Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Модель резервуарного илеита у крыс после проктоколэктомии и подвздошно-анального анастомоза с использованием декстрана сульфата натрия

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66623

⸱

31 мая 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of General Surgery, Tianjin Medical University General Hospital, 2Tianjin General Surgery Institute, 3Department of General Surgery, Zibo Municipal Hospital, 4Department of General Surgery, Binzhou Medical University Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описан метод создания крысиной модели резервуарного илеита. Модель подвздошного мешка была создана путем проведения операции подвздошно-анального анастомоза (IPAA) с использованием микрохирургических методов. После операции крысу обрабатывали 4% декстрана сульфатом натрия (ДСС) в течение 4 дней.

Аннотация

Язвенный колит (ЯК) – это хроническое иммуноопосредованное заболевание, поражающее всю толстую и прямую кишку с рецидивирующим и ремиттирующим течением, вызывая пожизненную заболеваемость. Когда медикаментозное лечение неэффективно, особенно в случаях массивного желудочно-кишечного кровотечения, перфорации, токсического мегаколона или канцерогенеза, хирургическое вмешательство становится последней линией обороны для лечения ЯК. Тотальная колоректальная резекция и анальный анастомоз подвздошной кишки (IPAA) дают наилучшие шансы на долгосрочное лечение. Резервуарный илеит является наиболее распространенным и проблемным послеоперационным осложнением. В этом исследовании микрохирургия используется для создания модели подвздошного мешка у экспериментальных крыс с помощью хирургии IPAA. Впоследствии была создана устойчивая модель резервуарного илеита на крысах путем индуцирования воспаления подвздошной кишки декстрансульфатом натрия (DSS). Успешное установление яленого мешка у крыс подтверждается анализом послеоперационного общего состояния, веса, потребления пищи и воды, данных кала, а также патологии тканей мешка, иммуногистохимии и анализа факторов воспаления. Эта экспериментальная животная модель резервуарного илеита обеспечивает основу для изучения патогенеза и лечения этого состояния.

Введение

Резервуарный илеит является неспецифическим воспалением, которое поражает подвздошный мешок и является распространенным осложнением после тотальной проктоколэктомии и анального анастомоза подвздошной кишки (ИПХА) у лиц с язвенным колитом (ЯК)1,2,3. Это состояние имеет относительно высокую частоту встречаемости до 50% и может вызывать различные клинические проявления, включая диарею, боли в животе, потерю каловой крови и лихорадку. Точная причина резервуарного илеита остается неясной, хотя некоторые исследователи считают, что сдвиг в флоре мешочек может вызвать иммунную активацию и последующее воспаление.

Из-за сложностей, связанных с проведением клинических испытаний резервуарного илеита, животные модели могут служить ценными инструментами для изучения лекарств и механизмов лечения резервуарного илеита. Растут опасения по поводу создания подвздошных мешочков крыс, при этом поступают сообщения о возможном воспалении8. Тем не менее, исследования в этой области остаются скудными из-за сложного характера производственного процесса, в котором отсутствуют четкие руководящие принципы. В 1998 году Лихтман был первым, кто создал модель подвздошного мешка у крыс Льюиса и крыс Спрага-Доули (SD), выполнив тотальную колэктомию11. Они наблюдали инфильтрацию макрофагов, изъязвление слизистых оболочек и увеличение анаэробной бактериальной флоры в кишечнике этих крыс, что обеспечило прочную основу для дальнейших исследований воспаления подвздошной кишки. Эта экспериментальная модель крысиного резервуарного илеита в точности имитирует физические признаки и основные механизмы, наблюдаемые при человеческом резервуарном резервуаре.

Обычно применяемые доклинические модели язвенного колита включают модели DSS и TNBS. Индуцирующее химическое вещество 2,4,6-тринитробензолсульфоновая кислота (ТНБС) обычно имитирует болезнь Крона12. Модель DSS, уважаемая за свою эффективность, профиль безопасности и доступность, часто используется в качестве надежного инструмента для индукции ЯК из-за наблюдаемых симптомов. Учитывая колонизацию ткани мешочка, мы успешно индуцировали модель резервуарного илеита с использованием DSS13,14.

В настоящем исследовании микрохирургия была использована для успешного создания модели подвздошного мешка у экспериментальных крыс с помощью хирургии IPAA. Впоследствии была создана устойчивая модель крысиного резервуарного илеита путем индукции воспаления подвздошного мешка с помощью DSS. Точность во время операции имеет важное значение для успешного формирования модели, а послеоперационный уход также имеет решающее значение. Эта модель может быть использована для исследования патогенеза резервуарного илеита, оценки потенциальных терапевтических агентов и углубления нашего понимания этого сложного состояния. Исследование оптимизирует процедуру изготовления подвздошного мешка, сокращая продолжительность операции и повышая эффективность, тем самым создавая прочную основу для фундаментальных исследований послеоперационных заболеваний подвздошного мешка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с политикой этических комитетов Больницы общего профиля Тяньцзиньского медицинского университета. Для этого исследования были использованы самцы крыс Sprague-Dawley в возрасте от 9 до 12 недель и весом примерно 320-360 г. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Отбор и содержание животных

  1. Выберите здоровое животное (масса тела ~220-240 г).
  2. Убедитесь, что они соответствуют критериям специфического уровня отсутствия патогенов (SPF)15 и адаптивно выращиваются в течение как минимум 2 недель в среде с достаточной вентиляцией (от 8 до 12 воздухообменов в час), комфортной температурой (20-25 °C), соответствующей влажностью (40%-70%), минимальным шумом (ниже 70 децибел) и естественным световым циклом (12 часов света и 12 часов темноты).
  3. В течение этого периода размещайте их в стандартных чистых клетках с плотностью от трех до пяти клеток на клетку и меняйте подстилку два раза в неделю. Обеспечьте неограниченный доступ к пище и воде, а также к стандартному корму для лабораторных крыс.

2. Предоперационная подготовка

  1. Выберите здоровую крысу с примерной массой тела от 320 г до 360 г. Голодайте крысу за 8-12 ч до операции и обеспечьте доступ к раствору физиологического раствора и 5% глюкозы в соотношении 1:1 для добровольного потребления.
  2. Подготовьте автоклавные микрохирургические инструменты (предоперационное замачивание в спирте на 1 ч), микроскоп, стол для препарирования крыс, 8-0 нерассасывающийся высокомолекулярный шовный материал, нерассасывающийся шовный материал 4-0, стерильная марля, стерильные ватные палочки и т.д.

3. Создание модели подвздошной кишки крысы

  1. Внутрибрюшинное введение 1% раствора пентобарбитала натрия в дозе 6 мл/кг и внутрибрюшинное введение местной анестезии с 0,5% ропивакаином для обезболивания крысы. Поддерживайте комфортную температуру крысы во время анестезии с помощью электрической лампы.
  2. Выполните тотальную колоректальную резекцию, выполнив следующие действия:
    1. Закрепите крысу в положении лежа на анатомической скамье в соответствии с удовлетворительным протоколом анестезии. Подтвердите глубину анестезии с помощью зажима пальца ноги. Используйте машинки для стрижки для бритья, чтобы удалить остатки волос, и дважды нанесите раствор йодофора для стерилизации хирургических полей.
    2. Сделайте разрез по средней линии, длиной примерно 6 см, чтобы рассечь через кожу, белую линию фасции и брюшину, обеспечивая вход в брюшную полость. С помощью ретрактора обнажите поверхность брюшины и накройте ее стерильной марлей, пропитанной бактериостатическим раствором.
    3. Изолировать сосудистый поток терминальной тощей кишки, перевязать его начало с помощью 8-0 Наложите шов нитью, а впоследствии разорвите ее. Установите культю слепой кишки, расположенную в 1-2 см от илеоцекального клапана, в состояние покоя, а затем разрежьте ее.
    4. Начните резекцию правого гемиколона, консервативно перевязывая правый гемиколон и среднюю коликовую вену.
    5. Далее отделите нижнюю брыжеечную артерию и изолируйте нижнюю ректальную артерию. Продолжайте изоляцию вниз по прямой кишке до интервала, равного двум сантиметрам от анального края. Косо резекцию дистального отдела прямой кишки под углом около 45 градусов во избежание послеоперационного стеноза.
  3. Выполните конструкцию J-образного мешка.
    1. С помощью микротомного скальпеля отделите поперечный срез терминальной подвздошной кишки от брыжеечной кишки, которая должна составлять около 6-7 см.
    2. Сложите терминальную подвздошную кишку в J-образную форму, чтобы получился мешочек для подвздошной кишки. Выполните анастомоз задней стенки с помощью блокирующего шва. Увеличьте переднюю стенку с помощью модифицированного шва Коннелла и сохраните соответствующую кишку, чтобы она соответствовала размеру поперечного сечения дистального отдела культи прямой кишки.
    3. Укрепите J-образный мешочек с помощью 8-0 сшивание при необходимости. Длина J-подсумка должна находиться в диапазоне от 2,5 см до 3,5 см.
  4. Выполняют подвздошно-анальный анастомоз, IPAA.
    1. Подтвердите отсутствие перекрута в брыжейке и зашите муравьиные боковые стенки отверстия мешочка и боковую стенку культи прямой кишки с интервалом 8-0 Сшивающая нить для вытяжения.
    2. В конечном итоге, наложите полнослойный непрерывный замковый шов как на переднюю, так и на заднюю стенки.
    3. Убедитесь в отсутствии активных кровотечений и физиологически очистите брюшную полость обычным физиологическим раствором. Последовательно закройте фасцию мышц живота и кожу швами 4-0.
  5. Выполняйте послеоперационное лечение.
    1. Вводите кетопрофен в качестве послеоперационной анальгезии (40 мг/кг, подкожно) всем крысам после закрытия брюшной полости. Следите за тем, чтобы крыса согревалась с помощью электрической лампы до тех пор, пока не произойдет восстановление.
    2. Ограничьте употребление пищи животным в течение как минимум 72 ч после операции, чтобы снизить риск кишечной непроходимости. Обеспечьте доступ к диете с содержанием 5% глюкозы в неограниченном количестве, чтобы быстро восполнить энергию и жидкости в организме, а также отрегулируйте частоту кормления в соответствии с режимом дефекации.
    3. Через неделю после операции начните с ограниченного питания и постепенно увеличивайте его количество. Затем обеспечьте крыс регулярным кормом для грызунов, чтобы они могли свободно потреблять, ведя ежедневный учет их рациона, потребления воды и массы тела.

4. Создание модели подвздошного резервуарного илеита крыс с помощью DSS

  1. Выполните экспериментальную группировку.
    1. Случайным образом распределите 12 крыс, перенесших тотальную колоректальную резекцию и операцию IPAA, в группу IPAA (группа A, n = 6) и группу резервуарного илеита (группа B, n = 6).
    2. Приготовьте 4% раствор DSS, добавив 4 г DSS в 100 мл чистой воды, только что приготовленной ежедневно.
    3. В группе IPAA и группе резервуарного илеита вводят чистую воду или 4% DSS на 31-й день после операции и на 35-й день соответственно. Позвольте крысам свободно пить и есть корм для крыс в течение четырех дней подряд.
  2. Выполните отбор проб из мешка.
    1. Утром 35-го дня, после операции, обезболить крыс внутрибрюшинной инъекцией 1% раствора пентобарбитала натрия, введя дозу 6 мл/кг (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
    2. Разрежьте стомный мешок перпендикулярно от устьица мешка до места соединения входного и выходного мешков в каждой группе. Получите образец из мешочка.
    3. Откройте мешочек по линии шва передней стенки и промойте кишечный канал физиологическим раствором.
    4. Поместите фрагмент ткани мешка в микроцентрифужную пробирку и быстро охладите его при температуре -80 °C. Используйте эту часть для выявления признаков воспаления с помощью ИФА. Зафиксируйте оставшуюся часть мешка 10% формальдегидом для гистопатологического скоринга и иммуногистохимического окрашивания.
    5. Наконец, усыпить крысу путем воздушной эмболии под глубокой анестезией (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).

5. Гистологический анализ

  1. После получения мешочной ткани от крысы погрузите ее в 4% параформальдегид на 24 ч. Затем приступайте к протоколам обезвоживания и внедрения. Срез обработанной ткани для гистологического исследования16.
  2. Применяйте окрашивание гематоксилином и эозином для выявления гистопатологических различий между группами. Изучите образцы под микроскопом и сделайте фотографии для документирования.

6. Иммуногистохимический анализ

  1. Тщательно обеспылите и обезвожьте участки тканей. Затем проводят забор антигена, охлаждая участки в растворе цитрата натрия и блокируя их блокирующей сывороткой в течение 20 мин.
  2. Затем подвергнуть срезы воздействию первичного антиокклюдинового антитела и инкубировать их в течение ночи при 4 °C. После этого обработайте их вторичными антителами в течение 30 минут перед противодействием гематоксилину16.
  3. Как только срезы высохнут, понаблюдайте и сфотографируйте их под световым микроскопом.

7. ИФА-тест

  1. 7.1 Измельчить и гомогенизировать фрагменты ткани в буфере для лизиса с использованием ультразвука для обеспечения тщательной гомогенизации. Используйте полученный надосадочный слой для обнаружения.
  2. Выделяйте лунки для заготовок, образцов и реплик для каждой группы. Определение концентрации белка путем считывания коэффициента поглощения при длине волны 450 нм (значение OD) и проведения линейного регрессионного анализа16.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Общая оценка состояния крыс с модельным подвздошным мешком после приживления
После того, как оператор прошел кривую хирургического обучения IPAA, крысы хорошо переносили операцию, продолжительность операции составила 192,94 мин ± 27,15 мин, и возникло меньше послеоперационных осложнений. В раннем послеоперационном периоде у крыс наблюдалось снижение потребления пищи, но их предоперационный аппетит восстанавливался в течение от 10 до 14 дней после операции. Ранняя послеоперационная активность несколько...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Язвенный колит (ЯК) – это хроническое воспаление кишечника, характеризующееся периодическими болями в эпигастрии, диареей и кровавым стулом со слизью. В первую очередь он поражает прямую кишку и может поражать прогрессирующую толстую кишку в разной степени. Хирургическое вмешательство играет решающую роль в лечении ЯК 17,18,19. С тех пор, как в 1978 году Parks et al.20 вв...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Безводный этанолТяньцзинь Fengchuan Chemical Reagent Technology Co., LtdКитай Окрашиваниегематоксином-эозином
Декстрана сульфат натрия   Yeasen 60316ES76Используется для индукции воспаления мешочкового мешка
Раствор формальдегидаТяньцзинь Чжиюань Реагентная компанияКитай Марляокрашивания гематоксином-эозином
Цзянси Чжунгань Компания по производству медицинского оборудованияКитайИспользуется для микрохирургии животных
ГематоксилинПекин Чжуншань Цзиньцяо КомпанияКитайОкрашивание гематоксином-эозином
Интерферон и гамма;   Набор реагентов для детектированияCloud-cloneSEA049RaДетектирование факторов воспаления
Набор для детектирования интерлейкина-10Cloud-cloneSEA056RaДетектирование факторов воспаления
Набор для детектирования интерлейкина-17Cloud-cloneSEA063RaДетектирование воспалительных факторов Набор для детектирования
интерлейкина-6Cloud-cloneSEA079RaДетектирование воспалительных факторов
IodophorTangpai Medical Equipment Co., LtdКитайИспользуется для микрохирургии животных
Инструменты для микроскопических манипуляцийAesculapГерманияИспользуется для микрохирургии животных
Occludinabcamab216327Иммуногистохимическое тестирование
Швейная иглаYangzhou Fuda Medical Equipment Co., LtdКитайИспользуется для микрохирургии животных
фактор некроза опухоли &альфа; Набор реагентов для обнаруженияCloud-клонSEA133RaОбнаружение воспалительных факторов
Бинокулярный хирургический микроскоп для двух человекOPTONГерманияИспользуется для микрохирургии животных
КсилолТяньцзинь Инда Завод редких и драгоценных реактивов КитайОкрашиваниегематоксином-эозином
для

Ссылки

  1. Yang, M. L., Brar, M. S., Kennedy, E. D., De Buck Van Overstraeten, A. Laparoscopic versus transanal IPAA for ulcerative colitis: A patient-centered treatment trade-off study. Dis Colon Rectum. 67 (1), 107-113 (2024).
  2. Aktas, M. K., et al. Current status and surgical technique for restorative proctocolectomy with ileal pouch-anal anastomosis. Balkan Med J. 40 (4), 236-243 (2023).
  3. Zhao, L., et al. Microbiota DNA translocation into mesentery lymph nodes is associated with early development of pouchitis after ipaa for ulcerative colitis. Diseases of the Colon & Rectum. 66 (11), e1107-e1118 (2022).
  4. Ng, S. C., et al. Worldwide incidence and prevalence of inflammatory bowel disease in the 21st century: A systematic review of population-based studies. Lancet. 390 (10114), 2769-2778 (2017).
  5. Pardi, D. S., D'haens, G., Shen, B., Campbell, S., Gionchetti, P. Clinical guidelines for the management of pouchitis. Inflamm Bowel Dis. 15 (9), 1424-1431 (2009).
  6. Shen, B., et al. Treatment of pouchitis, Crohn's disease, cuffitis, and other inflammatory disorders of the pouch: Consensus guidelines from the international ileal pouch consortium. Lancet Gastroenterol Hepatol. 7 (1), 69-95 (2022).
  7. Dalal, R. L., Shen, B., Schwartz, D. A. Management of pouchitis and other common complications of the pouch. Inflamm Bowel Dis. 24 (5), 989-996 (2018).
  8. Li, K. Y., et al. A new rat model of pouchitis after proctocolectomy and ileal pouch-anal anastomosis using 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid. J Gastrointest Surg. 25 (6), 1524-1533 (2021).
  9. Drzymala-Czyz, S., et al. Discrepancy between clinical and histological effects of dha supplementation in a rat model of pouchitis. Folia Histochem Cytobiol. 50 (1), 125-129 (2012).
  10. Santiago, P., Barnes, E. L., Raffals, L. E. Classification and management of disorders of the J pouch. Am J Gastroenterol. 118 (11), 1931-1939 (2023).
  11. Lichtman, S. N., Wang, J., Hummel, B., Lacey, S., Sartor, R. B. A rat model of ileal pouch-rectal anastomosis. Inflamm Bowel Dis. 4 (3), 187-195 (1998).
  12. Guarner, F. Inulin and oligofructose: Impact on intestinal diseases and disorders. Br J Nutr. 93, Suppl 1 S61-S65 (2005).
  13. Kim, C. J., et al. L-tryptophan exhibits therapeutic function in a porcine model of dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis. J Nutr Biochem. 21 (6), 468-475 (2010).
  14. Valatas, V., Bamias, G., Kolios, G. Experimental colitis models: Insights into the pathogenesis of inflammatory bowel disease and translational issues. Eur J Pharmacol. 759, 253-264 (2015).
  15. Letson, H. L., Morris, J., Biros, E., Dobson, G. P. Conventional and specific-pathogen free rats respond differently to anesthesia and surgical trauma. Sci Rep. 9 (1), 9399(2019).
  16. Gu, Y., et al. Saccharomyces boulardii, a yeast probiotic, inhibits gut motility through upregulating intestinal serotonin transporter and modulating gut microbiota. Pharmacol Res. 181, 106291(2022).
  17. Akiyama, S., et al. Endoscopic phenotype of the j pouch in patients with inflammatory bowel disease: A new classification for pouch outcomes. Clin Gastroenterol Hepatol. 20 (2), 293-302 (2022).
  18. Hata, K., et al. Pouchitis after ileal pouch-anal anastomosis in ulcerative colitis: Diagnosis, management, risk factors, and incidence. Dig Endosc. 29 (1), 26-34 (2017).
  19. Gallo, G., Kotze, P. G., Spinelli, A. Surgery in ulcerative colitis: When? How. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 32-33, 71-78 (2018).
  20. Parks, A. Proctocolectomy without ileostomy for ulcerative colitis. BMJ. 2, 85-88 (1978).
  21. Shebani, K. O., et al. Pouchitis in a rat model of ileal J pouch-anal anastomosis. Inflamm Bowel Dis. 8 (1), 23-34 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Модель паучита у крысязвенный колитэкспериментальная модель на животныхпатогенез паучитаметодика микрохирургической операциианализ воспалительных факторовиммуногистохимияпослеоперационный уход
Модель резервуарного илеита у крыс после проктоколэктомии и подвздошно-анального анастомоза с использованием декстрана сульфата натрия
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.