Методическая статья

Восстановление канала бактериального глутаматного рецептора путем инкапсуляции бесклеточной экспрессионной системы

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66595

⸱

8 марта 2024 г.

 ,  , 
1Neuroscience Program, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 4Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, 5Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает метод инвертированной эмульсии, используемый для инкапсуляции системы бесклеточной экспрессии (CFE) в гигантскую униламеллярную везикулу (GUV) для исследования синтеза и включения модельного мембранного белка в липидный бислой.

Аннотация

Системы бесклеточной экспрессии (CFE) являются мощными инструментами в синтетической биологии, которые позволяют осуществлять биомимикрию клеточных функций, таких как биосенсорика и регенерация энергии в синтетических клетках. Однако для реконструкции широкого спектра клеточных процессов требуется успешное восстановление мембранных белков в мембране синтетических клеток. В то время как экспрессия растворимых белков обычно успешна в обычных системах CFE, восстановление мембранных белков в липидных бислоях синтетических клеток оказалось сложной задачей. Здесь продемонстрирован метод воссоздания модельного мембранного белка, бактериального глутаматного рецептора (GluR0), в гигантских униламеллярных везикулах (GUVs) в модельных синтетических клетках, основанный на инкапсуляции и инкубации реакции CFE внутри синтетических клеток. С помощью этой платформы продемонстрировано влияние замещения N-концевого сигнального пептида GluR0 на сигнальный пептид протеородопсина на успешную котрансляционную транслокацию GluR0 в мембраны гибридных GUVs. Этот метод обеспечивает надежную процедуру, которая позволит бесклеточному восстановлению различных мембранных белков в синтетических клетках.

Введение

В последнее десятилетие синтетическая биология «снизу вверх» вызывает все больший интерес как новая область с многочисленными потенциальными применениями в биоинженерии, доставке лекарств и регенеративной медицине 1,2. Развитие синтетических клеток как краеугольного камня синтетической биологии «снизу вверх», в частности, привлекло широкий круг научных сообществ благодаря многообещающему применению синтетических клеток, а также их клеточным физическим и биохимическим свойствам, которые облегчают биофизические исследования in vitro 3,4,5,6 . Синтетические клетки часто конструируются в гигантских однослойных везикулах (GUV) размером с клетку, в которых воссоздаются различные биологические процессы. Восстановление цитоскелета клетки 7,8, светозависимаярегенерация энергии9, клеточная коммуникация10,11 и биосенсорика12 являются примерами усилий, предпринятых для реконструкции клеточного поведения в синтетических клетках.

В то время как некоторые клеточные процессы зависят от растворимых белков, многие характеристики естественных клеток, такие как восприятие и коммуникация, часто используют мембранные белки, включая ионные каналы, рецепторы и транспортеры. Основной проблемой в развитии синтетических клеток является восстановление мембранных белков. Несмотря на то, что традиционные методы восстановления мембранных белков в липидных бислоях основаны на очистке, опосредованной детергентом, такие методы трудоемки, неэффективны для белков, токсичных для экспрессирующего хозяина, или часто не подходят для восстановления мембранных белков в GUV13.

Альтернативным методом экспрессии белка являются системы бесклеточной экспрессии (CFE). Системы CFE являются мощным инструментом в синтетической биологии, который позволяет in vitro экспрессировать различные белки с использованием либо клеточного лизата, либо очищенного механизма транскрипции-трансляции14. Системы CFE также могут быть инкапсулированы в GUV, что позволяет проводить реакции синтеза компартментализированных белков, которые могут быть запрограммированы для различных применений, таких как создание светособирающих синтетических клеток9 или механочувствительных биосенсоров15,16. Аналогично методам экспрессии рекомбинантных белков, мембранная экспрессия белков является сложной задачей в системах CFE17. Агрегация, неправильное сворачивание и отсутствие посттрансляционной модификации в системах CFE являются основными узкими местами, препятствующими успешному синтезу мембранных белков с использованием систем CFE. Сложность восстановления мембранных белков снизу вверх с помощью систем CFE отчасти связана с отсутствием сложного пути биогенеза мембранного белка, который опирается на сигнальные пептиды, частицы распознавания сигналов, транслоконы и молекулы-шапероны. Однако в последнее время многочисленные исследования показали, что присутствие мембранных структур, таких как микросомы или липосомы во время трансляции, способствует успешной экспрессии мембранных белков 18,19,20,21. Кроме того, Eaglesfield et al. и Steinküher et al. обнаружили, что включение специфических гидрофобных доменов, известных как сигнальные пептиды, в N-конец мембранного белка может значительно улучшить его экспрессию22,23. В целом, эти исследования показывают, что проблема восстановления мембранных белков в синтетических клетках может быть преодолена, если трансляция белка происходит в присутствии мембраны GUV и если используется надлежащий N-концевой сигнальный пептид.

В данной работе представлен протокол инкапсуляции реакций синтеза белка с использованием реакций рекомбинантных элементов (PURE) CFE для восстановления мембранных белков в GUVs. В качестве модельного мембранного белка выбран бактериальный глутаматный рецептор24 (GluR0), изучено влияние его N-концевого сигнального пептида на восстановление его мембраны. Влияние сигнального пептида протеородопсина, который, как было показано Eaglesfield et al.22, улучшает эффективность восстановления мембранного белка, исследуется путем конструирования мутированного варианта GluR0, обозначенного как PRSP-GluR0, и сравнивается его экспрессия и мембранная локализация с GluR0 дикого типа (далее WT-GluR0), который содержит его нативный сигнальный пептид. Этот протокол основан на методе инвертированной эмульсии25 с модификациями, которые делают его устойчивым к инкапсуляции CFE. В представленном способе реакции CFE сначала эмульгируются с использованием липидного раствора в масле, который генерирует капли микронного размера, содержащие систему CFE и стабилизируемые монослоем липидов. Затем капли эмульсии наслаиваются поверх границы раздела «нефть-вода», который насыщается другим монослоем липидов. Затем капли эмульсии вынуждены перемещаться по границе раздела масло и вода под действием центробежной силы. В результате этого процесса капли получают еще один монослой, образуя таким образом двухслойный липидный пузырь. Затем ГУВ, содержащие реакцию CFE, инкубируют, в ходе которой мембранный белок экспрессируется и встраивается в мембрану ГУВ. Несмотря на то, что данный протокол предназначен для бесклеточной экспрессии GluR0, он может быть использован для бесклеточного синтеза других мембранных белков или для различных применений синтетических клеток, таких как восстановление цитоскелета или исследования слияния мембран26.

Протокол

Реагенты и оборудование, использованные для этого исследования, приведены в Таблице материалов.

1. Объемные реакции CFE в присутствии мелких униламеллярных везикул (SUV)

  1. Подготовка внедорожника
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап необходимо выполнять в вытяжном шкафу, следуя инструкциям по технике безопасности при работе с хлороформом.
    1. Приготовьте 5 мМ 1-пальмитоил-2-олеоил-глицеро-3-фосфохолин (POPC) SUV в стеклянном флаконе, перенеся 76 мкл 25 мг/мл стокового раствора POPC, растворенного в хлороформе.
    2. Осторожно вращая стеклянный флакон, вдуйте в него легкую струю аргона, чтобы на дне образовалась пленка из высохших липидов. Далее переложите стеклянный флакон в эксикатор с неплотно завинченной крышкой, чтобы испарить излишки хлороформа.
    3. Подержите стеклянный флакон в эксикаторе в течение 1 часа. Затем добавьте 0,5 мл ультрачистой деионизированной воды, чтобы растворить липидную пленку и вихрь примерно на 2 минуты.
    4. Настройте мини-экструзионный аппарат, замочив две фильтрующие опоры в деионизированной воде и разместив их на каждой из внутренних мембранных опор. Затем замочите поликарбонатный фильтр с длиной волны 100 нм и поместите его между двумя внутренними мембранными опорами, удерживаемыми вместе внешним корпусом экструдера и стопорной гайкой. Поместите эту установку в стойку экструдера.
    5. Промойте два газонепроницаемых шприца объемом 1 мл 3 раза сверхчистой деионизированной водой.
    6. Загрузите образец липидно-водной смеси в один из газонепроницаемых шприцев объемом 1 мл и поместите его в один конец мини-экструдера, удерживая шприц на месте с помощью зажимов с поворотным рычагом. Вставьте второй шприц в другой конец мини-экструдера и убедитесь, что он полностью нажат.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При загрузке шприца смесью липидов и воды убедитесь, что в шприце нет воздуха, прежде чем пропускать его через мини-экструдер.
    7. Аккуратно пропустите липидно-водную смесь из исходного шприца в пустой шприц через мини-экструдер. Повторите этот шаг 11 раз, чтобы сформировать внедорожники. Переложите внедорожники в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор внедорожника можно хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
  2. Реакционная сборка ДОВСЕ
    1. Соберите реакцию CFE, следуя протоколу бесклеточной экспрессии, предоставленному производителем, с небольшими изменениями, подробно описанными ниже.
    2. Смешайте 10 мкл раствора 1 (содержащего аминокислоты, NTP, тРНК и субстраты для ферментов, а также необходимый буфер), 1 мкл раствора 2 (белки в 20% глицерине), 2 мкл раствора 3 (рибосома (20 мкМ)), соответствующее количество ДНК, кодирующей растворимый sfGFP-sfCherry(1-10)27 (далее именуемый растворимым sfGFP), WT-GluR0-sfGFP или PRSP-GluR0-sfGFP (10-60 нг/1000 пар оснований), 1 мкл ингибитора мышиной РНКазы и 4 мкл 5 мл раствора SUV 5 мМ для мембранных белков или 4 мкл воды для растворимых белков.
    3. Доведите конечный объем реакции до 20 μл, добавив сверхчистую деионизированную воду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При сборке системы CFE все компоненты должны быть на льду. Все материалы чувствительны к температуре и могут разрушаться, если они достигают комнатной температуры.
  3. Инкубация и мониторинг реакции CFE
    1. Перенесите раствор CFE на 96-луночную коническую пластину с V-образным дном. Чтобы предотвратить испарение в ходе реакции, накройте пластину уплотнительной пленкой.
    2. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C в считывателе планшетов в течение 4-5 часов, контролируя реакцию CFE путем измерения сигнала GFP с коэффициентом усиления 100 на длинах волн возбуждения/излучения 488 нм/528 нм каждые 2 минуты.

2. Реакции CFE, инкапсулированные в GUV

  1. Приготовление наружного буферного раствора GUV
    1. В микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл смешать 1,5 мкл 1 М спермидина, 37,5 мкл 100 мМ АТФ, 25 мкл 100 мМ ГТФ, 12,5 мкл 100 мМ CTP, 12,5 мкл 100 мМ УТФ, 25 мкл 1 М креатинфосфата, 18 мкл 1 М ацетата магния, 93,33 мкл 3 М глутамата калия, 50 мкл 1 М HEPES KOH (pH 7,4), 1,15 мкл 332 мМ фолиевой кислоты, 100 мкл 2 М глюкозы и 50 мкл из исходного раствора 6 мМ смеси каждой из 20 аминокислот (приготовлено в соответствии с протоколом, описанным Sun et al.28).
    2. Доведите конечный объем раствора до 1 мл, добавив ультраочищенную деионизированную воду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все компоненты должны храниться на льду. Добавьте аминокислотную смесь в конце, чтобы избежать истощения аминокислот28. Раствор может быть аликвотирован в 330 мкл аликвот и храниться при температуре -20 °C до использования.
  2. Приготовление липидно-масляной смеси
    ПРИМЕЧАНИЕ: этот этап необходимо выполнять в вытяжном шкафу, следуя инструкциям по технике безопасности при работе с хлороформом.
    1. В вытяжном шкафу смешайте 17,3 мкл стокового раствора POPC 25 мг/мл и 1,08 мкл сополимера поли(бутадиен)-b-поли(этиленоксида) (PEO-b-PBD) 50 мг/мл в стеклянном флаконе объемом 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный раствор липидов в масле содержит 0,5 мМ липида с 95% и 5% POPC и PEO-b-PBD соответственно. PEO-b-PBD использовали для повышения стабильности мембраны во время экспрессии белка, но поддерживали на низком молярном соотношении для снижения тенденции сополимера к агрегации в мицеллы, отделенные от липидных молекул29,30.
    2. Осторожно вдуйте слабую струю газообразного аргона в стеклянный флакон, вращая флакон, чтобы испарить хлороформ.
    3. Нанесите пипеткой 1,2 мл легкого минерального масла в стеклянный флакон объемом 15 мл, содержащий высушенные липиды.
    4. Смешайте липиды и масло путем вортекса на максимальной скорости в течение 10-20 с. Растворенная липидно-сополимерная смесь будет выглядеть мутной.
    5. Чтобы убедиться, что все возможные липидные агрегаты в масле полностью растворены и диспергированы по всему маслу, поместите стеклянный флакон в духовку при температуре около 50 °C на 20 минут, а затем выдавите еще на 10-20 секунд на максимальной скорости.
  3. Сборка и инкапсуляция реакции CFE (на рисунке 1 обобщены следующие этапы).
    1. Приготовьте 300 мкл наружного раствора GUV в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл, смешав 270 мкл наружного буферного раствора CFE, приготовленного на стадии 2.1, 15 мкл 5 М NaCl и 15 мкл 4,5 М KCl.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе добавьте 0,45 мкл 1 М 1,4-дитиотреитол (DTT) в наружный раствор GUV. Целью добавления NaCl и KCl является регулировка осмоляльности внешнего раствора в соответствии с внутренним раствором CFE. Точный объем NaCl и KCl зависит от желаемой регулировки осмоляльности. Можно добавить либо NaCl, либо KCl, либо оба для регулировки осмоляльности.
    2. Аккуратно нанесите пипеткой 300 мкл смеси липидов в масле поверх наружного раствора GUV.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При добавлении липидно-масляной смеси важно, чтобы масло не смешивалось с водным наружным раствором. После добавления должна быть видимая граница раздела между смесью липидов в масле и наружным раствором GUV.
    3. Инкубируйте границу раздела нефть-вода при комнатной температуре в течение 2 часов, чтобы монослой липидов сформировался и стабилизировался на границе раздела.
    4. В то же время, следуя разделу 1.2.1, можно собрать реакцию CFE, содержащую плазмидную ДНК, кодирующую варианты мембранного белка или растворимый GFP. Замените 4 мкл 5 мМ раствора SUV или воды на 4 мкл 1 М сахарозы. Эта реакция и будет внутренним раствором GUV.
      Примечание: Для измерения осмоляльности внутренних и наружных растворов использовался осмометр. Затем осмоляльность наружного раствора соответствующим образом регулировалась добавлением NaCl или воды. Осмоляльность реакции CFE обычно составляет около 1600 мОсм/кг. Добавление сахарозы в реакцию увеличивает плотность внутреннего раствора, тем самым позволяя везикулам перемещаться по границе раздела нефть-вода во время стадии центрифугирования. Альтернативой сахарозе является решение для измерения градиента плотности Opti-Prep.
    5. Добавьте 600 мкл липидно-масляной смеси в микроцентрифужную трубку, содержащую реакцию CFE, и энергично пипетируйте вверх и вниз в течение ~1 мин, чтобы эмульгировать реакцию в растворе липидов в масле и сформировать монослой липидов вокруг синтетических клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный раствор не должен иметь пузырьков и должен выглядеть непрозрачным.
    6. Аккуратно нанесите эмульсию внутреннего раствора поверх слоя масла в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл, где была установлена граница раздела масло и вода.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не нарушить или не дестабилизировать интерфейс.
    7. Центрифуга в течение 10 мин при 2 000 x g при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость центрифугирования была оптимизирована для этого протокола. Adir et al.31 сообщили об иной скорости центрифугирования.
    8. После окончания центрифугирования осторожно удалите излишки масла и внешнего раствора из микроцентрифужной пробирки с помощью пипеттора. Удалите внешний раствор до тех пор, пока оставшийся объем не составит около 100 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула GUV обычно видна на дне микроцентрифужной пробирки. Тем не менее, отсутствие видимой гранулы не обязательно означает отсутствие выхода GUV. Вместо использования пипеттора излишки масла поверх внешнего раствора можно удалить с помощью аспирации. Очень важно убедиться, что липидный раствор в масле полностью удален. Загрязнение масла в растворе GUV может привести к некачественному качеству изображений.
    9. Повторно суспендируйте гранулу GUV в оставшемся растворе объемом 100 μл, осторожно пипетируя вверх и вниз. Затем перелейте раствор GUV в чистую 96 хорошо прозрачную пластину с плоским дном для инкубации.

3. Инкубация и визуализация инкапсулированной реакции CFE

  1. Накройте пластину уплотнительной пленкой, чтобы предотвратить испарение. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C в течение 5-6 часов. Можно использовать считыватель планшетов и следовать шагу 1.3.2 для подготовки считывателя планшетов к этапу инкубации.
  2. После завершения инкубации поместите 96-луночный планшет на предметный столик инвертированного микроскопа, оснащенного камерой EMCCD (или камерой sCMOS), лазером, управляемым DAQ-MX (или интегрированной системой лазерного сумматора) и конфокальным вращающимся диском CSU-X1 (или конфокалом лазерного сканирования). Сосредоточьтесь на любой окупаемости инвестиций, содержащей GUV, и получайте изображения с длиной волны возбуждения 488 нм с помощью объектива Plan-Apochromat 60 x/1.4 NA.
  3. Сохраняйте изображения GUV в формате .tiff.
  4. Откройте изображения в программном обеспечении для обработки изображений (например, ImageJ или Fiji). Откройте панель настроек Яркость/Контрастность . Отрегулируйте яркость и контрастность до соответствующих настроек, которые делают видимыми флуоресцентные белки.
  5. Если цель состоит в том, чтобы сравнить интенсивность сигнала различных экспрессированных белков, сначала сформируйте отдельные изображения GUV, содержащих разные белки, используя панель Images to Stack , расположенную в подменю Image > Stacks . Затем отрегулируйте яркость и контрастность всех изображений с помощью панели «Яркость/Контрастность ».

Результаты

До инкапсуляции реакций CFE два варианта GluR0-sfGFP, содержащие нативные и протеородопсиновые сигнальные пептиды (последовательности сигнальных пептидов представлены в дополнительной таблице 1), и растворимые sfGFP индивидуально экспрессировались в объемных реакциях, и их экспрессию контролировали путем детектирования сигнала sfGFP с помощью планшетного ридера (рис. 2A). Мембранные белки экспрессировались в отсутствие или в присутствии 100 нм SUV. Кроме того, с помощью калибровочной кривой, которая коррелирует сигнал sfGFP с его концентрацией (дополнительный рисунок 1), были оценены концентрации синтезированных белков (дополнительный рисунок 2). Очевидно, что растворимый sfGFP имел самую высокую экспрессию среди всех трех белков, что говорит о том, что экспрессия мембранных белков накладывает нагрузку на систему CFE, тем самым замедляя реакцию и снижая ее выход. Кроме того, в среднем, реакции, экспрессирующие мембранные белки в присутствии внедорожников, показали более высокий сигнал sfGFP по сравнению с реакциями, в которых отсутствуют SUV. Это наблюдение согласуется с выводами Steinküher et al., которые показали, что экспрессия мембранных белков снижает способность систем CFE производить белки23. Тем не менее, учитывая успешную демонстрацию экспрессии белка в реакции объемного CFE, можно предположить, что инкапсулированный CFE также будет синтезировать белки внутри GUV.

Затем отдельные реакции CFE инкапсулировали в GUV с использованием метода инвертированной эмульсии для экспрессии вариантов GluR0, а именно WT-GluR0, PRSP-GluR0 и растворимого sfGFP. В то время как WT-GluR0, содержащий нативный сигнальный пептид GluR0, продемонстрировал отличную экспрессию и мембранную локализацию (рис. 2B, левая панель), его аналог, PRSP-GluR0, который содержит N-концевой сигнальный пептид протеородопсина, не продемонстрировал аналогичной сильной мембранной локализации. Было обнаружено, что PRSP-GluR0 более склонен к агрегации и точечному образованию (Рисунок 2B, средняя панель). Как и ожидалось, растворимый sfGFP экспрессировался в GUV и оставался в просвете GUV (рисунок 2B, правая панель; см. дополнительный рисунок 2 для изображений когорт GUV).

figure-results-1
Рисунок 1: Этапы эксперимента с инвертированной эмульсией. (1) Этапы с 2.3.1 по 2.3.3 протокола визуализированы для демонстрации сборки монослоя липидов на границе между липидно-масляной смесью и внешним буферным раствором. (2) Здесь показана визуализация шага 2.3.5 протокола для представления формирования монослоя липидов вокруг эмульгированных капель, инкапсулирующих внутренний раствор CFE. (3) На шаге 2.3.6 протокола показано добавление монослойных GUV к микроцентрифужной трубке с липидным монослоем на границе липидно-масляной смеси и внешнего буферного раствора. (4) Здесь изображен шаг 2.3.7, в котором центрифугирование приводит к образованию гранулы GUV во внешнем растворе. (5) Здесь показан шаг 2.3.8, показывающий процесс удаления избытка смеси липидов в масле и наружного раствора. (6) Наконец, здесь изображен шаг 2.3.9, где гранула GUV повторно суспендируется в наружном растворе, и GUV готовы к инкубации, после чего проводится визуализация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Экспрессия белка в объемных реакциях CFE и в GUV, инкапсулирующих реакции CFE. (A) Флуоресцентные показания отдельных объемных CFE-реакций, экспрессирующих WT-GluR0-sfGFP, PRSP-GluR0-sfGFP и растворимый sfGFP. График растворимого sfGFP представляет собой сигнал от реакции объемом 2,5 мкл (стандартный объем реакции составляет 20 мкл) во избежание пересыщения измерений считывателя планшетов. Данные представлены в виде среднего ± S.D, n = 3. (B) Слева: Репрезентативное конфокальное изображение реакции GUV, инкапсулирующей CFE, экспрессирующей WT-GluR0-sfGFP. В центре: Репрезентативное конфокальное изображение GUVs, инкапсулирующих реакцию CFE, экспрессирующую PRSP-GluR0-sfGFP. Справа: Репрезентативное конфокальное изображение GUV, инкапсулирующей реакцию CFE, экспрессирующую растворимый sfGFP. Масштабные линейки: 10 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок 1: Кривая калибровки сигнала sfGFP и соответствующий ей линейный регрессионный анализ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Репрезентативное конфокальное изображение когорт GUV, экспрессирующих (слева) WT-GluR0-sfGFP, (в центре) PRSP-GluR0-sfGFP и (справа) растворимый sfGFP. Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 1: Аминокислотная последовательность сигнальных пептидов дикого типа и протеородопсина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 2: Концентрация синтезированных белков в объемных реакциях CFE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Практически любой клеточный процесс, который зависит от передачи молекул или информации через клеточную мембрану, такой как клеточная сигнализация или клеточное возбуждение, требует мембранных белков. Таким образом, восстановление мембранных белков стало основным узким местом в реализации различных конструкций синтетических клеток для различных применений. Традиционное опосредованное детергентом восстановление мембранных белков в биологических мембранах требует таких методов генерации GUV, как мягкое набухание или электроформирование. При набухании обычно образуются пузырьки небольшого размера, а выход электрообразования значительно снижается при инкапсуляциисложных растворов, что часто бывает при создании синтетических элементов. Кроме того, детергенты растворяют мембранный белок, и их удаление в процессе восстановления может привести к неправильному сворачиванию белка33,34. С другой стороны, представленный здесь подход основан на котрансляционном включении мембранного белка в липидный бислой, что больше напоминает естественный путь биогенеза белка в клетках22.

С технической точки зрения, представленный протокол имеет преимущество перед другими распространенными методами инкапсуляции, такими как электрообразование и непрерывное пересечение границы раздела капель 7,8,35,36 (cDICE), для более простой реализации, поскольку единственным лабораторным оборудованием, необходимым для генерации GUV, является центрифуга. В отличие от электроформования, метод инвертированной эмульсии позволяет инкапсулировать различные комбинации молекул с различной концентрацией. Кроме того, по сравнению с оригинальным методом инвертированной эмульсии25, этот подход позволяет получить более стабильные GUV, пригодные для инкапсуляции лизатов CFE или систем PURE. Более высокая стабильность GUV обусловлена наличием диблок-сополимера в составе GUV-мембраны37, а также длительной инкубацией границы раздела нефть-вода, что позволяет насыщать границу раздела молекулами липидов. Наконец, в отличие от подходов микрофлюидики, представленный здесь протокол не требует небольших каналов и трубок. Таким образом, реакция CFE может быть инкапсулирована сразу после сборки, а более короткое время сборки GUV из-за отсутствия потока и возможного засорения предотвращает преждевременное начало реакции CFE. Хотя демонстрация экспрессии мембранных белков в этом протоколе является эксклюзивной для реакций PUREfrex, этот метод можно расширить для синтеза белков с использованием различных доступных систем CFE, таких как бактериальные системы на основе лизата или CFE млекопитающих.

Представленный здесь подход имеет ограничения, которые обусловлены нефтезависимым характером процесса формирования ГУВ и стремлением иметь стабильные ГУВ. Этот подход обычно дольше по сравнению с другими методами, такими как cDICE или микрофлюидика, из-за длительного времени инкубации границы раздела нефть-вода, которое требуется для стабилизации границы раздела и высокого выхода GUV. Кроме того, липидный состав в первую очередь ограничен POPC с небольшими дозами других липидов или блок-сополимеров, в то время как другие методы, такие как электроформирование, больше подходят для включения липидов с различными физическими и химическими свойствами. В то время как состав мембраны GUV в этом методе представляет собой смесь POPC и PBD-PEO для максимального выхода CFE, можно протестировать возможные вариации состава мембраны GUV. Однако для других мембранных белков может потребоваться дальнейшая оптимизация параметров. Поскольку эмульгирование капель происходит путем ручного пипетирования, GUV, полученные с помощью этого метода, являются полидисперсными и довольно неоднородными по размеру. Кроме того, тот факт, что липиды растворены в органической фазе, может иногда вызывать образование слоя масла между двумя створками мембраны GUV или загрязнение камеры визуализации маслом, что может нанести ущерб качеству изображения. Возможным решением проблемы остаточного масла является замена минерального масла летучим органическим растворителем, таким как диэтиловый эфир, как показано в работе Tsumoto et al.38, для использования испарения растворителя наряду с центрифугированием во время образования GUV.

Несмотря на то, что в данной работе не демонстрируется функция канала, вдохновленная предыдущими анализами, использованными для зондирования восстановленной механо- или светочувствительной функциональности канала, в ней представлен анализ, основанный на флуоресцентной микроскопии. Сообщается, что открытие канала GluR0 увеличивает проводимость мембраны для ионов K+ 24. Поскольку CFE реакции уже содержат высокую концентрацию K+, типичные показатели калия не подходят для оценки функциональности канала. Однако, поскольку приток калия изменяет мембранный потенциал, чувствительные индикаторы мембранного потенциала, такие как DiBAC4(3)22 или BeRST139 , могут сообщать об активности GluR0 в присутствии глутамата.

Успешное восстановление мембранных белков в синтетических клетках открывает широкие возможности для создания синтетических клеток с беспрецедентными способностями, которые более точно имитируют природные клетки. В настоящее время основным недостатком синтетических клеток является их неспособность воспроизводить и перерабатывать энергию. Тем не менее, с помощью свето- и химически зависимых схем регенерации энергии, которые в значительной степени зависят от мембранных белков, можно представить себе долговечныесинтетические клетки. Использование систем CFE позволяет восстанавливать несколько мембранных белков, которые могут совместно выполнять определенные задачи. Например, воссоздание лиганд-зависимого ионного канала, подобного описанному здесь GluR0, наряду с различными потенциал-зависимыми ионными каналами, может привести к созданию возбудимой нейроноподобной синтетической клетки.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

APL выражает признательность за поддержку со стороны Национального научного фонда (EF1935265), Национальных институтов здравоохранения (R01-EB030031 и R21-AR080363) и Армейского исследовательского управления (80523-BB)

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фильтр из поликарбоната 100 нмSTERLITECH1270193
96 Хорошо прозрачная нижняя пластинаThermoFisher Scientific165305
BioTek Synergy H1M Гибридный многорежимный считывательAgilent11-120-533
КреатинфосфатMillipore Sigma10621714001
CSU-X1 Блок конфокального сканераYokogawaCSU-X1 
Градиент плотности среды (Optiprep)Millipore SigmaD1556Опционально переключатель с сахарозой во внутреннем растворе
Фильтр поддерживаетAvanti610014
Fisherbrand (1,5 мл)Fisher Scientific05-408-129 
Фолиевая кислота кальция соль гидрат MilliporeSigmaF7878
ГлюкозаMillipore Sigma158968
HEPESMillipore SigmaH3375
iXon X3 камера AndorDU-897E-CS0 
L-глутаминовая кислота соль калия моногидратMillipore SigmaG1501
Легкое минеральное маслоMillipore SigmaM5904
Тетрагидрат ацетата магния Millipore SigmaM5661
Мини-экструдер (включая держатель шприца и подставку для экструдера)Avanti610020
Olympus IX81 Инвертированный микроскоп OlympusIX21
Olympus PlanApo N 60x Масляный микроскоп Объектив Олимп1-U2B933 
PEO-b-PBDПолимерный источникp41745-bdEO
pET28b-PRSP-GluR0-sfGFP плазмидная ДНКДомашняяН/Д
pET28b-sfGFP-sfCherry(1-10) плазмидная ДНКДомашняяН/Д
pET28b-WT-GluR0-sfGFP Плазмидная ДНКДомашняяН/Д
POPC Липид в хлороформе Avanti850457C
Хлорид калияMillipore SigmaP9541
PUREfrex 2.0Cosmo Bio СШАGFK-PF201
Набор растворов рибонуклеотидов NewEngland BioLabsN0450
РНКаза Ингибитор, мышьNew England BioLabsM0314S
RTS Пробоотборник аминокислотBiotechrabbitBR1401801
Хлорид натрияMillipore SigmaS9888
СпермидинMillipore SigmaS2626
СахарозаMillipore SigmaS0389
VAPRO Осмометр давления пара Модель 5600ELITechGroupVAPRO 5600
микротрубки

Ссылки

  1. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: In vitro reconstitution of cellular function. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (9), 644-650 (2009).
  2. Lin, A. J., Sihorwala, A. Z., Belardi, B. Engineering tissue-scale properties with synthetic cells: Forging one from many. ACS Synth Biol. 12 (7), 1889-1907 (2023).
  3. Powers, J., Jang, Y. Advancing biomimetic functions of synthetic cells through compartmentalized cell-free protein synthesis. Biomacromolecules. 24 (12), 5539-5550 (2023).
  4. Jiang, W., et al. Artificial cells: Past, present and future. ACS Nano. 16 (10), 15705-15733 (2022).
  5. Groaz, A., et al. Engineering spatiotemporal organization and dynamics in synthetic cells. WIREs Nanomed Nanobiotech. 13 (3), 1685(2021).
  6. Sharma, B., Moghimianavval, H., Hwang, S. W., Liu, A. P. Synthetic cell as a platform for understanding membrane-membrane interactions. Membranes. 11 (12), 912(2021).
  7. Bashirzadeh, Y., et al. Actin crosslinker competition and sorting drive emergent GUV size-dependent actin network architecture. Commun Biol. 4 (1), 1-11 (2021).
  8. Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes. iScience. 25 (5), 104236(2021).
  9. Berhanu, S., Ueda, T., Kuruma, Y. Artificial photosynthetic cell producing energy for protein synthesis. Nat Commun. 10 (1), 1325(2019).
  10. Ji, Y., Chakraborty, T., Wegner, S. V. Self-regulated and bidirectional communication in synthetic cell communities. ACS Nano. 17 (10), 8992-9002 (2023).
  11. Moghimianavval, H., Loi, K. J., Hwang, S. W., Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Light-based juxtacrine signaling between synthetic cells. bioRxiv. , (2024).
  12. Boyd, M. A., Thavarajah, W., Lucks, J. B., Kamat, N. P. Robust and tunable performance of a cell-free biosensor encapsulated in lipid vesicles. Science Advances. 9 (1), 6605(2023).
  13. Schneider, B., et al. Membrane Protein expression in cell-free systems. Methods Mol Biol. 601, 165-186 (2010).
  14. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annu Rev Biomed Eng. 22 (1), 51-77 (2020).
  15. Majumder, S., et al. Cell-sized mechanosensitive and biosensing compartment programmed with DNA. Chem. Commun. 53 (53), 7349-7352 (2017).
  16. Poddar, A., et al. Membrane stretching activates calcium permeability of a putative channel Pkd2 during fission yeast cytokinesis. MBoC. 33 (14), (2022).
  17. Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
  18. Dondapati, S. K., et al. Functional reconstitution of membrane proteins derived from eukaryotic cell-free systems. Front Pharmacol. 10, 917(2019).
  19. Majumder, S., et al. In vitro synthesis and reconstitution using mammalian cell-free lysates enables the systematic study of the regulation of LINC complex assembly. Biochemistry. 61 (14), 1495-1507 (2022).
  20. Niwa, T., et al. Comprehensive study of liposome-assisted synthesis of membrane proteins using a reconstituted cell-free translation system. Sci Rep. 5 (1), 18025(2015).
  21. Moghimianavval, H., Hsu, Y. Y., Groaz, A., Liu, A. P. In vitro reconstitution platforms of mammalian cell-free expressed membrane proteinsmembrane proteins. Methods Mol Biol. 2433, 105-120 (2022).
  22. Eaglesfield, R., Madsen, M. A., Sanyal, S., Reboud, J., Amtmann, A. Cotranslational recruitment of ribosomes in protocells recreates a translocon-independent mechanism of proteorhodopsin biogenesis. iScience. 24 (5), 102429(2021).
  23. Steinküher, J., et al. Improving cell-free expression of membrane proteins by tuning ribosome cotranslational membrane association and nascent chain aggregation. bioRxiv. , (2023).
  24. Chen, G. Q., Cui, C., Mayer, M. L., Gouaux, E. Functional characterization of a potassium-selective prokaryotic glutamate receptor. Nature. 402 (6763), 817-821 (1999).
  25. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  26. Hsu, Y. Y., et al. Calcium-triggered DNA-mediated membrane fusion in synthetic cells. Chemical Communications. 59 (57), 8806-8809 (2023).
  27. Moghimianavval, H., et al. Engineering functional membrane-membrane interfaces by interspy. Small. 19 (13), 2202104(2023).
  28. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762(2013).
  29. Jacobs, M. L., Boyd, M. A., Kamat, N. P. Diblock copolymers enhance folding of a mechanosensitive membrane protein during cell-free expression. PNAS. 116 (10), 4031-4036 (2019).
  30. Kostarelos, K., Tadros, T. F., Luckham, P. F. Physical conjugation of (tri-) block copolymers to liposomes toward the construction of sterically stabilized vesicle systems. Langmuir. 15 (2), 369-376 (1999).
  31. Adir, O., et al. Preparing protein producing synthetic cells using cell free bacterial extracts, liposomes and emulsion transfer. J Vis Exp. (158), e60829(2020).
  32. van de Cauter, L., van Buren, L., Koenderink, G. H., Ganzinger, K. A. Exploring giant unilamellar vesicle production for artificial cells - current challenges and future directions. Small Methods. 7 (12), 2300416(2023).
  33. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1666 (1), 105-117 (2004).
  34. Guo, Y. Detergent-free systems for structural studies of membrane proteins. Biochem Soc Trans. 49 (3), 1361-1374 (2021).
  35. Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. J Vis Exp. (177), e63332(2021).
  36. Hwang, S. W., et al. Hybrid vesicles enable mechano-responsive hydrogel degradation. Angew Chemie Int Ed. 62 (41), e202308509(2023).
  37. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  38. Tsumoto, K., Hayashi, Y., Tabata, J., Tomita, M. A reverse-phase method revisited: Rapid high-yield preparation of giant unilamellar vesicles (GUVs) using emulsification followed by centrifugation. Colloids Surf A: Physicochem Eng Asp. 546, 74-82 (2018).
  39. Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. J Am Chem Soc. 137 (33), 10767-10776 (2015).
  40. Bailoni, E., et al. Minimal out-of-equilibrium metabolism for synthetic cells: A membrane perspective. ACS Synth Biol. 12 (4), 922-946 (2023).

Перепечатки и разрешения

Теги

Восстановление канала бактериального глутаматного рецептора путем инкапсуляции бесклеточной экспрессионной системы
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.