Модели легких на чипе превосходят традиционные 2D-культуры, имитируя воздушно-жидкостную границу раздела и перфузию эндотелиальных клеток, имитируя кровоток и обмен питательных веществ, что имеет решающее значение для исследований физиологии легких. Это повышает актуальность исследований легких, предлагая динамичную, физиологически точную среду для улучшения понимания и лечения респираторных инфекций.
Методическая статья
Иммунокомпетентная модель альвеолы на чипе для изучения иммунных реакций альвеолярной слизистой оболочки
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мы представляем передовую иммунокомпетентную модель легкого на чипе, предназначенную для воспроизведения альвеолярной структуры и функции человека. В этой инновационной модели используется микрофлюидно-перфузионный биочип, который поддерживает воздушно-жидкостную границу, имитирующую окружающую среду в альвеолах человека. Тканевая инженерия используется для интеграции ключевых клеточных компонентов, включая эндотелиальные клетки, макрофаги и эпителиальные клетки, для создания репрезентативной тканевой модели альвеолы. Модель облегчает углубленное изучение иммунных реакций слизистых оболочек на различные патогены, включая вирусы, бактерии и грибки, тем самым улучшая наше понимание иммунитета легких. Основная цель этого протокола состоит в том, чтобы предоставить подробную информацию для создания этой модели альвеолы на чипе в качестве надежной платформы in vitro для изучения инфекций, позволяющей исследователям внимательно наблюдать и анализировать сложные взаимодействия между патогенами и иммунной системой хозяина в легочной среде. Это достигается за счет применения микрофлюидных методов для моделирования ключевых физиологических состояний альвеол человека, включая кровоток и биомеханическую стимуляцию эндотелиальных клеток, а также поддержания границы раздела воздух-жидкость, имеющего решающее значение для реалистичного воздействия воздуха на эпителиальные клетки. Модельная система совместима с рядом стандартизированных анализов, таких как иммунофлуоресцентное окрашивание, профилирование цитокинов и анализ колониеобразующих единиц (КОЕ)/бляшек, что позволяет получить всестороннее представление об иммунной динамике во время инфекции. Альвеола-он-чип состоит из основных типов клеток, включая эпителиальные клетки дистального отдела легких человека (H441) и эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs), разделенные пористыми мембранами из полиэтилентерефталата (ПЭТ), при этом первичные макрофаги, полученные из моноцитов, стратегически расположены между эпителиальным и эндотелиальным слоями. Тканевая модель расширяет возможности препарирования и анализа нюансов факторов, участвующих в легочных иммунных реакциях in vitro. Являясь ценным инструментом, он должен способствовать развитию исследований легких, обеспечивая более точную и динамичную модель in vitro для изучения патогенеза респираторных инфекций и тестирования потенциальных терапевтических вмешательств.
Введение
Легкое человека играет замечательную роль в дыхании и иммунной защите, со сложными взаимодействиями между иммунными реакциями альвеолярной слизистой оболочки1. Способность альвеол создавать эффективный иммунный ответ жизненно важна для предотвращения инфекций легких и обеспечения здоровья легких. Поскольку легкие постоянно подвергаются воздействию широкого спектра потенциальных рисков, включая бактерии, вирусы, грибки, аллергии и твердые частицы, понимание сложностей иммунных реакций слизистых оболочек альвеол имеет решающее значение для выявления механизмов респираторных инфекций, воспалительных заболеваний и лечения легочныхзаболеваний.
Для изучения инфекций и воспалительных процессов дыхательных путей in vitro требуются модели, которые могли бы точно имитировать альвеолярную среду и иммунные реакции. Двухмерные клеточные культуры и модули животных на протяжении десятилетий использовались в качестве важных инструментов для биомедицинских исследований иммунного ответа легких. Тем не менее, они часто имеют ограничения в своем трансляционном потенциале в человеческих ситуациях. Модели «легкое на чипе» могут способствовать заполнению пробела между традиционными моделями in vitro и in vivo и обеспечить новый подход к изучению специфических иммунных реакций человека 2,3. Модели «легкое на чипе» могут имитировать границу раздела воздух-жидкость, которая необходима клеткам легких для повторения физиологических условий дыхательных путей и разработки более точной и надежной модели ткани. Этот метод культивирования позволяет точно исследовать дифференцировку, функционирование и реакцию клеток на лекарства или стимулы, связанные с заболеванием, in vitro 2.
В этом исследовании мы представляем микрофлюидную модель альвеолы человека в качестве эффективного инструмента для повторения альвеолярной среды человека путем применения перфузии для имитации кровотока и биомеханической стимуляции эндотелиальных клеток, а также включения воздушно-жидкостного интерфейса с эпителиальными клетками, подвергшимися воздействию воздушной фазы4. Мы разработали микрофлюидную перфузную альвеолу на кристалле, которая имитирует физическую структуру и биологические взаимодействия альвеолы человека, уделяя особое внимание границе раздела воздух-жидкость. Этот интерфейс играет решающую роль в дифференцировке эпителиальных клеток дыхательных путей, что имеет важное значение для точного моделирования легочной среды. В модели используются эпителиальные клетки дистального отдела легких человека (H441) и эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs), разделенные пористыми мембранами из полиэтилентерефталата (ПЭТ), с первичными макрофагами, полученными из моноцитов, расположенными между слоями клеток. Эта установка воспроизводит сложное клеточное расположение альвеолы и имеет решающее значение для точного моделирования границы раздела воздух-жидкость, которая является важным фактором физиологической функции легочной ткани.
Обоснование разработки модели распространяется на интеграцию как циркулирующих, так и тканевых резидентных иммунных клеток. Этот подход предназначен для точной имитации воспалительной реакции хозяина на респираторные инфекции человека, обеспечивая динамическую среду для изучения взаимодействий патогена и хозяина. Присутствие макрофагов позволяет исследовать непосредственные иммунные реакции и их взаимодействие с патогенами, отражая первую линию защиты от респираторных инфекций. Кроме того, конструкция платформы биочипа способствует удобному и точному манипулированию как биофизическими, так и биохимическими сигналами, что имеет решающее значение для репликации функции альвеол in vitro. Такая гибкость играет важную роль в анализе факторов, способствующих инфицированию человека, позволяя исследователям корректировать условия в соответствии с различными состояниями заболевания или тестировать потенциальные терапевтические вмешательства. Совместимость платформы с несколькими технологиями считывания, включая передовую микроскопию, микробиологический анализ и биохимический анализ сточных вод, повышает ее полезность. Эти возможности позволяют всесторонне оценить реакцию тканей на инфекции, включая оценку клеточного поведения, пролиферации патогенов и эффективности иммунных реакций.
Мы представляем подробный протокол и методы создания и использования модели альвеолы на чипе человека, ориентированной на репликацию границы раздела воздух-жидкость и интеграцию иммунных клеток для изучения инфекций человека in vitro.
Протокол
Клетки HUVEC выделяют из пуповины и используют до пассажа 4. Первичные моноциты выделяются от здоровых доноров из цельной крови. Исследование было одобрено комитетом по этике Университетской больницы Йены, Йена, Германия (3939-12/13). Согласно Хельсинкской декларации, все лица, сдающие клетки для исследования, дали свое информированное согласие.
1. День 1: Подготовка биочипа
- Биочипы доступны в различных размерах и моделях. Для экспериментов здесь используйте модель BC002. Поместите биочип в стеклянную чашку Петри, наполните чашку и промойте все полости стерильным 70% этанолом (EthOH). Выдерживать 45 минут при комнатной температуре. После этого промойте полости 2 раза стерильным ddH2O. Удалите ddH2O.
- Покройте мембрану биочипа обеих полостей стерильным раствором коллагена для внутривенного введения (0,5 мг/мл в 0,5 мМ уксусной кислоты; используйте концентрацию 1:100 в фосфатном буферном физрастворе Дульбекко, содержащем магний и кальций PBS (+/+)) путем осторожного промывания раствора коллагена внутривенно через обе полости с помощью пипетки объемом 1000 мкл с синими наконечниками. Инкубировать в течение 15 минут при 37 °C и 5%CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать пипетку объемом 1 000 мкл с наконечниками с синим фильтром (P1000) на протяжении всего протокола. Диаметр отверстия наконечника фильтра полностью закрывает отверстие портов, соединяющих каналы, что позволяет избежать попадания пузырьков воздуха внутрь чипа. - После 30 минут инкубации 2 раза промойте нижнюю и верхнюю камеры стерильным PBS (+/+) для вымывания остатков коллагена и уксусной кислоты.
- Приготовьте среду EC, добавив 1:100 (v/v) пенициллин/стрептомицин (10 000 ЕД/мл). Заполните верхнюю камеру каждой полости 250 μL EC-среды, а нижнюю камеру 150 μL EC-среды.
- Соберите HUVEC из фляги T25: Промойте 5 мл фосфатного буферного физиологического раствора Дульбекко без магния и кальция PBS (-/-), добавьте 1 мл 0,25% трипсина + 1 мМ ЭДТА в PBS (-/-) и инкубируйте в течение 3 минут при 37 °C. Остановите активность трипсина, добавив 5 мл PBS (+/+) + 5% FCS, и центрифугируйте при 350 x g в течение 5 мин при комнатной температуре (RT) в коническую пробирку объемом 50 мл. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл EC-среды.
- Используйте последовательное разведение в соотношении 1:10 при подсчете клеток. Добавьте 10 мкл ресуспендированной клеточной гранулы в 90 мкл клеточной среды. Тщательно комбинируйте образцы. Используйте микроцентрифужную пробирку с 10 μл трипанового синего пятна. Раствор клетки разбавить трипановым синим (1:1) с помощью предметных стекол камеры подсчета клеток. Подсчитывайте ячейки вручную с помощью камеры Нейбауэра или с помощью автоматического счетчика ячеек. Определите количество клеток и отрегулируйте концентрацию с точностью до 0,4 x 106 клеток на 200 μл.
- Замените среду эндотелиальных клеток в верхней камере биочипа на 200 мкл EC-среды, содержащей взвешенные HUVECs. Делайте пипетку аккуратно, чтобы избежать образования пузырьков воздуха в каналах или камерах. Поместите стеклянную чашку Петри с биочипами при температуре 37 °C и 5%CO2.
2. День 2: Проверка клеточного слоя
- На 2-й день визуально проверьте слияние клеточного слоя HUVEC в верхней камере. Проведите обмен среды в верхней камере с 300 μл EC среды. Делайте пипетку аккуратно, чтобы избежать отслоения клеток от мембраны. Осуществляйте медиаобмен ежедневно после 24 часов. Поместите стеклянную чашку Петри с биочипами обратно при температуре 37 °C и 5%CO2.
3. День 3: Подготовка нижней камеры
- Визуально проверьте слияние слоя эндотелиальных клеток. На этом этапе определите наличие сливающегося слоя и морфологию, похожую на булыжник (Рисунок 1). Проведите обмен среды в верхней камере с 300 μл EC среды.
- Далее подготовьте нижнюю камеру для засеивания клеток, образующих эпителиальный слой. Аккуратно промойте нижнюю камеру 150 μL среды RPMI (добавьте 1:100 (v/v) пенициллин/стрептомицин (10 000 Ед/мл), 5% эмбриональную сыворотку коровы, 1 μМ дексаметазона).
- Для нижней камеры затравка 0,5 x 106 ячеек H441 суспендирована в 200 мкл среды RPMI (RPMI) на полость.
- Забор клеток H441
- Промойте ячейки 5 мл PBS (-/-) один раз. Добавьте 2 мл 0,25% трипсина + 1 мМ ЭДТА в PBS (-/-).
- Инкубируйте клетки в течение 5 минут при 37 °C и 5%CO2. Время инкубации варьируется в зависимости от слияния несушки. В течение 5-7 мин клетки должны полностью отделиться.
- Остановите активность трипсина с помощью 10 мл PBS (+/+) + 5% FBS, соберите клетки и центрифугируйте при 200 x g в течение 4 минут.
- После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 1 мл RPMI и подсчитайте.
- Затравите 0,5 х 10по 6 клеток в камере, аккуратно пипетируя раствор клеток в нижнюю камеру. Закройте все порты и переверните биочип вверх дном, чтобы клетки могли прикрепиться к мембране ПЭТ. Держите биочип вверх дном и инкубируйте в течение ночи в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C и 5%CO2.
4. День 4 - День 7: Поддержание клеток и сбор моноцитов
- Выполняйте ежедневный среднесрочный обмен в верхней и нижней камере. Для верхней камеры выполните замену среды на 300 мкл EC-среды.
- Используйте 200 мкл RPMI+ (среда RPMI плюс 1:100 (v/v) пенициллин/стрептомицин (10 000 ЕД/мл), 10 нг/мл GM-CSF, 10% аутологичной человеческой сыворотки, 1 мкМ дексаметазон) для нижней камеры. На 7-й день промойте нижнюю камеру препаратом RPMI+, чтобы подготовить полость для посева моноцитов.
- Затравка 0,1 х 106 моноцитов, взвешенных в 200 мкл RPMI+ в нижней камере.
- Заготовка моноцитов
- Промойте клетки 1 мл PBS (-/-) и инкубируйте в течение 7 мин при 37 °C в предварительно подогретом PBS (-/-), содержащем 4 мг/мл лидокаина + 5 мМ ЭДТА при 37 °C и 5%CO2.
- Соберите клетки и центрифугируйте при 350 x g в течение 7 минут, повторно суспендируйте клетки в 1 мл RPMI+ и подсчитайте. Поместите порты биочипа вниз, чтобы клетки прикрепились к мембране.
5. День 8: Перфузия биочипа
- На этом этапе убедитесь, что биочипы готовы к подключению к потоку и перфузии. Перед началом перфузии подготовьте пустой инкубатор и поместите внутрь перистальтический насос.
- Перфузия биочипов
- Перед тем, как прикрепить стерилизованную трубку к биочипу, промойте трубку 200 μL PBS (+/+), а затем 200 μL EC-среды. Трубка имеет внутренний диаметр 0,5 мм, состоящий из более длинных (20 см) и более коротких (12 см) сторон, разделенных двумя перистальтическими пробками насоса. Отложите трубки в сторону и подготовьте резервуары для среды.
- Проведите обмен сред в верхней и нижней камерах, промыв их соответствующей свежеприготовленной средой для культивирования клеток.
- Вставьте резервуар на выходной стороне биочипа и подсоедините резервуар с трубкой к входному отверстию биочипа (рис. 2). Подсоедините трубку к резервуару и биочипу так, чтобы между резервуаром и биочипом была круговая перфузия среды.
- Как только все будет подключено к портам, заполните резервуар 500 μл EC среды. Соедините биочип с трубкой на перфузии с расходом 21 мкл/мин (рис. 2). Внимательно наблюдайте в течение первых 15 минут перфузии на предмет введения пузырьков. Проводите обмен медиумов ежедневно в обеих камерах.
6. День 9 - День 11: Создание границы раздела воздух-жидкость
- Остановите перфузию, опорожните резервуары и наполните их свежеприготовленной средой под стерильным безопасным шкафом. Нанесите пипеткой 500 мкл EC-среды в резервуары и аккуратно промойте нижнюю камеру 200 мкл RPMI+. Начните перфузию снова со скоростью перфузии 21 μл/мин.
- Воздушно-жидкостный интерфейс (ALI)
- Устанавливайте ALI с 12-го дня и до конца эксперимента (14-й день). Во время культивирования ALI подвергайте эпителиальные клетки воздействию воздуха.
- Чтобы получить культуру ОПЛ, приготовьте новую сосудистую среду EC (добавьте 1:100 (v/v) пенициллин/стрептомицин (10 000 ЕД/мл), 10 нг/мл GM-CSF, 20% аутологичной сыворотки человека, 1μМ дексаметазон) для поддержания всех типов клеток в чипе. На этом этапе среда содержит более высокую концентрацию АС (20%).
- Откройте пробки в нижней камере под стерильным защитным шкафом и осторожно впитайте среду до тех пор, пока не станет виден пузырь воздуха, как показано на рисунке 3. Убедитесь, что вся жидкость из канала и камеры удалена, и осторожно закройте порты.
- Заполните резервуары средой EC (-/-) и продолжайте перфузионную культуру с расходом 21 μл/мин. Замените среду только в верхней камере до 14-го дня и держите эпителиальные клетки в нижней камере только воздухом.
7. День 14: Забор и анализ тканей
- Отсоедините биочип от потока. Закупорьте трубку и проверьте на микроскопе слияние клеток. Из-за воздуха в нижней камере клеточные слои могут казаться нечеткими и трудными для визуализации. На этом этапе модель готова к дальнейшим экспериментам.
- Фиксация и окрашивание ткани в биочипе
- Промойте полости PBS (+/+) для удаления среды клеточной культуры. Пипетку 300 мкл 4% параформальдегида (PFA) растворяют в PBS (-/-) в верхнюю камеру и 200 мкл в нижней камере и инкубируют в течение 10 мин при РТ.
ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с фиксирующими химическими веществами, такими как PFA, используйте вытяжной шкаф. Соберите и утилизируйте отходы соответствующим образом. - Промойте камеры 3 раза с PBS (+/+). После фиксации храните биочипы при температуре 4 °C или используйте их непосредственно для иммунофлуоресцентного окрашивания клеток.
- Для пермеабилизации пипетку дозируйте 300 мкл 0,25% Triton X-100 в PBS (+/+). Инкубировать в течение 30 минут при RT.
- После инкубации промойте обе камеры PBS (+/+) и нанесите пипеткой 300 мкл 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS (+/+) в обеих камерах. Инкубировать в течение 1 ч при РТ.
- Тем временем подготовьте панель антител для иммунофлуоресцентного окрашивания. Для подготовки панели антител к иммунофлуоресцентному окрашиванию устанавливали пробирку с достаточным количеством 3% БСА для разбавления антител. Используйте 50 мкл разведений антител для каждой мембраны. Используйте коэффициент разведения 1:100 для панелей первичных антител и 1:200 для панелей вторичных антител. Кроме того, для вторичной панели антител готовят DAPI в соотношении разведения 1:2000. Соответствующие антитела см. в таблице 1.
- Чтобы получить прямой доступ к клеткам внутри биочипа, необходимо снять связующую фольгу. Чтобы открыть микрофлюидные камеры, сделайте точный разрез по внешней стороне полости и снимите связующую фольгу. Вырежьте мембрану, удалив скальпелем края, припаянные к биочипу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте точно и аккуратно на этом этапе, чтобы избежать повреждения мембраны и травм из-за остроты скальпеля. - Отсоединив мембрану от биочипа, разделите мембрану на две части. Соберите кусочки мембраны пинцетом и поместите их на микроскопическое предметное стекло для окрашивания.
- Пипетка 50 мкл раствора антитела на кусочек мембраны. Выдерживать в течение ночи при температуре 4 °C, в защищенном от света месте.
- После инкубации поместите мембрану в 500 мкл PBS (-/-) в 24-луночную пластину и промойте мембрану 3 раза в течение 5 минут в PBS (+/+). После промывки пипетку пипетку 50 мкл раствора вторичного антитела и инкубировать в течение 1 ч при РТ в защищенном от света месте.
- Промойте мембрану PBS (+/+) 3 раза в течение 5 минут каждая. Тем временем подготовьте и промаркируйте микроскопические предметные стекла для эксперимента. Поместите каплю монтажного материала на предметное стекло и установите соответствующую мембрану. Повторите этот шаг для всех мембран. В конце поместите еще одну каплю монтажного материала на верхнюю часть мембраны и используйте покровное стекло. Хранить при температуре 4 °C.
- Промойте полости PBS (+/+) для удаления среды клеточной культуры. Пипетку 300 мкл 4% параформальдегида (PFA) растворяют в PBS (-/-) в верхнюю камеру и 200 мкл в нижней камере и инкубируют в течение 10 мин при РТ.
Результаты
Изучение морфологических изменений и экспрессии маркерных белков может быть выполнено с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания. После совместного культивирования в течение 14 дней сосудистая и эпителиальная стороны анализируются на экспрессию соответствующих клеточных маркеров. Этот метод полезен для изучения взаимодействий и целостности сосудистых и эпителиальных компонентов, что имеет важное значение для моделирования заболевания в качестве функционального биологического считывания, связанного с инфекцией. Иммунофлуоресцентное окрашивание может быть поддержано количественным анализом, морфологической оценкой и функциональными анализами, включая высвобождение цитокинов, анализ маркеров гибели клеток, таких как высвобождение ЛДГ, и изменение морфометрии клеток5. Что касается сосудов, то целостность и морфология белков соединения эндотелиальных клеток, таких как VE-кадгерин, могут быть изучены для оценки слияния и формирования эндотелиального барьера6 (рис. 4A). После перфузии слой эндотелиальных клеток должен сливаться с четко структурированной экспрессией VE-кадгерина на границах эндотелиальных клеток. Нижняя часть мембраны может быть иммуноокрашена на эпителиальные маркеры, такие как Е-кадгерин и сурфактант белок А (SP-A)7. Экспрессия SP-A, ключевого компонента легочного сурфактанта и сложной смеси липидов и белков, снижает поверхностное натяжение на границе эпителия воздух-жидкость и тем самым предотвращает in vivo коллапс альвеол во время выдоха и поддерживает надлежащую функцию легких и газообмен 6,8. В нашей модели эпителиальные клетки экспрессируют SP-A после лечения ОПП и могут быть визуализированы с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания (рис. 4B). Слияние и целостность слоя эпителиальных клеток могут быть подтверждены иммунофлуоресцентным окрашиванием E-кадгерина, важного эпителиального соединительного маркера альвеолярных эпителиальных клеток (рис. 4C). Присутствие макрофагов может быть подтверждено иммунофлуоресцентным окрашиванием белка-производителя макрофагов CD686 (рис. 4C). Для изучения вирусной, бактериальной или грибковой инфекции ознакомьтесь с подробной информацией о моделях инфекций, представленной в Deinhardt-Emmer et al.6, Schicke et al.7 и Hoang et al.9.
Рисунок 1: Репрезентативное изображение сливающегося слоя HUVECs в биочипе на 3-й день. На изображении показана светлопольная микроскопия с 10-кратным увеличением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Установка для индукции альвеолы на кристалле и ALI. (A) Репрезентативное изображение перфузионной установки для модели альвеолы на кристалле и (B) Репрезентативное изображение индукции ALI в камере путем поглощения среды и подачи воздуха в ячейки. Образование пузырька воздуха внутри камеры свидетельствует о том, что клетки подвергаются воздействию воздуха. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Схематический обзор альвеолы на кристалле. Подробный протокол для 14 дней культивирования указывает на важные этапы посева и выращивания клеток внутри биочипа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: Иммунофлуоресцентное окрашивание эндотелиальных и эпителиальных клеточных слоев. (A) эндотелиальные клетки HUVEC экспрессируют VE-кадгерин (оранжевый), эпителиальные клетки (B-C) H441 экспрессируют (B) SP-A (красный) и (C) E-кадгерин (оранжевый), SP-A (красный) и CD68 (зеленый) экспрессию на эпителиальной стороне. DAPI (синий) окрашивает ДНК и указывает на ядра клеток. Масштабная линейка представляет собой 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Полость | Клетки |
| Верхняя полость | Эндотелиальные (0,4 x 106) |
| Нижняя полость | Эпителиальные (0,5x106H441+ 1x105 моноцитов) |
Таблица 1: Обзор посева клеток в биочипе.
Обсуждение
Модель альвеолы на чипе представляет собой многослойную тканевую модель альвеолы человека, объединяющую основные типы клеток нижних дыхательных путей, включая эпителиальные клетки легких, эндотелиальные клетки и макрофаги, культивируемые в органотипической компоновке в ОПЛ со средней перфузией эндотелиальной выстилки. Клетки разных слоев экспрессируют специфические белки клеточных маркеров, такие как Е-кадгерин, кальций-зависимая молекула адгезии эпителиальных клеток легких, которая играет центральную роль в установлении межклеточных эпителиальных барьеров 5,10. Е-кадгерин образует физический барьерный элемент и контролирует иммунологическую реакцию на вредные патогены и вещества в окружающей среде10,11. Эпителиальные клетки H441 дополнительно экспрессируют сурфактант белок А, который также имеет решающее значение в первой линии защиты хозяина от инфекции, опосредуя иммуномодулирующую и антибактериальную активность8. Интеграция иммунных клеток в альвеолюсную модель увеличивает ее клеточную сложность, тем самым улучшая репликацию иммунного ответа на воспалительные триггеры, т.е. во время инфекции. В этом контексте модель была использована для изучения коинфекции вируса гриппа А и условно-патогенного микроорганизма человека Staphylococcus aureus (S. aureus)5. В ходе исследования был выявлен механизм коинфекции при пневмонии, при которой вирусная инфекция эпителиальных клеток провоцирует значительную воспалительную реакцию, которая наносит значительные повреждения эндотелиальным клеткам, приводя к потере барьерной функции. В другом исследовании модель была использована для демонстрации того, что инфекция, вызванная S. aureus, снижает внеклеточный уровень белка сурфактанта-А (SP-A), важнейшего компонента иммунной защиты в легких, вероятно, из-за бактериальных протеаз. В то время как экспрессия SP-A напрямую не зависит ни от S. aureus, ни от вируса гриппа А, она значительно подавляется TNF-α, цитокином, который в значительной степени вырабатывается в ответ на бактериальные инфекции, особенно в присутствии макрофагов. Эти результаты свидетельствуют о том, что бактериальные моно- и суперинфекции могут снижать уровни SP-A в легких, потенциально ухудшая исход бактериальнойпневмонии. Кроме того, модель альвеолы была использована для изучения грибковой инфекции альвеолы Aspergillus fumigatus и эффективности противогрибковых препаратов с использованием микроскопии высокого разрешения и анализа изображений на основе алгоритмов в сочетании с молекулярно-биологическими анализами, включая иммунофлуоресцентное окрашивание и профилирование цитокинов7. Моделирование инвазивного легочного аспергиллеза в альвеоле-на-чипе выявило ключевые функции макрофагов человека, которые могут частично подавлять рост грибка. Макрофаги играли центральную роль в высвобождении провоспалительных цитокинов и хемокинов, что коррелировало с увеличением количества инвазивных гиф грибов. Кроме того, исследование подтвердило, что фунгистатический препарат каспофунгин эффективно ограничивает рост грибков и вызывает морфологические изменения в структуре грибов, что согласуется с результатами других исследований. Эти исследования подтверждают потенциал модельной платформы для идентификации клеточных мишеней инфекции и тестирования лекарственных препаратов в клинически значимых концентрациях.
Существует несколько аспектов, которые необходимо учитывать при создании альвеолы на чипе. Точный посев клеток имеет решающее значение для достижения равномерного распределения клеток и формирования слоев. Убедитесь, что клетки засеяны с соответствующей плотностью, чтобы достичь слияния без перерастания друг друга, что может нарушить целостность и функциональность клеточных слоев. В процессе установки ALI осторожно удалите среду с апикальной стороны и закройте порты, чтобы предотвратить загрязнение. Поддержание оптимальных условий совместного культивирования, таких как температура, уровеньCO2 и состав среды, имеет решающее значение для выживания и взаимодействия как эндотелиальных, так и эпителиальных клеток. Всегда выполняйте смену среды осторожно, чтобы не нарушить клеточные слои и не ввести пузырьки воздуха. Аккуратно пипетируйте и убедитесь, что все используемое оборудование стерильно, чтобы свести к минимуму риск загрязнения. Чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха, делайте пипетку медленно и наклоняйте чип во время смены среды, чтобы пузырьки могли выйти. Работайте в чистой, стерильной и контролируемой среде, чтобы свести к минимуму загрязнение. Учитывайте сложность и точность, необходимые для создания и поддержания 3D-модели для последующих экспериментов с моделью. Если клеточные слои формируются неправильно, рассмотрите возможность оптимизации плотности клеток и партий клеток, так как различия в росте клеток могут возникать в зависимости от донора и партии.
Несмотря на то, что модель предлагает значительные улучшения по сравнению с существующими методами, также важно признать, что необходимо учитывать некоторые ограничения. Одним из таких ограничений является сложность и стоимость, связанные с эксплуатацией микрофлюидного устройства. Для запуска моделей «орган на чипе» требуется специализированное оборудование и опыт в области микрофлюидики, чтобы принять модель альвеолы на чипе. Кроме того, хотя эта модель может успешно воспроизвести многие ключевые особенности альвеолярной среды, она не может полностью воспроизвести все клеточные взаимодействия и механические силы, обнаруженные in vivo. Например, модель не имеет всеобъемлющей иммунной системы или полного спектра типов клеток в легких человека, что может повлиять на точность исследований взаимодействия патогена и хозяина.
Несмотря на эти ограничения, модель «легкое на чипе» предлагает преимущества по сравнению с традиционными 2D-культурами клеток, такими как системы Transwell. Объединяя воздушно-жидкостный интерфейс, эндотелиальные и эпителиальные клетки, а также иммунные компоненты в многослойную ткань в динамической, перфузированной среде, модель представляет собой более физиологически релевантный подход к изучению физиологии легких, заболеваний и реакций на лечение in vitro. Это имеет решающее значение для углубления нашего понимания респираторных инфекций человека и разработки более эффективных методов лечения. Способность модели точно манипулировать биофизическими и биохимическими сигналами представляет собой важную особенность для анализа механизмов прогрессирования заболевания и действия лекарств. Использование клеточного материала человека может еще больше уменьшить межвидовые различия, наблюдаемые в экспериментах на животных. Интеграция анализа нескольких биомаркеров дополнительно увеличивает глубину и широту данных, получаемых в рамках одного эксперимента, что способствует снижению затрат на эксперименты in vitro. Признавая свои ограничения, модель «легкое на чипе» представляет собой значительный шаг вперед в исследованиях респираторных заболеваний, предлагая более точную, этичную и эффективную альтернативу традиционным методам.
Раскрытие информации
К.Р. является генеральным директором Dynamic42 GmbH и владеет акциями компании. A.S.M. является научным консультантом компании Dynamic 42 GmbH и владеет акциями компании. У всех остальных авторов конфликта интересов нет.
Благодарности
H.K. и A.S.M. выражают признательность за финансирование от Leibniz Science-Campus InfectoOptics Jena, финансируемое по линии финансирования Strategic Networking Ассоциации Лейбница. M.A. и A.S.M. были поддержаны проектом IGF IMPROVE, финансируемым Федеральным министерством экономики и энергетики на основании постановления Бундестага Германии. Компания A.S.M также выражает признательность за финансовую поддержку со стороны Кластера передового опыта Balance of the Microverse в рамках Стратегии совершенствования Германии - EXC 2051 - Project-ID 690 390713860.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <Сильно>Расходные материалы | |||
| Камерные слайды для подсчета клеток (Графиня) | Invitrogen | C10283 | |
| Многолуночные планшеты для клеточных культур, 24 лунки, стерил | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| Многолуночные планшеты для клеточных культур, 6 лунок, стерил | Greiner Bio-One | 657 160 | |
| Покровные стекла (24x40мм; #1.5) | Menzel-Glä ser | 15747592 | |
| Эко салфетки | Dr. Schuhmacher | 00-915-REW10003-01 | |
| Eppies 2.0 | Sarstedt | 72.691 | |
| Eppis 0.5 | Sarstedt | 72.699 | |
| Eppis 1.5 | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Falcons 15mL | Greiner Bio-One | 188 271-TRI | |
| Falcons 50mL | Greiner Bio-One | 227 261-TRI | |
| Марлевый тампон | Noba | PZN 2417767 | |
| Перчатки Nitril 3000 | Meditrade | 1280 | |
| Предметные стекла для микроскопа | Menzel-Glä ser | AAAA000001##12E | |
| Многолуночные планшеты 24 лунки, стерильные | Greiner Bio-One | 662 160 | |
| пипеток Пастера (стекло) 150 мм | Assistent | 40567001 | |
| пипетки Пастера (стекло) 230 мм | Assistent | 40567002 | |
| трубки с круглым дном (PS, 5 мл) | Falcon | 352052 | |
| Safety-Multifly-Set, 20G, 200 мм | Sarstedt | 85.1637.235 | |
| Скальпели | Dahlhausen | 11.000.00.715 | |
| Серологические пипетки 10 мл | Greiner Bio-One | 607 160-TRI | |
| Серологические пипетки 25 мл | Greiner Bio-One | 760 160-TRI | |
| Серологические пипетки 2 мл | Greiner Bio-One | 710 160-TRI | |
| Серологические пипетки 50 мл | Greiner Bio-One | 768 160-TRI | |
| Серологические пипетки 5 мл | Greiner Bio-One | 606 160-TRI | |
| S-Monovette, 7,5 мл Z-гель | Sarstedt | 1.1602 | |
| S-Monovette, 9,0 мл K3E | Sarstedt | 02.1066.001 | |
| Softasept N | Braun | 3887138 | |
| T25 колба | Greiner Bio-One | 690 960 | |
| Насадки стерильные 10&микро; L | Greiner Bio-One | 771 261 | |
| Наконечники стерильные 1250&микро; L | Greiner Bio-One | 750 261 | |
| Наконечники стерильные 300&м; L | Greiner Bio-One | 738 261 | |
| Наконечники нестерильные 10&микро; L | Greiner Bio-One | 765 290 | |
| наконечников нестерильных 1000&микро; L | Greiner Bio-One | 739 291 | |
| Наконечники нестерильные 200&микро; L | Greiner Bio-One | 686 290 | |
| пинцетов (prä zisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 мм) | Roth | K343.1 | |
| Chemicals | |||
| Descosept AF | Dr. Schuhmacher | N-20338 | |
| Этанол 96% | Nordbrand-Nordhausen | 410 | |
| Флуоресцеин изотиоцианат (FITC)-декстран (3-5 кДа) | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Флуоресцентная монтажная среда | Dako | S3023 | |
| Метанол | VWR | 20847.295 | |
| Сапонин | Fluka | 47036 | |
| Тергазим | Alconox | 1304-1 | |
| Культура клеток | |||
| Коллаген IV | Sigma-Aldrich | C5533-5MG | |
| Dexametason | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DPBS (-/-) | Lonza | BE17-516F | |
| DPBS (+/+) | Lonza | BE17-513F | |
| ЭДТА раствор | Sigma-Aldrich | E788S | |
| Среда для роста эндотелиальных клеток | Promocell | C-22020 | |
| Смесь добавок | Promocell | C-39225 | |
| Фетальная бычья сыворотка | Sigma-Aldrich | E2129-10g | |
| H441 | ATCC | ||
| Человеческий рекомбинантный GM-CSF | Peprotech | 300-30 | |
| Лидокаин | Sigma-Aldrich | L5647-15G | |
| Пенициллин-стрептомицин (10,000 ЕД/мл) | Gibco | 15140-122 /-163 | |
| RPMI | Gibco | ||
| Трипановый синий краситель 0,4% | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Primary антитела | |||
| Cadherin-5 / VE-Cadherin (козлятник) | BD | 610252 | |
| CD68 (кролик) | CellSignaling | 76437 | |
| E-Cadherin (козлятник) | НИР D | AF748 | |
| SP-A (мышь) | Abcam | ab51891 | |
| Вторичные антитела | |||
| AF488 (ослица против мыши) | Invitrogen | R37114 | |
| AF647 (ослица против мыши) | invitrogen | A31571 | |
| AF647 (ослица против кролика) | Invitrogen | A31573 | |
| Cy3 (ослик против козы) | jackson research | 705-165-147 | |
| Microfluidic | |||
| Chip | Dynamic 42 | BC002 | |
| Замок Люэра с наружной резьбой (маленький) | ChipShop | 09-0503-0270-09 | |
| Вилки с наружной резьбой, ряд из четырех, полипропилен, зеленый | микрофлюидный чипшоп | 09-0558-0336-11 | |
| Вилки мини люэра с наружной резьбой, ряд из четырех, полипропилена, непрозрачный | микрофлюидный чипшоп | 09-0556-0336-09 | |
| Штекер мини люэровские вилки, ряд из четырех, ПП, красный | микрофлюидный чипшоп | 09-0557-0336-10 | |
| Заглушки | Cole Parmer | GZ-45555-56 | |
| Резервуар 4,5 мл | ChipShop | 16-0613-0233-09 | |
| Динамические трубки | 42 | ST001 | |
| Equipment | |||
| Autoclave | Tuttnauer | 5075 ELV | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| CO2 Инкубатор | Heracell | 150i | |
| Countess автоматизированный счетчик клеток | Invitrogen | C10227 | |
| Flowcytometer | BD | FACS Canto II | |
| Морозильная камера (-20 °°; C) | Морозильная камера Liebherr | LCexv 4010 | |
| (-80 °; C) | Heraeus | Herafreeze HFU 686 | |
| Холодильник | Liebherr | LCexv 4010 | |
| Heraeus Multifuge | Thermo Scientific | X3R | |
| Микроскоп | Leica | DM IL LED | |
| LED Orbital Shaker | Heidolph | Reax2000 | |
| Перистальтический насос | REGLO Digital MS-4/12 | ISM597D | |
| Пипетки 10&микро; L | Eppendorf Research plus | 3123000020 | |
| дозаторы 100&микро; L | Eppendorf Research plus | 3123000047 | |
| пипетки 1000&микро; L | Eppendorf Research plus | 3123000063 | |
| дозаторы 2,5&микро; L | Eppendorf Research plus | 3123000012 | |
| пипетки 20&микро; L | Eppendorf Research plus | 3123000039 | |
| пипетки 200&микро; L | Eppendorf Research plus | 3123000055 | |
| Scale | Sartorius | 6101 | |
| Scale | Sartorius | TE1245 | |
| Стерильная скамья | Kojair | Biowizard SL-130 | |
| Водяная баня | Julabo | SW-20C | |
| Настройка флуоресцентного микроскопа | |||
| Apotome.2 | Zeiss | ||
| HXP 120 C | |||
| Микроскоп | Zeiss | Axio Observer 5 | |
| Оптический срез | Zeiss | ApoTome | |
| Power Supply Микроскоп | Zeiss | Eplax VP232 | |
| Software | |||
| ZEN Синяя версия | Zeiss |
Ссылки
- Mettelman, R. C., Allen, E. K., Thomas, P. G. Mucosal immune responses to infection and vaccination in the respiratory tract. Immunity. 55 (5), 749-780 (2022).
- Artzy-Schnirman, A., et al. Advanced in vitro lung-on-chip platforms for inhalation assays: From prospect to pipeline. Eur J Pharma Biopharma. 144, 11-17 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nat Meth. 13 (2), 151-157 (2016).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. A multi-organ chip with matured tissue niches linked by vascular flow. Nat Biomed Eng. 6 (4), 351(2022).
- Deinhardt-Emmer, S., et al. Co-infection with staphylococcus aureus after primary influenza virus infection leads to damage of the endothelium in a human alveolus-on-a-chip model. Biofabrication. 12 (2), 025012(2020).
- Schicke, E., et al. Staphylococcus aureus lung infection results in down-regulation of surfactant protein-a mainly caused by pro-inflammatory macrophages. Microorganisms. 8 (4), 577(2020).
- King, S. D., Chen, S. Y. Recent progress on surfactant protein a: Cellular function in lung and kidney disease development. Am J Physiol Cell Physiol. 319 (2), C316-C320 (2020).
- Hoang, T. N. M., et al. Invasive aspergillosis-on-chip: A quantitative treatment study of human aspergillus fumigatus infection. Biomaterials. 283, 121420(2022).
- Yuksel, H., Ocalan, M., Yilmaz, O. E-cadherin: An important functional molecule at respiratory barrier between defence and dysfunction. Front Physiol. 12, 720227(2021).
- Van Roy, F., Berx, G. The cell-cell adhesion molecule e-cadherin. Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).
Перепечатки и разрешения
Теги
