Method Article

Прямая микробная идентификация с помощью автоматизированной системы микробной идентификации для упрощения метода EUCAST RAST без масс-спектрометрии

DOI:

10.3791/66588

⸱

May 24th, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, All India Institute of Medical Sciences, Bhopal, 2Department of Microbiology, All India Institute of Medical Sciences, Bhubaneswar

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Компания EUCAST разработала протокол прямого тестирования чувствительности к противомикробным препаратам (АСТ) для автоматизированного посева крови. Тем не менее, его зависимость от идентификации микроорганизмов на основе масс-спектрометрии может быть устранена путем использования протокола прямой подготовки инокулюма в автоматизированной системе идентификации микроорганизмов. Такой подход позволяет получать отчеты AST в течение 24 часов после сбора пробы.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Грамотрицательный сепсис (ГН) – это неотложная медицинская ситуация, при которой лечение в условиях ограниченных ресурсов основано на традиционных методах микробиологического культивирования, обеспечивающих результаты в течение 3-4 дней. Признавая эту задержку во времени обработки (TAT), EUCAST и CLSI разработали протоколы для определения результатов AST непосредственно из автоматически помеченных флаконов для посева крови (+aBCs). Протокол EUCAST rapid AST (RAST) был впервые представлен в 2018 году, в котором можно сообщить о точках разрыва диаметра зоны для четырех распространенных этиологических агентов сепсиса GN, т.е. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa и комплекса Acinetobacter baumannii . Тем не менее, те клинические лаборатории, которые внедрили этот метод в свой повседневный рабочий процесс, полагаются на микробную идентификацию на основе масс-спектрометрии, которая не всегда доступна, что исключает ее применение в условиях ограниченных ресурсов. Чтобы обойти его, мы оценили протокол прямого инокулята (DIP) с использованием коммерческой автоматизированной системы идентификации микроорганизмов и тестирования чувствительности к противомикробным препаратам (aMIAST), чтобы обеспечить раннюю идентификацию микроорганизмов в течение 8 часов после положительной маркировки aBC. Мы оценили этот протокол с января по октябрь 2023 года, чтобы определить четыре ГН, О КОТОРЫХ МОЖНО БЫЛО БЫ СООБЩИТЬ ПО RAST (RR-GN) в положительно отмеченном aBC. Результаты микробной идентификации в DIP сравнивали со стандартным протоколом приготовления инокулюма (SIP) в aMIAST. Из 204 +aBC с мономорфным GN (+naBC) один из 4 RR-GN был идентифицирован в 105 +naBC с помощью SIP (E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 и комплекс A. baumannii : 26). Из них 94% (98 из 105) были правильно идентифицированы с помощью DIP, в то время как частота серьезных и очень серьезных ошибок составила 6% (7 из 105) и 1,7% (4 из 240) соответственно. Если DIP для идентификации микроорганизмов проводится с использованием метода EUCAST RAST, предварительные клинические отчеты могут быть предоставлены в течение 24 часов после получения образца. Этот подход обладает потенциалом для значительного снижения ТАТ, что позволяет на ранних этапах начать соответствующую антимикробную терапию.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сепсис, важная глобальная проблема здравоохранения, определяется как опасная для жизни дисфункция органов из-за нерегулируемой реакции организма на инфекцию. По оценкам исследования «Глобальное бремя болезней», в 2017 году во всем мире было зарегистрировано 48,9 миллиона случаев сепсиса и 11 миллионов смертей, связанных с сепсисом, что составляет почти 20% всех случаев смерти вмире1. Около 2/3 инфекций кровотока (BSI), вызывающих смертность, вызваны грамрицательными бактериальными патогенами2. Ведущими причинами смертности среди грамотрицательных организмов (ГН) являются Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii, на долю которых приходится около 40% случаев среди 33 бактериальных патогенов2.

Бактериологическое исследование крови остается золотым стандартом для диагностики BSI, а быстрая микробная идентификация наряду с результатами тестирования на чувствительность к противомикробным препаратам (AST) является ключом к лечению. Было подсчитано, что при сепсисе3 вероятность смертности увеличивается на 9% с каждым часом задержки в назначении соответствующих противомикробных препаратов. Время обработки (ТАТ) микробиологически положительных отчетов о посеве крови с результатами АСТ составляет около 48-72 ч при использовании микробиологических инструментов в условиях ограниченных ресурсов, даже при использовании автоматизированных систем. В результате такого некачественного ТАТ противомикробные препараты широкого спектра действия используются эмпирически, что способствует растущей проблеме устойчивости к противомикробным препаратам (УПП). Признавая эту острую необходимость снижения TAT для методов микробиологического культивирования сепсиса, EUCAST и CLSI переходят к проведению AST непосредственно из флаконов с положительной маркировкой для посева крови (+aBC)4,5.

В 2018 году EUCAST впервые представила метод быстрого AST (RAST) для определения AST по дисковому диффузионному методу Кирби-Бауэра при коротком времени инкубации, т.е. 4 ч, 6 ч и 8 ч, непосредственно от +aBC 6,7. В настоящее время метод валидирован для определения АСТ для +aBC, содержащих одну из 8 наиболее распространенных причин BSI, а именно E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa и комплекс A. baumannii среди грамотрицательных и Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E. faecium и Streptococcus pneumoniae среди грамположительных8. Контрольные точки для определения AST в различные временные интервалы приведены в соответствии с перечисленными выше видами микроорганизмов. Следовательно, прежде чем категорически интерпретировать результаты АСТ, необходима микробная идентификация. Однако в стандарте RAST не указан метод, позволяющий проводить идентификацию микроорганизмов в течение этого периода времени.

В большинстве исследований, в которых оценивали метод EUCAST RAST, использовалась микробная идентификация на основе масс-спектрометрии после короткой инкубации на покрытых средах для идентификации микроорганизмов 9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Тем не менее, инструменты масс-спектрометрии не являются широко доступными, особенно в странах с низким и средним уровнем дохода (СНСД), что значительно ограничивает потенциальную полезность этого метода. В немногих исследованиях сообщалось о внедрении этого метода в их центрах без использования масс-спектрометрии 18,19,20. Tayşi et al.18 сообщили о широкой категоризации GN среди Enterobacterales, Pseudomonas и Acinetobacter spp. на основе морфологии окрашивания по Граму и теста оксидазы перед интерпретацией результатов AST. В других исследованиях этого центра, проведенных Gupta et al.19 и Siddiqui et al.20, идентификация микроорганизмов на видовом уровне проводилась путем приготовления бактериальной гранулы из положительно помеченной смеси крови и бульона и ее инокуляции с помощью обычных биохимических тестов. В то время как Tayşi et al.18 не прокомментировали точность идентификации микроорганизмов с помощью своего подхода, Gupta et al.19 сообщили, что при их подходе в 165 из 176 (94%) случаев был зарегистрирован грамотрицательный грамотрицатель (RR-GN), т.е. E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa и A. baumannii сложный. Однако, при последнем подходе, считывание результатов RAST проводилось ретроспективно с использованием пороговых точек диаметра зоны 8 ч только после полной инкубации обычных биохимических результатов, т.е. через 18-24 ч после инокуляции, а среднее время представления отчетности составляло около 2 дней.

Чтобы еще больше сократить TAT клинических отчетов, мы предлагаем альтернативную методологию, позволяющую раннюю идентификацию ГН, присутствующих в +aBC, с помощью aMIAST. До появления систем идентификации микроорганизмов, основанных на масс-спектрометрии, эти автоматизированные системы идентификации считались стандартом для идентификации микроорганизмов, где идентификация обеспечивалась по колориметрическим и/или флуориметрическим изменениям, вызванным тестовыми бактериями при инокулировании в миниатюрных биохимических тестах, помещенных в кассету, и сопоставлении результатов с их базой данных изолятов. Среднее время идентификации в этих системах составляет от 4 до 8 часов, однако они ограничены тем фактом, что производители рекомендуют выращивать микробы в течение ночи, прежде чем их соответствующие идентификационные карты могут быть привиты. Это требование сильно ограничивает их полезность в плане сокращения времени на отчетность.

В немногих исследованиях оценивались методы прямой идентификации микробов из +aBC с использованием этих автоматизированных систем 21,22,23,24,25,26,27. В случае +aBC, содержащих мономорфный GN, большинство исследований показало отличное соответствие между прямым посевом из бактериальных гранул, изготовленных из положительной смеси крови и бульона, и стандартной инкубацией колоний. Однако в случае грамположительных результатов показатели конкордантности были неоптимальными. Поскольку среднее время достижения положительного результата +aBC составляет от 8 до 16 часов, а идентификация GN занимает от ~4 до 8 часов в автоматизированной системе идентификации микроорганизмов, мы предполагаем, что, используя протокол прямой инокуляции в автоматизированной микробной идентификации, мы можем завершить клиническую отчетность +aBC с GN с RR-GN в течение 24 часов после получения образца.

Обстановка для исследования
Настоящее исследование проводилось в клинической бактериологической лаборатории академического института третичной медицинской помощи национального значения (INI) на 950 коек в Центральной Индии с января по октябрь 2023 года. Лаборатория оснащена системой непрерывного мониторинга культуры крови (CBCMS) и aMIAST. Бактериологическая лаборатория функционирует круглосуточно с наличием техников и микробиологов для обработки и составления отчетов о любых флаконах с положительным флаконом для посева крови (+aBCs).

Применяемые здесь микробные методы
Рабочий процесс исследования показан на рисунке 1. +aBC, показывающие мономорфные GN (+naBC), были обработаны путем прямой инокуляции соответствующих идентификационных карт для обеспечения идентификации и AST с использованием протокола EUCAST RAST. Эти результаты сравнивали со стандартным методом лечения (SoC) для +aBCs, т.е. субкультивированием на обычных плоских средах с помощью агара овечьей крови (SBA), шоколадного агара (CA) и агара Мак-Конки (MA), аэробной инкубацией в течение от 16 до 24 часов с последующей идентификацией и выдачей карт AST aMIAST при появлении изолированных колоний. Из исследования были исключены культуры крови, показывающие грамположительные кокки, грамположительные бациллы, почковающиеся дрожжевые клетки и ≥2 различных микроорганизма на исходном окрашивании по Граму или покрытых средах.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование, финансируемое за счет очного исследовательского гранта, предоставленного доктору Аюшу Гупте AIIMS Bhopal, было одобрено Институциональным комитетом по этике человека (IHEC) в письме No: IHEC-LOP/2022/IL072.

ПРИМЕЧАНИЕ: Объем образца 5 мл был использован на основе исследований, проведенных Quesada et al.25 и Munoz-Davila et al.27.

1. Стандартный протокол инокулята (SIP) для идентификации бактерий с помощью aMIAST

  1. Наденьте чистые перчатки и внутри шкафа биобезопасности класса IIa (BSC) продезинфицируйте перегородку +naBC тампоном, содержащим 70% изопропилового спирта.
  2. Наберите примерно 1 мл кровяно-бульонной смеси с помощью стерильного шприца с иглой 21 G.
  3. Нанесите 1 большую каплю кровяно-бульонной смеси из иглы на поверхность покрытой среды, а именно SBA, CA и MA. Разрежьте планшеты и инкубируйте планшеты с культуральными культурами в инкубаторе при температуре 37 °C ± 2 °C в аэробных условиях в течение 18-24 часов.
  4. После инкубации исследуйте планшеты на предмет появления изолированных колоний в БСК и продолжайте идентификацию и АСТ с помощью aMIAST.
  5. Для каждого изолята поместите полистирольную пробирку aMIAST в подставку для пробирок aMIAST и добавьте в нее 3 мл стерильного физиологического раствора с помощью дозатора, прикрепленного к бутылке с физиологическим раствором.
  6. Прикоснитесь к трем-пяти морфологически сходным колониям стерильной прямой инокуляционной проволокой и перенесите бактериальный инокулюм в первую пробирку.
  7. Отрегулируйте помутнение с помощью стерильного физиологического раствора в инокулированной пробирке в диапазоне 0,47-0,63 Макфарланда с помощью денситометра.
  8. Поместите капиллярную насадку грамотрицательной идентификационной карты aMIAST в первую пробирку.
  9. Поместите выбранные карты в соответствующее положение на кассете. Инокулюм в кассете готов и поступает на аМИАСТ в секцию розлива.
    ВНИМАНИЕ: Срок блокировки не должен превышать 30 минут до прививки карт.
  10. Загрузите кассету на место в камере розлива так, чтобы образец был обращен внутрь со штрих-кодом.
  11. Закройте дверцу и нажмите «Заполнить » на экране пользовательского интерфейса. Наполнение осуществляется циклом 70 с. Когда цикл завершится, синий индикатор на системе начнет мигать. Помещение карт в систему aMIAST распределяет инокулят по маленьким камерам карт с помощью машины.
  12. Извлеките кассету из камеры наполнения, закройте дверцу и поместите в камеру загрузки. Штрих-коды автоматически сканируются и проверяются на соответствие электронному рабочему списку виртуальной кассеты. Соломинки автоматически запечатываются, а карты автоматически загружаются в карусель. Мигающая синяя стрелка на aMIAST указывает на то, что загрузка завершена.
  13. По окончании извлеките отходы кассеты. Ознакомьтесь с процедурой утилизации отходов в литературе по продукту или следуйте другим стандартным практикам. Используйте остаток суспензии в пробирках для субкультуры на CLED агаре для проверки чистоты изолятов.
  14. Считывание результатов после того, как прибор завершит анализ.

2. Протокол прямого посева посева (DIP) для идентификации бактерий с помощью aMIAST

  1. Наденьте стерильные перчатки, а внутри шкафа биобезопасности очистите перегородку от +naBC тампоном, содержащим 70% изопропилового спирта.
  2. С помощью стерильного шприца с иглой 21 G возьмите 5 мл аликвоты из кровяно-бульонной смеси +naBC и перенесите ее в пробирку-сепаратор сыворотки (SST) после дезинфекции резиновой перегородки 70% изопропиловым спиртом (рис. 2A).
  3. Центрифугируйте эту аликвоту в течение 10 мин при 160 x g , чтобы клетки крови осели в смеси крови и бульона. После первого центрифугирования понаблюдайте за надосадочной жидкостью, в которой будут располагаться клетки крови.
  4. Откройте крышку флакона внутри шкафа биобезопасности и с помощью стерильного наконечника и пипетки осторожно извлеките надосадочную жидкость и переложите ее в новую простую пробирку для сбора крови (красная крышка), сняв ее верхнюю часть.
  5. Наденьте крышку на флакон и снова центрифугируйте его в течение 10 минут при давлении 2000 x g. После второго центрифугирования на дне образуется бактериальная гранула.
  6. Аспирируйте надосадочную жидкость и выбросьте ее с помощью стерильной пипетки и наконечника. Бактериальная гранула останется на дне пробирки и будет использована для инокуляции идентификационной карты aMIAST.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В первом центрифугировании при давлении 160 x g использовалась трубка-сепаратор сыворотки. Это было основано на исследованиях, проведенных Quesada et al.25 и Munoz-Davila et al.27, где первая стадия центрифугирования была выполнена примерно при 30 x g и 60 x g соответственно. Смесь крови и бульона из +aBC сначала центрифугировали на низкой скорости в SST для гранулирования клеток крови.
  7. Поместите полистирольную трубку aMIAST в подставку для пробирок aMIAST и добавьте в нее 3 мл стерильного физиологического раствора с помощью дозатора, прикрепленного к бутылке с физиологическим раствором.
  8. Используя стерильную петлю инокуляции, возьмите бактериальную гранулу со дна флакона и введите ее в пробирку aMIAST
  9. Повторите шаги 1.7-1.14.

3. AST по протоколу EUCAST RAST 4

  1. Держите наготове неинокулированные 90-миллиметровые круглые пластины для агара Мюллера-Хинтона (MHA) в шкафу для биобезопасности.
  2. Наденьте стерильные перчатки, а внутри шкафа биобезопасности очистите перегородку от +naBC тампоном, содержащим 70% изопропилового спирта.
  3. С помощью стерильного шприца аспирируйте 125 мкл ± 25 мкл неразбавленной кровяно-бульонной смеси из +naBC и добавьте в каждую пластину MHA в центре.
  4. Аккуратно распределите отвар по тарелкам с помощью стерильного ватного тампона в трех направлениях и нанесите ≤ 6 антимикробных дисков на каждую пластину.
  5. Инкубировать планшеты в аэробном инкубаторе при температуре 35 °C± 1 °C в течение 8 часов. После завершения инкубации соблюдайте чистоту изолята.
  6. Считывание зон торможения через 8 ч ± 5 мин. Интерпретируйте результаты с помощью таблицы точек останова RAST для короткой инкубации после проверки результатов идентификации бактерий в aMIAST.
  7. Сообщайте о результатах AST только в том случае, если изолят идентифицирован как один из RR-GN, а на пластинах MHA и CLED растет один морфотип.

4. Контроль качества

  1. Выполняйте внутренний контроль качества протокола SIP AMIAST в соответствии с инструкциями производителя с использованием рекомендованных эталонных штаммов.
  2. Проводите внутренний контроль качества метода RAST еженедельно с использованием рекомендуемого референсного штамма E. coli , как описано ниже.
    1. Разложите 4 стерильные стеклянные пробирки в подставке для пробирок. Дозируйте по 3 мл стерильного физиологического раствора в первой пробирке и 990 мл стерильного физиологического раствора в каждой из второй, третьей и четвертой пробирок.
    2. Сделайте суспензию 0,5 Макфарланда штамма QC из изолированных колоний ночной культуры на гальванических средах.
    3. С помощью стерильной пипетки и наконечника перенесите 10 мкл суспензии из первой пробирки во вторую.
    4. После смешивания перелейте 10 мкл суспензии из второй пробирки в третью, а затем в последнюю пробирку.
    5. Из последней пробирки возьмите 1 мл инокулюма с помощью стерильного шприца с иглой и добавьте его к неинокулированному аВС.
    6. Одновременно с помощью стерильного шприца с иглой добавить 5 мл стерильной овечьей крови в аБК и инкубировать ее в СККРМ до получения положительного результата из-за изменения цвета датчика жидкой эмульсии в основании аБЦ.
    7. Повторите шаги, описанные в шагах 1-3 для идентификации с помощью SIP, DIP и RAST, соответственно. Ожидаемые результаты заключаются в том, что деформация QC должна быть правильно идентифицирована обоими протоколами идентификации aMIAST, а диаметры зон в пластинах RAST должны находиться в указанном диапазоне28.

5. Статистический анализ

  1. Рассматривайте микробную идентификацию с использованием SIP в качестве золотого стандарта, и если такая же идентификация получена с помощью DIP, рассматривайте ее как согласующуюся.
  2. Если RR-GN, т.е. один из комплексов E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa и A. baumannii , идентифицированный с помощью SIP, дискордантирует в DIP, то считайте это серьезной ошибкой (ME), в то время как обратный вариант рассматривается как очень серьезная ошибка (VME), поскольку он может привести к выдаче отчета с неправильной идентификацией.
  3. Рассчитайте коэффициент согласованности для RR-GN как отношение общего числа согласованных RR-GN к общему числу RR-GN, идентифицированных с помощью SIP, умноженное на 100.
  4. Рассчитайте коэффициент ME как отношение числа +naBC, идентифицированных как имеющие не-RR-GN, к общему числу +naBC с RR-GN, идентифицированных с помощью SIP, умноженному на 100.
  5. Рассчитайте скорость VME как отношение числа +naBC, ошибочно идентифицированных как имеющие RR-GN в DIP, к общему no. из +naBC, протестированных методом DIP, умноженные на 100.
  6. Рассчитайте время идентификации изолята (TTI) как время, затраченное на идентификацию изолята по обоим протоколам с момента маркировки посева крови CBCMS.
  7. Рассчитайте разницу между DIP и SIP как уменьшение TTI. Вычислите это только для согласованных +naBC, имеющих RR-GN. Обратите внимание на соответствующие временные точки на часах CBCMS и aMIAST.
  8. Управляйте данными и анализируйте их с помощью электронных таблиц. Используйте U-критерий Манна-Уитни для непрерывных переменных, считая двустороннее p-значение ≤ 0,05 статистически значимым.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общие исходы
В течение периода исследования 240 +naBC были идентифицированы с помощью aMIAST с использованием как DIP, так и SIP. Из них 15% (36/240) +naBC были обнаружены полимикробными после ночной инкубации на покрытых средах. Из 204 +naBC доля RR-GN, идентифицированных с помощью SIP, составила 51,5% (105/204). Среди них 47,6% (50/105) составили E. coli, 19% (20/105) K. pneumoniae, 8,6% (9/105) P. aeruginosa и 24,8% (26/105) A. baumannii complex. Подробное описание всех результатов идентификации по SIP приведено в таблице 1.

Диагностическая точность при идентификации микроорганизмов
Из 105 RR-GN 98 (93,3%) и 99 (94,2%) соответствовали DIP до идентификации на уровне вида и рода соответственно. Показатели конкордантности по организмам составили 94% (47/50) для E. coli, 90% (18/20) для K. pneumoniae, 100% (9/9) для P. aeruginosa и 92,3% (24/26) для комплекса A. baumannii , как показано в таблице 1. В 7 +naBC результаты были противоречивыми вплоть до идентификации на уровне вида с использованием DIP, из которых aMIAST либо давал неидентифицированный (3), либо идентифицировал Non-RR-GN (4), как показано в таблице 2. Поскольку эти результаты не являются обязательными для клинического микробиолога, они были сочтены серьезными ошибками (МЭ). Уровень МЭ в нашем исследовании составил 6,7% (7/105) до идентификации на уровне вида. Доля не-RR-GN в aMIAST по SIP составила 48,5% (99/204). Из них 60 (60,6%) были согласованы по DIP до видовой идентификации. Среди 99 не-RR-GN RR-GN был идентифицирован с помощью DIP в 4 +naBCs, как показано в таблице 2. Такое несоответствие могло привести к ошибке в отчетности и считалось очень серьезной ошибкой (VME). Общая частота ВМЭ при использовании DIP составила 1,7% (4/240). Полное описание результатов идентификации и ошибок всех грамотрицательных кодов приведено в дополнительной таблице 1.

Сокращение времени на изолирующую идентификацию (TTI)
TTI конкордантных +naBC в DIP был значительно меньше, чем TTI в SIP (медиана (IQR): 507,5 мин (685-404) против 2171 мин (2532-1855), P2 против P1, p<0,00001 (критерий Манна-Уитни)). Медиана разницы в TTI между обоими протоколами составила 1635 мин (IQR: 1964-1299).

figure-results-1
Рисунок 1: Рабочий процесс исследования: изображение рабочего процесса в исследовании для флакона с положительно помеченной культурой крови с мономорфными грамотрицательными данными, обрабатываемого по протоколу стандартного и прямого посева. Сокращения: +aBC = флакон с положительной маркировкой для посева крови, +naBC = положительно помеченный флакон для посева крови с мономорфными грамотрицательными значениями, DIP = протокол прямого посева, SIP = стандартный протокол инокулята, SBA = агар овечьей крови, CA = шоколадный агар, MA = агар Мак-Конки, RR-GN = грамотрицательный, регистрируемый RAST, TAT = время выполнения Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Протокол прямого посева для идентификации бактерий: показ изображений флаконов во время выполнения протокола прямого посева. Сокращения: +naBC = флакон с грамнегативами с положительной маркировкой Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Грамотрицательные грамотрицательные препараты, о которых сообщается по RASTПротестировано изолятов (n)ГармоничныйНеправильная идентификацияНет идентификации
n (%)n (%)n (%)
Итог10598 (93.3%)4 (3.8%)3 (2.8%)
Кишечная палочка5047 (94%)12
Клебсиелла пневмония (Klebsiella pneumoniae)2018 (90%)11
Комплекс Acinetobacter baumannii2624 (92.3%)2#0
Синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa)99 (100%)00
# Один изолят правильно идентифицирован на уровне рода, но не на уровне вида (комплекс Acinetobacter baumannii идентифицирован как A. haemolyticus)

Таблица 1: Результаты идентификации бактерий в протоколе прямого посева. Результаты получены только для грамотрицательных сосудов, зарегистрированных по RAST. Сокращения: n = числитель, % = процент.

Грамотрицательные грамотрииВсего протестировано изолятовСерьезная ошибкаОчень большая погрешность, n (%)
ЧислоНеправильная идентификацияБез удостоверения личности(идентифицирован как)
n (%)nn
Кишечная палочка503 (6%)1 (A. haemolyticus)20
Клебсиелла пневмония (Klebsiella pneumoniae)202 (10%)1 (Ralstonia pickettii)10
Комплекс Acinetobacter baumannii262 (7.7%)2 (A. hemolyticus, Cupriaviadus pauculus)-0
Salmonella spp.10NA1 (10%)
(кишечная палочка)
Комплекс Enterobacter cloacae8NA1 (12.5%)
(кишечная палочка)
Acinetobacter lwoffi14NA1 (7.1%)
(Комплекс A. baumannii)
Sphingomonas paucimobilis9NA1 (11.1%)
(К. pneumoniae)
Сокращения: n: числитель, %: процент, ID: идентификация, NA: не применяется,
A: Acinetobacter, E: Escherichia, K: Klebsiella

Таблица 2: Подробная информация об основных и очень серьезных ошибках при протоколе прямого посева. Сокращения: n = числитель, % = процент, ID = идентификация, NA = не применимо, A = Acinetobacter, E = Escherichia, K = Klebsiella.

Дополнительная таблица 1: Подробные результаты идентификации микроорганизмов в обоих протоколах, а также результаты ошибок в протоколе прямого посева. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С помощью DIP мы успешно идентифицировали RR-GN со значительной диагностической точностью. Среднее значение TTI после положительного определения aBC составило всего 507 мин (~ 8,5 ч). Таким образом, при использовании в сочетании с методом EUCAST RAST для определения AST, он может обеспечить идентификацию изолята при 8-часовом считывании AST. Такой подход имеет потенциал для реализации метода EUCAST RAST, устраняющего необходимость в идентификации на основе масс-спектрометрии. Это благо для стран с ограниченными ресурсами, которые хотят внедрить метод EUCAST RAST в свой повседневный рабочий процесс, чтобы сократить время на составление клинических отчетов и обойти основные препятствия на пути его внедрения.

До внедрения метода EUCAST RAST многие авторы оценивали точность прямого тестирования от +aBC для различных систем aMIAST 21,22,23,24,25,26,27,29,30,31. В этих исследованиях протоколы прямых испытаний отличались либо тем, что следовала либо одна стадия центрифуги 29,30,31,32, либо стадия двойной центрифуги 21,22,24,25,26,27 для изготовления бактериальных гранул. При одноступенчатом методе смесь крови и бульона из +aBC центрифугировали на высокой скорости в трубке-сепараторе сыворотки (SST) для гранулирования бактерий над слоем силиконового геля. Гранула использовалась для подготовки инокулята к инокуляции идентификационных карт. При методе двойного центрифугирования смесь крови и бульона из +aBC сначала центрифугировалась на низкой скорости в SST для гранулирования клеток крови. Из этой пробирки надосадочная жидкость, содержащая бактерии, удалялась и переносилась в новую пробирку и подвергалась высокоскоростному центрифугированию. Из этой пробирки отбраковывалась надосадочная жидкость, а гранула использовалась для прививки соответствующих идентификационных карт. В этих исследованиях скорость согласования варьировалась от 62% до 100%, но в целом точность была выше при использовании метода двойного центрифугирования.

Мы обнаружили, что метод прост в исполнении и был использован в обычной диагностической лаборатории с персоналом из >10 лаборантов по очереди, что доказывает надежность метода. В ~94% (98/105) +naBC, содержащих один из RR-GN, DIP правильно идентифицировал микроорганизм. Коэффициент согласованности для разных категорий организмов также был сопоставим друг с другом, составляя 94%, 90%, 100% и 92,3% соответственно для комплекса E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa и A. baumannii. Мы также обнаружили, что общий уровень конкордантности для любого грамотрицательного диска был неоптимальным, ~77% (157/204). Тем не менее, большинство этих ошибочных идентификаций было связано с неферментативными грамотрицательными организмами, такими как Acinetobacter spp., отличным от комплекса baumannii, Pseudomonas spp., Moraxella spp., и Sphingomonas paucimobilis, которые обычно считаются распространенными загрязнителями кожи. Ошибочная идентификация с неферментативными грамотрицательными были отмечены и другими авторами21,23, что, вероятно, связано с низкой реакционной способностью этих бактерий в идентификационных картах aMIAST.

Мы обнаружили значительное снижение TTI бактерий в +naBCs с помощью DIP. Медиана TTI DIP была примерно в 4 раза меньше, чем медиана TTI SIP (507 мин против 2171 мин) при проведении в обычной клинической диагностической лаборатории. Этот TTI ~8,5 ч также включал интервал между положительной маркировкой aBC и проведением инокуляции карты aMIAST, так как среднее время выделения анализа с помощью aMIAST составляло всего 5,45 ч ± 1,6 ч. Сложив среднее время положительного результата в 728 мин ± 301 мин (~12 ч) для конкордантных +naBC в нашем исследовании, этот подход к идентификации бактерий может дать отчет в тот же день после получения aBC в обычной диагностической лаборатории.

Существуют также определенные ограничения, связанные с DIP. Во-первых, поскольку препарат инокулята используется не по прямому назначению, результаты следует считать предварительными, как и результаты AST от EUCAST RAST. Тем не менее, он служит основной цели своевременной идентификации только RR-GN со значительной диагностической точностью. Во-вторых, существует практическая возможность нерационального использования ресурсов тестирования, так как примерно в 60% +naBC; мы не смогли бы сообщить об этом из-за полимикробных инфекций или выявления не-RRGN. Эта потеря ресурсов относится к любому из новых автоматизированных методов прямого AST для посева крови. В-третьих, уровень полимикробных инфекций и выявление распространенных загрязнений кожи в этом исследовании были выше из-за плохих методов сбора образцов. В-четвертых, мы не подтвердили идентичность тестируемых изолятов с помощью масс-спектрометрии, которая в настоящее время является золотым стандартом идентификации бактерий.

Это исследование успешно установило, что даже с помощью фенотипических тестов можно в тот же день сообщать о положительных посевах крови, особенно при грамотрицательных бактериемиях. Это может привести к значительному сокращению продолжительности начала соответствующей антимикробной терапии в странах с низким и средним уровнем дохода, где микробиологическая диагностика для идентификации бактерий и АСТ в значительной степени опирается на традиционные фенотипические тесты. Этот подход должен быть обоснован путем проведения многоцентрового исследования и его потенциального влияния на исходы лечения пациентов, а также в качестве инструмента контроля антимикробной терапии должен быть в центре внимания будущих клинических испытаний в странах с низким и средним уровнем дохода.

В заключение следует отметить, что DIP for aMIAST дополняет метод EUCAST RAST, обеспечивая раннюю идентификацию RR-GN. Это избавляет от необходимости полагаться на передовые методы идентификации микроорганизмов и AST, поскольку время для отчетности с помощью этих подходов сопоставимо с этим подходом. В случае грамотрицательных бактерий отчетность в тот же день достижима с помощью обычных фенотипических методов, если они максимально оптимизированы. Это может привести к сокращению продолжительности антимикробной терапии широкого спектра действия и облегчению контроля антимикробной терапии в условиях ограниченных ресурсов.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование финансировалось за счет гранта на внутренние исследования, предоставленного доктору Аюшу Гупте AIIMS Bhopal. Мы признательны за вклад лаборантов и врачей-резидентов, которые усердно выполняли и считывали анализы в обычные и экстренные часы.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<СИЛЬНО>АНТИМИКРОБНЫЕ ДИСКИ
Амикациновый диск 30 &микро; gHimedia, Мумбаи, ИндияSD035-1VLТестирование чувствительности к противомикробным препаратам 
Диск Amoxyclav (20/10 &; micro; g)Himedia, Мумбаи, ИндияSD063-1VLТестирование чувствительности к противомикробным препаратам 
Цефотаксим диск 5 & микро; gHimedia, Мумбаи, ИндияSD295E-1VLТестирование чувствительности к противомикробным препаратам 
Цефтазидим диск 10 & микро; gHimedia, Мумбаи, ИндияSD062A-1VLТестирование чувствительности к противомикробным препаратам 
Ципрофлоксацин диск (5 & микро; g)Himedia, Мумбаи, ИндияSD060-1VLТестирование чувствительности к противомикробным препаратам 
Ко-тримоксазол диск (23,75/1,25 &; g)Himedia, Мумбаи, ИндияSD010-1VLТестирование чувствительности к противомикробным препаратам 
Гентамицин диск 10 & микро; gHimedia, Мумбаи, ИндияSD016-1VLТестирование чувствительности к противомикробным препаратам 
Имипенем диск 10 & микро; gHimedia, Мумбаи, ИндияSD073-1VLТестирование чувствительности к противомикробным препаратам 
Левофлоксацин диск 5 & микро; gHimedia, Мумбаи, ИндияSD216-1VLТестирование чувствительности к противомикробным препаратам 
Меропенем диск 10 & микро; Г&нбсп;Himedia, Мумбаи, ИндияSD727-1VLТестирование чувствительности к противомикробным препаратам 
Пиперациллин-тазобактам диск (30/6 &; микро; g)Himedia, Мумбаи, ИндияSD292E-1VLТестирование чувствительности к противомикробным препаратам 
Тобрамицин диск 10 & микро; gHimedia, Мумбаи, ИндияSD044-1VLТестирование чувствительности к противомикробным препаратам 
ATCC Escherichia coli 25922Microbiologics, Minnesota США0335AРекомендуемый штамм грамотрицательных бактерий для контроля качества в RAST
BacT-Alert 3D 480bioMerieux, Marcy d' Etoille, Франция412CM8423Непрерывная автоматизированная система культивирования крови
Шкаф биобезопасности II Тип A2Dyna Filters Pvt. Limited, Пуна, ИндияDFP-2/21-22/149Для защиты от опасных и инфекционных агентов и для поддержания контроля качества
Кровяной агар основа No 2Himedia, Мумбаи, ИндияM834-500GПриготовление кровяного агара и шоколадного агара
Клиническая модель центрифуги SP-8BLLaby Instruments, Амбала, ИндияHLL/2021-22/021Центрифугирование на низких и высоких скоростях для отделения надосадочной жидкости
Диспенсер S Аналогово-регулируемый диспенсер для бутылок BrandTech, Эссекс, Коннектикут, АнглияV1200Дозирование точного количества физиологического раствора
MacConkey agar Himedia, Мумбаи, ИндияM008-500GДифференциальная среда для ферментеров лактозы / неферментеров Грамотрицательные бациллы
Микропипетки (100-1000 &; L)Axiflow Biotech Private Limited, Дели, ИндияNJ478162Перенос надосадочной жидкости после первого центрифугирования, отбрасывание надосадочной жидкости после второго центрифугирования
Наконечники для микропипеток (200-1000 &; L)‎ Tarsons Products Pvt. Ltd., Калькутта, Индия521020Перенос надосадочной жидкости после первого центрифугирования, отбрасывание надосадочной жидкости после второго центрифугирования
Mueller-Hinton agar Himedia, Мумбаи, ИндияM173-500G Тестированиечувствительности к противомикробным препаратам методом Кирби-Бауэра дисковой диффузии
Нихромовая петля D-4Himedia, Мумбаи, ИндияLA019Для нанесения полос на питательные среды
Нихромовая прямая проволокаHimedia, Мумбаи, ИндияLA022Для колющей инокуляции
Nulife стерильные перчаткиMRK healthcare Pvt Limited, Мумбаи, ИндияДля безопасности меры предосторожности
Простой флакон (флакон с красной крышкой), вакутайнер Advance BDBecton-Dickinson, Cockeysville, MD, США367815Получение гранул после второго центрифугирования
Sheep bloodLabline Trading Co., Хайдарабад, Индия70014Приготовление кровяного агара и шоколадного агара
SST II пробирка, вакутайнер Advance BDBecton-Dickinson, Cockeysville, MD, США367954Отделение надосадочной жидкости при первом центрифугировании
Стерильный ватный тампон (с деревянной палочкой)Himedia, Мумбаи, ИндияPW005-1X500NOГазонная культура бульона для исследования чувствительности к противомикробным препаратам
Стерильный одноразовый шприц для подкожных инъекций 5 мл/млNihal Healthcare, Солан, Индия2213805NB2Приготовление аликвот из эталонного
набора+aBC VITEK DensiCHEK McFarlandbioMerieux, Marcy d' Etoille, Франция422219Денситометр для проверки мутности суспензии
солевого раствора VITEK (0,45% NaCl)bioMerieux, Marcy d' Etoille, ФранцияV1204Регулировка стандартной мутности
трубки McFarland VITEK bioMerieux, Marcy d' Etoille, France533306-4 REVПодставка для правильного размещения пробирок перед инокуляцией идентификационной карты
VITEKtubes bioMerieux, Marcy d' Etoille, ФранцияПробирки для приготовления инокулята
VITEK-2 Compact 60bioMerieux, Marcy d' Etoille, ФранцияVKC15144Автоматизированная система идентификации и AST
VITEK-2 GN cardbioMerieux, Marcy d' Этуаль, Франция21341Идентификация грамотрицательных бацилл

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990–2017: analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
  2. Ikuta, K. S., et al. Global mortality associated with 33 bacterial pathogens in 2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet. 400 (10369), 2221-2248 (2022).
  3. Liu, V. X., et al. The timing of early antibiotics and hospital mortality in sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 196 (7), 856-863 (2017).
  4. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Methodology-EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 4.0. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , Basel. (2023).
  5. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 33rd ed. CLSI. Clinical and Laboratory Standards Institute. , Wayne, PA. CLSI supplement M100 (2023).
  6. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Methodology-EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 1.0. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , Basel. (2018).
  7. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Zone diameter breakpoints for rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 1.0. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , Basel. (2018).
  8. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Zone diameter breakpoints for rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 6.1. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , Basel. (2023).
  9. Soo, Y. T., Waled, S. N. M. B., Ng, S., Peh, Y. H., Chew, K. L. Evaluation of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from blood culture bottles. Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 39 (5), 993-998 (2020).
  10. Berinson, B., et al. EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST): Analytical performance and impact on patient management. J Antimicrob Chemother. 76 (5), 1332-1338 (2021).
  11. Strubbe, G., Messiaen, A. S., Vandendriessche, S., Verhasselt, B., Boelens, J. EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) compared to conventional susceptibility testing: implementation and potential added value in a tertiary hospital in Belgium. Acta Clinica Belgica: Int J Clin Lab Med. 78 (5), 385-391 (2023).
  12. Jasuja, J. K., Zimmermann, S., Burckhardt, I. Evaluation of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) for positive blood cultures in clinical practice using a total lab automation. Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 39 (7), 1305-1313 (2020).
  13. Martins, A., et al. Rapid antimicrobial susceptibility of Enterobacteriaceae by disk diffusion directly from blood culture bottles using the EUCAST RAST breakpoints. J Glob Antimicrob Resist. 22, 637-642 (2020).
  14. Ekwall-Larson, A., Fröding, I., Mert, B., Åkerlund, A., Özenci, V. Analytical performance and potential clinical utility of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing in blood cultures after four hours of incubation. Microbiol Spectr. 11 (2), e500122(2023).
  15. Cerrudo, V., et al. Usefulness of EUCAST rapid antibiotic susceptibility breakpoints and screening cut-off values directly from blood cultures for the inference of β-lactam resistance mechanisms in Enterobacterales. JAC-Antimicrob Resist. 5 (1), 017(2023).
  16. Shan, Y., et al. Evaluation of the EUCAST rapid antimicrobial susceptibility test for enterobacterales-containing blood cultures in China. J Clin Microbiol. 60 (4), e0255921(2022).
  17. Jonasson, E., Matuschek, E., Kahlmeter, G. The EUCAST rapid disc diffusion method for antimicrobial susceptibility testing directly from positive blood culture bottles. J Antimicrob Chemother. 75 (4), 968-978 (2020).
  18. Tayşi, M. R., et al. Implementation of the EUCAST rapid antimicrobial susceptibility test (RAST) directly from positive blood culture bottles without the advanced identification systems. J Antimicrobial Chemotherapy. 77 (4), 1020-1026 (2022).
  19. Gupta, A., et al. A prospective study evaluating the effect of a ‘Diagnostic Stewardship Care-Bundle’ for automated blood culture diagnostics. J Glob Antimicrob Resist. 34, 119-126 (2023).
  20. Siddiqui, F., Gupta, A., Purwar, S., Saigal, S., Sharma, J. P. A prospective study to reduce turnaround time of microbiologically positive blood cultures in patients with sepsis in intensive care unit. Indian J Med Microbiol. 40 (4), 541-546 (2022).
  21. Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiol Infect Dis. 72 (1), 20-31 (2012).
  22. Lemos, T. C., Cogo, L. L., Maestri, A. C., Hadad, M., Nogueira, K. daS. Is it possible to perform bacterial identification and antimicrobial susceptibility testing with a positive blood culture bottle for quick diagnosis of bloodstream infections. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 51 (2), 215-218 (2018).
  23. Funke, G., Funke-Kissling, P. Use of the BD PHOENIX automated microbiology system for direct identification and susceptibility testing of gram-negative rods from positive blood cultures in a three-phase trial. J Clin Microbiol. 42 (4), 1466-1470 (2004).
  24. Nimer, N. A., Al-Saa’da, R. J., Abuelaish, O. Accuracy of the VITEK 2 system for a rapid and direct identification and susceptibility testing of Gram negative rods and Gram-positive cocci in blood samples. East Mediterr Health J. 22 (3), 193-200 (2016).
  25. Quesada, M. D., et al. Performance of VITEK-2 Compact and overnight MicroScan panels for direct identification and susceptibility testing of Gram-negative bacilli from positive FAN BacT/ALERT blood culture bottles. Clin Microbiol Infect. 16 (2), 137-140 (2010).
  26. De Cueto, M., Ceballos, E., Martinez-Martinez, L., Perea, E. J., Pascual, A. Use of positive blood cultures for direct identification and susceptibility testing with the Vitek 2 system. J Clin Microbiol. 42 (8), 3734-3738 (2004).
  27. Munoz-Dávila, M. J., Yagüe, G., Albert, M., García-Lucas, T. Comparative evaluation of Vitek 2 identification and susceptibility testing of Gram-negative rods directly and isolated from BacT/ALERT-positive blood culture bottles. Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 31 (5), 663-669 (2012).
  28. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. Quality control criteria for the implementation of the RAST method. Version 6.0. EUCAST. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , Basel. (2023).
  29. Chen, J. R., Lee, S. Y., Yang, B. H., Lu, J. J. Rapid identification and susceptibility testing using the VITEK 2 system using culture fluids from positive BacT/ALERT blood cultures. J Microbiol, Immunol Infect. 41 (3), 259-264 (2008).
  30. Bruins, M. J., Bloembergen, P., Ruijs, G. J. H. M., Wolfhagen, M. J. H. M. Identification and susceptibility testing of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa by direct inoculation from positive BACTEC blood culture bottles into Vitek 2. J Clin Microbiol. 42 (1), 7-11 (2004).
  31. Lupetti, A., Barnini, S., Castagna, B., Nibbering, P. H., Campa, M. Rapid identification and antimicrobial susceptibility testing of Gram-positive cocci in blood cultures by direct inoculation into the BD Phoenix system. Clin Microbiol Infect. 16 (7), 986-991 (2010).
  32. Barreales, A., Lara, M., Hernández, I., Díez, O. Rapid identification and susceptibility testing of Gram-positive cocci in BacT/ALERT blood cultures by direct inoculation into the Vitek 2 system. Rev Esp Quimioter. 24 (3), 131-135 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Automated Microbial IdentificationEUCAST RAST MethodDirect Inoculum ProtocolGram Negative SepsisAntimicrobial Susceptibility TestingBlood Culture BottlesKirby Bauer Disc DiffusionRapid AST ProtocolBacterial IdentificationAntimicrobial Therapy

Related Articles