Этот протокол описывает все процедуры, от культивирования мезенхимальных стволовых клеток (ADSC) человека, полученных из жировой ткани, и сбора надосадочной жидкости до экстракции внеклеточных везикул (ВВ) с помощью ультрацентрифугирования.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Очистка и характеристика внеклеточных везикул из мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани человека
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мезенхимальные стволовые клетки (ADSC) человека, полученные из жировой ткани, могут способствовать регенерации и реконструкции различных тканей и органов. Недавние исследования показывают, что их регенеративная функция может быть связана с межклеточным контактом и клеточными паракринными эффектами. Паракринный эффект является важным способом взаимодействия клеток и передачи информации на короткие расстояния, в которых внеклеточные везикулы (ВВ) играют функциональную роль в качестве носителей. Существует значительный потенциал для ADSC EV в регенеративной медицине. В многочисленных исследованиях сообщалось об эффективности этих методов. В настоящее время описываются различные методы экстракции и изоляции ВВ, основанные на таких принципах, как центрифугирование, осаждение, размер молекул, аффинность и микрофлюидика. Ультрацентрифугирование считается золотым стандартом для изоляции электромобилей. Тем не менее, тщательный протокол, подчеркивающий меры предосторожности во время ультрацентрифугирования, до сих пор отсутствует. В этом исследовании представлена методология и важнейшие этапы, связанные с культивированием ADSC, сбором надосадочной жидкости и ультрацентрифугированием EV. Однако, несмотря на то, что ультрацентрифугирование является экономически эффективным и не требует дополнительной обработки, все же есть некоторые неизбежные недостатки, такие как низкая скорость восстановления и агрегация EV.
Введение
Большинство ADSC получают из жировой ткани и, как было продемонстрировано, способствуют регенерации и реконструкции различных тканей и органов, включая миокард, кости и кожу1. Недавние исследования показывают, что регенеративная функция ADSC может быть обусловлена межклеточным контактом и паракринными эффектамиклеток. Паракринный эффект является важным средством взаимодействия клеток и передачи информации на короткие расстояния, и эта функция достигается за счет внеклеточных везикул (ВВ).
ВВ представляют собой двухслойные мембранные структуры, производимые клетками, диаметром от 40 нм до 160 нм (в среднем около 100 нм). Они влияют на различные клеточные функции, такие как выработка цитокинов, пролиферация клеток, апоптоз и метаболизм 3,4. Были проведены многочисленные исследования функций ADSC EVs, включая содействие регенерации костной ткани, регенерации слизистой оболочки полости рта, выживаемость жировой ткани после трансплантации тканей и восстановление кожных ран 5,6,7,8. Огромный потенциал электромобилей ADSC в регенеративной медицине очевиден. Существуют различные методы экстракции и отделения ВВ из надосадочной жидкости, такие как методы, основанные на центрифугировании, осаждении, размере молекул, аффинности и микрофлюидике. Метод ультрацентрифугирования считается золотым стандартом для изоляции электромобилей9. Фундаментальный принцип ультрацентрифугирования для разделения EV основан на том, что частицы в образце имеют различные коэффициенты осаждения, что приводит к их осаждению и агрегации в отдельных разделительных слоях. Тем не менее, подробный протокол, подчеркивающий меры предосторожности во время ультрацентрифугирования, еще не разработан.
Таким образом, в данном исследовании объективно излагаются культура ADSC, сбор надосадочной жидкости и процедуры ультрацентрифугирования ВВ, а также ключевые моменты с логическим потоком информации и четким, формальным языком. Это дает ценный ориентир для будущих экспериментов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Обзор этапов протокола показан на рисунке 1. Подробная информация о реактивах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в Таблице материалов.
1. Подготовка СМИ
- Готовят питательную среду для АДСК без экзосом, используя 450 мл базальной питательной среды, 50 мл фетальной бычьей сыворотки без экзосом и 5 мл тройных антибиотиков.
2. Реанимация и культивирование ADSC
ПРИМЕЧАНИЕ: Реанимируйте ADSC.
- Предварительно включите ультрафиолетовое излучение ультрачистого стола и продезинфицируйте его в течение 30 минут.
- Предварительно разогрейте среду на водяной бане при температуре 37 °C.
- Извлеките 2 пробирки с замороженными ADSC (P3) из жидкого азота и перемешайте их на водяной бане при температуре 37 °C при постоянной температуре до полного оттаивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отверстие трубки морозильной камеры не должно соприкасаться с водой, чтобы предотвратить загрязнение. - Продезинфицируйте пробирку для криоконсервации с помощью 75% спирта, а затем переместите ее на ультрачистый стол. Аспирируйте клеточную суспензию с помощью пипетки и поместите ее в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
- Поместите пробирку центрифуги в низкоскоростную центрифугу и центрифугируйте при температуре 250 x g в течение 5 минут при температуре 4 °C.
- Приготовьте четыре посуды для культуры по 10 см и положите в каждую посуду по 9 мл среды. Отметьте название, тип ячейки, поколение и дату эксперимента, а затем разогрейте их в термостатическом инкубаторе с температурой 37 °C.
- Продезинфицируйте пробирку центрифуги и переместите ее на ультрачистый стол. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
- Добавьте 4 мл среды и аккуратно перемешайте раствор (1 x 105 клеток/мл) до его равномерного диспергирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не удалить клеточную гранулу при экстракции надосадочной жидкости. - Добавьте по 1 мл клеточной суспензии в каждую посуду. Встряхивайте посуду крестообразным методом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Расположите тарелку на ровной поверхности и перемешивайте ее крестообразно (перемещая вверх, вниз, влево и вправо) в течение 5-6 повторений. Избегайте круговых движений, так как они могут привести к скоплению клеток в центре. - Понаблюдайте за клетками при 40-кратном увеличении с помощью оптического микроскопа, а затем поместите чашки в инкубатор.
Примечание: Основная цель наблюдения за клетками состоит в том, чтобы определить, равномерно ли они распределены, так как неравномерное распределение повлияет на последующий рост. - Приготовьте обменную среду для клеток.
- Предварительно включите ультрафиолетовое излучение ультрачистого стола и продезинфицируйте его в течение 30 минут.
- Предварительно разогрейте среду на водяной бане при температуре 37 °C.
- Наблюдайте за состоянием клеток под оптическим микроскопом при 40-кратном увеличении. Уровень слияния составляет примерно 50%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень слияния рассчитывается как отношение площади, занимаемой клетками, к площади поверхности чашки Петри после того, как клетки прилипают к стенке и полностью растягиваются. - После дезинфекции перенесите чашку для культивирования на ультрачистый стол (уровень биобезопасности 2) и удалите среду.
- Тщательно промойте каждую чашку для культуры дважды 2 мл раствора PBS.
- Добавьте по 10 мл медиума в каждую посуду. Перенесите посуду в инкубатор.
3. Сбор надосадочной жидкости ADSC и извлечение EV
- Предварительно включите ультрафиолетовое излучение ультрачистого стола и продезинфицируйте его в течение 30 минут.
- Наблюдайте за состоянием клеток под микроскопом. Уровень слияния составляет примерно 80%.
- После дезинфекции переложите блюдо на ультрачистый стол. Осторожно соберите надосадочную жидкость с помощью пипетки и поместите ее в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть как заморожены, так и выброшены. Если стерильность не требуется, на операционном столе можно выполнить следующие действия. На этом этапе эксперимент можно приостановить, а затем возобновить позже. Если эксперимент остановлен, храните надосадочную жидкость в холодильнике при температуре 4 °C не более одной недели. Длительное хранение не рекомендуется, так как это может повлиять на активность электромобилей. Оптимальный подход — немедленно извлекать электромобили. - Центрифуга (300 г , 10 мин, при комнатной температуре) для удаления взвешенных клеток. Соберите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не наливайте. Оставьте немного надосадочной жидкости, чтобы гранула не всасывалась. - Центрифуга для удаления клеточного мусора (2000 x g, 10 мин, 4 °C), затем продолжайте сбор надосадочной жидкости с помощью пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ключевые моменты те же, что и в шаге 3.4. - Фильтруйте надосадочную жидкость с мембраной 0,22 мкм, чтобы удалить крупные частицы и клеточный мусор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отфильтруйте надосадочную жидкость с помощью 2 мл стерильного PBS, чтобы увлажнить фильтрующую мембрану перед фильтрацией. - Центрифуга в ультрацентрифуге (10 000 x g, 30 мин, 4 °C).
- Затем центрифугируйте при 1 00 000 x g в течение 70 минут при 4 °C, чтобы удалить гранулу и собрать надосадочную жидкость.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полученные EV многократно очищали центрифугированием для повышения их чистоты. Гранула может быть не видна невооруженным глазом. Поэтому очень важно работать с пипеткой осторожно и оставлять немного надосадочной жидкости на дне, чтобы избежать скопления гранул. - Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки. Суспендируйте гранулу с помощью PBS и центрифуги (1 00 000 x g, 70 мин, 4 °C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула может быть не видна невооруженным глазом. Поэтому при аспирации надосадочной жидкости с помощью пипетки крайне важно аккуратно и тщательно удалить надосадочную жидкость, чтобы максимизировать чистоту ВВ. - Удалите надосадочную жидкость и получите гранулу EVs. Повторно суспендируйте его с 1 мл PBS, переложите в центрифужную пробирку объемом 1 мл и храните в холодильнике при температуре 4 °C для последующего обнаружения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула может быть не видна невооруженным глазом. Следовательно, при отсасывании надосадочной жидкости с помощью пипетки крайне важно аккуратно и тщательно удалить надосадочную жидкость, чтобы максимизировать чистоту электромобилей. Если образцы не нужны в течение длительного периода времени, храните их в холодильнике при температуре -80 °C.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Во-первых, были охарактеризованы и идентифицированы ADSC, включая их морфологию10 и поверхностные антитела. Исходя из рисунка 2А, видно, что ADSC расположены в форме веретена и образуют вихрь после плотного роста. Культивируемые клетки дифференцировали в адипогенные, остеогенные и хондрогенные клетки и окрашивали Oil Red O, Alizarin Red и Alcian Blue11. Эксперимент по индуцированной дифференцировке и проточная цитометрия подтвердили, что они де...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В ходе формального экспериментального процесса несколько моментов имеют решающее значение для достижения наилучших экспериментальных результатов. Исходя из нашего предыдущего опыта, рекомендуется выбирать 3-6 ADSC, так как они обеспечивают наилучшее возможное состояние клеток. До P3 эритроциты, эндотелиальные клетки и другие различные клетки могли не быть отсеяны. После P6 клетки могут постепенно стареть, что может повлиять на состояние секретируемых ВВ. Во-вторых, надосадочная жидкость должна быть собрана, когда степень...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют финансового интереса, чтобы заявить об этом.
Благодарности
Эта работа была частично поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (82202473).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Игольчатый фильтр Acrodisc мембраны Supor | Acros Organics | 4652 | 0.22 μ m |
| Базальная среда для клеточных культур | OriCell | BHDM-03011 | |
| Фетальная бычья сыворотка без EXO + Культуральная добавка (для мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека) | OriCell | HUXMD-05002 | |
| Инвертированный микроскоп | OLYMPUS | LX70-S8F2 | |
| Низкоскоростная центрифуга | Anhui USTC Zonkia Scientific Instruments Co., Ltd. | SC-3612 | |
| Normocin | InvivoGen | ant-nr-05 | |
| Optima Max-XP настольная ультрацентрифуга | Beckman Coulter | 393315 | |
| раствором пенициллин-стрептомицин-гентамицин (100x) | Solarbio | P1410 |
Ссылки
- Al-Ghadban, S., Artiles, M., Bunnell, B. A. Adipose stem cells in regenerative medicine: Looking forward. Front Bioeng Biotechnol. 9, 837464(2021).
- Xin, H., Li, Y., Chopp, M. Exosomes/miRNAs as mediating cell-based therapy of stroke. Front Cell Neurosci. 8, 377(2014).
- Li, Q., et al. The tissue origin effect of extracellular vesicles on cartilage and bone regeneration. Acta Biomater. 125, 253-266 (2021).
- Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. Extracellular vesicles from adipose tissue-a potential role in obesity and type 2 diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 8, 202(2017).
- Zheng, Y., et al. Production and biological effects of extracellular vesicles from adipose-derived stem cells were markedly increased by low-intensity ultrasound stimulation for promoting diabetic wound healing). Stem Cell Rev Rep. 19 (3), 784-806 (2023).
- Mou, S., et al. Extracellular vesicles from human adipose-derived stem cells for the improvement of angiogenesis and fat-grafting application. Plast Reconstr Surg. 144 (4), 869-880 (2019).
- Li, W., et al. Tissue-engineered bone immobilized with human adipose stem cells-derived exosomes promotes bone regeneration. ACS Appl Mater Interfaces. 10 (6), 5240-5254 (2018).
- Han, B., et al. Adipose-derived stem cell-derived extracellular vesicles inhibit the fibrosis of fibrotic buccal mucosal fibroblasts via the microRNA-375/foxf1 axis. Stem Cells Int. 2021, 9964159(2021).
- Brezgin, S., et al. Technological aspects of manufacturing and analytical control of biological nanoparticles. Biotechnol Adv. 64, 108122(2023).
- Kim, S. H., et al. Character comparison of abdomen-derived and eyelid-derived mesenchymal stem cells. Cell Prolif. 46 (3), 291-299 (2013).
- Gan, L., et al. Exosomes from adipose-derived mesenchymal stem cells improve liver fibrosis by regulating the miR-20a-5p/TGFBR2 axis to affect the p38 MAPK/NF-κB pathway. Cytokine. 172, 156386(2023).
- Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample preparation and imaging of exosomes by transmission electron microscopy. J Vis Exp. (131), e56482(2018).
- Han, Y. D., et al. Co-transplantation of exosomes derived from hypoxia-preconditioned adipose mesenchymal stem cells promotes neovascularization and graft survival in fat grafting. Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 305-312 (2018).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509(2015).
- Lamparski, H. G., et al. Production and characterization of clinical grade exosomes derived from dendritic cells. J Immunol Methods. 270 (2), 211-226 (2002).
- Baranyai, T., et al. Isolation of exosomes from blood plasma: Qualitative and quantitative comparison of ultracentrifugation and size exclusion chromatography methods. PLoS One. 10 (12), e0145686(2015).
- Yuan, X., et al. Engineering extracellular vesicles by three-dimensional dynamic culture of human mesenchymal stem cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12235(2022).
- Eguchi, T., et al. Organoids with cancer stem cell-like properties secrete exosomes and HSP90 in a 3D nanoenvironment. PLoS One. 13 (2), e0191109(2018).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
