В этом протоколе описан надежный метод получения биопленки пленки. Метод может быть масштабирован на различные объемы культур, что позволяет легко использовать его для различных экспериментальных целей. Дизайн метода позволяет качественно или количественно оценить биопленкообразующий потенциал нескольких видов микобактерий.
Методическая статья
Выращивание биопленки микобактерий в качестве модели для изучения устойчивости к противомикробным препаратам
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Многие бактерии процветают в сложных природных сообществах, проявляя ключевые атрибуты многоклеточности, такие как общение, сотрудничество и конкуренция. Наиболее распространенным проявлением бактериального многоклеточного поведения является образование биопленок, часто связанных с патогенностью. Биопленки обеспечивают защиту от противомикробных агентов, способствуя возникновению устойчивости к противомикробным препаратам. Традиционная практика культивирования бактерий в жидких культурах из колб не отражает их надлежащий физиологический рост в природе, что ограничивает наше понимание их сложной динамики. Примечательно, что метаболические и транскрипционные профили бактерий, обитающих в биопленках, очень похожи на профили естественно растущих клеток. Этот параллелизм подчеркивает важность биопленок как идеальной модели для фундаментальных и трансляционных исследований. В данной статье основное внимание уделяется использованию Mycobacterium smegmatis в качестве модельного организма для иллюстрации метода культивирования биопленок пелликулы. Этот подход может быть адаптирован к различным объемам культур, что облегчает его реализацию для различных экспериментальных целей, таких как исследования противомикробных препаратов. Кроме того, дизайн метода позволяет качественно или количественно оценить биопленкообразующие способности различных видов микобактерий с незначительными корректировками.
Введение
Бактерии способны выживать в виде одноклеточных сущностей; Однако в большинстве физиологически значимых состояний они организуются в миметики сообщества. Биопленка — это широко признанная общественная организация бактерий, образованная агрегированными клетками, заключенными в самостоятельно производимую матрицу1. Такая сборка обладает признаками ранней многоклеточности и обеспечивает более высокую стрессоустойчивость к бактериальным системам. Биопленки часто толерантны к противомикробным препаратам и, по оценкам, являются причиной почти 80% микробных инфекций 2,3.
Встряхивание колб и планшетные культуры традиционно являются обычной практикой для бактериального культивирования. Их огромную приемлемость и успех можно объяснить простотой в обращении, воспроизводимостью и масштабируемостью. Однако отсутствие физиологического контекста ограничивает трансляционный потенциал знаний, полученных с помощью таких систем4. Таким образом, биопленки становятся привлекательной модельной системой для изучения бактериальной патофизиологии. Биопленки представляют собой динамическую модельную систему, точно отражающую природные условия, что позволяет исследователям воспроизводить физиологические аспекты, такие как градиенты питательных веществ и пространственная неоднородность 5,6.
Биопленочный образ жизни особенно актуален в исследованиях микобактерий, поскольку микобактерии, в том числе печально известная Mycobacterium tuberculosis, являются адептами биопленкообразующих7. Их способность процветать в биопленках способствует их стойкости в тканях хозяина во время инфекций. Это представляет собой огромную проблему в лечении микобактериальных заболеваний, учитывая присущую антибиотикам устойчивость, связанную с биопленочным образом жизни8. Биопленки также представляют собой идеальную модельную систему для изучения метаболизма микобактерий, поскольку они позволяют исследовать уникальные метаболические адаптации и стратегии использования питательных веществ, используемые микобактериями в сложныхмикробных сообществах.
В то время как биопленка все чаще принимается в качестве лучшей модельной системы для исследований микобактерий10, существует потребность в последовательных и воспроизводимых стандартных операционных процедурах, особенно для проведения параллелей между исследованиями, проводимыми в различных лабораториях. Описанный здесь метод описывает процедуры формирования биопленки для вида микобактерий M. smegmatis. M. smegmatis является более доступной моделью для изучения биопленок микобактерий, учитывая ее непатогенность и более быструю кинетику образования биопленки. Метод может быть модифицирован в соответствии с такими приложениями, как скрининг антимикобактерий, экстракция метаболитов и омиксные исследования.
Протокол
Подробная информация обо всех реактивах и оборудовании, использованных для исследования, приведена в Таблице материалов.
1. Подготовка среды Sauton
- Приготовьте 50 мл 2,5% раствора дигидрофосфата калия, тщательно взвесив 1,25 г дигидрофосфата калия и растворив его в 50 мл деионизированной воды.
- Приготовьте 50 мл 2,5% раствора сульфата магния, взвесив 2,56 г сульфата магния и растворив его в 50 мл деионизированной воды.
- Приготовьте 10 мл 5% раствора цитрата железа и аммония, весом 0,5 г цитрата железа и аммония и растворив его в 10 мл деионизированной воды. Храните его в янтарной тубе.
- Приготовьте 100 мл 20% раствора глюкозы, взвесив 20 г глюкозы и растворив ее в 100 мл деионизированной воды. Фильтр-стерилизация осуществляется с помощью стерильного шприца объемом 50 мл и шприцевого фильтра 0,2 мкМ PVDF в пробирке.
- Приготовьте 10 мл стерильного 1% раствора сульфата цинка, тщательно взвесив 0,1 г сульфата цинка и растворив его в 10 мл деионизированной воды. Фильтр-стерилизация осуществляется с помощью стерильного шприца объемом 10 мл и шприцевого фильтра PVDF объемом 0,2 мкМ в ламинарном колпаке.
- Подготовленные компоненты смешать с 750 мл деионизированной воды, как описано в таблице 1. Измерьте pH раствора и отрегулируйте его до 7. Восполните объем до 900 мл деионизированной водой.
- Автоклавируйте среду при 15 PSI и 121 °C в течение 15-20 минут. Дайте ему остыть. Затем добавьте 100 μл стерилизованного фильтром 1% сульфата цинка. Добавьте 100 мл стерилизованной фильтром 20% глюкозы и хорошо растворите ее.
2. Приготовление фильтрованного стерилизованного 5% твина-80
- Растворите 0,5 мл Tween-80 в 9,5 мл деионизированной воды.
- Стерилизуют раствор с помощью стерильного шприца объемом 10 мл и шприцевого фильтра 0,2 мкМ PVDF в ламинарном колпаке.
3. Подготовка первичной культуры
- В ламинарном колпаке с помощью серологической пипетки можно распределить 2 мл автоклавированной среды LB в две стерильные пробирки объемом 14 мл.
- Добавьте 20 мкл стерилизованного фильтром 5% Tween-80 в пробирки с помощью микропипетки.
- Инокулируйте M. smegmatis в одну из пробирок, добавив его криоматериал с помощью петли инокуляции. Другая пробирка служит в качестве контроля среды.
- Инкубируйте пробирки в течение 48 ч в вибростенде при 300 об/мин и 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: На трубке управления средой не должно быть видно роста.
4. Подготовка вторичной культуры
- В ламинарном колпаке с помощью серологической пипетки можно распределить 2 мл автоклавированной среды LB в две стерильные пробирки объемом 14 мл.
- Добавьте 20 мкл стерилизованного фильтром 5% Tween-80 в пробирки с помощью микропипетки.
- Добавьте 20 мкл первичной культуры в одну из пробирок с помощью микропипетки. Держите другую трубку в качестве средства контроля среды.
- Инкубируйте культуры в шейкерном инкубаторе при 300 об/мин и 37 °C до тех пор, пока они не достигнут наружного диаметра600 от 0,6 до 0,8.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно требуется от 12 до 14 часов, чтобы достичь внешнего диаметра600 от 0,6 до 0,8. Можно использовать и другие плотности ячеек, но определенное значение OD600 помогает в сравнительных исследованиях.
5. Установка биопленки
- В ламинарном колпаке дозируйте 6 мл среды Саутона с добавлением 2% глюкозы в каждую лунку 6-луночного планшета с помощью серологической пипетки.
- В соответствующие лунки ввели 120 мкл (т.е. 2%) вторичного инокулюма с помощью микропипетки. Держите один из них непривитым в качестве средства контроля среды.
- Смешайте среду и культуру, пипетируя вверх и вниз микропипеткой объемом 1 мл. Накрываем крышкой и тщательно заклеиваем тарелку парафиновой пленкой.
- Непрерывно инкубируйте планшет в статическом инкубаторе при температуре 37 °C в течение 7 дней.
6. Настройка биопленок для стадийно-специфичных наблюдений
ПРИМЕЧАНИЕ: Общая структура биопленки такая же, как описана на шаге 5. Для сбора или изображения биопленки в разные моменты времени предлагается, чтобы одна и та же биопленка была установлена в нескольких наборах на отдельных планшетах.
- Для наблюдения биопленок в период с 3 по 6 день подготовьте четыре планшета с идентичными условиями и используйте одну пластину в день для визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слой биопленки начинает появляться на границе воздух-среда, начиная с третьего дня после установки планшета.
7. Оценка развития биопленки
- Визуальная оценка
- Визуализируйте пластины с помощью гелевой системы документирования с эпи-белым светом (рис. 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация дает общую качественную и количественную оценку образовавшейся биопленки. В качестве альтернативы можно использовать любую камеру хорошего качества.
- Визуализируйте пластины с помощью гелевой системы документирования с эпи-белым светом (рис. 1).
- Оценка сухой массы
- Выполнение измерения сухого веса для более точного количественного определения.
- Чтобы измерить сухой вес, начните с взвешивания промокательной бумаги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо промокательной бумаги также можно использовать фильтровальную бумагу. - Извлеките биопленку из 6-луночного планшета и перенесите ее на бумагу с помощью шпателя.
- Тщательно соберите большую часть биопленки с культуры, стараясь не перенести чрезмерное количество среды на бумагу.
- Поместите биопленку на промокательную бумагу.
- Поместите его в инкубатор при температуре 50 °C на 0,5-1 ч до полного высыхания биопленки.
- Измерьте общий вес бумаги и биопленки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сухая масса биопленки=(Масса биопленки + бумага)-(Масса бумаги)
8. Определение толерантности к антибиотикам в биопленках
- Оцените MIC90 рифампицина в планктонной культуре M. smegmatis в соответствии с протоколом, описанным Irith Wiegand et al., с использованием среды Sauton11. Добавляйте антибиотик, когда культуры достигнут наружного диаметра600 0,2.
- Настройте планшеты для роста биопленки, как описано в шаге 5 протокола.
- На четвертый день инкубации добавляют рифампицин в культуры в концентрации MIC90 (64 мкг/мл) с боков лунки с помощью микропипетки в ламинарном колпаке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Делайте это осторожно, не слишком повреждая биопленку. Оставьте одну из лунок с биопленкой необработанной. - Медленно перемешивайте пластины, чтобы смешать антибиотики.
- Застелите боковые стороны пластин парафиновой пленкой и держите их в инкубаторе для дальнейшего выращивания.
- Через 24 ч снимите пластины с ламинарного колпака и добавьте Твин-80 до конечной концентрации 0,2% во все лунки, содержащие биопленку.
- Еще раз накройте пластины парафиновой пленкой и держите их при температуре 4 °C и 100 об/мин в течение 12 часов.
- Выньте планшеты в ламинарный колпак и гомогенизируйте компоненты с помощью микропипетки объемом 1 мл.
- Промойте компоненты средой Sauton в соответствии с протоколом, описанным в Anand et al.12.
- Наконец, ресуспендируйте клетки в среде Саутона объемом 6 мл и разбавьте до конечных концентраций 10-4, 10-5, 10-6 и 10-7.
- Распределите по 100 мкл каждого разбавления на пластины LB-агара с помощью автоклавных стеклянных шариков.
- Запечатайте все пластины с помощью парафиновой пленки и держите их в инкубаторе при температуре 37 °C.
- Через 3 дня инкубации подсчитайте колонии на каждой пластине. Учитывайте только тарелки с числом колоний от 30 до 300.
- Рассчитайте КОЕ/мл и относительное уменьшение КОЕ/мл по приведенным формулам13.
ПРИМЕЧАНИЕ: КОЕ/мл = (Число колоний × коэффициентом разбавления) / (Объем покрытия (в мл))
Относительное уменьшение КОЕ/мл = ((КОЕ/мл в необработанных - КОЕ/мл в обработанных)) / ((КОЕ/мл в необработанных)) × 100
Результаты
Биопленочные пленки становятся видимыми невооруженным глазом с третьего дня. Хотя биопленка растет на средах Саутона без 2% глюкозы, при его добавлении наблюдалось улучшение сетчатости. Мы получали 10,48 мг ± 3,13 мг (n = 4) сухой массы биопленки из каждой лунки 24-луночного планшета с 1,5 мл среды Саутона (с добавлением 2% глюкозы), выращенной в течение четырех дней. На рисунке 2 развитие биопленки было видно с 3-го по 6-й день. Он начинает образовывать пленку с небольшой сетчатостью на 3-й день, а к 5-му дню он полностью созревает. Начиная с 6-го дня, биопленка начинает разрушаться. MIC90 рифампицина (64 мкг/мл) снижал КОЕ биопленки на 25% ± всего на 12% (n = 3).
Рисунок 1: Биопленки M. smegmatis после 4 дней инкубации в среде Sauton. (1) Без глюкозы и с 2% посевом. (2) Без глюкозы и с инокулированным 4% инокулятом. (3) С 2% глюкозой и инокулированным 2% инокулятом. (4) С 2% глюкозы и инокулированным 4% инокулятом. (5) и (6) являются средствами управления средой. Здесь образцы находятся в стандартных 6-луночных планшетах. Фотографии получаются без какого-либо увеличения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Морфология биопленки M. smegmatis с3-го дня после инокуляции до6-го дня. Здесь образцы находятся в стандартных 24-луночных планшетах. Фотографии получаются без какого-либо увеличения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
| S. No. | Компонент | Рабочая концентрация (б/об) | Концентрация исходного раствора | Объем/Вес складского решения | |||||
| 1 | Дигидрофосфат калия | 0.05% | 2.50% | 20 мл | |||||
| 2 | Сульфат магния | 0.05% | 2.50% | 20 мл | |||||
| 3 | Цитрат железа и аммония | 0.01% | 5% | 1 мл | |||||
| 4 | Глицерин | 6% | 100% | 60 мл | |||||
| 5 | L- Аспарагин | 0.40% | NA | 4 г | |||||
| 6 | Лимонная кислота | 0.20% | NA | 2 г | |||||
Таблица 1: Компоненты для подготовки среды Sauton.
Обсуждение
Многоклеточный образ жизни микробов был описан почти столетие назад; Тем не менее, клинические исследования остаются редкими, в основном из-за отсутствия надежных методов14. Методы, описанные в работах по биологии биопленки, часто трудно адаптировать. Ожидается, что в данном случае детальная методология, подкрепленная демонстрацией критических шагов, улучшит воспроизводимость протоколов.
Описанный в данной статье метод получения биопленки является масштабируемым, требующим пропорционального увеличения объема среды и размера инокулята. Для таких применений, как экстракция метаболитов, требуется больший объем культуры, в то время как для анализа чувствительности к противомикробным препаратам требуется меньшая биомасса12. Кроме того, размер инокулюма может быть отрегулирован в соответствии со скоростью образования биопленки. Такая гибкость позволяет исследователям надлежащим образом контролировать продолжительность экспериментов.
Условия роста и микроокружение играют решающую роль в физиологии биопленки15. Примечательно, что наличие глюкозы не является обязательным для формирования биопленки; Тем не менее, было замечено, что включение 2% глюкозы усиливает сетчатость и стабильность биопленки. Еще одним интересным наблюдением является потенциал усиления биопленки при размещении стеклянного покровного стекла на дне культуральных лунок. Добавление Tween-80 как в первичные, так и во вторичные культуры имеет решающее значение для смягчения клеточной агрегации.
Развитие биопленки включает в себя различные фазы роста, такие как прикрепление, созревание и рассеивание. В то время как описанная здесь биопленка обычно инкубируется в течение 7 дней, пленки становятся видимыми невооруженным глазом с3-го дня и далее. Такая установка позволяет изучать временную динамику развития биопленки. В то время как в данной статье описывается оценка сухой массы для оценки биомассы биопленки, установка также поддается традиционному окрашиванию кристаллическим фиолетовым цветом или оценке на основе микроскопии12,16.
Образование биопленок микобактериями играет существенную роль в их патогенности и придает повышенную устойчивость к лекарственным препаратам 8,17. Мы наблюдали в семь-восемь раз более высокую толерантность к антибиотикам в биопленочных культурах по сравнению с культурами встряхивающих колб. Несколько групп используют биопленки в качестве модельной системы для изучения физиологии бактерий; Более широкое внедрение этого способа роста сообществом исследователей микобактерий может дать новое понимание патофизиологии различных патогенных видов в пределах этого рода.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана стипендией DBT-Ramalingaswami, присужденной Амитешу Ананду.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,2 & микро; M PVDF шприцевой фильтр | Axiva | SFNY04 R | |
| 1 мл наконечники | Genetix | GXM-611000 C | |
| 10 & микро; L-образные наконечники | Genetix | GXM-6110 C | |
| 200 & L наконечники | Genetix | GXM-61200C | |
| 6-луночные полипропиленовые пластины | Tarsons | 980010 | |
| Янтарные трубки | Tarsons | 546051 | |
| Автоклав | Hospharma | ||
| Шкаф биобезопасности A II | MSET | ||
| Промокательная бумага | любого подходящего производителя | ||
| Центрифуга | Eppendorf | ||
| Лимонная кислота | Sigma | 251275 | |
| Кюветы | Bio-Rad | 2239955 | |
| Цитрат железа и аммония | Sigma | F5879 | |
| Система документирования геля | Bio-Rad | ||
| Стеклянные бусины | Sigma | G8772 | |
| Глюкоза | Sigma | 49139 | |
| Глицерин | Sigma | G5516 | |
| Петли инокуляции | Genaxy | HS81121C | |
| L-аспаргина | Sigma | A0884 | |
| LB-агар | Himedia | M1151 | |
| LB-media | Himedia | M575 | |
| M. smegmatis mc2155 cryo-stock | ATCC 700084 | ||
| Сульфат магния | Sigma | M2643 | |
| Микропипетки | Gilson | ||
| Parafilm | Tarsons | ||
| Petri Dish | Tarsons | 460020 | |
| pH-метр | Labman Scientific Instruments | ||
| Планшетный ридер | Tecan | ||
| Полипропиленовые пробирки | Genaxy | GEN-14100-PS | |
| Одноосновной фосфат калия | Sigma | P5379 | |
| Рифампицин | MedchemExpress | HY-B0272 | |
| Серологическая пипетка | SPL Life Sciences | 95210 | |
| Шейкер Инкубатор | Eppendorf | ||
| Шпатель | |||
| Спектрофотометр | Thermo Scientific | ||
| Статический инкубатор | CARON | ||
| Sterile 10 мл Шприц | Becton Dickinson | 309642 | |
| Стерильный 50 мл Шприц | Becton Dickinson | 309653 | |
| Tween-80 | Sigma | P1754 | |
| Весовые весы | Sartorius | ||
| Сульфат цинка | Sigma | Z0251 |
Ссылки
- Davey, M. E., O'toole, G. A. Microbial biofilms: From ecology to molecular genetics. Microbiol Mol Biol Rev. 64 (4), 847-867 (2000).
- Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nat Rev Microbiol. 18 (10), 571-586 (2020).
- Davies, D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov. 2 (2), 114-122 (2003).
- Hernández-Jiménez, E., et al. Biofilm vs. planktonic bacterial mode of growth: Which do human macrophages prefer. Biochem Biophys Res Commun. 441 (4), 947-952 (2013).
- Nadell, C. D., Drescher, K., Foster, K. R. Spatial structure, cooperation and competition in biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (9), 589-600 (2016).
- Jo, J., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. Gradients and consequences of heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 20 (10), 593-607 (2022).
- Keating, T., et al. Mycobacterium tuberculosis modifies cell wall carbohydrates during biofilm growth with a concomitant reduction in complement activation. Cell Surf. 7, 100065(2021).
- Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Mol Microbiol. 69 (1), 164-174 (2008).
- Dietrich, L. E. P., et al. Bacterial community morphogenesis is intimately linked to the intracellular redox state. J Bacteriol. 195 (7), 1371-1380 (2013).
- Kulka, K., Hatfull, G., Ojha, A. K. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms. J Vis Exp. (60), e3820(2012).
- Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).
- Anand, A., et al. Polyketide quinones are alternate intermediate electron carriers during mycobacterial respiration in oxygen-deficient niches. Mol Cell. 60 (4), 637-650 (2015).
- Growth Curves: Generating Growth Curves Using Colony Forming Units and Optical Density Measurements. , Available from: https://www.jove.com/v/10511/growth-curves-cfu-and-optical-density-measurements (2019).
- Høiby, N. A personal history of research on microbial biofilms and biofilm infections. Pathog Dis. 70 (3), 205-211 (2014).
- Rajewska, M., Maciąg, T., Jafra, S. Carbon source and surface type influence the early-stage biofilm formation by rhizosphere bacterium Pseudomonas donghuensis P482. bioRxiv. , (2023).
- O'Toole, G. A. Microtiter dish biofilm formation assay. J Vis exp. (47), e2437(2011).
- Chakraborty, P., Bajeli, S., Kaushal, D., Radotra, B. D., Kumar, A. Biofilm formation in the lung contributes to virulence and drug tolerance of Mycobacterium tuberculosis. Nat Comm. 12 (1), 1606(2021).
Перепечатки и разрешения
