Методическая статья

Крысиная модель окклюзии/реперфузии средней мозговой артерии без повреждения анатомической структуры сосудов головного мозга

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66635

⸱

17 мая 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, The Third Hospital of Hebei Medical University, 2School of Pharmacy, Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation, Ministry of Education, Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong, Yantai University

В этой статье

Краткое содержание

Текущий протокол описывает крысиную модель окклюзии/реперфузии средней мозговой артерии, которая сохраняет анатомическую структуру сосудов головного мозга, не вызывая повреждений.

Аннотация

Ишемический инсульт является основной причиной долгосрочной инвалидности и смертности среди взрослых во всем мире. Животные модели ишемического инсульта внесли значительный вклад в наше понимание его патологических механизмов и разработку потенциальных методов лечения. В настоящее время существует два распространенных метода с использованием нитевых (эндоваскулярных швов) для индуцирования животных моделей ишемии головного мозга. Тем не менее, эти методы имеют неотъемлемые ограничения, такие как снижение перфузии крови в мозге, повреждение системы наружных сонных артерий, нарушение приема пищи и/или воды, а также сенсорная дисфункция лица. В данной статье представлен новый метод индуцирования модели ишемического инсульта крыс без нарушения анатомии сосудов головного мозга. В этом исследовании была обнажена общая сонная артерия (КЦА) крыс Спрэг-Доули, и был сделан разрез. Затем через разрез во внутреннюю сонную артерию вводили филамент, чтобы окклюзировать среднюю мозговую артерию. Через 1,5 ч после индуцированной ишемии окклюзионная нить была полностью удалена как из внутренней сонной артерии, так и из ОСА. Разрез в области ОСА впоследствии был зашит с использованием микрохирургических швов 11-0 под микроскопом (увеличение 4x). Благодаря использованию микрохирургических методов для восстановления КЦА, в этом исследовании был успешно разработан уникальный метод индуцирования модели ишемического инсульта у крыс с сохранением анатомической целостности кровеносных сосудов головного мозга.

Введение

Инсульт, ведущая причина смерти и долговременной неврологической дисфункции у взрослых во всем мире, охватывает различные типы, при этом ишемический инсульт составляет примерно 81,9% случаев, в то время как кровоизлияние в мозг и субарахноидальное кровоизлияние составляют 14,9% и 3,1% соответственно1. Ишемический инсульт часто возникает в результате атеросклероза или окклюзии средней мозговой артерии (СМА), что приводит к локальному снижению мозгового кровотока и последующему повреждению головного мозга. Это снижение поступления питательных веществ к ишемизированным клеткам вызывает истощение энергии, вызывая потерю целостности мембраны, набухание клеток и, в конечном итоге, лизис. Кроме того, такие факторы, как повышенный внутриклеточный кальций, возбуждающее высвобождение аминокислот, повышенная выработка свободных радикалов и активация воспалительных клеток, способствуют повреждению тканей мозга после инсульта2.

Цели лечения ишемического инсульта многогранны: уменьшение текущих неврологических повреждений и снижение смертности и долгосрочной инвалидности; предотвращение осложнений, возникающих из-за неподвижности и неврологической дисфункции; и минимизация риска рецидива инсульта. Учитывая сложность патофизиологии ишемического инсульта, надежная модель инсульта имеет важное значение для исследований и разработки методов лечения, нацеленных на ишемический инсульт.

В настоящее время окклюзия средней мозговой артерии (MCAo) является распространенной животной моделью ишемического инсульта3. MCAo обычно выполняется путем введения моноволокна с силиконовым наконечником или затупленного пламенем через цервикальные сосуды до тех пор, пока она не достигнет истока средней мозговой артерии (MCA). В 1986 году Коидзуми и его коллеги разработали метод, включающий введение моноволокна с силиконовым наконечником через разрез в общей сонной артерии (CCA), что позволило ей достичь входа в MCA и заблокировать ее кровоток4. В 1989 году группа Лонги сообщила о другом методе MCAo, который включал введение моноволокна через разрез в наружной сонной артерии (ЭКА). Затем монофиламент проходит через бифуркацию внутренней сонной артерии (ICA) и ECA, прежде чем достичь начальной точки MCA5.

Ограничения двух существующих методов индуцирования MCAo очевидны. Метод Коидзуми требует постоянной блокировки ипсилатерального CCA, что приводит к снижению перфузии MCA, поскольку реперфузия полагается исключительно на круг Willis4. И наоборот, метод Лонги включает в себя разрезание ECA, что приводит к повреждению системы ECA и последующему нарушению функции лицевых мышц5. Это повреждение может повлиять на потребление пищи и воды, а также вызвать сенсорную дисфункцию лица, влияя на реабилитацию и оценку неврологической функции после ишемического инсульта6.

Текущий протокол направлен на устранение этих ограничений путем разработки нового метода индуцирования модели ишемического инсульта без повреждения анатомической структуры сосудов головного мозга. Этот новый подход использует микрохирургические методы для восстановления ОСА, что позволяет избежать недостатков, связанных с предыдущими методами.

Протокол

Экспериментальная процедура получила одобрение от Комитета по уходу за животными и их использованию в Университете Яньтай (номер одобрения: YTDX20230410) и соответствует рекомендациям Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Для этого исследования были использованы самцы крыс Sprague-Dawley весом от 300 до 350 г. Полный список используемых животных, реагентов и оборудования представлен в Таблице материалов.

1. Подготовка животных

  1. Содержате животных в условиях, поддерживающих 12-часовой цикл света/темноты, контролируемую температуру и влажность. Обеспечьте им неограниченный доступ к пище и воде.

2. Анестезия

  1. Обезболивайте крыс путем внутрибрюшинной инъекции смесью, содержащей кетамин (80 мг/кг) и ксилазин (20 мг/кг).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наклоните голову и тело крыс вниз. Место инъекции находится в нижнем правом квадранте брюшной полости животного. Перед введением потяните поршень назад. Средний объем инъекции составляет 0,4 мл.
  2. Подтвердите индукцию анестезии, оценив рефлекс отвода задней лапы и мигающий рефлекс. Если адекватная глубина анестезии не достигнута, во время хирургического вмешательства следует дополнить препарат изофлураном.

3. Процедура ишемического моделирования

  1. Простерилизуйте хирургические инструменты с помощью автоклава. Продезинфицируйте операционные столы и сопутствующее оборудование 70% этанолом.
  2. Подготовьте место операции, сбрив шерсть вокруг предполагаемого места разреза. Продезинфицируйте кожу в месте операции трижды бетадином и 70% этанолом.
  3. Сделайте разрез по средней линии на вентральной стороне, длиной примерно 1,5 см, и вскройте поверхностную фасцию.
  4. Выполните резкое и тупое рассечение, чтобы обнажить наружную сонную артерию (ECA), внутреннюю сонную артерию (ICA) и общую сонную артерию (CCA) в соответствии с ранее описанным методом7.
  5. Наложите три шелковых шовных нити 4-0 вокруг CCA и еще один шелковый шов через ECA рядом с бифуркацией ICA. Завяжите съемный скользящий узел на проксимальном участке CCA. Затяните шов на дистальном отделе ОСА с помощью гемостата для блокировки кровотока. Во время наложения швов завяжите еще один скользящий узел вокруг CCA, чтобы убедиться, что сосуд не закупорен.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что скользящий узел не слишком тугой, достаточный только для блокировки кровотока, так как его необходимо будет освободить во время наложения сосудистых швов.
  6. Сделайте разрез 0,5 мм между проксимальным шелковым швом и средним швом на ОСА с помощью ножниц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что разрез позволяет нити (наконечник с силиконовым покрытием) войти в CCA.
  7. Введите в CCA нить длиной 3-0 4-0 (наконечник с силиконовым покрытием). Затяните шелковые швы вокруг CCA, чтобы закрепить внутрипросветную нить и предотвратить кровотечение; затем снимите шов с дистального отдела КЦА.
  8. Продолжайте вводить нить в просвет MCA, контролируя швы вокруг ECA, чтобы убедиться, что нить не попадет в ECA. Длина введения обычно составляет от 18 мм до 20 мм.
  9. Запустите таймер и запишите время, когда начинается окклюзия. Зашить разрез на шее шелковыми швами 3-0 и осторожно поместить животное в клетку для восстановления. Введите 0,5 мл физиологического раствора внутрибрюшинно.

4. Микрохирургическое наложение швов ОСА

  1. Повторная анестезия крысы через 1,5 ч после ишемии. Трижды продезинфицируйте место разреза 70% этанолом и снова откройте разрез.
  2. Аккуратно извлеките окклюзионную нить до тех пор, пока рядом с разрезом CCA не станет хорошо виден белый кончик. Поместите микрозажим горизонтально рядом с закрепленным внутрипросветным шовным узлом рядом с бифуркацией CCA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте зажима белого кончика нити, чтобы предотвратить отслоение силикона и последующий тромбоз.
  3. Отпустите закрепленный внутрипросветный шовный узел и полностью удалите нить.
  4. Поместите еще один микрозажим рядом с сердцевинной стороной проксимального узла CCA. Впоследствии снимите шовный узел вокруг проксимального отдела CCA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное размещение зажимов имеет решающее значение для поднятия неподвижных сосудов на последующих этапах для облегчения наложения микрососудистых швов. Расположите зажимы горизонтально на окружающих мышцах, чтобы предотвратить соскальзывание.
  5. Промойте место разреза обычным физиологическим раствором и высушите область стерильным ватным тампоном, чтобы удалить кровь и получить чистое операционное поле.
  6. Под микроскопом (4-кратное увеличение) наложите шов на разрез CCA с использованием микрохирургических швов 11-0 в прерывистой схеме, обычно требующей двух швов в зависимости от размера разреза.
  7. После наложения швов снимите микрозажимы с обоих концов ОСА для восстановления кровотока.
  8. Прижмите стерильным ватным тампоном к месту наложения шва на 30 с. Соблюдайте ОСА в течение 2 минут, чтобы убедиться, что кровотечение не происходит. Зашить разрез на шее крысы и поместить животное в бокс с температурой 35 °C для восстановления после анестезии, прежде чем вернуть его в клетку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вводите внутрибрюшинно мелоксикам в дозе 2 мг/кг для послеоперационной анальгезии.

5. Окрашивание 2,3,5-трифенилтетразолия хлоридом (TTC)

  1. Через трое суток после ишемии-реперфузии животных усыпить под глубокой анестезией 4% изофлураном и вывихнуть шейку матки.
  2. Удалите мозги и разрежьте их на корональные срезы толщиной 2 мм с помощью лезвия скальпеля8.
  3. Инкубируйте отделы мозга с 2% ТТК в течение 20 минут при 37 °C.
  4. Дважды промойте участки мозга 10% формалином, затем зафиксируйте их 10% формалином на 30 минут при комнатной температуре.
  5. Делайте цифровые фотографии последовательных срезов и количественно измеряйте области инфаркта с помощью программного обеспечения Image J.

6. Тест на неврологическую функцию

ПРИМЕЧАНИЕ: Неврологические функции оценивались с помощью теста Гарсии, в соответствии с предыдущим отчетом9.

  1. Оцените спонтанную активность, симметрию в движении всех четырех конечностей, вытягивание передней лапы, лазание, проприоцепцию тела и реакцию на прикосновения вибрисс. Назначьте баллы на основе критериев теста Гарсии, при этом максимальный балл 18 баллов указывает на нормальную неврологическую функцию.

7. Статистический анализ

  1. Используйте GraphPad Prism для проведения статистического анализа с использованием t-критерия Стьюдента. Выразите данные в виде среднего ± стандартного отклонения. Учитывайте различия между средними статистически значимыми, если P < 0,05.

Результаты

Процесс микрохирургического ушивания
Нить вытягивали из области разреза общей сонной артерии (CCA) до тех пор, пока не стал виден белый кончик нити (Рисунок 1A). Затем на CCA наложили микрозажимы (Рисунок 1B). Под микроскопом при 4-кратном увеличении разрез CCA ушили с помощью микрохирургических швов прерывистым методом (Рисунок 1C). После этого микрозажимы с CCA сняли, восстановив анатомическую структуру и кровоток (Рисунок 1D).

Окрашивание TTC и уровень смертности
В общей сложности 12 взрослых самцов крыс были случайным образом разделены на две группы: ложнооперированную (sham) и опытную (model) (n = 6 в каждой группе). К сожалению, одно животное в ложнооперированной группе погибло от передозировки анестетика, а одно животное в опытной группе погибло в течение 24 ч. Инфаркты, возникшие в результате ишемии головного мозга, наблюдались как в стриатуме, так и в коре (Рисунок 2A). Через 3 дня после ишемического инсульта общая площадь инфаркта составила 29,3% ± 1,6% полушария (Рисунок 2B), при этом уровень смертности после операции составил 16,7%.

Оценка неврологической функции
На 1-й и 3-й дни после ишемического инсульта показатели групп с моделью заболевания были значительно ниже, чем в контрольных группах (17,8 ± 0,4 vs. 8,2 ± 1,5, Рисунок 3A; 17,6 ± 0,9 vs. 9,6 ± 1,3, Рисунок 3B, соответственно).

Схема техники хирургического шва; пинцет удерживает ткань; этапы: введение иглы, завязывание узла.
Рисунок 1: Процесс микрохирургического шва. (A) Извлечение нити из общей сонной артерии (CCA). Синие стрелки указывают на микрососудистые зажимы. (B) Черная стрелка указывает на разрез после полного удаления нити. Синие стрелки указывают на микрососудистые зажимы. (C) Под микроскопом (увеличение 4x) разрез CCA зашивали с использованием микрохирургических швов 11-0 отдельными стежками. Синие стрелки указывают на микрососудистые зажимы. Черная стрелка указывает на зашитый разрез. (D) Микрозажимы удалены, и кровоток в CCA восстановлен. Черная стрелка указывает на место наложения шва на CCA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Срезы ишемизированной ткани мозга, столбчатая диаграмма, сравнение процента площади ишемии, результаты эксперимента.
Рисунок 2Результаты окрашивания ТТК модели ишемии. (A) Репрезентативные изображения срезов головного мозга, окрашенных 2,3,5-трифенилтетразолиумхлоридом (ТТХ), после церебральной ишемии. В живой ткани ТТХ ферментативно восстанавливается дегидрогеназами до 1,3,5-трифенилформазана, имеющего красный цвет. Ткани в зонах некроза остаются белыми из-за отсутствия такой ферментативной активности. (B) Процент ишемизированной области у крыс через 3 дня после церебральной ишемии. По сравнению с группой Sham, **P < 0,01. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. В каждой группе было пять крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Столбчатая диаграмма, сравнивающая показатели по шкале Гарсия в группах Sham и Model, демонстрирующая значимое различие (**).
Рисунок 3: Оценка неврологической функции. (A) Показатели по шкале Гарсия через 1 день после ишемии головного мозга. (B) Показатели по шкале Гарсия через 3 дня после ишемии головного мозга. По сравнению с группой Sham, **P < 0.01. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. В каждой группе было по пять крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

MCAo является широко используемым методом для создания животных моделей инсульта, эффективно воспроизводящим процесс инсульта, наблюдаемый у пациентов, путем восстановления кровотока после ишемии 10,11,12. Наша лаборатория разработала модель ишемического инсульта, которая позволяет проводить реперфузию из ОСА без повреждения ЭХА. После индукции ишемии проводится микрохирургическая коррекция ОСА. Хотя прямое измерение кровотока ОСА не проводилось, экспериментаторы наблюдали пульсацию сосудов в ОСА перед тем, как приступить к реперфузии. Эта методика позволяет сохранить анатомическую целостность сосудов шеи, при этом очень напоминая процесс инсульта у пациентов. Кроме того, оценка неврологической функции и области ишемии головного мозга подтвердила обоснованность инсульта, вызванного этим хирургическим подходом.

На описанные ранее модели ишемического инсульта могут влиять различные факторы. В методе Koizumi et al.4 реперфузия крови в значительной степени зависит от Виллизиева круга из-за лигирования CCA. Тем не менее, вариации сосудистой сети головного мозга могут влиять на окончательный объем инфаркта головного мозга, потенциально увеличивая смертность модели инсульта из-за низкой перфузии крови13,14. Кроме того, ишемия ЭХА может нарушать функцию лицевых мышц и нервов, влияя на оценку различных неврологических функций15,16.

Текущий метод решает эти проблемы с помощью трех ключевых этапов: (1) Сохранение разреза CCA как можно меньше, достаточно большого только для введения нити, что сокращает время и повреждения, связанные с наложением сосудистых швов. (2) Размещение микрососудистых зажимов как можно ближе к бифуркации CCA при зажиме дистального CCA для предотвращения зажатия белого кончика нити, которое может привести к отслоению силикона и тромбозу. (3) Наблюдение за ОСА на предмет возобновления пульсации и отсутствия существенного кровотечения перед наложением швов на разрез средней линии шеи после восстановления сосудов.

Текущий метод имеет несколько ограничений. Во-первых, существует вероятность образования эмболов в месте наложения швов, что может привести к дальнейшей ишемии мозга в случае их отслоения. Этот риск следует тщательно учитывать и управлять им в будущих экспериментах. Во-вторых, в исследовании не контролировалась масса тела крыс, что затрудняет определение того, повлиял ли метод на потребление ими пищи. Потребление пищи является прямым показателем преимуществ метода, и его оценка может дать ценную информацию. Наконец, современный метод требует технических знаний в области микрохирургических операций, что может ограничить его широкое использование без надлежащей подготовки и опыта.

Таким образом, несмотря на то, что метод моделирования MCAo обеспечивает высокую физиологическую значимость и структурную целостность, он имеет ограничения, которые необходимо устранить для более надежных экспериментов. Существенными сильными сторонами метода являются сохранение анатомической целостности сосудов шеи и точное моделирование инсультных процессов у пациентов. Такой подход, несомненно, внесет значительный вклад в исследования ишемического инсульта, повысив надежность и точность экспериментальных моделей. В конечном счете, это может привести к меньшему количеству экспериментальных групп, необходимых для проверки терапевтических эффектов, что приведет к более надежным экспериментальным результатам.

Раскрытие информации

У авторов нет никаких потенциальных конфликтующих интересов, которые можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана проектом провинции Хэбэй "Внедрение иностранной разведки" в 2023 году. Мы благодарим Лизу Крейнер, доктора философии, из Liwen Bianji, (Edanz) (www.liwenbianji.cn), за редактирование английского текста черновика этой рукописи.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10% формалинаBeijing Labgic Technology Co., Ltd.BL913A
11-0 микрохирургические шовные нитиNingbo Medical Suture Needle Co., Ltd.3/8 1&раз;
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (TTC)SIGMAT8877
3-0 шелковый шовный материалNingbo Medical Suture Needle Co., Ltd.3-0
4% изофлурана   Тяньцзинь Рингпу Био-Технология Ко., Лтд.
6-0 шелковый шовный материалNingbo Medical Suture Needle Co., Ltd.6-0
70% этанолShandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd.
ФиламентXinong Technologies Co Ltd.2838-A5
Кетамин   Цзянсу Хенгруй Фармасьютикал Ко., Лтд.230613BL
Самец крысы Спрэг ДоулиЦзинань Пэнъюэ Экспериментальное разведение животных Co., Ltd.SCXK (Lu) 20190003
MicroclipsШанхайская фабрика медицинского оборудования JinzhongW40150
МикроскопZEISSS100 OPMI pico
Бокс для кормленияBeijing Fuyi Electrical Appliance Co., Ltd.FYL-YS-100L
КСИЛАЗИНСИГМАPHR3263
52022110220230408

Ссылки

  1. Tu, W. J., et al. China stroke surveillance report 2021. Mil Med Res. 10 (1), 33(2023).
  2. Wu, L., et al. Targeting oxidative stress and inflammation to prevent ischemia-reperfusion injury. Front in Mol Neurosci. 13, 28(2020).
  3. Ringelstein, E. B., et al. Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization. Neurology. 42 (2), 289-298 (1992).
  4. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. E. Experimental studies of ischemic brain edema: A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jap J Stroke. 8, 1-8 (1986).
  5. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  6. Trueman, R. C., et al. A critical re-examination of the intraluminal filament MCAO model: Impact of external carotid artery transection. Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).
  7. Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser Doppler flowmetry guidance in mice. J Vis Exp. (51), e2879(2011).
  8. Yu, Z., et al. Icaritin inhibits neuroinflammation in a rat cerebral ischemia model by regulating microglial polarization through the GPER-ERK-NF-κB signaling pathway. Mol Med. 28 (1), 142(2022).
  9. Garcia, J. H., Wagner, S., Liu, K. F., Hu, X. J. Neurological Deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 26 (4), 627-634 (1995).
  10. Bracko, O., et al. 3-Nitropropionic acid-induced ischemia tolerance in the rat brain is mediated by reduced metabolic activity and cerebral blood flow. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (9), 1522-1530 (2014).
  11. Goldmacher, G. V., et al. Tracking transplanted bone marrow stem cells and their effects in the rat MCAO stroke model. PLoS One. 8 (3), e60049(2013).
  12. Lee, H. J., et al. The therapeutic potential of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in Alzheimer's disease. Neurosci Lett. 481 (1), 30-35 (2010).
  13. Connolly, E. S., Winfree, C. J., Solomon, R. A. Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia. Neurosurgery. 38 (3), 523-531 (1996).
  14. Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).
  15. Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).
  16. Virtanen, T., Jolkkonen, J., Sivenius, J. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2004).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи