Очистка и характеристика внеклеточных везикул из мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека

Краткое содержание

Этот протокол описывает все процедуры, от культивирования мезенхимальных стволовых клеток (ADSC) человека, полученных из жировой ткани, и сбора надосадочной жидкости до экстракции внеклеточных везикул (ВВ) с помощью ультрацентрифугирования.

Аннотация

Мезенхимальные стволовые клетки (ADSC) человека, полученные из жировой ткани, могут способствовать регенерации и реконструкции различных тканей и органов. Недавние исследования показывают, что их регенеративная функция может быть связана с межклеточным контактом и клеточными паракринными эффектами. Паракринный эффект является важным способом взаимодействия клеток и передачи информации на короткие расстояния, в которых внеклеточные везикулы (ВВ) играют функциональную роль в качестве носителей. Существует значительный потенциал для ADSC EV в регенеративной медицине. В многочисленных исследованиях сообщалось об эффективности этих методов. В настоящее время описываются различные методы экстракции и изоляции ВВ, основанные на таких принципах, как центрифугирование, осаждение, размер молекул, аффинность и микрофлюидика. Ультрацентрифугирование считается золотым стандартом для изоляции электромобилей. Тем не менее, тщательный протокол, подчеркивающий меры предосторожности во время ультрацентрифугирования, до сих пор отсутствует. В этом исследовании представлена методология и важнейшие этапы, связанные с культивированием ADSC, сбором надосадочной жидкости и ультрацентрифугированием EV. Однако, несмотря на то, что ультрацентрифугирование является экономически эффективным и не требует дополнительной обработки, все же есть некоторые неизбежные недостатки, такие как низкая скорость восстановления и агрегация EV.

Введение

Большинство ADSC получают из жировой ткани и, как было продемонстрировано, способствуют регенерации и реконструкции различных тканей и органов, включая миокард, кости и кожу¹. Недавние исследования показывают, что регенеративная функция ADSC может быть обусловлена межклеточным контактом и паракринными эффектами^{клеток.} Паракринный эффект является важным средством взаимодействия клеток и передачи информации на короткие расстояния, и эта функция достигается за счет внеклеточных везикул (ВВ).

ВВ представляют собой двухслойные мембранные структуры, производимые клетками, диаметром от 40 нм до 160 нм (в среднем около 100 нм). Они влияют на различные клеточные функции, такие как выработка цитокинов, пролиферация клеток, апоптоз и метаболизм ^3,4. Были проведены многочисленные исследования функций ADSC EVs, включая содействие регенерации костной ткани, регенерации слизистой оболочки полости рта, выживаемость жировой ткани после трансплантации тканей и восстановление кожных ран 5,6,7,8. Огромный потенциал электромобилей ADSC в регенеративной медицине очевиден. Существуют различные методы экстракции и отделения ВВ из надосадочной жидкости, такие как методы, основанные на центрифугировании, осаждении, размере молекул, аффинности и микрофлюидике. Метод ультрацентрифугирования считается золотым стандартом для изоляции электромобилей⁹. Фундаментальный принцип ультрацентрифугирования для разделения EV основан на том, что частицы в образце имеют различные коэффициенты осаждения, что приводит к их осаждению и агрегации в отдельных разделительных слоях. Тем не менее, подробный протокол, подчеркивающий меры предосторожности во время ультрацентрифугирования, еще не разработан.

Таким образом, в данном исследовании объективно излагаются культура ADSC, сбор надосадочной жидкости и процедуры ультрацентрифугирования ВВ, а также ключевые моменты с логическим потоком информации и четким, формальным языком. Это дает ценный ориентир для будущих экспериментов.

Протокол

Обзор этапов протокола показан на рисунке 1. Подробная информация о реактивах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка СМИ

1. Готовят питательную среду для АДСК без экзосом, используя 450 мл базальной питательной среды, 50 мл фетальной бычьей сыворотки без экзосом и 5 мл тройных антибиотиков.

2. Реанимация и культивирование ADSC

ПРИМЕЧАНИЕ: Реанимируйте ADSC.

1. Предварительно включите ультрафиолетовое излучение ультрачистого стола и продезинфицируйте его в течение 30 минут.
2. Предварительно разогрейте среду на водяной бане при температуре 37 °C.
3. Извлеките 2 пробирки с замороженными ADSC (P3) из жидкого азота и перемешайте их на водяной бане при температуре 37 °C при постоянной температуре до полного оттаивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отверстие трубки морозильной камеры не должно соприкасаться с водой, чтобы предотвратить загрязнение.
4. Продезинфицируйте пробирку для криоконсервации с помощью 75% спирта, а затем переместите ее на ультрачистый стол. Аспирируйте клеточную суспензию с помощью пипетки и поместите ее в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
5. Поместите пробирку центрифуги в низкоскоростную центрифугу и центрифугируйте при температуре 250 x g в течение 5 минут при температуре 4 °C.
6. Приготовьте четыре посуды для культуры по 10 см и положите в каждую посуду по 9 мл среды. Отметьте название, тип ячейки, поколение и дату эксперимента, а затем разогрейте их в термостатическом инкубаторе с температурой 37 °C.
7. Продезинфицируйте пробирку центрифуги и переместите ее на ультрачистый стол. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
8. Добавьте 4 мл среды и аккуратно перемешайте раствор (1 x 10⁵ клеток/мл) до его равномерного диспергирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не удалить клеточную гранулу при экстракции надосадочной жидкости.
9. Добавьте по 1 мл клеточной суспензии в каждую посуду. Встряхивайте посуду крестообразным методом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Расположите тарелку на ровной поверхности и перемешивайте ее крестообразно (перемещая вверх, вниз, влево и вправо) в течение 5-6 повторений. Избегайте круговых движений, так как они могут привести к скоплению клеток в центре.
10. Понаблюдайте за клетками при 40-кратном увеличении с помощью оптического микроскопа, а затем поместите чашки в инкубатор.
    Примечание: Основная цель наблюдения за клетками состоит в том, чтобы определить, равномерно ли они распределены, так как неравномерное распределение повлияет на последующий рост.
11. Приготовьте обменную среду для клеток.
    1. Предварительно включите ультрафиолетовое излучение ультрачистого стола и продезинфицируйте его в течение 30 минут.
    2. Предварительно разогрейте среду на водяной бане при температуре 37 °C.
    3. Наблюдайте за состоянием клеток под оптическим микроскопом при 40-кратном увеличении. Уровень слияния составляет примерно 50%.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень слияния рассчитывается как отношение площади, занимаемой клетками, к площади поверхности чашки Петри после того, как клетки прилипают к стенке и полностью растягиваются.
    4. После дезинфекции перенесите чашку для культивирования на ультрачистый стол (уровень биобезопасности 2) и удалите среду.
    5. Тщательно промойте каждую чашку для культуры дважды 2 мл раствора PBS.
    6. Добавьте по 10 мл медиума в каждую посуду. Перенесите посуду в инкубатор.

3. Сбор надосадочной жидкости ADSC и извлечение EV

1. Предварительно включите ультрафиолетовое излучение ультрачистого стола и продезинфицируйте его в течение 30 минут.
2. Наблюдайте за состоянием клеток под микроскопом. Уровень слияния составляет примерно 80%.
3. После дезинфекции переложите блюдо на ультрачистый стол. Осторожно соберите надосадочную жидкость с помощью пипетки и поместите ее в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть как заморожены, так и выброшены. Если стерильность не требуется, на операционном столе можно выполнить следующие действия. На этом этапе эксперимент можно приостановить, а затем возобновить позже. Если эксперимент остановлен, храните надосадочную жидкость в холодильнике при температуре 4 °C не более одной недели. Длительное хранение не рекомендуется, так как это может повлиять на активность электромобилей. Оптимальный подход — немедленно извлекать электромобили.
4. Центрифуга (300 г , 10 мин, при комнатной температуре) для удаления взвешенных клеток. Соберите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не наливайте. Оставьте немного надосадочной жидкости, чтобы гранула не всасывалась.
5. Центрифуга для удаления клеточного мусора (2000 x g, 10 мин, 4 °C), затем продолжайте сбор надосадочной жидкости с помощью пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ключевые моменты те же, что и в шаге 3.4.
6. Фильтруйте надосадочную жидкость с мембраной 0,22 мкм, чтобы удалить крупные частицы и клеточный мусор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью 2 мл стерильного PBS, чтобы увлажнить фильтрующую мембрану перед фильтрацией.
7. Центрифуга в ультрацентрифуге (10 000 x g, 30 мин, 4 °C).
8. Затем центрифугируйте при 1 00 000 x g в течение 70 минут при 4 °C, чтобы удалить гранулу и собрать надосадочную жидкость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полученные EV многократно очищали центрифугированием для повышения их чистоты. Гранула может быть не видна невооруженным глазом. Поэтому очень важно работать с пипеткой осторожно и оставлять немного надосадочной жидкости на дне, чтобы избежать скопления гранул.
9. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки. Суспендируйте гранулу с помощью PBS и центрифуги (1 00 000 x g, 70 мин, 4 °C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула может быть не видна невооруженным глазом. Поэтому при аспирации надосадочной жидкости с помощью пипетки крайне важно аккуратно и тщательно удалить надосадочную жидкость, чтобы максимизировать чистоту ВВ.
10. Удалите надосадочную жидкость и получите гранулу EVs. Повторно суспендируйте его с 1 мл PBS, переложите в центрифужную пробирку объемом 1 мл и храните в холодильнике при температуре 4 °C для последующего обнаружения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула может быть не видна невооруженным глазом. Следовательно, при отсасывании надосадочной жидкости с помощью пипетки крайне важно аккуратно и тщательно удалить надосадочную жидкость, чтобы максимизировать чистоту электромобилей. Если образцы не нужны в течение длительного периода времени, храните их в холодильнике при температуре -80 °C.

Результаты

Во-первых, были охарактеризованы и идентифицированы ADSC, включая их морфологию¹⁰ и поверхностные антитела. Исходя из рисунка 2А, видно, что ADSC расположены в форме веретена и образуют вихрь после плотного роста. Культивируемые клетки дифференцировали в адипогенные, остеогенные и хондрогенные клетки и окрашивали Oil Red O, Alizarin Red и Alcian Blue¹¹. Эксперимент по индуцированной дифференцировке и проточная цитометрия подтвердили, что они действительно являются ADSC с потенциалом для многонаправленной дифференцировки. Тем не менее, 22% клеток являются CD45-положительными в результатах, что не повлияет на вывод, поскольку достаточное количество положительных и отрицательных антител поддерживает его (рис. 2A, B).

Далее, важное значение имеет идентификация извлеченных электромобилей. В основном он включает в себя три аспекта: морфологию, размер частиц и маркерные белки. Результаты ПЭМ ясно показывают чашеобразную структуру EV с двухслойной мембраной¹² (фиг.3А). NTA указывает, что EV имеют распределение частиц по размерам около 50-150 нм с концентрацией примерно 1,6 x¹⁰ частиц/мл (рис. 3B). Анализ вестерн-блоттинга также показывает, что маркерные белки ВВ, включая CD9, CD63 и TSG101¹³, экспрессируются плавно (рис. 3C).

Рисунок 1: Обзор этапов протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Определение характеристик ADSC. (A) Морфология ADSC веретенообразная. ADSC культивировали в среде для адипогенной, остеогенной и хондрогенной дифференцировки соответственно. Адипогенная дифференциация была выявлена по окрашиванию Oil Red O. Остеогенная и хондрогенная дифференциация была подтверждена окрашиванием Ализариновым красным и Альцианским синим окрашиванием соответственно. Масштабная линейка: 100 мкм. (B) Анализ проточной цитометрии ADSCs на поверхностные маркеры МСК (CD90, CD105, CD29 и CD73) и маркеры гемопоэтических клеток (CD31, CD34, CD45 и HLA-DR). Стратегия стробирования: сначала обведите пустую группу. Исходя из этого, обведите CD90, CD105, CD29, CD73, CD31, CD34, CD45 и HLA-DR последовательно в соответствии с мечеными антителами каждой группы. Этот рисунок адаптирован из Han, Y. D. et ^al.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Характеристика ВВ. (A) Результаты ПЭМ ясно показывают чашеобразную структуру ЭВ двухслойной мембраны. Масштабная линейка: 200 нм. (B) NTA указывает, что EV имеют распределение частиц по размерам около 50-150 нм с концентрацией примерно 1,6 x^{10 10} частиц/мл. (C) Обнаружение экспрессии TSG101, CD9 и CD63 в экзосомах методом вестерн-блоттинга. Этот рисунок адаптирован из Han, Y. D. et ^al.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

В ходе формального экспериментального процесса несколько моментов имеют решающее значение для достижения наилучших экспериментальных результатов. Исходя из нашего предыдущего опыта, рекомендуется выбирать 3-6 ADSC, так как они обеспечивают наилучшее возможное состояние клеток. До P3 эритроциты, эндотелиальные клетки и другие различные клетки могли не быть отсеяны. После P6 клетки могут постепенно стареть, что может повлиять на состояние секретируемых ВВ. Во-вторых, надосадочная жидкость должна быть собрана, когда степень слияния клеток составляет от 80% до 90%, чтобы обеспечить достаточную секрецию как можно большего количества ВВ. Чтобы поддерживать максимальную чистоту электромобилей, исследователи должны быть осторожны во время первых трех центрифугирования и следить за тем, чтобы не осталось жидких остатков, чтобы предотвратить всасывание примесей и гранул. Во время последних двух центрифугий убедитесь, что надосадочная жидкость полностью удалена, защищая при этом гранулу.

Ультрацентрифугирование является экономически эффективным и не требует дополнительной обработки. Этот метод широко использовался в исследованиях ЭВ и продемонстрировал удовлетворительную эффективность при получении ВВ, что было подтверждено экспериментами по характеризации. Тем не менее, есть и некоторые неизбежные недостатки. Во-первых, скорость восстановления электромобилей низкая. Во-вторых, электромобили иногда имеют тенденцию агрегировать. Кроме того, неклеточные компоненты могут быть изолированы, и некоторые электромобили могут разрываться во время процесса, что приводит к накоплению мусора 14,15,16. Чтобы устранить эти дефекты, большинство исследований сосредоточено на очистке электромобилей^12,13. Тем не менее, этот протокол охватывает весь процесс от культивирования клеток до очистки экзосом, поскольку мы считаем, что весь процесс влияет на статус и чистоту конечных экстрагированных EV. Очень важно придерживаться вышеупомянутых рекомендаций во время работы. Кроме того, сбор большего количества надосадочной жидкости и внедрение 3D-культуры клеток может быть полезным, поскольку многочисленные исследования показали, что 3D-культура более эффективна в стимуляции секреции EV по сравнению с 2D-культурой^17,18.

В этом протоколе описывается процесс извлечения электромобилей из ADSC с помощью ультрацентрифугирования. Он дает практическое руководство и позволяет экспериментаторам максимально избегать деталей во время операции. Таким образом, протокол помогает экспериментаторам улучшить качество образцов и служит напоминанием о том, что мы должны не только сосредоточиться на деталях каждого этапа, но и рассматривать эксперимент в целом.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Игольчатый фильтр Acrodisc мембраны Supor	Acros Organics	4652	0.22 μ m
Базальная среда для клеточных культур	OriCell	BHDM-03011
Фетальная бычья сыворотка без EXO + Культуральная добавка (для мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека)	OriCell	HUXMD-05002
Инвертированный микроскоп	OLYMPUS	LX70-S8F2
Низкоскоростная центрифуга	Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co., Ltd.	SC-3612
Normocin	InvivoGen	ant-nr-05
Optima Max-XP настольная ультрацентрифуга	Beckman Coulter	393315
раствором пенициллин-стрептомицин-гентамицин (100x)	Solarbio	P1410