Методическая статья

Применение тандемной масс-спектрометрии с помощью жидкостной хроматографии в исследованиях природных продуктов: тропановые алкалоиды на примере

1.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66620

⸱

8 марта 2024 г.

 ,  , 
1Department of Chemistry, Northern Michigan University

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем метод быстрой масс-спектрометрии (МС)/масс-спектрометрии (МС) аннотации и классификации тропановых алкалоидов, полезный как для предварительной дерепликации образцов, содержащих тропан, так и для обнаружения новых алкалоидов для выделения.

Аннотация

Несмотря на то, что многие лекарства, используемые сегодня, имеют синтетическое происхождение, натуральные продукты по-прежнему являются богатым источником нового химического разнообразия и биологической активности, а также могут дать многообещающие результаты в борьбе с устойчивыми или новыми заболеваниями. Проблема, однако, двоякая: исследователи должны не только найти натуральные продукты и выяснить их структуру, но и определить, что стоит выделить и проанализировать (и что уже известно – процесс, известный как дерепликация). С появлением современных аналитических приборов темпы обнаружения и дерепликации натуральных продуктов ускорились. Жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия (ЖХ-МС/МС) стала особенно ценным методом для идентификации и классификации химических структур. Тропановые алкалоиды (ТА) являются соединениями растительного происхождения, имеющими большое медицинское и токсикологическое значение. В этом исследовании мы разработали процесс скрининга на основе LC-MS/MS, используя несколько конфигураций MS/MS, доступных на тройном квадрупольном масс-спектрометре (QQQ), для аннотирования и классификации структур TA на основе их различных паттернов фрагментации. Используя комбинацию сканирования ионов, зависящих от данных (DD), сканирования ионов-предшественников (PrIS) и сканирования нейтральных потерь (NLS), мы применили этот метод к богатым TA экстрактам пасленовых Datura stramonium и Datura metel. Этот метод является быстрым, чувствительным и был успешно использован как для предварительной дерепликации сложных образцов, содержащих ТА, так и для открытия нового кандидата для выделения, очистки (и последующего биоанализа).

Введение

Несмотря на то, что в последние десятилетия полностью синтетические молекулы стали играть все более заметную роль в разработке лекарств, почти две трети всех одобренных лекарств за последние 39 лет являются натуральными продуктами или продуктами, вдохновленными натуральными продуктами,1,2  что подчеркивает сохраняющуюся важность исследований в области натуральных продуктов. Алкалоиды, некоторые азотсодержащие природные продукты, особенно ценятся за свои лечебные свойства. Тропановые алкалоиды (ТА), содержащие [3.2.1.]-бициклические азотсодержащие системы, продуцируются в основном растениями семейств Пасленовые, Эритроксиловые и Вьюнковые (Convolvulaceae). Примеры включают атропин, скополамин и кокаин; Многократные полусинтетические или синтетические тропаны также используются в клинической практике3. ТА и их производные используются для лечения многих состояний 3,4, и некоторые из этих препаратов включены в Список основных лекарственных средств ВОЗ на 2023 год5. Из-за своей мощной активности ТК также используются в рекреационных целях (в качестве стимуляторов или делириантов) и могут вызвать отравление при употреблении в пищу растений (или препаратов), которые их содержат 6,7. ТК нежелательны в пище человека и животных8 и могут испортить чаи, специи, зерновые, мед и травяные добавки 9,10. Из-за их лечебных возможностей и способности отравлять, аналитические методы, которые могут помочь в открытии новых ТА (и идентификации известных ТА), являются полезными.

В тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) «масс-фильтры» (например, квадруполи, времяпролетные трубки) физически связаны друг с другом («в космосе»), или в приборе используются дополнительные «временные» этапы реакции/разделения. В космосе МС/МС использует различные режимы для отбора и фрагментации различных ионов на различных массовых фильтрах (например, квадруполях тройного квадруполя или инструмента QQQ). Эти различные режимы могут использоваться для определения того, какие конкретные фрагменты образуются данным ионом (сканирование ионов продукта), какие ионы в образце дают определенные фрагменты (сканирование ионов-предшественников или PrIS) или претерпевают потери характерной массы (сканирование нейтральными потерями или NLS), или какие конкретные соединения обладают какими конкретными фрагментами (мониторинг множественных реакций). Таким образом, MS/MS предоставляет фрагменты, которые полезны для предложения структур для новых соединений или подтверждения присутствия существующего соединения. МС/МС все чаще используется в области разработки лекарственных препаратов, химии природных продуктов и метаболомики 11,12, а также используется для профилирования веществ, содержащих алкалоиды (для фитохимической характеристики или хемотаксономического анализа), а также для обнаружения и количественного определения специфических алкалоидов в пищевых или лекарственных растениях 10,13,14,15,16.

Несмотря на множество доступных методов масс-спектрометрии, существуют проблемы с поиском новых алкалоидов. В дополнение к поиску организма-кандидата для скрининга, полное структурное подтверждение алкалоида является трудоемким процессом, который может включать в себя множество различных аналитических методов. Кроме того, исследователи могут изолировать соединение, которое уже известно, тратя впустую труд, время и ресурсы. Это особенно сложно для ТА, где регистрируются сотни, если не тысячи ТА, многие из которых изомерны друг другу. Процесс «идентификации известного и отличия его от неизвестного» известен как дерепликация. Для помощи в этом процессе публикуются базы данных о времени удержания (r.t.s) и массовых фрагментах различных TA и других соединений17,18. Тем не менее, дерепликация трудоемка; простое аннотирование (т.е. присвоение предполагаемых структур) алкалоидов во всей хроматограмме LC-MS/MS образца занимает много времени. В последнее время для бензилизохинолина, монотерпена индола и тропановых алкалоидов были использованы как молекулярная сеть1 9,20, так и ручная дерепликация 18,21,22. Тем не менее, не существует специальных методов или рабочих процессов, доступных для быстрой дерепликации образцов, содержащих ТА, на основе ЖХ-МС/МС, даже несмотря на то, что ТА обладают общими, легко идентифицируемыми фрагментами (рис. 1). В описанном здесь методе используется комбинация зависящих от данных (DD) сканирования ионов продуктов, PrIS и NLS для аннотирования и классификации структур TA в растениях на основе как различных структур фрагментации моно-, ди- и тризамещенных тропанов (рисунок 1A), так и потерь общих эфирных групп, обнаруженных в этих алкалоидах (рисунок 1B). Исследуемыми организмами являются несколько видов пасленовых рода Datura. Богатый источник разнообразных ТА, дурман использовался на протяжении всей мировой истории в медицинских икультурных целях, и его трудно воспроизвести из-за его многочисленных, структурно схожих ТА, что дает нам привлекательные образцы для тестирования нашего метода.

Протокол

ВНИМАНИЕ: Пожалуйста, ознакомьтесь со всеми соответствующими паспортами безопасности материалов (MSDS) перед использованием перечисленных химикатов.

1. Подготовка образцов

ВНИМАНИЕ: Жидкий азот может вызвать криогенные ожоги. Используйте криогенные перчатки и средства защиты глаз в хорошо проветриваемом помещении. Содержащие алкалоиды образцы растений могут раздражать кожу; Всегда обращайтесь с ними в перчатках. Метанол токсичен и легковоспламеняющ, поэтому с ним следует обращаться в вытяжном шкафу вдали от потенциальных источников возгорания.

ПРИМЕЧАНИЕ: Теоретически можно использовать культурную или дикую растительную ткань (сушеную или молотую свежую); Приведенная ниже процедура как раз и используется при разработке метода.

  1. Если интересующая растительная ткань свежая, заморозьте ее, поместив в полипропиленовую коническую трубку и погрузив в жидкий азот на 2-3 минуты.
  2. Поместите замороженную растительную ткань в предварительно охлажденную ступку (в полистирольный холодильник с жидким азотом), и с помощью предварительно охлажденного пестика измельчите ткань до однородного порошка.
  3. Быстро взвесьте нужное количество ткани в тарированную полипропиленовую микроцентрифужную пробирку с помощью предварительно охлажденного шпателя и немедленно добавьте 20% метанола (при комнатной температуре [RT]) в концентрации 1 мл на каждые 100 мг ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Метанол (20%) обычно используется для извлечения ТЖ25. Иногда добавляют 0,1% муравьиной кислоты, хотя никакой разницы в эффективности экстракции при разработке этого и других методов не наблюдалось.
  4. Поместите закрытые пробирки на качающийся шейкер (средняя скорость) минимум на 3 часа при RT.
  5. Центрифугируйте пробирки при давлении 9464 x g в течение 10 минут. Отпидайте надосадочную жидкость в флакон автосамплера LC-MS или, если по-прежнему мутно, сначала профильтруйте через шприцевой фильтр 0,45 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен на этом этапе, хотя обработанные свежие образцы растений и экстракты должны храниться в морозильной камере при температуре -80 °C перед анализом, чтобы избежать любой потенциальной деградации алкалоидов.

2. Конфигурация прибора LC-MS и сбор данных

ВНИМАНИЕ: Ацетонитрил токсичен и легковоспламеняющ; Держите подальше от источников возгорания и контролируйте пары с помощью вытяжного шкафа. Муравьиная кислота вызывает коррозию; Избегайте контакта с кожей и глазами и носите соответствующие средства индивидуальной защиты.

  1. Используйте прибор LC-MS с источником ионизации с электрораспылением (ESI) и колонкой ВЭЖХ с обратной фазой (C18, 4,6 x 100 мм).
  2. Для ВЭЖХ используйте 0,1% муравьиной кислоты в H2O в качестве растворителя А и 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле в качестве растворителя В; Уравновесьте столбец с 99% A и 1% B. Настройте 30-минутный градиент 1%-50% B в течение 26 мин, возвращаясь к 1% B через 26,01 мин и удерживая на уровне 1% B в течение 4 мин. Используйте температуру духового шкафа 45 °C и расход 0,5 мл/мин.
  3. В методе ЖХ-МС используются следующие рабочие параметры масс-спектрометра: напряжение на границе раздела: 4,0 кВ, расход распыляющего газа: 3 л/мин, расход нагревательного газа: 10 л/мин, температура DL: 250 °C, температура теплового блока: 400 °C, температура границы раздела: 300 °C, расход осушающего газа: 10 л/мин, давление газа (аргона), вызванного столкновением (CID), составляет 17 кПа.
  4. Создание метода МС в позитивном режиме ESI, включающего в себя сканирование Q3 и сканирование Q1 (100-1000 Да), функционирующее как событие обследования (заданное по длине метода LC), с включенным автоматическим исключением изотопов. В качестве зависимого события сканирования Q1 (анализ DD) включите сканирование ионов продукта с массовым окном 50-1000 Да, энергией ячейки столкновения -20 В и временем события <0,2 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Порог подсчета для запуска сканирования ионов продукта DD Q1 может варьироваться, но, как правило, используется уровень 7 000-10 000 отсчетов. На некоторых приборах, таких как тот, который использовался для разработки метода, сканирование Q3 обеспечивает большую массовую точность и чувствительность, чем Q1, и включено для подтверждения ионов, наблюдаемых при сканировании Q1, хотя его можно без проблем пропустить на шаге 2.4.
  5. К описанному выше методу МС добавим PrIS положительной моды, равные длине метода LC с энергиями столкновений ячеек -20 В и временами событий 0,75 с. Убедитесь, что во всех случаях включены функции автоматического исключения изотопов или деизотопирования . Убедитесь, что интересующие нас значения m/z для фрагментов TA (в Da, см. рисунок 1A) составляют 124,1 (для монозамещенных TA, массовое окно 125-1000 Da), 122,1 и 140,1 (для дизамещенных TA, массовые окна, начинающиеся с 123 и 141 Da, соответственно), и 156,1 и 138,1 (для тризамещенных TA, массовые окна, начинающиеся с 157 и 139 Da, соответственно).
    Примечание: Во время разработки метода PrIS были разделены на два различных метода, один для моно- и дизамещенных ТЖ, а другой для тризамещенных ТД, хотя они могут быть разделены или объединены любым способом.
  6. Создайте второй метод MS, который включает в себя параметры, описанные в шаге 2.4.
    1. К этому методу MS/MS добавьте NLS с положительной модой, равную длине метода LC, с энергиями ячеек столкновений -20 В и временем событий 0,75 с. Убедитесь, что во всех случаях включены функции автоматического исключения изотопов или деизотопирования .
    2. Убедитесь, что представляющие интерес нейтральные массы потерь для сложных эфиров на ТА (в Да, см. рисунок 1В) составляют 100,05 (для сложных эфиров, полученных из тиглиевой кислоты, массовое окно 110-1000 Да), 60,03 (для ацетильных групп, массовое окно 100-1000 Да) и 166,06 (сложные эфиры фенилмолочной или тропной кислоты, массовое окно 170-1000 Да).
  7. Загрузите метод LC-MS и создайте файлы данных для интересующих образцов. После того как колонка ВЭЖХ уравновесится при температуре 45 °C, запустите интересующие образцы в пакете или файле проекта с соответствующими заготовками растворителей экстракции между различными видами или типами тканей. Типичный объем инъекции составляет 10-20 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При особенно больших объемах детектор масс-спектрометра может быть насыщенным. Если вы работаете с очень концентрированными образцами, убедитесь, что источник ESI очищен и прибор регулярно настраивается. Здесь протокол может быть приостановлен после того, как все данные будут собраны.

3. Анализ данных

  1. Изучите общую ионную хроматограмму сканирования Q1 и Q3 (и сканирования ионов продукта DD) и обратите внимание на родительскую массу любых обильных ионов, которые имеют TA-подобные особенности: а) масса <500 Да для иона [M+H]+ , обычно четная масса, б) типичные ОТК от 2 до 22 мин при использовании вышеуказанного метода ЛК, и в) фрагменты из следующего списка: м/з 93, 124, 142, 140, 122, 138, 156, 174, 110 или 128 Да.
  2. Изучите хроматограмму/канал PrIS для m/z 124 и обратите внимание, какие пики/ионы находятся на которых r.t.s (записанные на шаге 3.1) производят этот фрагмент. Просматривайте хроматограмму методом сканирования по сканированию, а также изучайте полные спектры МС/МС, полученные при сканировании ионов продукта DD, особенно для веществ с более низкой численностью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настоящий вид, содержащий этот фрагмент, будет существовать в течение нескольких сканирований и появится как в Q1, так и в Q3 сканированиях (если используется последний). Электронная таблица прилагается к вспомогательной информации (Дополнительный файл 1) для помощи в составлении аннотаций.
  3. Повторите шаг 3.2 с другими хроматограммами PrIS. Поскольку оба m/z 122 и 140 указывают на дизамещенные ТА, а m/z 138 и 156 указывают на тризамещенные ТА, изучите эти хроматограммы/каналы вместе.
  4. Изучите хроматограмму/каналы NLS для m/z 100, 60 и 166 и обратите внимание, какие пики/ионы, при которых r.t.s (зарегистрированные на шаге 3.1) вызывают эти нейтральные потери. Как и в случае с PrIS, щелкните по хроматограмме сканированием и сравните с фрагментацией, полученной при сканировании ионов продукта DD, особенно для веществ с более низкой численностью.
  5. Используя комбинацию данных PrIS и NLS, подкрепленных результатами ионного сканирования продукта DD, сделать предполагаемые аннотации наблюдаемых алкалоидов путем добавления наименьшей массы тропана (например, 124, 122 или 138) и нейтральных потерь, а затем учесть оставшуюся остаточную массу.
    Примечание: Типичными группами, замещающими ТК (и их массой в Да), являются гидроксил (18), ацетил (60), пропионил (74), изобутирил (88), тиглоил (100), насыщенный тиглоил/2-метилбутирил (102) или фениллактат/тропная кислота (166).
  6. Сравните аннотации для алкалоидов с аннотациями, приведенными в литературе17 и базах данных (например, MoNA)26 , чтобы определить, какие модели замещения TA представлены (и какие потенциально являются новыми). Кроме того, используйте стандарты некоторых распространенных тропановых алкалоидов (например, атропина, литорина, скополамина), которые коммерчески доступны для подтверждения.
  7. Для получения дополнительной структурной информации для образцов с низким содержанием (PrIS и NLS могут регистрировать ионы ниже зависимых пороговых значений событий) соберите сканирование ионов конкретного продукта (используя интересующую массу в качестве иона-предшественника) на более концентрированном образце.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод был разработан на приборе QQQ с низким разрешением. Для всех предполагаемых новых соединений следует использовать прибор МС с высоким разрешением для получения точных масс-спектров.

Результаты

Чтобы продемонстрировать эффективность метода, в качестве положительного контроля была проанализирована стандартная смесь ТЖК (10 мкг/мл каждой из смеси ацетилтропина/ацетилпсевдотропина [монозамещенная], по 10 мкг/мл каждой из смеси двух изомеров анизодамина, а также гиосциамин [монозамещенный], литорин [монозамещенный] и скополамин [тризамещенный]) (рис. 2). Полная хроматограмма сканирования Q1 (отображается в виде базовой пиковой хроматограммы) показана на рисунке 2A, при этом стандартные структуры TA обозначены соответствующими пиками. PrIS для m/z 124 (рис. 2B) отображает пики в своей хроматограмме для монозамещенных ТА; Следовательно, отображается смесь ацетилтропина и псевдотропина, гиосциамин и литорин. Пики, соответствующие ацетилтропину и псевдотропину в хроматограмме m/z 124, невелики (возможно, потому, что они имеют более низкую концентрацию, чем другие стандарты, и, возможно, потому, что они могут производить менее распространенный фрагмент m/z 124, чем другие монозамещенные ТА). Тем не менее, они по-прежнему обнаруживаются как на этой хроматограмме, так и в соответствующем канале PrIS. Рисунок 2C и рисунок 2D представляют собой хроматограммы PrIS для m/z 122 и 140 соответственно. Обнаруживая дизамещенные фрагменты ТА, они оба помечают два изомера анизодамина, причем более сильный сигнал виден на канале m/z 140. Поскольку разные ТА могут обладать фрагментами разной интенсивности, каналы m/z 122 и 140 следует исследовать вместе. Наконец, каналы m/z 156 (рис. 2E) и m/z 138 (рис. 2F), диагностические для тризамещенных ТА, демонстрируют один пик для скополамина (единственный тризамещенный ТА в стандартной смеси).

Затем с помощью NLS-хроматограмм были назначены присутствующие эфирные группы. На рисунке 2G показана NLS-хроматограмма для 60 Да (потеря уксусной кислоты из ацетатных эфиров): видны два ацетилированных монозамещенных изомера ТА. NLS-хроматограмма для 166 Да (рис. 2I), предназначенная для идентификации фенилмолочных или тропных эфиров, правильно идентифицирует все алкалоиды, содержащие любую из этих групп (гиосциамин, литторин, два изомера анизодамина и скополамин). Наконец, как и предсказывалось, хроматограмма (рис. 2H) для потери 100 Da (диагностика сложных эфиров тиглоила) является пустой, за исключением незначительной примеси при относительной массе 1,75 мин, так как ни один из стандартных алкалоидов не содержит эту группу.

Затем метод был проверен на ложноположительные результаты. Водно-метанольный экстракт листьев томата (Solanum lycopersicum) служил в качестве отрицательного контроля. Несмотря на то, что помидоры являются пасленовыми растениями, они не производят ТЗ. Полная хроматограмма с базовым пиком сканирования Q1 показана на рисунке 3A. PrIS для m/z 124 (рис. 3B) в основном пустой, с небольшими базовыми флуктуациями, которые, вероятно, являются шумом детектора (ни один сигнал не соответствовал этим массам на сканированиях Q1 или Q3). Две особенности с ОТК 2,6 и 3,4 мин дают фрагмент 124, но изучение сканирования ионов продукта DD показывает, что эти особенности не производят никаких других монозамещенных фрагментов тропана (m/z 93 или 142), что позволяет предположить, что они не являются ТА. Этот пример также подчеркивает полезность включения ионного сканирования продукта DD в этот метод для исключения ложных срабатываний. Аналогично, канал m/z 122 для дизамещенных TA (рис. 3C) также показывает только шум. Хроматограммы PrIS для m/z 140, m/z 138 и m/z 156, а также три NLS, которые предполагают только не-TA признаки на сканировании DD, показаны на дополнительном рисунке 1A-F.

Чтобы продемонстрировать использование этого метода для дерепликации образца, содержащего TA, был проанализирован экстракт корня D. metel var. 'fastuosa'. Корни являются основным местом биосинтеза ТА у пасленовых, и было предсказано, что в них присутствует множество разнообразных ТА. Полная хроматограмма сканирования Q1 показана на рисунке 4A. Как и ожидалось, на PrI были обнаружены многочисленные особенности различной плотности для m/z 124 (Рисунок 4B), m/z 122 (Рисунок 4C), m/z 140 (Рисунок 4D), m/z 156 (Рисунок 4E) и m/z 138 (Рисунок 4F). Многие из этих TA также были ацетилированы или тиглоилированы, или получены из фенилмолочной/тропной кислоты, как показано многочисленными сигналами в хроматограммах NLS на рисунке 4G-I, соответственно.

Электронная таблица, предоставленная в виде файла .xls (пустой лист для использования читателем находится в дополнительном файле 1, корень D. metel находится в дополнительном файле 2), была использована для того, чтобы сначала задокументировать, какие особенности (массы или r.t.s) кажутся похожими на TA (с использованием критериев в шаге 3.1). Далее были отмечены осколки и нейтральные потери, относящиеся к этим особенностям. Метод чрезвычайно чувствителен: каналы PrIS легко обнаруживают даже малораспространенные ТА, которые не дают видимых пиков на соответствующих хроматограммах. Используя фрагменты и нейтральные потери, можно затем предложить структуру алкалоида, следуя шагу 3.5.

Пример использования спектральных данных для аннотирования алкалоидов представлен на рисунке 5. Полная хроматограмма Q1 для корня D. metel представлена на рисунке 5A. Была выбрана функция на 14,4 минуты; спектр сканирования Q1 (рис. 5B) показывает родительскую массу m/z 224 для этого пика. Спектр ионного сканирования продукта DD показан на рисунке 5C. Канал PrIS для m/z 124 (рис. 5D) указывает на то, что ион 224 производит этот фрагмент (также виден на сканировании ионов продукта DD). Канал NLS для 100 Да (для обнаружения тиглоилированных TA) также помечает m/z 224 (также подтверждено сканированием ионов продукта DD). Сложение нейтральных потерь и наименьшего массового фрагмента TA (100 + 124 Da) равно родительской массе, 224, подтверждает, что тиглоильная группа является единственной заменой; вероятная структура этого алкалоида указана на рисунке 5В. Для ди- и тризамещенных ТА наблюдаемые массы нейтральных потерь были добавлены к наименьшей массе ТА, а затем была предложена другая замена для объяснения оставшейся массы: например, m/z 222 с дизамещенными фрагментами ТА 140 и 122 и нейтральными потерями 100 Да имеет остаточную массу 100 (222-122 = 100), Вероятно, это вторая группа тиглоилов. Этот рабочий процесс можно интуитивно использовать для процесса элиминации: объект, в котором отсутствуют фрагменты тропана (даже если он может потерять 60, 100 или 166 Да), вряд ли будет ТА. В качестве примера тщательной и быстрой репликации с использованием этого рабочего процесса в корне D. metel был идентифицирован 71 отдельный ТК различной плотности и полярности, включая множественные изомерные соединения (Дополнительный файл 2). Некоторые из этих соединений имели эфирные группы, которые не могли быть легко отнесены к другим, а некоторые дополнительные соединения были помечены как потенциальные ТЗ, но не могли быть аннотированы с высокой степенью достоверности.

Также был проанализирован метанольно-водный экстракт молотых семян D. stramonium. Полная хроматограмма основания и пика Q1 для корня D. metel показана на рисунке 6A. PrIS для m/z 124 показан на рисунке 6B, а PrIS для m/z 122 показан на рисунке 6C; другие хроматограммы показаны на дополнительном рисунке 2A-F. На рисунке 6B показано очень большое количество монозамещенного тропанового алкалоида при относительном весе = 12,6 мин, вероятно, гиосциамина. Таблица, показывающая аннотации начальных ТП, включена в Дополнительный файл 3. Эффективность метода оказалась ниже для этого конкретного образца: две очень обильные особенности с m/z 259 при r.t.s 8,5 и 10,2 мин дали пики на NLS-хроматограммах для 60 и 100 Да (дополнительный рисунок 2 D,E) с массой m/z 260 (изотоп M+1), указанной в соответствующих спектрах. Эти соединения не являются ТА, а образуют фрагменты, согласующиеся с бета-карболиновыми алкалоидами27. Они не ацетилированы и не тиглоилированы, но теряют 60 или 100 от своего изотопа M+1, что делает их появление на этих двух каналах NLS неправильным. Кроме того, скополамин (r.t. = 10,5 мин) дал фрагмент m/z 122 из своего пика изотопа m/z 305 M+1, изотоп ожидаемого фрагмента скополамина m/z 121. Несмотря на то, что в этих методах используются функции деизотопирования, при таких высоких концентрациях образцов возможна некоторая «утечка» изотопов. Хотя это может быть уникальным явлением для инструмента, используемого в этом исследовании или в этом образце, его стоит отметить.

С помощью этого метода в семенах D. stramonium аннотировали 40 ТА, в том числе несколько, которые, по-видимому, гликозилированы, теряя массу 162 (гексоза), 146 (дезоксигексозу) или 132 Да (ксилоза или аналогичный сахар). В то время как гексозосодержащие ТК были зарегистрированы в Merremia (Convolvulaceae)28, Duboisia29 и Atropa25, это первое сообщение о дезоксигексозе или ксилозосодержащих ТЖ. Один ТА имел относительное сечение 13,8 мин (Рисунок 7A) и массу m/z 436 (сканирование Q1 на Рисунке 7B). Эта функция выдавала сигнал на канале m/z 124, указывающий на монозамещение TA (рис. 7D), но не давала сигналов ни на одном другом канале PrIS или NLS. Сканирование ионов продукта DD (рис. 7C) показало ожидаемую m/z 124, потерю 312 Да, возможно, 166 + 146 Да, от родительского иона. MS/MS с высоким разрешением был получен на квадрупольном времяпролетном приборе (спектр на рисунке 7E), который показал фрагмент m/z 290, предполагающий гиосциамин или литорингликозилированный на гидроксильном эфире с рамнозой или аналогичным сахаром; измеренная точная масса также была очень близка к точной, рассчитанной для рамнозилгиосциамина или литорина (структура на рисунке 7E). Благодаря своей беспрецедентной структуре и распространенности, этот алкалоид заслуживает выделения из семян D. stramonium , что является примером, демонстрирующим использование этого метода в открытии новых алкалоидов.

figure-results-1
Рисунок 1: Релевантные фрагменты и потери, наблюдаемые при МС ТК. (А) Характерные фрагменты (и их диагностические массы), образованные из монозамещенных, дизамещенных и трисубситутированных ТП, а также репрезентативные примеры алкалоидов в каждом классе. (В) Общие нейтральные потери, наблюдаемые от сложных эфиров в ТК (и их диагностические массы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Сканирование ионов с положительным контролем предшественника и нейтральных потерь. Для всех хроматограмм ось X — это время удержания, а ось Y — подсчет (содержание ионов). (A) Общая ионная хроматограмма стандартной смеси алкалоидов в виде основной пиковой хроматограммы. Указаны структуры стандартов; Соответствующие вершины обозначены красными стрелками. (B-F) представляют собой хроматограммы PrIS для (B) m/z 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 и (F) 138. (Г-И) NLS-хроматограммы для 60 Да (ацетил, G), 100 Да (тиглоил, H) и 166 Да (фенилмолочная/тропная кислота, I). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Сканирование ионов прекурсора с отрицательным контролем и нейтральными потерями. Для всех хроматограмм ось X — это время удержания, а ось Y — подсчет (содержание ионов). (A) Хроматограмма общих ионов в виде хроматограммы основания и пика метанола/водного экстракта листьев S. lycopersicum . (B) Хроматограмма PrIS для m/z 124, показывающая только два нетропановых признака при относительном отношении 2,6 и 3,4 мин. (C) Хроматограмма PrIS для m/z 122, пустая, за исключением шума детектора. Используются те же масштабы, что и на рисунке 2; остальные хроматограммы представлены на дополнительном рисунке 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Применение метода MS/MS к корням D. metel var. 'fastuosa'. Для всех хроматограмм ось X — это время удержания, а ось Y — подсчет (содержание ионов). (A) Общая ионная хроматограмма в виде хроматограммы основания и пика метанола/водного экстракта корней D. metel var. 'fastuosa'. (B-F) — хроматограммы PrIS для m/z (B) 124, (C) 122, (D) 140, (E) 156 и (F) 138. (G-I) — NLS-хроматограммы для 60 Da (ацетил, G), 100 Da (тиглоил, H) и 166 Da (фенилмолочная/тропная кислота, I). Обратите внимание на обильные сигналы на каждой хроматограмме, соответствующие многочисленным ТА. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Применение комбинированного ионного сканирования продукта DD, сканирования ионов-предшественников и метода сканирования нейтральных потерь для предложения структуры TA. (A) Хроматограмма общих ионов в виде хроматограммы метанола/воды из корней D. metel var. ' fastuosa' . Пик при относительном весе = 14,4 мин обозначен красной стрелкой. (B) Q1 (обзорное сканирование) с большой массой m/z 224 для этого пика. Для всех спектров ось X — это масса, а ось Y — интенсивность. (C) Сканирование ионов продукта DD, показывающее фрагментацию иона m/z 224, указывающую на потерю 100 Да и фрагмент m/z 124 (красные стрелки). Это соединение появляется как в канале (D) m/z 124 PrIS, так и в (E) канале 100 Da NLS, что указывает на то, что оно является как монозамещенным, так и тиглоилированным (структура на панели C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-6
Рисунок 6: Применение метода MS/MS к семенам D. stramonium . Для всех хроматограмм ось X — это время удержания, а ось Y — подсчет (содержание ионов). (A) Общая ионная хроматограмма в виде пиковой хроматограммы метанола/водного экстракта семян D. stramonium. (B) Хроматограмма PrIS для m/z 124; (C) изображает хроматограмму PrIS для m/z 140. Остальные хроматограммы представлены на дополнительном рисунке 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-7
Рисунок 7: Аннотирование нового алкалоида в семенах D. stramonium . Для всех хроматограмм ось X — это время удержания, а ось Y — подсчет (содержание ионов). (A) Общая ионная хроматограмма в виде хроматограммы основания и пика метанола/водного экстракта семян D. stramonium. Обозначается особенность при r.t. = 13,7 мин. (B) Q1 (обзорное сканирование), показывающее массу m/z 436 для этого пика. Для всех спектров ось X — это масса, а ось Y — интенсивность. (C) Сканирование ионов продукта DD, показывающее фрагментацию m/z 436 иона. (D) Это монозамещенное соединение ТА появляется в канале m/z 124 PrIS. (E) Спектр MS/MS с высоким разрешением для этой новой ТА, наряду с предполагаемыми структурами и точной массой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок 1: Дополнительное сканирование ионов прекурсора негативного контроля и нейтральных потерь. (А-С) Хроматограммы PrIS для m/z (A) 140, (B) 156 и (C) 138. (Д-Ж) NLS-хроматограммы для 60 Да (ацетил, D), 100 Да (тиглоил, E) и 166 Да (фенилмолочная/тропная кислота, F). Используемые масштабы такие же, как на рисунке 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Применение метода MS/MS к семенам D. stramonium; дополнительные хроматограммы. (A-C) представляют собой хроматограммы PrIS для m/z (A) 140, (B) 156 и (C) 138. (Д-Ж) NLS-хроматограммы для 60 Да (ацетил, D), 100 Да (тиглоил, E) и 166 Да (фенилмолочная/тропная кислота, F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: Пустая электронная таблица, используемая для аннотаций к алкалоидам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Таблица аннотаций и структур алкалоидов для корней D. metel var. 'fastuosa'. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Таблица аннотаций и структур алкалоидов для семян D. stramonium. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Несмотря на то, что параметры прибора, представленные в протоколе, позволяют обеспечить удовлетворительную производительность, успешное использование этого метода может потребовать тщательного внимания или оптимизации нескольких критических этапов. Хотя градиент растворителя ВЭЖХ, представленный на шаге 2.2, в целом подходит для тропановых алкалоидов, его может потребоваться модификация в зависимости от профиля тропановых алкалоидов исследуемого образца или вида растения. Объем ввода образца также может быть изменен в зависимости от чувствительности прибора и способа использования метода. «Глубокое» метаболическое профилирование или дерепликация должны использовать больший объем инъекции (в этом исследовании использовалось 15-20 мкл), в то время как простое обнаружение алкалоидов может использовать меньшие объемы. При использовании больших объемов образцов следует проявлять осторожность, чтобы (а) регулярно очищать источник ионов, (б) контролировать колонку ВЭЖХ на предмет изменений давления или засоров (всегда следует использовать соответствующую защитную колонку), (в) предотвращать перенос между образцами и (г) исследовать хроматограммы на предмет потенциальной «утечки изотопов», как описано выше. Температура и напряжение интерфейса не должны существенно отличаться от указанных в методе во избежание преждевременной фрагментации в источнике. Кроме того, несмотря на то, что рекомендуется использовать напряжение ячейки коллизии 20 В, оно может не обеспечить оптимальный сигнал хроматограммы (или диагностические фрагменты ионного сканирования продукта DD) для всех ТА. Некоторые приборы и функции MS имеют функцию «нарастания энергии столкновений» или возможность сбора сканов при нескольких или оптимизированных энергиях столкновений, что также может быть полезно в методе, подобномэтому.

Этот метод MS сам по себе также легко модифицируется: в то время как сложные эфиры тигловой, уксусной и фенилмолочной/тропной кислот распространены у видов дурмана , схемы замещения сложных эфиров TA могут отличаться у других растений или образцов. Массы NLS могут быть изменены для обнаружения других групп сложных эфиров (например, потеря 74 Da для пропионовых эфиров) или потенциальное обнаружение гликозилирования (например, потеря 162 Da для гексоз). Массы PrIS также могут быть изменены. Например, ТА в обоих образцах дурмана (r.t. = 12,5 мин; см. Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2) были аннотированы как норгиосциамин или норлитторин (гиосциамин/литторин минус тропановая N-метильная группа) на основании фрагментов ионного сканирования продукта DD (m/z 110 и 93) и соответствовали литературным спектрам31; этот ТА не появлялся ни на одном из каналов PrIS фрагмента тропана. Для этих двух масс может быть добавлен канал для обнаружения нортропанов. Фрагмент m/z 93 также присутствует в большинстве монозамещенных TA17; добавление этого канала может обеспечить дополнительное подтверждение наличия монозамещенной ЦА и помочь уменьшить количество ложных срабатываний.

В дополнение к его адаптивности для различных типов ТА, одним из основных преимуществ этого протокола (по сравнению с существующими методами аннотирования алкалоидов) является его скорость. В зависимости от того, как настроен метод МС (и используемого времени выполнения ВЭЖХ), все данные МС/МС для образца могут быть собраны в течение 60-90 минут. Например, в ходе наших исследований моно- и дизамещенные TA PrI были встроены в один метод, тризамещенные TA PrI — в другой, а NLS — в третий (все методы содержали сканирование ионов продукта DD), в общей сложности три инъекции по тридцать минут каждая. Полное аннотирование образца с использованием объединенных данных MS/MS происходит гораздо быстрее, чем ручное исследование каждого пика или сбор сканирования отдельных ионов продукта для многочисленных пиков, представляющих интерес. Этот метод может быть выполнен на любом приборе с режимами ионного сканирования продукта, PrIS и NLS и может быть использован для быстрой качественной оценки (т.е. присутствуют или отсутствуют ТА?), для различения или «дактилоскопирования» различных родов растений, видов, сортов или сортов, органов или стадий роста, а также для сравнения наблюдаемых ТП с зарегистрированными (в рамках рабочего процесса дерепликации). Как показано, протокол также может быть использован для открытия новых ТК в качестве проводников для выделения, очистки или биоанализа, а также для идентификации видов-кандидатов и тканей для их выделения. Этот метод может быть использован в области природных продуктов и метаболомики, в том числе для помощи в понимании биохимии растений и для исследования на ранних стадиях разработки лекарств. Дополнительные приложения могут быть найдены в области безопасности пищевых продуктов или судебной экспертизы (например, обнаружение ТЖ в продуктах питания, добавках или биожидкостях).

У этого метода есть несколько недостатков, которые заслуживают обсуждения. Во-первых, в зависимости от используемого прибора и цели использования протокола, может потребоваться большой объем ввода образца, что может привести к проблемам с производительностью прибора и потенциалу ложноположительных результатов в некоторых случаях (как описано выше). Во-вторых, этот метод был разработан на приборе QQQ с низким разрешением, и ложные срабатывания могут быть результатом низкого разрешения (например, признак, содержащий фрагмент m/z 124 в отрицательном контроле, который не является TA). Прибор с более высоким разрешением обеспечит лучшую диагностическую способность, и для любого предлагаемого нового алкалоида должны быть получены спектры МС/МС с точной массой. Дополнительными недостатками этого метода являются просто недостатки МС/МС анализа в целом. Хотя MS/MS полезен для предложения структур («аннотация», как указано в Инициативе по стандартам метаболомики32), он не предоставляет конкретных назначений молекулярной связности («идентификации»). Например, в обоих образцах дурмана мы обнаружили несколько изомеров m/z 306 TA, которые, по-видимому, имели как m/z 124, так и m/z 140 фрагменты (Дополнительный файл 2), что затрудняет окончательное определение схемы замещения. Это может представлять собой еще не открытый механизм фрагментации, и другой метод (например, спектроскопия ядерного магнитного резонанса) может быть полезен для разрешения неоднозначностей. Методы, основанные на МС/МС, часто борются с изомерией: эфир фенилмолочной кислоты литорин (или его производные) трудно отличить от гиосциамина (эфира тропной кислоты), а другие пасленовые растения содержат ТА, замещенные изомерными группами тиглоил, сенециоил и ангелоил33,34; В отсутствие стандартов эти соединения может быть трудно, если не невозможно, отличить друг от друга. Метод также не позволяет дифференцировать энантиомеры (например, 3,6- и 3,7-дигидрокситропан; см. нумерацию на рисунке 1) или региоизомеры (например, различие между 3-ацетилом и 7-ацетилом без стандарта). Мы отнесли большинство монозамещенных тропанов к 3-замещенным на основе предыдущих моделей, зарегистрированных в роде Datura и других пасленовых растениях17,35. Следовательно, любые биохимические знания или литература об изучаемом организме (если таковые имеются) всегда должны быть проконсультированы наряду с любым инструментальным анализом.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была профинансирована за счет исследовательского гранта факультета (Университет Северного Мичигана, присужденный M.A.C.), исследовательской стипендии для студентов (Университет Северного Мичигана, присужден J.C.) и факультета химии. Авторы хотели бы поблагодарить Джона Бергера (NMU) за помощь в подготовке растительных тканей, Ханну Хокинс (NMU) за обслуживание LC-MS и помощь в устранении неполадок, а также доктора Райана Форнвальда и его студентов CH 495 (Синтез натуральных продуктов) за приготовление ацетилтропиновой смеси. Авторы также выражают благодарность доктору Дэниелу Джонсу (Университет штата Мичиган) за получение спектров MS/MS с высоким разрешением.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ацетонитрил, Для УВЭЖХ, подходит для масс-спектрометрииSigma-Aldrich900667ВЭЖХ растворитель
Аргон газообразныйAirGasAR UHP300CID газ
Муравьиная кислота, 99% для анализаThermo ScientificAC270480010добавка ВЭЖХ
Защитный держатель колонкиRestek25812
ВЭЖХ, Shimadzu LC-2030C 3D PlusShimadzu228-65802-58ВЭЖХ колонка
LCMS, Shimdazu LCMS-8045Shimadzu225-31800-44Масс-спектрометр; мы запустили программное обеспечение LabSolutions, которое является стандартным для Shimadzu instruments
Жидкий азотAirGasNI 180LT22
Метанол, для ВЭЖХ/УВЭЖХ/ЛКМСVWRBDH 85800.400Для изготовления экстракционного растворителя
Микроцентрифуга VWR2400-37
Микроцентрифужные пробирки, 1,5 млFisher Scientific05-408-129
Раствор Fisher ScientificFB961CДля измельчения растительных тканей
ПестикFisher ScientificFB961MДля измельчения растительных тканей
Пипетка 1000 млGilson 
Наконечник для пипетки 1000 млFisher scientific02-707-404
Растительные тканиРазличные источникиН/ДМожет быть что угодно дикорастущие или культивируемые
полипропиленовые конические трубки, 15 млFisher Scientific05-539-4
Охладитель из полистиролаULINES-18312Тип охладителей, в которых поставляются реагенты для молекулярной биологии, будет следующим соответствующий
Roc C18 3 &микро; m, 100 мм x 4,6 ммRestek9534315колонка для ВЭЖХ
Roc C18, 10 мм x 4 ммRestek953450210Guard колонка
КачалкаThemo Scientific11-676-680
Набор для удобства флакона с винтовой резьбой (9 мм)Fisher scientific13-622-190Флаконы с автопробником LCMS
Шприц, 3 млFisher Scientific03-377-27
Шприцевой фильтр 0,45 & микро; М Avantor/VWR76479-008
Вода, для использования в жидкостной хроматографии и масс-спектрометрииJT Baker9831-03Для приготовления экстракционного растворителя
Вода, содержит 0,1% v/v муравьиной кислоты, для УВЭЖХ, подходит для масс-спектрометрииSigma-Aldrich900687-1LВЭЖХ растворитель
F144059M

Ссылки

  1. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. J Nat Prod. 75, 311-335 (2012).
  2. Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019. J Nat Prod. 83 (3), 770-803 (2020).
  3. Kohnen-Johannsen, K., Kayser, O. Tropane alkaloids: Chemistry, pharmacology, biosynthesis and production. Molecules. 24 (4), 796(2019).
  4. Shim, K. H., Kang, M. J., Sharma, N., An, S. S. A. Beauty of the beast: anticholinergic tropane alkaloids in therapeutics. Nat Prod Bioprospect. 12 (1), 33(2022).
  5. Web Annex A. World Health Organization Model List of Essential Medicines - 23rd List, 2023. The Selection and Use of Essential Medicines 2023: Executive Summary of the Report of the 24th WHO Expert Committee on the Selection and Use of Essential Medicines. , World Health Organization. Geneva. 24-28 (2023).
  6. Kerchner, A., Farkas, A. Worldwide poisoning potential of Brugmansia and Datura. Forensic Toxicol. 38, 30-41 (2020).
  7. Hanna, J. P., Schmidley, J. W., Braselton, W. E. Datura delirium. Clin Neuropharmacol. 15, 109-113 (1992).
  8. Alexander, J., et al. Scientific opinion of the panel on contaminants in the food chain on a request from the European Commission on tropane alkaloids (from Datura sp.) as undesirable substances in animal feed. EFSA J. 691, 1-55 (2008).
  9. González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pérez-Quintanilla, D., Sierra, I. Occurrence and chemistry of Tropane alkaloids in foods, with a focus on sample analysis methods: A review on recent trends and technological advances. Foods. 11 (3), 407(2022).
  10. Cirlini, M., Cappucci, V., Galaverna, G., Dall'Asta, C., Bruni, R. A sensitive UHPLC-ESI-MS/MS method for the determination of tropane alkaloids in herbal teas and extracts. Food Control. 105, 285-291 (2019).
  11. Amorim Madiera, P. J., Florencio, M. H. Applications of Tandem Mass Spectrometry: From Structural Analysis to Fundamental Studies. Tandem Mass Spectrometry - Applications and Principles. Prasain, J. , InTech. London. (2012).
  12. Xing, J., Xie, C., Lou, H. Recent applications of liquid chromatography-mass spectrometry in natural products bioanalysis. J Pharm Biomed Anal. 44 (2), 368-378 (2007).
  13. Negrin, A., Long, C., Motley, T. J., Kennelly, E. J. LC-MS metabolomics and chemotaxonomy of caffeine-containing holly (Ilex) species and related taxa in the Aquifoliaceae. J. Agric. Food Chem. 67 (19), 5687-5699 (2019).
  14. Och, A., Szewczyk, K., Pecio, L., Stochmal, A., Zaluski, D., Bogucka-Kocka, A. UPLC-MS/MS profile of alkaloids with cytotoxic properties of selected medicinal plants of the Berberidaceae and Papaveraceae families. Oxid Med Cell Longevity. 2017, 9369872(2017).
  15. Li, Y., Pang, T., Shi, J., Liu, X., Deng, J., Lin, Q. Simultaneous determination of alkaloids and their related tobacco-specific nitrosamines in tobacco leaves using LC-MS-MS. J Chromatogr Sci. 53 (10), 1730-1736 (2015).
  16. González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pereira, J. A. M., Câmara, J. S., Sierra, I. Improved analytical approach for determination of tropane alkaloids in leafy vegetables based on µ-QuEChERS combined with HPLC-MS/MS. Toxins. 14 (10), 650(2022).
  17. Cinelli, M. A., Jones, A. D. Alkaloids of the Genus Datura: Review of a rich resource for natural product discovery. Molecules. 26, 2629(2021).
  18. Gonçalves Dantas, C., et al. Dereplication of tropane alkaloids from four Erythroxylum species using liquid chromatography coupled with ESI-MSn and HRESIMS. Rapid Commun Mass Spectrom. 37 (21), e9629(2023).
  19. Santos, C. L. G., et al. Molecular networking-based dereplication of strictosidine-derived monoterpene indole alkaloids from the curare ingredient Strychnos peckii. Rapid Commun Mass Spectrom. 34 (3), e8683(2020).
  20. Qin, G. F., et al. MS/MS-based molecular networking: An efficient approach for natural products dereplication. Molecules. 28, 157(2023).
  21. Du, N., Zhou, W., Jin, H., Liu, Y., Zhou, H., Liang, X. Characterization of tropane and cinnamamide alkaloids from Scopolia tangutica by high-performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. J Sep Sci. 42 (6), 1163-1173 (2019).
  22. Agnes, S. A., et al. Implementation of a MS/MS database for isoquinoline alkaloids and other annonaceous metabolites. Sci Data. 9 (1), 270(2022).
  23. Sixto, A., Pérez-Parada, A., Niell, S., Heinzen, H. GC-MS and LC-MS/MS workflows for the identification and quantitation of pyrrolizidine alkaloids in plant extracts, a case study: Echium plantagineum. Rev Bras Farmacog. 29 (4), 500-503 (2019).
  24. Wang, H., Xu, X., Wang, X., Guo, W., Jia, W., Zhang, F. An analytical strategy for discovering structural analogues of alkaloids in plant food using characteristic structural fragments extraction by high resolution orbitrap mass spectrometry. LWT- Sci Technol. 154, 112329(2022).
  25. Parks, H. M., et al. Redirecting tropane alkaloid metabolism reveals pyrrolidine alkaloid diversity in Atropa belladonna. New Phytol. 237 (5), 1810-1825 (2023).
  26. MassBank of North America. , Available from: https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu (2024).
  27. Maier, I., et al. Fluorodaturatin und Homofluorodaturatin - zwei neue β-carbolinderivate in Samen von Datura stramonium L. var. stramonium. Monatsh Chem. 112, 1425-1439 (1981).
  28. Jennett-Siems, K., et al. Chemotaxonomy of the pantropical genus Merremia (Convolvulaceae) based on the distribution of tropane alkaloids. Phytochemistry. 66, 1448-1464 (2005).
  29. Kohnen, K. L., Sezgin, S., Spiteller, M., Hagels, H., Kayser, O. Localization and organization of scopolamine biosynthesis in Duboisia myoporoides R. Br. Plant Cell Physiol. 59 (1), 107-118 (2018).
  30. Guan, P., et al. Full collision energy ramp-MS2 spectrum in structural analysis relying on MS/MS. Anal Chem. 93 (46), 15381-15389 (2021).
  31. Al Balkhi, M. H., Schlitz, S., Lesur, D., Lanoue, A., Wadouachi, M., Boitel-Conti, M. Norlittorine and norhyoscyamine identified as products of littorine and hyoscyamine metabolism by 13C-labeling in Datura innoxia hairy roots. Phytochemistry. 74, 105-114 (2012).
  32. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3, 211-221 (2007).
  33. Gambaro, V., Labbe, C., Castillo, M. Angeloyl, Tigloyl and Senecioyloxytropane Alkaloids from Schizanthus hookerii. Phytochemistry. 22 (8), 1838-1839 (1983).
  34. Christen, P., Cretton, S., Humam, M., Bieri, S., Muñoz, O., Joseph-Nathan, P. Chemistry and biological activity of alkaloids from the genus Schizanthus. Phytochem Rev. 19, 615-641 (2020).
  35. Lounasmaa, M., Tamminen, T. The Tropane Alkaloids. The Alkaloids: Chemistry and Pharmacology. , Academic Press. New York, NY. (1993).

Перепечатки и разрешения

Теги

Datura StramoniumDatura Metel
Применение тандемной масс-спектрометрии с помощью жидкостной хроматографии в исследованиях природных продуктов: тропановые алкалоиды на примере
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.