic flux phenotype of tobacco hairy roots engineered for increased geraniol production. Phytochemistry. 99, 73-85 (2014).
  28. Schwender, J., Ohlrogge, J. B., Shachar-Hill, Y. A flux model of glycolysis and the oxidative pentosephosphate pathway in developing brassica napus embryos. J Biol Chem. 278 (32), 29442-29453 (2003).

Перепечатки и разрешения

Теги

13МечениеC6-глюкозы, ассоциированное с LC-MS: идентификация первичных органов растений в синтезе вторичных метаболитов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.