Методическая статья

Подготовка образцов сетчатки к объемной электронной микроскопии

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66589

⸱

24 мая 2024 г.

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Eye Hospital, Wenzhou Medical University, 2Laboratory of Retinal Physiology and Disease, School of Ophthalmology and Optometry, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе подробно описаны этапы подготовки образцов сетчатки для объемной электронной микроскопии, уделяя особое внимание структурным особенностям фоторецепторных окончаний сетчатки.

Аннотация

Объемная электронная микроскопия (Volume EM) стала мощным инструментом для визуализации трехмерной структуры клеток и тканей с нанометровой точностью. Внутри сетчатки различные типы нейронов устанавливают синаптические связи во внутреннем и внешнем плексиформных слоях. В то время как традиционные методы ЭМ позволили получить ценную информацию о субклеточных органеллах сетчатки, их ограничение заключается в предоставлении данных 2D-изображений, что может затруднить точные измерения. Например, количественная оценка размера трех различных бассейнов синаптических везикул, имеющих решающее значение для синаптической передачи, является сложной задачей в 2D. Volume EM предлагает решение, предоставляющее крупномасштабные 3D-данные с высоким разрешением. Стоит отметить, что подготовка образцов является критически важным этапом в Volume EM, значительно влияющим на четкость и контрастность изображения. В этом контексте мы описываем протокол подготовки образцов для 3D-реконструкции окончаний аксонов фоторецепторов в сетчатке. Этот протокол включает в себя три ключевых этапа: диссекция и фиксация сетчатки, процессы встраивания образца и выбор области интереса.

Введение

Сетчатка плотно заполнена переплетающимися нейронными аксонами и дендритами, которые образуют синапсы между ними1. Микроскопия является незаменимым инструментом для изучения анатомии сетчатки, так как она имеет тонкие, сложные и мелкие структуры. Несмотря на то, что электронная микроскопия (ЭМ) обеспечивает беспрецедентную мощность для исследования ультраструктуры субклеточных органелл и точной локализации специфических белков на нанометровом уровне2, она позволяет получать изображения, ограниченные двумерной (2D) плоскостью, что приводит к потенциальной потере ключевой информации.

Развитие новых методов объемной электронной микроскопии с высоким разрешением (Volume EM) способствует предоставлению более полной и крупномасштабной трехмерной (3D) структурной информации. Некоторые методы 3D EM недавно были рассмотрены другими 3,4,5. 3D EM позволяет реконструировать форму нейронов и детали связи, что позволяет проводить точный количественный анализ интересующих структур. Это свидетельствует о том, что данные, полученные с помощью объемной ЭМ, являются более систематичными, полными и точными.

Фоторецепторы сетчатки, составляющие исходные нейроны в зрительной сигнализации 6,7, образуют синапсы с дендритами биполярных и горизонтальных клеток второго порядка в конце фоторецептора для облегчения возбуждающих сигналов 8,9. Эти окончания, называемые конусными ножками и сферулами палочек, включают в себя три важнейших компонента: митохондрии, синаптические ленты и синаптические везикулы. В то время как предыдущие исследования в основном были сосредоточены на общей структуре ленточных синапсов, было заметно отсутствие исследований тонкой структуры основных компонентов, включая митохондрии, ленты, везикулы, и их пространственной организации в терминалах 10,11,12,13. Точный и систематический анализ каждого компонента, наряду с пониманием их взаимосвязи в фоторецепторных окончаниях, жизненно важен для разгадки пространственной организации и всестороннего понимания функций визуальной обработки. В фоторецепторах митохондрии в основном присутствуют во внутреннем сегменте, теле клетки и терминале. Здесь мы сосредоточились на митохондриях в терминальных фоторецепторах. Сканирующая электронная микроскопия с фокусированным ионным пучком (FIB-SEM) — тип объемной ЭМ с высоким разрешением (x, y и z < 5 нм) и относительно большим объемным потоком 4,14 — является мощным инструментом для точной визуализации трехмерной структуры фоторецепторных терминалов.

Как FIB-SEM, так и серийный блочный сканирующий электронный микроскоп (SBF-SEM) представляют собой объемную ЭМ на основе SEM для получения изображения тканей путем сканирования поверхности образца. Ультраструктурные особенности поверхности образца проявляются благодаря контрасту, создаваемому интенсивностью вторичных или обратно рассеянных электронов (BSE) при сканировании образца электронным пучком15. По существу, обнаружение ГЭКРС или вторичных электронов с поверхности поперечного сечения образца ткани, залитого смолой, в СЭМ позволяет получать изображения внедренного образца16,17. Когда BSE или вторичные электроны генерируются меньше, информация о поверхности образца может быть получена только в объеме. Для получения стабильного контраста и высококачественных серийных изображений требуется достаточное осаждение тяжелых металлов в образце. Таким образом, конкретные протоколы пробоподготовки имеют решающее значение для последующей сегментации, 3D-реконструкции и анализа при использовании SEM для серийной визуализации. Метод осмий-тиокарбогидразид-осмий (ОТО) представляет собой типовую схему пробоподготовки для 3D электронной микроскопии биологических образцов, сохраняющую структуру липидсодержащих мембран и сохраняющую хороший контраст18,19.

Здесь мы разработали метод ОТО для подготовки образцов сетчатки к использованию Volume EM. Этот процесс особенно сосредоточен на препарировании сетчатки, определении оптимального времени фиксации ткани сетчатки и подробном описании конкретных процедур и мер предосторожности при подготовке 3D-образцов. Кроме того, сегментация и 3D-реконструкция целевой структуры являются неотъемлемыми этапами этого расширенного приложения. Сетчатка, будучи небольшой и сложной структурой для получения материалов, требует быстрых и точных операций для ЭМ, с фиксированным временем и свежими реагентами, подготовленными для немедленного использования.

Протокол

Протоколы ухода за животными и их использования были одобрены Комитетом по этике Медицинского университета Вэньчжоу и соответствовали рекомендациям, установленным Ассоциацией исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO). Все мыши содержались в 12-часовом солнечном и 12-часовом темном цикле и получали стандартную диету чау-чау.

1. Диссекция и фиксация сетчатки

  1. Обезболивайте мышей (C57BL/6J, самец, 8 недель, 20-25 г) путем внутрибрюшинного введения 2,2,2-трибромэтанола (0,25 мг/г массы тела). Подтвердите глубину анестезии отсутствием втягивания задней лапы после защемления пальца ноги или отсутствием мигающего рефлекса. Затем вывихните шейный позвонок, еще находясь под наркозом, чтобы усыпить животное.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трибромэтанол был выбран из-за его хорошо задокументированной эффективности в индуцировании быстрой и надежной анестезии на моделях мелких животных, особенно при краткосрочных процедурах. В то время как фармацевтические анестетики являются предпочтительными, трибромэтанол имеет определенные преимущества в определенных протоколах, что делает его подходящей альтернативой при правильном приготовлении и применении. Были приняты все меры предосторожности для обеспечения его безопасного и эффективного использования. Это исследование придерживается этических соображений, обеспечивая надлежащую подготовку, проведение и мониторинг для снижения потенциальных рисков, связанных с его использованием.
  2. Удалите глаза изогнутыми ножницами и погрузите глаза в смешанный раствор, содержащий 2% глутаральдегида и 2% параформальдегида в фосфатном буфере (PB, 0,1 M, pH 7,4).
  3. Удалите передний сегмент и стекловидное тело из глаз с помощью щипцов под препарирующим микроскопом.
  4. Отклейте склеру двумя щипцами до тех пор, пока сетчатка не будет полностью изолирована от наглазника.
  5. Быстро разрежьте сетчатку на полоски толщиной 100 - 200 мкм с помощью бритвы и обрабатывайте полоски сетчатки пипеткой Пастера в новой микроцентрифужной (EP) пробирке, содержащей 2% глутаральдегида и 2% параформальдегида в фосфатном буфере (PB, 0,1 M, pH 7,4) в течение 2 часов при комнатной температуре (RT) на ротаторе. После завершения поместите трубки для фиксации при температуре 4 °C на 24 часа.

2. Процесс встраивания образца

  1. После промывки в 0,1 М буфере какодилата натрия (pH 7,4) 5 раз по 15 мин инкубировать полоски сетчатки раствором, содержащим 1,5% ферроцианида калия и 1% OsO4 (в PB, pH7,4) в 0,1 М какодилата натрия с 4 мМ CaCl2 в течение 1,5 ч в темноте на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Темная инкубация и недостаток фосфатов могут предотвратить выпадение осадков и появление артефактов в образце.
  2. Промойте полоски сетчатки 3 раза в ddH2O в течение 10 минут каждая, а затем обработайте 1% тиокарбогидразидом в ddH2O в течение 30 минут в темноте в RT.
  3. После полоскания в ddH2O 3 раза по 15 мин каждый инкубируйте полоски сетчатки в 2% OsO4 (в PB, PH 7,4) в течение 45 мин в темноте при ЛТ.
  4. После промывки в ddH2O 3 раза по 15 мин погрузите полоски сетчатки в 1% водный уранилацетат в темноте при температуре 4 °C на ночь.
  5. На следующий день, после промывания в ddH2O 3 раза по 15 мин, обработайте полоски сетчатки 0,66% нитратом свинца в L-аспарагиновой кислоте (0,03 М, pH 5,5) в течение 40 мин при 65 °C.
  6. После промывания в ddH2O 3 раза по 15 минут каждый раз обезвоживайте полоски сетчатки с возрастающей концентрацией этанола 30%, 50%, 70%, 90% и 100% в течение 20 минут в каждом растворе.
  7. Обработайте полоски сетчатки глаза смешанным раствором, содержащим равное количество этанола и ацетона, в течение 20 минут, после чего промывайте ацетоном 2 раза по 20 минут.
  8. Инфильтрируйте полоски сетчатки в ацетон/смолу, смешанные в соотношении 7:3 в темноте при ЛТ, на ночь, а затем ацетон/смола в соотношении 3:7 в темноте в течение 24 ч при ЛТ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Точный состав смолы следующий: Epon812 10,06 мл, DDSA 4 мл, MNA 5,94 мл и DMP-30 0,2 мл.
  9. На следующий день замените трубки и пропитайте полоски сетчатки чистой смолой в течение 24 часов при температуре 45 °C. На следующий день снова смените смолу и вставьте полоски сетчатки на 48 часов при температуре 60 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целью повышения температуры является улучшение проникновения.

3. Выбор области интересов

  1. Разрежьте смоляные блоки на срезы толщиной 1 мкм, окрасьте срезы 1% толуидинового синего и понаблюдайте за общей структурой сетчатки под световой микроскопией, чтобы выбрать шероховатые участки интереса.
  2. Покрытие смоляных блоков платиной с помощью распылительного коастера с последующим фрезерованием с толщиной сечения 70 нм с помощью сканирующей электронной микроскопии с сфокусированным ионным пучком под действием тока 0,23 нА и разгонного напряжения 30 кВ.
  3. Предварительно просмотрите срез с помощью FIB-SEM с 2000-кратным увеличением, чтобы определить точные области интереса.
  4. Сбор данных осуществляется с помощью FIB-SEM с током луча 0,69 нА и напряжением ускорения 2 кВ. Остальные параметры следующие: время задержки = 2 μс, размер вокселя = 1,8 нм x 1,8 нм x 15 нм.

Результаты

На рисунке 1А представлено изображение фоторецепторных окончаний сетчатки, полученных с использованием традиционного химического метода двойной фиксации, а на рисунке 1В представлено изображение фоторецепторных окончаний сетчатки, полученных методом ОТО. Оба образца были отобраны с помощью FIB-SEM. Хорошо видно, что структура клеточной мембраны может быть максимально сохранена с помощью метода ОТО, и даже четко видны очертания везикул. Кроме того, контраст изображений, полученных с помощью метода ОТО, также более четкий.

На рисунке 2 показан экспериментальный рабочий процесс, используемый для реконструкции ультраструктурных характеристик фоторецепторных окончаний. Реконструкция была сосредоточена на четырех типах фоторецепторных окончаний, включая ножки М-колбочек, ножки S-колбочек, сферулы палочки 1 и сферулы палочки 2. Основной акцент был сделан на основных компонентах, таких как митохондрии, синаптические ленты и пулы синаптических везикул в терминалях фоторецепторов.

На рисунке 3 показаны восстановленные митохондрии и синаптические ленты в терминальных концах фоторецепторов палочек. Примечательно, что синаптические ленты сферул стержня2 демонстрируют характерную подковообразную форму, обычно с одной лентой на сферулу. Кроме того, на рисунке 2 показано наличие двух митохондрий в сферулах палочек, имеющих постоянное положение в центральном пространстве окончаний, расположенных над синаптическими лентами. Все структуры были прорисованы вручную, страница за страницей.

figure-results-1
Рисунок 1: Примеры изображений, отобранных с использованием FIB-SEM для традиционного метода химической двойной фиксации и метода ОТО. (A) Традиционный метод химической двойной фиксации. (В) Метод ОТО. Масштабная линейка: 1000 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Рабочий процесс 3D-реконструкции фоторецепторных терминалов с использованием FIB-SEM. После выравнивания с помощью программного обеспечения для визуализации 3D-данных серийные изображения были вручную сегментированы и визуализированы для дальнейшего анализа. (A) Оригинальные серийные изображения. (B) Выровненные изображения. (C) Сегментированные изображения. (D) Реконструированные изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: 3D реконструкция. Репрезентативные 3D-реконструктивные изображения изображают фоторецепторные терминалы белым цветом, митохондрии — оранжевым, а синаптические ленты — синим. Масштабная линейка: 500 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Мы реализовали протокол подготовки образцов OTO Volume EM для анализа концевой структуры фоторецепторов в ткани сетчатки. Основное внимание было уделено детализации всей процедуры, начиная от отслойки и фиксации сетчатки и заканчивая демонстрацией результатов 3D-реконструкции окончаний фоторецепторных аксонов.

Отличительная особенность ткани сетчатки, в отличие от ткани мозга, заключается в отсутствии в ней региональных различий. Сетчатка, состоящая из трех слоев тел нейронных клеток и двух слоев синаптических связей, демонстрирует регулярную и иерархическую структуру, несмотря на сложность ее нейронных и синаптических компонентов. При препарировании сетчатки становится крайне важным убедиться, что тонкие полоски сведены к минимуму, чтобы гарантировать равномерный контраст на последующих этапах подготовки образца. Терминали аксонов фоторецепторов, критические структуры, представляющие интерес, расположены во внешнем плексиформном слое (OPL) сетчатки. Иерархический и организованный характер сетчатки позволяет эффективно локализовать целевые структуры, способствуя точной выборке во время ЭМ и обеспечивая точность последующих результатов 3D-реконструкции.

Volume EM облегчает трехмерную визуализацию локальных нейронных цепей и синаптических связей в сетчатке на наноуровне, используя серийные участки21,22. Этот метод позволяет автоматически генерировать 3D-изображения с высоким разрешением, а FIB-SEM обладает потенциалом для раскрытия сложных деталей как физиологической, так и патологической активности. Поэтому поддержание стабильного контраста изображения по всему блоку имеет решающее значение в процессе подготовки образца. Для достижения равномерной проводимости мы используем метод предварительного встраивания ОТО, классический подход, широко признанный своей эффективностью в повышении контраста в сканирующей электронной микроскопии (СЭМ)18,23,24. Этот метод включает в себя двойное покрытие осмием в сочетании с тиокарбогидразидом, что обеспечивает оптимальную объемную проводимость для больших образцов. Кроме того, обработка двойным осмием способствует превосходному сохранению структур липидной мембраны, добавляя уровень точности нашим исследованиям. Образцы сетчатки иерархически, тканевые блоки малы и легко проникают, а метод ОТО позволяет сохранить лучший контур клеточной мембраны и равномерный контраст изображения.

Несколько важнейших факторов способствуют успеху этого протокола. Во-первых, быстрое забор сетчатки и точное время фиксации имеют первостепенное значение для поддержания оптимальной субклеточной структуры. Во-вторых, обеспечение соответствующих концентраций осмия и тиокарбогидразида имеет важное значение для сохранения контраста в мембранной структуре серийных изображений. Осмий, в частности, играет решающую роль, связываясь с молекулами липидов, усиливая сигнал BSE.

Наш протокол подготовки образцов сетчатки удобен в использовании, не требует дополнительного оборудования и минимизирует время обработки. Эта характеристика подчеркивает его потенциальную применимость к другим методам объемной ЭМ, предполагая универсальность и простоту применения в различных экспериментальных установках. Метод OTO значительно повышает контрастность изображений FIB-SEM. Тем не менее, детали клеточной мембраны, особенно бислойной структуры, все еще могут казаться несколько размытыми. Наша нынешняя схема пробоподготовки предполагает некоторое принесение в жертву мелких деталей в структуре клетки. В будущем мы планируем разработать оптимизированные методы для устранения и улучшения этого ограничения.

Раскрытие информации

Авторы не раскрывают информацию.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана грантами Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2022YFA1105503), Государственной ключевой лаборатории нейронаук (SKLN-202103), Чжэцзянского фонда естественных наук Китая (Y21H120019).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2,2,2-трибромэтанолSigma-AldrichT48402
Ацетоннаяэлектронная микроскопия Наука10000
Amira 6.8Thermo Fisher Scientific
CaCl2SigmaC-2661
Встраиваемая формаBeijing Zhongjingkeyi TechnologyGP10590
Epon смолаЭлектронная микроскопия Наука14900
ЭтанолSigma64-17-5
ГлутаральдегидЭлектронная микроскопияНаука 16020
Гелиос НаноЛаб 600i двухлучевой SEMFEI
L-аспарагиновая кислотаSigma56-84-8
Нитрат свинцаSigma10099-74-8
Na2HPO4.12H2OSigma71650Компонент фосфатного буфера
2PO4. H2OSigma71507Компонент фосфатного буфера
OsO4TED PELLA4008-160501
Параформальдегиднаяэлектронная микроскопия Наука157-8
Ферроцианид калияSigma14459-95-1
Какодилат натрияSigma6131-99-3
Распылитель для нанесения покрытийLeicaACE200
ТиокарбогидразидSigma2231-57-4
УранилацетатTED PELLACA96049

Ссылки

  1. Masland, R. H. The fundamental plan of the retina. Nat Neurosci. 4 (9), 877-886 (2001).
  2. Harris, J. R. Transmission electron microscopy in molecular structural biology: A historical survey. Arch Biochem Biophys. 581, 3-18 (2015).
  3. Varsano, N., Wolf, S. G. Electron microscopy of cellular ultrastructure in three dimensions. Curr Opin Struct Biol. 76, 102444(2022).
  4. Briggman, K. L., Bock, D. D. Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction. Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 154-161 (2012).
  5. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biol Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  6. Sterling, P., Matthews, G. Structure and function of ribbon synapses. Trends Neurosci. 28 (1), 20-29 (2005).
  7. Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. Synaptic transmission at retinal ribbon synapses. Prog Retin Eye Res. 24 (6), 682-720 (2005).
  8. Thoreson, W. B. Transmission at rod and cone ribbon synapses in the retina. Pflugers Arch. 473 (9), 1469-1491 (2021).
  9. Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea. Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).
  10. Schmitz, F. The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do. Neuroscientist. 15 (6), 611-624 (2009).
  11. Kantardzhieva, A., Peppi, M., Lane, W. S., Sewell, W. F. Protein composition of immunoprecipitated synaptic ribbons. J Prot Res. 11 (2), 1163-1174 (2011).
  12. Zampighi, G. A., et al. Conical tomography of a ribbon synapse: structural evidence for vesicle fusion. PLoS One. 6 (3), e16944(2011).
  13. Barnes, S., et al. Morphological diversity of the rod spherule: A study of serially reconstructed electron micrographs. Plos One. 11 (3), e0150024(2016).
  14. Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, e25916(2017).
  15. Crewe, A. V., Lin, P. S. The use of backscattered electrons for imaging purposes in a scanning electron microscope. Ultramicroscopy. 1 (3), 231-238 (1976).
  16. Richards, R. G., Gwynn, I. A. Backscattered electron imaging of the undersurface of resin-embedded cells by field-emission scanning electron microscopy. J Microsc. 177, Pt 1 43-52 (1995).
  17. Wergin, W. P., et al. Imaging thin and thick sections of biological tissue with the secondary electron detector in a field-emission scanning electron microscope. Scanning. 19 (6), 386-395 (1997).
  18. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. J Histochem Cytochem. 32 (4), 455-460 (1984).
  19. Buravkov, S. V., Chernikov, V. P., Buravkova, L. B. Simple method of specimen preparation for scanning electron microscopy. Bull Exp Biol Med. 151 (3), 378-382 (2011).
  20. Masland, R. H. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
  21. Svara, F. N., Kornfeld, J., Denk, W., Bollmann, J. H. Volume EM reconstruction of spinal cord reveals wiring specificity in speed-related motor circuits. Cell Rep. 23 (10), 2942-2954 (2018).
  22. Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis. Front Neural Circuits. 12, 98(2018).
  23. Guo, J., et al. An optimized approach using cryofixation for high-resolution 3D analysis by FIB-SEM. J Struct Biol. 212 (1), 107600(2020).
  24. Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid-containing membranes and droplets in osmium tetroxide-fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide (TCH). J Cell Biol. 30 (2), 424-432 (1966).

Перепечатки и разрешения

Теги

3D
Подготовка образцов сетчатки к объемной электронной микроскопии
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.