Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение костного мозга мышей у новорожденных и получение макрофагов костного мозга

3.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66613

⸱

24 мая 2024 г.

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, & Cell Biology, West Virginia University School of Medicine, 2Vaccine Development Center, West Virginia University Health Sciences Center

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает неферментативный и простой метод выделения 7-9-дневных клеток костного мозга новорожденных мышей и получения дифференцированных макрофагов с использованием надосадочной жидкости клеток L929 в качестве источника гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (M-CSF). Макрофаги, полученные из костного мозга, были дополнительно проанализированы на поверхностные антигены F4/80, CD206, CD11b и функциональную компетентность.

Аннотация

Хорошо известны различные методы выделения костного мозга от взрослых мышей. Тем не менее, выделение костного мозга у неонатальных мышей является сложной и трудоемкой задачей, но для некоторых моделей это является трансляционно актуальным и необходимым. Этот протокол описывает эффективный и простой метод получения клеток костного мозга у 7-9-дневных щенков. Затем эти клетки могут быть дополнительно выделены или дифференцированы в конкретные типы клеток, представляющие интерес. Макрофаги являются важнейшими иммунными клетками, которые играют важную роль в воспалении и инфекции. Во время развития неонатальные макрофаги вносят значительный вклад в ремоделирование тканей. Более того, фенотип и функции неонатальных макрофагов отличаются от таковых у их взрослых собратьев. В этом протоколе также описана дифференцировка неонатальных макрофагов из выделенных клеток костного мозга в присутствии среды, кондиционированной L929. Поверхностные маркеры дифференцированных неонатальных макрофагов оценивали с помощью проточного цитометрического анализа. Для демонстрации функциональности фагоцитарная эффективность также была проверена с использованием pH-чувствительной красителя, конъюгированной с Escherichia coli.

Введение

Костный мозг включает в себя как гемопоэтические, так и мезенхимальные популяции стволовых клеток, которые являются самовозобновляемыми и могут дифференцироваться в различные клеточные линии. Гемопоэтические стволовые клетки в костном мозге дают начало миелоидным и лимфоидным линиям1. Мезенхимальные стволовые клетки продуцируют остеобласты (кости), адипоциты (жир) или хондроциты (хрящи)2. Эти клетки имеют множество применений в области клеточной биологии и тканевой инженерии, включая генную терапию 3,4. Клетки-предшественники, присутствующие в костном мозге, дифференцируются в определенные типы клеток в присутствии факторов, специфичных для линии. Эритропоэтин способствует пролиферации эритроидных клеток-предшественников, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) стимулирует рост колоний нейтрофилов, а тромбопоэтин регулирует выработку тромбоцитов в качестве нескольких примеров линейно-специфических факторов роста5. FACS, меченный антигеном на клеточной поверхности, и магнитно-активируемая сортировка клеток (MACS) являются хорошо зарекомендовавшими себя методами выделения и очистки специфических типов клеток, полученных из костного мозга6.

Несмотря на то, что неонатальные исследования продвигаются вперед в направлении поиска причин неонатальной смертности и устранения осложнений при преждевременных родах, прямая терапевтическая разработка остается неудовлетворенной медицинской потребностью. Смит и Дэвис утверждали: «Педиатрические пациенты остаются терапевтическими сиротами»7. Существует несколько проблем, таких как небольшие выборки, пожизненные последствия исхода и этические проблемы при получении согласия в клинических исследованиях новорожденных8. Следовательно, существует высокий спрос на модели исследований in vivo и in vitro , специфичные для новорожденных, для достижения трансляционной релевантности. Из-за сходства между анатомическим и тканевым уровнями, коротких периодов беременности и размеров помета, грызуны являются наиболее изученной модельной системой млекопитающих.

В этой статье мы опишем подробную, вполне осуществимую и воспроизводимую процедуру выделения костного мозга у 7-9-дневных детенышей мышей и их способность дифференцироваться в макрофаги. Тем не менее, разнообразие клеточных линий может быть достигнуто с помощью различных сигналов дифференцировки. Мы также демонстрируем наличие маркеров клеточной поверхности и наличие фагоцитарной активности in vitro , ожидаемой для макрофагов, полученных из костного мозга (МПМД).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры были одобрены Комитетами по уходу за животными и их использованию в учреждении Западной Вирджинии и выполнены в соответствии с рекомендациями Руководства по уходу за лабораторными животными и их использованию Национальным исследовательским советом. Для исследования использовались мышиные щенки C57BL/6J. Подробная информация обо всех используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка СМИ

  1. Приготовьте 3 мл питательных сред MEM с добавлением 10% FBS, 2 мМ глутамина, 25 мМ HEPES и пенициллина (100 Ед/мл)/стрептомицина (100 мкг/мл) в центрифужной пробирке объемом 5 мл и держите на льду.
  2. При необходимости хранения предшественников костного мозга в жидком азоте готовят замораживающие среды, содержащие 10% DMEM, 80% FBS и 10% DMSO.
  3. Для получения полного DMEM приготовьте DMEM с добавлением 10% FBS, 2 мМ глутамина, 25 мМ HEPES и пенициллина (100 Ед/мл)/стрептомицина (100 мкг/мл).
  4. Для дифференцировки макрофагов готовят DMEM с добавлением 10% FBS, 2 мМ глутамина, пенициллина (100 Ед/мл)/стрептомицина (100 мкг/мл) и 10% L929-клеточного супернатанта 9,10,11.

2. L929-клеточный супернатант препарат

  1. Разморозьте клетки L929, хранящиеся в жидком азоте, и перенесите в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 5 мл полного DMEM. Центрифуга при 350 х г в течение 5 минут при комнатной температуре.
  2. Ресуспендируйте клетки в 5 мл полной среды DMEM и засейте их в колбу для культуры тканей T25 с плотностью 2×105 клеток. Подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек, используя 0,4% трипанового синего. Инкубируйте при 37 °C с 5%CO2 до тех пор, пока конфлюентность не достигнет 70%.
  3. Чтобы отделить клетки, сначала промойте их 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS). Аспирируйте PBS и замените его 2,5 мл 0,05% трипсина-ЭДТА.
  4. Инкубировать при 37 °C с 5%CO2 в течение 5 минут и добавить 5 мл полного DMEM.
  5. Соберите ячейки и центрифугируйте при 350 х г в течение 5 минут при комнатной температуре.
  6. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 15 мл полной среды DMEM и переложите ее в колбу T75.
  7. Инкубируйте при 37 °C с 5%CO2 до тех пор, пока клетки не достигнут 90% конфлюенции, а затем соберите среду и центрифугируйте при 500 x g в течение 5 минут при 4 °C. Фильтрующий материал, содержащий M-CSF, пропустить через фильтр 0,45 мкм и заморозить при -80 °C в 5 мл аликвот.

3. Подготовка животных

  1. Под шкафом биобезопасности осторожно отделите 7-9-дневных детенышей мыши C57BL/6J (помет из 6 щенков) от матери и поместите их в отдельную клетку.
  2. Замочите ватный тампон в 2 мл ветеринарного изофлурана в банке-колокольчике или другой камере содержания.
  3. Поместите щенка в камеру и закройте крышкой. Наблюдайте за новорожденным в течение примерно 90 секунд, чтобы убедиться, что он становится неподвижным и бессознательным.
  4. Быстро извлеките щенка и обезглавьте его острыми ножницами (следуя утвержденным в учреждении протоколам), прежде чем щенок сможет прийти в сознание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Новорожденные не дышат достаточно глубоко для эвтаназии только при вдыхании изофлурана.
  5. Обязательно закрывайте крышку контейнера после того, как каждый щенок будет удален. Этот же ватный тампон можно использовать для 5-7 щенков.

4. Выделение костного мозга новорожденных

  1. Простерилизуйте тело новорожденного с помощью 70% этанола.
  2. «С помощью щипцов и хирургических ножниц с тонким наконечником сделайте разрез между
    брюшко и задние ноги. Снимите кожу, потянув к ноге задние конечности.
  3. Соскребите соединительную ткань и мышцы, прикрепленные к костям, с помощью щипцов с острыми краями.
  4. Разрежьте большеберцовую и бедренную кости, как показано на рисунке 1, ножницами, чтобы отсоединить и снять. С помощью щипцов поместите эти кости в медиа-трубку на льду. Повторите этот процесс для каждого щенка.
  5. Перенесите кости с помощью щипцов в ситечко 40 мкм с трубкой для сбора. Раздавите кости и освободите костный мозг, прижав поршень шприца объемом 3 мл к ситечку.
  6. Центрифугируйте клеточную суспензию при 350 x g в течение 5 мин при 4 °C.
  7. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки путем щадящего пипетирования в 0,2% NaCl, гипотоническом растворе для лизиса эритроцитов. Сразу же добавьте равный объем 1,6% NaCl, чтобы довести раствор до изотонического.
  8. Центрифугируйте при 350 x g в течение 5 минут при 4 °C и удалите лизисный раствор.
  9. Повторно суспендируйте в полной DMEM для немедленного использования или заморозьте среду для хранения и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
    Примечание: Для настоящего исследования этот метод дал 6,55 (± 1,44) × 106 клеток костного мозга на детеныша (рис. 1E).
  10. Храните элементы при температуре -80 °C в морозильной среде или используйте их немедленно, как описано ниже.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за возраста кости достаточно прозрачны и прозрачны, чтобы через них можно было визуализировать костный мозг. Важно быть осторожным при вытягивании костей, так как приложения легкого давления на них может быть достаточно, чтобы освободить костный мозг. Костный мозг в костях новорожденного находится в виде жидкости, а не неповрежденной нити, как в костях взрослого человека. Трудно собрать костный мозг, если он ускользает во время сбора костей.

5. Дифференцировка неонатальных макрофагов, полученных из костного мозга

  1. Затравка 2 × 107 клеток костного мозга в колбе T75 в 10 мл полного DMEM, который содержит 10% L929-клеточного супернатанта (2,5 мл) в качестве источника M-CSF. Инкубировать чашки для культуры при 37 °C с 5%CO2 в течение 5 дней. Добавьте 2 мл среды, кондиционированной L929, на 3-й день дифференцировки.
  2. Ежедневно наблюдайте за клетками под микроскопом с помощью инвертированного микроскопа и системы визуализации с 20-кратным увеличением. При дифференцировке макрофаги должны казаться адгезивными, удлиненными и неоднородными (рис. 2).
  3. Чтобы собрать макрофаги для последующих анализов, аспирируйте дифференцировочные среды.
  4. Промойте клетки 5 мл PBS, чтобы удалить неадгезивные клетки и сывороточные белки, которые будут препятствовать отслойке. Аспирация PBS.
  5. Соберите клетки, добавив в колбу 5 мл 0,05% трипсина-ЭДТА. Поместите колбу для культур при температуре 37 °C с 5%CO2 в инкубатор на 5 минут и добавьте 5 мл DMEM.
  6. Отсоедините ячейки пипеткой и центрифугируйте при 350 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
  7. Диссоциируйте клеточную гранулу в 1 мл полного DMEM, а также подсчитайте и проверьте жизнеспособность клеток с помощью трипанового синего. МПДМ, выделенные с помощью этого метода, составляют 7,05 (± 2,52) ×105 клеток/детеныша (рис. 1E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание на наличие веретенообразных клеток, которые начинают появляться на второй день дифференцировки (Рисунок 1B, красные стрелки). Если цвет среды становится желтым, указывая на то, что она израсходована, добавьте больше L929-кондиционированных сред на 4-й день дифференцировки; Полная замена носителя не рекомендуется.

6. Иммуномечение и проточный цитометрический анализ

  1. Мечение блокирующими неспецифическими антителами BMDM (2x105/label) путем обработки 10 μL/107 клеток реагента-блокатора FcR в соответствии с рекомендациями производителя в объеме буфера проточной цитометрии 100 μL/label (PBS с добавлением 2 мМ ЭДТА и 0,5% бычьего сывороточного альбумина). Держать на льду 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки могут быть заблокированы как в большом количестве, так и в отдельных лунках или трубках. На всех последующих этапах указываются количества и объемы на каждую отдельную метку клеточного маркера при конечном объеме 100 μл.
  2. Промойте клетки, добавив 200 μл буфера для проточной цитометрии, и центрифугируйте при 525 x g в течение 7 минут при комнатной температуре.
  3. Удалите надосадочную жидкость и засейте клетки в U-образный 96-луночный планшет с плотностью 5 × 105 клеток на лунку. Окрашивание клеток путем добавления разбавленного в 3000 раз красителя для подсчета клеток FVS780-Live/Dead и 0,625 мкл BV786-CD11b, PE-F4/80 и AlexaFluor488-CD206 в 100 мкл буфера для проточной цитометрии по отдельности или в комбинации 12,13,14,15. Инкубируйте клетки в течение 45 мин на льду, покрытом фольгой.
  4. Добавьте 100 μл буфера для проточной цитометрии и промойте клетки центрифугированием при 525 x g в течение 7 минут при комнатной температуре.
  5. Аспирируйте надосадочную жидкость и осторожно воздействуйте на клеточную гранулу. Добавьте 100 мкл 0,4% параформальдегида в каждую лунку и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
  6. Промойте клетки, добавив 100 мкл буфера для проточной цитометрии и гранулы центрифугированием при 525 х г в течение 7 минут при комнатной температуре.
  7. Ресуспендируйте клетки в 400 мкл буфера для проточной цитометрии и проанализируйте с помощью проточного цитометра.

7. Анализ in vitro для оценки фагоцитарной эффективности макрофагов, полученных из костного мозга новорожденных

  1. Ресуспендируйте BMDM в полной DMEM без фенолового красного или антибиотиков и затравите их в плотности 2 × 105 / квадрант в 35 мм четырехугольной чашке объемом 500 μл.
  2. Для приготовления бактериального посевного материала при кратности инфекции (MOI) 25 или другом желаемом MOI удалите заранее рассчитанный запас Escherichia coli O1:K1:H7, хранящийся при -80 °C.
  3. Поместите желаемый объем бактерий в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл. Промойте бактерии, добавив PBS до общего объема 1 мл. Гранулируйте бактерии центрифугированием при концентрации 2 000 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Повторите этап стирки.
  4. Суспендируйте бактериальную гранулу в 50 μл PBS и добавьте зеленый флуоресцентный pH-чувствительный краситель до конечной концентрации 500 μM. Это pH-чувствительный краситель без флуоресцентного сигнала при нейтральном pH и ярко флуоресцирует в кислых средах, таких как подкисленные фагосомы, в процессе фагоцитоза.
  5. Инкубируйте бактериальные клетки в течение 20 минут в темноте для конъюгации красителя.
  6. Четыре раза промойте бактерии 1 мл PBS центрифугированием при 1000 × г в течение 5 минут при комнатной температуре.
  7. Ресуспендируйте бактерии в 500 мкл полного DMEM без фенолового красного и добавьте в культуры BMDM.
  8. Инкубируйте BMDM при 37 °C в инкубаторе с 5%CO2 в течение 4 часов, а затем добавьте 200 нг проницаемого для клеток красного флуоресцентного красителя, который окрашивает лизосомы.
    Примечание: Фагоцитарные бактерии могут быть визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя метод, описанный в этом исследовании, можно успешно выделить от 25 до 37 миллионов клеток костного мозга из помета из пяти детенышей мышей C57BL/6. Этот метод был проверен при размерах помета от 5 до 7 щенков. Минимальный возраст для изоляции в наших экспериментах составлял 7 дней. В зависимости от размера помета и количества клеток, необходимых для эксперимента, менее миллиона, исследователи могут попробовать использовать этот протокол для мышей младше 7 дней. В присутствии L929-клеточного супернатанта в качес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Исследования с использованием неонатальных мышиных моделей могут быть сопряжены с рядом проблем. Новорожденные имеют развивающуюся иммунную систему, которая уникальна по сравнению со взрослыми8. Таким образом, данные, полученные на моделях взрослых животных, не должны предполагать, что они применимы к новорожденным, и в нескольких опубликованных работах эта идея хорошо сформулирована18,19. Таким образом, для изучения тонкостей иммунного от...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, имеющих отношение к данной статье.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения [R01 AI163333] для CMR. Мы выражаем признательность за дополнительную финансовую поддержку, предоставленную Центру проточной цитометрии и ядра одиночных клеток Университета Западной Вирджинии в виде следующих грантов: грант WV CTSI GM104942, грант CoBRE для микроокружения опухолей GM121322 и грант NIH OD016165.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
40 & микро; m ситечкоGreiner542040Клеточная культура
96 лунка круглая (U) нижняя пластинаThermo Scientific12-565-65Клеточная культура
Антимышиный CD11b-BV786BD Biosciences740861FACS анализ
Антимышиный CD206-Alexa Fluor488BD Biosciences141709FACS анализ
Антимышиный F4/80-PEBD Biosciences565410FACS анализ
Countess3Thermo ScientificTSI-C3ACCАвтоматизированный счетчик клеток
DMEMHycloneSH30022.01Клеточная культура
DMSOVWRWN182Клеточная культура
DPBS, 1xCorning21-031-CVКлеточная культура
Escherichia coli O1:K1:H7ATCC11775Инфекция
ЭВОС ФЛ&nбсп;Invitrogen12-563-649 
FBSAvantor 76419-584Клеточная культура
FluoroBright BMDMThermo fisher ScientificA1896701Безкрасители
ГлутаминCytivaSH30034.01Клеточная культура
HEPESCytivaSH30237.01Клеточная культура
L-929ATCCДифференцировка
LSRFortessaBecton DickinsonПроточный цитометр
Лизотрекер красный DND 99InvitrogenL7528Флуоресцентный краситель
MEMCorning15-010-CVКлеточная культура
Пенициллин /стрептомицин ГиклонSV30010Клеточная культура
pHrodo зеленый STP эфир InvitrogenP35369Флуоресцентный краситель
T75 колбаКлеточная звезда658170Клеточная культура
Trypsin-EDTAGibco25300120Клеточная
культура Zeiss 710 КонфокальныйP20GM103434 Zeiss
Система визуализации клеток

Ссылки

  1. Lucas, D. Structural organization of the bone marrow and its role in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 28 (1), 36-42 (2021).
  2. Deb, A. How stem cells turn into bone and fat. N Engl J Med. 380 (23), 2268-2270 (2019).
  3. Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. Bone marrow mesenchymal stem cells: Aging and tissue engineering applications to enhance bone healing. Biomaterials. 203, 96-110 (2019).
  4. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
  5. Kaushansky, K. Lineage-specific hematopoietic growth factors. N Engl J Med. 354 (19), 2034-2045 (2006).
  6. Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. J Orthop Translat. 3 (1), 26-33 (2015).
  7. Smith, A. M., Davis, J. M. Challenges and opportunities to enhance global drug development in neonates. Curr Opin Pediatr. 29 (2), 149-152 (2017).
  8. Lagler, F. B., Hirschfeld, S., Kindblom, J. M. Challenges in clinical trials for children and young people. Arch Dis Child. 106 (4), 321-325 (2021).
  9. Heap, R. E., et al. Proteomics characterization of the L929 cell supernatant and its role in BMDM differentiation. Life Sci Alliance. 4 (6), 202000957(2021).
  10. Weischenfeldt, J., Bone Porse, B. marrow-derived macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, pub prot5080 (2008).
  11. Goncalves, R., Kaliff Teofilo Murta, G., Aparecidade de Souza, I., Mosser, D. M. Isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice. J Vis Exp. (196), e64566(2023).
  12. Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: An effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
  13. Springer, T., Galfre, G., Secher, D. S., Milstein, C. Mac-1: A macrophage differentiation antigen identified by monoclonal antibody. Eur J Immunol. 9 (4), 301-306 (1979).
  14. Austyn, J. M., Gordon, S. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage. Eur J Immunol. 11 (10), 805-815 (1981).
  15. Akbarshahi, H., Menzel, M., Posaric Bauden, M., Rosendahl, A., Andersson, R. Enrichment of murine CD68+ CCR2+ and CD68+ CD206+ lung macrophages in acute pancreatitis-associated acute lung injury. PLoS One. 7 (10), e42654(2012).
  16. Yao, Y., Xu, X. H., Jin, L. Macrophage polarization in physiological and pathological pregnancy. Front Immunol. 10, 792(2019).
  17. Lu, L., et al. Differential expression of CD11c defines two types of tissue-resident macrophages with different origins in steady-state salivary glands. Sci Rep. 12 (1), 931(2022).
  18. Harbeson, D., Ben-Othman, R., Amenyogbe, N., Kollmann, T. R. Outgrowing the immaturity myth: The cost of defending from neonatal infectious disease. Front Immunol. 9, 1077(2018).
  19. Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: Lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
  20. Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 930358(2022).
  21. Winterberg, T., et al. Distinct phenotypic features of neonatal murine macrophages). Eur J Immunol. 45 (1), 214-224 (2015).
  22. de Brito Monteiro, L., et al. M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes. Immunobiology. 225 (3), 151935(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Костный мозг новорожденныхдифференцировка макрофаговпроточная цитометрияанализ фагоцитозакондиционированная среда L929гипотонический растворинфицирование Escherichia coliсчетчик клеток
Выделение костного мозга мышей у новорожденных и получение макрофагов костного мозга
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.