Method Article

Количественная оценка активности секреционной системы Yersinia pseudotuberculosis III типа после железного голодания и анаэробного роста

DOI:

10.3791/66642

⸱

May 31st, 2024

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Environmental Toxicology, University of California, Santa Cruz

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Бактерии колонизируют ткани хозяина, которые различаются по биодоступности кислорода и железа, однако в большинстве подходов к изучению бактерий используется аэрированная, обогащенная среда. В этом протоколе описывается культивирование патогена человека Yersinia pseudotuberculosis при различных концентрациях железа и напряжении кислорода, а также количественная оценка активности системы секреции Yersinia III типа, которая является важным фактором вирулентности.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ключевым механизмом вирулентности для многих грамотрицательных патогенов является система секреции III типа (T3SS), игольчатый придаток, который перемещает цитотоксические или иммуномодулирующие эффекторные белки в клетки хозяина. T3SS является мишенью для кампаний по открытию противомикробных препаратов, поскольку он доступен внеклеточно и в значительной степени отсутствует у непатогенных бактерий. Недавние исследования показали, что T3SS Yersinia и Salmonella регулируются факторами, реагирующими на железо и кислород, которые являются важными специфическими для ниши сигналами, возникающими во время инфекции млекопитающих. Здесь описан способ лечения железного голодания при Yersinia pseudotuberculosis с последующим факультативным приемом неорганического железа. Чтобы оценить влияние доступности кислорода, этот процесс железного голодания демонстрируется как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Наконец, инкубация культур при температуре хозяина млекопитающих 37 °C индуцирует экспрессию T3SS и позволяет количественно оценить активность Yersinia T3SS путем визуализации эффекторных белков, высвобождаемых в надосадочную жидкость. Описанные здесь шаги дают преимущество по сравнению с использованием хелаторов железа при отсутствии железного голодания, которое недостаточно для того, чтобы вызвать сильное железное голодание, предположительно из-за эффективных систем поглощения и удаления железа Yersinia . Кроме того, лабораторная посуда с кислотной промывкой тщательно продумана для обеспечения удаления остатков железа, которые необходимы для вызова сильного железного голодания. Кроме того, описано использование хелатирующего агента для удаления остаточного железа из сред и культивирование бактерий в течение нескольких поколений в отсутствие железа для истощения бактериальных запасов железа. Используя стандартные протоколы осаждения белка, индуцированного трихлоруксусной кислотой, SDS-PAGE и окрашивания серебром, эта процедура демонстрирует доступные способы измерения активности T3SS. Хотя эта процедура оптимизирована для Y. pseudotuberculosis, она предлагает основу для исследований патогенов с аналогичными надежными системами поглощения железа. В эпоху устойчивости к антибиотикам эти методы могут быть расширены для оценки эффективности антимикробных соединений, нацеленных на T3SS в условиях, связанных с хозяином.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Многие клинически значимые грамотрицательные патогены, такие как Yersinia, Vibrio, Escherichia, Pseudomonas и Shigella, кодируют систему секреции III типа (T3SS) для введения эффекторных белков в клетки-хозяева1. У многих видов бактерий T3SS находится под строгимрегуляторным контролем2. Например, транслокация эффекторных белков Yersinia T3SS в клетки-мишени хозяина имеет решающее значение для подрыва защитных механизмов хозяина и обеспечения бактериальной колонизации тканей хозяина. Тем не менее, активность Yersinia T3SS метаболически обременительна и может вызывать распознавание иммунными рецепторами хозяина3. Соответственно, регуляторы, которые ощущают специфические сигналы окружающей среды, контролируют экспрессию генов T3SS у многих видов бактерий. Поскольку патогены, такие как Yersinia, испытывают изменения окружающей среды во время цикла заражения, которые влияют на экспрессию критических факторов вирулентности, важно разработать лабораторные условия, которые имитируют характерные особенности ниш хозяина, занимаемых бактериальными патогенами. В частности, напряжение кислорода и доступность железа различаются между различными участками тканей пространственно-временным образом и влияют на экспрессию генов вирулентности, таких как T3SS 4,5,6. Таким образом, цель этого метода состоит в том, чтобы оценить, как кислород и железо влияют на экспрессию Yersinia T3SS. Это позволит получить представление о динамике взаимодействия хозяина и патогена.

Описанный здесь метод подробно описывает, как культивировать Yersinia pseudotuberculosis аэробно и анаэробно, а также как истощить запасы железа Yersinia во время аэробного или анаэробного роста. Здесь выделено несколько важных соображений относительно успешного культивирования бактерий в этих изменчивых условиях. Во-первых, анаэробное культивирование требует дополнительного приема глюкозы, модификация которой отмечена в рецепте среды. Во-вторых, поскольку Y. pseudotuberculosis использует сидерофоры и другие системы поглощения железа, которые могут надежно поглощать железо из окружающей среды, особое внимание уделяется тому, чтобы питательные среды и лабораторная посуда были как можно более свободными от железа. В предыдущих исследованиях использовались хелаторы железа, такие как дипиридил, для истощения железа из богатых бактериальных культур для имитации железного голодания 8,9. Тем не менее, истощение запасов железа Yersinia для вызова железного голодания требует удаления остатков железа из стеклянной посуды и сред, а также длительного роста в отсутствие железа. В этом протоколе подробно описано, как мыть кислотой стеклянную посуду и хелатировать среду для удаления остатков железа, а также культивировать бактерии в течение нескольких поколений для обеспечения полного железного голодания. Железное голодание может быть обеспечено путем измерения относительных уровней транскриптов хорошо охарактеризованных железочувствительных генов в различных условиях, как показано здесь на примере yfeA и bfd.

Кульминация этого протокола демонстрирует, как осаждать секретируемые эффекторные белки T3SS из каждого из этих состояний путем обработки надосадочной жидкости культуры трихлоруксусной кислотой (TCA) и визуализации секретируемых белков с помощью SDS-PAGE. Наконец, относительная активность T3SS оценивается путем визуализации секретируемых белков с помощью окрашивания серебром и количественного определения относительных уровней эффекторных белков T3SS, называемых внешними белками Yersinia (Yops)10.

В анализах активности T3SS обычно используются специфические антитела для определения уровней эффекторного белка T3SS в надосадочной жидкости культуры. Тем не менее, антитела вестерн-блоттинга к эффекторным белкам T3SS часто не доступны в продаже. Поэтому особое внимание было уделено тому, чтобы окончательная визуализация активности T3SS в этом методе не требовала специфических антител, а вместо этого могла использовать окрашивание серебром, которое позволяет визуализировать все секретируемые белки. Хотя этот метод специально разработан и оптимизирован для Y. pseudotuberculosis, он может быть адаптирован и к другим видам бактерий, хотя точные условия среды и время инкубации могут варьироваться.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подробная информация о реагентах, составе среды, последовательностях праймеров и оборудовании приведена в Таблице материалов. На рисунке 1 показан общий рабочий процесс эксперимента.

1. Приготовление посуды, промытой кислотой, и хелатных сред М9

ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем начать, обратитесь к разделу материалов для получения точных реагентов и рецептов, которые будут использоваться. Среда M9 впервые была использована для анализа Yersinia T3SS в Cheng et al.11.

  1. Налейте 100 мл 6 Н HCl в стеклянную колбу объемом 250 мл.
    ВНИМАНИЕ: HCl чрезвычайно опасен; Убедитесь, что при работе с этим веществом приняты соответствующие меры предосторожности.
  2. Закройте горлышко стеклянной емкости стеклянной пробкой и осторожно поворачивайте колбу в течение 1 минуты, чтобы тщательно распределить HCl, периодически меняя направление.
  3. Утилизируйте 6 N HCl надлежащим образом.
  4. Промойте стеклянную емкость, добавив 100 мл деионизированного H2O, запечатайте горлышко, встряхивайте в течение 20 с, затем слейте воду.
  5. Повторите этап полоскания в общей сложности 3 раза.
  6. Дайте высохнуть на воздухе. Автоклав для стерилизации.
  7. Для хелатирования среды смешайте компоненты M9 с хелатирующим реагентом и перемешайте с помощью магнитной мешалки при комнатной температуре в течение ~18 часов. Процедить-простерилизовать и добавить MgSO4 до конечной концентрации 1 мМ.

2. Культивирование Y. pseudotuberculosis при различных уровнях железа и напряжении кислорода

  1. Нанесите полосу Y. pseudotuberculosis (в данном исследовании используется штамм IP2666pIB1) на агаровых планшетах Lysogeny Broth (LB) и инкубируйте при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация Yersinia при 37 °C, особенно в среде с низким содержанием кальция, приводит к активности T3SS, остановке роста и, в конечном итоге, к потере плазмиды для Yersinia virulence (pYV), которая кодирует T3SS12. Таким образом, в этом протоколе используется инкубация Yersinia при 26 °C до тех пор, пока не потребуется измерить активность T3SS.
  2. Через 48 ч, после того как сформируются видимые колонии, ввести 4 мл среды М9, содержащей 0,2% глюкозы, 1 мг/л FeSO 4,7Н2 О и дополненной казаминокислотами (здесь именуемыми средами М9) из одной изолированной колонии и культурой в течение ночи при 26 °С с аэрацией при 250 об/мин в течение примерно 18 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стеклянную посуду, промытую кислотой, начиная со следующего шага и далее.
  3. Субкультура в хелатные медиа M9, следуя следующим шагам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех последующих этапов используется среда М9 с 0,9% глюкозы, а не стандартными 0,2% глюкозы.
    1. С помощью спектрофотометра измерьте оптическую плотность (OD600) ночной культуры.
    2. Разведите ночную культуру до значения OD600 0,1 в общей сложности 14 мл стерильной хелатной среды M9, содержащей 0,9% глюкозы и не содержащую FeSO4,7H 2O, в колбе объемом 250 мл с кислотной промывкой без добавления железа.
    3. Выдерживать в течение 8 ч при 26 °C с аэрацией при 250 об/мин.
  4. Субкультура на аэробную и анаэробную культуры параллельно.
    1. Измерьте наружный диаметр600 растущих культур.
    2. Для продолжения аэробной инкубации субкультуру выращивают до значения OD600 0,1 в 14 мл стерильной хелатной среды M9, содержащей 0,9% глюкозы и не содержащей FeSO4,7H 2O, в промытой кислотой колбе объемом 250 мл и культурой с аэрацией при 26 °C в течение 12 ч без добавления железа.
    3. Для анаэробного культивирования субкультуру со значением наружного диаметра600 0,1 в 14 мл стерильной хелатированной среды M9 поместить в две стеклянные пробирки, промытые кислотой. В первую пробирку добавьте стерилизованный фильтром (с использованием 0,22 мкм полиэфирсульфоновой мембраны) FeSO 4,7H2O до конечной концентрации 1 мг/л (называемый «высоким содержанием железа»). Во вторую пробирку добавьте FeSO4,7H 2O до конечной концентрации 0,01 мг/л (так называемая «низкое содержание железа»). Это можно сделать с помощью стокового раствора FeSO4.7H 2O в дозе 10 мг/мл. Обе пробирки анаэробно инкубировать в анаэробной камере при комнатной температуре в течение 12 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1 мг/л FeSO 4,7H 2O обеспечивает богатые железом условия для устойчивого роста Yersinia. И наоборот, добавление всего 0,01 мг/л FeSO 4,7H 2O к анаэробным культурам обеспечивает достаточный рост в анаэробных условиях, но все же способствует реакции на железоистое голодание, в то время как аэробные культуры выращивают в течение 12 ч в отсутствие добавления железа для стимуляции реакции железного голодания до стимуляции активности T3SS.
  5. Индуцирует активность системы секреции III типа.
    1. Переместите анаэробные культуры до 37 °C и продолжайте анаэробную инкубацию в течение 4 ч, чтобы индуцировать T3SS.
    2. Измерьте внешний диаметр600 аэробно растущей культуры.
    3. В двух промытых кислотой колбах субкультивируют аэробно растущие культуры до значения наружного диаметра600 0,2 на 14 мл стерильных хелатных сред М9. В первую колбу добавить стерилизованный фильтром FeSO4,7H 2O до конечной концентрации 1 мг/л. Во вторую колбу добавить FeSO4,7H 2O до конечной концентрации 0,01 мг/л. Инкубировать обе колбы с аэрацией при 26 °C при 250 об/мин в течение 2 ч.
    4. Через 2 ч перенесите аэробные культуры до 37 °C с аэрацией при 250 об/мин и инкубируйте в течение 4 ч, чтобы вызвать T3SS.

3. Осаждение трихлоруксусной кислотой (ТСА) эффекторных белков T3SS

  1. После завершения анаэробной инкубации измерьте внешний диаметр600 культур.
  2. Нормализуйте все анаэробные образцы для достижения одинаковой массы клеток (см. пример, приведенный в таблице 1). Для анаэробного культивирования обычно ожидайте значение наружного диаметра600 ~0,5 для культур с недостаточным содержанием железа и ~1 для культур, богатых железом. В этом случае используйте 6 мл культур с железным голоданием и 3 мл культур, богатых железом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшаяся культура может быть использована для других целей, таких как сбор общей РНК и использование количественной ПЦР для измерения стационарных уровней мишени мРНК (не описано здесь).
  3. Переложите нормализованные объемы каждой культуры в пробирки объемом 15 мл.
  4. Для контроля эффективности осаждения секретируемого белка добавьте 4 мкл 0,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) в каждую пробирку.
  5. Гранулированные культуры при 3200 х г в течение 15 мин при 4 °C.
  6. Присоедините фильтр PVDF 0,22 мкм к шприцу объемом 10 мл и отфильтруйте надосадочную жидкость каждой гранулированной культуры в свежую пробирку объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап фильтрации сводит к минимуму вероятность переноса целых бактериальных клеток, что может привести к нежелательным цитоплазматическим белкам в образце.
  7. Добавьте в каждый образец 10% от объема надосадочной жидкости 6,1 Н ТСА.
  8. Энергично вихрь в течение 1 мин. Инкубируйте пробирки на льду в холодном помещении при температуре 4 °C на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность инкубации может быть оптимизирована в зависимости от необходимости. Всего 1 час инкубации может работать для состояний или штаммов, где секреция стабильна.
  9. Повторите этапы сбора гранул и осаждения ТСА с аэробными культурами после завершения 4-часовой инкубации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализуйте аэробные культуры путем гранулирования объемов с эквивалентной клеточной массой.
  10. Добавьте по 2 мл каждого образца в свежую пробирку объемом 2 мл и центрифугируйте при температуре 21 000 x g в течение 15 минут при 4 °C.
  11. Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью вакуумной насадки, и будьте осторожны, чтобы не касаться дна или боковых сторон трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулу может быть трудно визуализировать, и она может выглядеть в виде дымки по всей длине трубки.
  12. Повторяйте шаги 3.10 и 3.11 до тех пор, пока все содержимое каждой реакции осаждения не осаждается в одну пробирку объемом 2 мл. Это может занять три или четыре последовательных этапа центрифугирования, но позволяет концентрировать все секретируемые белки из каждого образца в пробирке объемом 2 мл.
  13. Чтобы промыть гранулы, аккуратно добавьте 1 мл ледяного 100% ацетона в каждую трубку. Во избежание потери пробы не суспендируйте повторно и не прикасайтесь к стенкам пробирки.
  14. Центрифугируйте образцы при концентрации 21 000 x g в течение 15 минут при 4 °C.
  15. Отсадите надосадочную жидкость и будьте осторожны, чтобы не касаться дна или боковых сторон трубки.
  16. Повторите шаги промывания ледяным ацетоном 3.13 и 3.14.
  17. После окончательной аспирации надосадочной жидкости откройте трубки и дайте грануле полностью высохнуть на стенде в течение примерно 1 часа.
  18. Добавьте 50 μL раствора FSB:DTT в каждый высушенный образец. Чтобы избежать потери белка, не применяйте повторную супсию.
  19. Тщательно оберните каждый образец в течение 1 минуты, убедившись, что раствор FSB:DTT покрывает стенки всей пробирки. Это можно оптимизировать, используя вихревую насадку, способную удерживать несколько трубок одновременно.
  20. Кипятите образцы при температуре 95 °C в течение 15 минут.
  21. Кратковременно центрифугируйте образцы в течение 30 с на максимальной скорости при комнатной температуре.
  22. Хранить при температуре -80 °C до дальнейшего использования.

4. SDS-PAGE и окрашивание серебром для визуализации эффекторных белков T3SS

  1. Загрузите 15 мкл каждого анаэробного образца и 10 мкл каждого аэробного образца в 12,5% гель SDS-PAGE вместе с 3 мкл коммерчески доступного неокрашенного стандарта в качестве лестницы.
  2. Запустите гель около 90 минут при 100 В. Эти настройки могут варьироваться в зависимости от используемого аппарата.
  3. Следуйте протоколу окрашивания серебра в соответствии с инструкциями производителя, в результате чего получится гель, как показано на рисунке 2.

5. Количественная оценка относительной активности T3SS

  1. Поместите гель в систему визуализации, убедившись, что все полосы, предназначенные для количественной оценки, находятся в кадре изображения.
    Примечание: Молекулярная масса BSA составляет ~66 кДа, в то время как молекулярная масса эффекторного белка T3SS YopE составляет ~23 кДа.
  2. В программном обеспечении выберите все полосы YopE по всем скважинам.
  3. Установите референсный диапазон YopE на соответствующий образец.
  4. Экспортируйте относительные количественные значения, рассчитанные программным обеспечением для всех диапазонов YopE.
  5. Вернувшись в программу, выберите все полосы BSA для всех скважин.
  6. Установите референсный канал BSA так, чтобы он был из того же образца, что и эталонный канал YopE.
  7. Экспортируйте относительные количественные значения, рассчитанные программным обеспечением для всех диапазонов BSA.
  8. Чтобы вычислить относительные уровни экспрессии YopE, разделите значение относительной величины YopE на значение относительной величины BSA для каждого образца.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод позволяет проводить относительное сравнение секретируемых Йоп в различных условиях относительно референсного условия, представляющего интерес. Общий рабочий процесс эксперимента представлен на рисунке 1. В таблице 1 показано, как нормализация клеточной культуры обычно происходит в случае каждого условия культивирования и объем ТСА, который будет добавлен к каждой надосадочной жидкости. Здесь представлены репрезентативные результаты с использованием дикого типа (WT) Y. pseudotuberculosis IP2666pIB1, а также двух конгенных мутантов, ΔyscNU и ΔyopE. Мутант ΔyopE используется в качестве контроля, лишенного YopE, в то время как мутант ΔyscNU используется в качестве полного отрицательного контроля T3SS, поскольку он не может собрать функциональный T3SS13,14. Репрезентативное изображение окрашенного серебром 12,5% геля SDS-PAGE, содержащего секретируемые белки, изображено на рисунке 2. Как описано выше, каждый образец содержал спайковый BSA в качестве контроля эффективности осаждения белка. При анализе данных анаэробные и аэробные наборы данных следует рассматривать как независимые наборы данных, поскольку каждый из них был нормализован отдельно. В анаэробных образцах в образцах с низким содержанием железа присутствовало в ~38 раз больше YopE по сравнению с образцами с высоким содержанием железа, что согласуется с предыдущими результатами15,16. В аэробных образцах аналогичное количество секретируемого YopE наблюдалось в образцах с низким и высоким содержанием железа, что согласуется с предыдущими результатами16. Как правило, для установления статистической значимости используются, по крайней мере, три биологические реплики каждого состояния.

Чтобы подтвердить, что этот протокол приводит к адекватному железосодержащему голоданию, был проведен анализ qPCR железочувствительных генов yfeA и bfd в штамме дикого типа во всех условиях. YfeA является периплазматическим связывающим белком транспортной системы ABC, ответственным за транспорт железа, в то время как Bfd представляет собой бактериоферритин-ассоциированный ферредоксин, участвующий в мобилизации запасов железа 17,18,19,20. РНК выделяли, как описано ранее21, и, как и ожидалось, yfeA и bfd значительно повышали регуляцию в условиях обеднения железом по сравнению с условиями с высоким содержанием железа, как аэробно, так и анаэробно, как показано на рисунке 3. Кроме того, мы количественно оценили уровни равновесной мРНК yopE с помощью количественной ПЦР, чтобы подтвердить, что наблюдаемые результаты относительного YopE на уровне белка согласуются с уровнями транскрипта yopE (см. рис. 3).

Наконец, поскольку бактерии склонны к лизингу в стрессовых условиях культивирования, было важно показать, что шаги в этом протоколе не приводят к бактериальному лизису, который потенциально может исказить результаты. Чтобы подтвердить это, образцы надосадочной жидкости, осащенные TCA, были подвергнуты вестерн-блоттингу и исследованы на наличие YopE и RpoA, субъединицы РНК-полимеразы и цитоплазматического белка. Как показано на рисунке 4, в то время как паттерн экспрессии YopE соответствует показанному на рисунке 3, не было обнаружено никаких доказательств присутствия RpoA в супернатантах образца, что позволяет предположить, что не было наблюдаемого лизиса, который мог бы высвободить цитоплазматический RpoA в надосадочную жидкость.

figure-results-1
Рисунок 1: Экспериментальный процесс выращивания Yersinia pseudotuberculosis при различной доступности железа и кислорода. Графическое представление этапов культивирования. Обратите внимание, что стеклянную посуду, промытую кислотой, необходимо использовать начиная с 4-го дня. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Результаты окрашивания серебром 12,5% геля SDS-PAGE осаждалого белка TCA из супернатантов культур. Осажденные супернатанты культур загружали на 12,5% гель SDS-PAGE и окрашивали серебром. (А) Профиль секреции штаммов WT, ΔyscNU и ΔyopE , выращенных анаэробным путем. Репрезентативные относительные значения YopE нормализованы по отношению к анаэробному образцу WT, изобилующему железом. (B) Профиль секреции штаммов WT, ΔyscNU и ΔyopE , выращенных аэробным путем. Репрезентативные относительные значения YopE нормализованы по отношению к аэробному образцу WT, изобилующему железом. Белыми стрелками обозначен YopE (~23 кДа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Относительные уровни мРНК железочувствительных генов демонстрируют железное голодание. РНК выделяли из WT Y. pseudotuberculosis, культивируемого в условиях, описанных на рисунке 1. С помощью количественной ПЦР измеряли относительную экспрессию уровней yfeA, bfd и yopE, нормализованных до 16S рРНК в анаэробных (A-C) и аэробных (D-F) условиях. ****p < 0,0001 по данным непарного t-теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Недостаток цитоплазматического RpoA в образцах надосадочной жидкости свидетельствует об отсутствии лизиса клеток в условиях культивирования. 5 мкл осажденных надосадочных линий (А) анаэробных и (В) аэробных образцов из рисунка 3 наносили на 12,5% гель SDS-PAGE вместе с контролем гранул. Белки переносили на мембрану PVDF для вестерн-блоттинга. Мембрану разрезали, и верхняя половина зондировала RpoA с помощью антитела против RpoA, а нижняя половина зондировала YopE с помощью антитела против YopE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

(А)
АНАЭРОБНЫЙ
СостояниеОДОбъем сбора (мл)Объем 6,1 Н ТСА с добавлением Sup (мл)
WT с низким содержанием железа0.560.6
WT с высоким содержанием утюга130.3
(В)
АЭРОБНЫЙ
СостояниеОДОбъем сбора (мл)Объем 6,1 Н ТСА с добавлением Sup (мл)
WT с низким содержанием железа0.960.6
WT с высоким содержанием утюга1.43.8570.386

Таблица 1: Репрезентативный рабочий процесс сбора проб. На 5-й день (А) после завершения 4-часовой инкубации при 37 °С для анаэробных образцов было собрано 6 мл образца с наименьшим значением наружного диаметра600 и остальные объемы образцов были соответственно нормализованы. После фильтрации надосадочной жидкости добавляли 6,1 Н ТСА. (В) После завершения аэробной инкубации (2 ч при 26°С и 4 ч при 37°С) отбирали 6 мл пробы с наименьшим значением OD600 , а остальные объемы пробы нормализовали соответственно. После фильтрации надосадочной жидкости добавляли 6,1 Н ТСА.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T3SS является важным фактором вирулентности у многих патогенных бактерий; Таким образом, разработка лабораторных методов для изучения его регуляции важна для понимания патогенеза и разработки потенциальных терапевтических средств1. Железо и кислород, как известно, являются важными сигналами хозяина, воспринимаемыми бактериальными патогенами для регуляции экспрессии T3SS5; Таким образом, данный метод представляет стратегию культивирования Y. pseudotuberculosis в анаэробных или аэробных условиях, с голоданием или восполнением запасов железа, и демонстрирует, как количественно оценить относительную активность T3SS в этих различных условиях путем оценки относительных количеств секретируемых уровней эффекторного белка YopE T3SS.

Несмотря на то, что рабочий процесс для этого эксперимента относительно прост, есть несколько моментов, которые необходимо тщательно рассмотреть для оптимизации результатов. На этапе осаждения белка, опосредованного ТСА, важно избегать аспирации белковой гранулы, которую может быть трудно увидеть. Крайне важно принять дополнительные меры предосторожности, чтобы кончик аспиратора не касался стенок или дна трубки. Кроме того, при работе с мутантными штаммами с более низким уровнем активности T3SS целесообразно собирать более крупную выборку для обработки. Наконец, если полосы выглядят размазанными после обработки образца и окрашивания гелем вместо того, чтобы получить отчетливые полосы, это может быть связано либо с лизисом клеток во время культивирования, либо с переносом целых бактерий из гранулы во фракцию надосадочной жидкости. В этом случае эксперимент следует повторить, и следует проявлять большую осторожность, чтобы избежать попадания гранулы при удалении надосадочной жидкости. Важно отметить, что этот протокол может быть недостаточно чувствительным для обнаружения белков, секретируемых в очень малых количествах, и в этом случае может потребоваться использование других методов обнаружения. Кроме того, поскольку многие хелатирующие агенты удаляют из среды иные двухвалентные катионы, кроме железа и магния, другие двухвалентные катионы могут быть добавлены обратно в среду после хелатирования, чтобы определить их влияние на секрецию.

Еще одним важным моментом, который следует учитывать в этих экспериментах, является склонность солей в среде M9 к выпадению в осадок, что приводит к изменчивости между экспериментальными партиями. Чтобы решить эту проблему, можно добавить стерилизованный фильтром MgSO4 в фильтрующий материал непосредственно перед культивированием.

В целом, эти методы обеспечивают надежную основу для количественной оценки относительной активности Yersinia T3SS путем измерения уровней белка. Наряду с параллельными подходами, направленными на оценку экспрессии T3SS, представленные здесь методы позволяют всесторонне понять динамику T3SS в ответ на сигналы окружающей среды, относящиеся к хозяину. Этот протокол также может быть адаптирован к другим бактериям, которые могут быть выращены в определенной среде, где источник железа может быть опущен, и для применений, где измерение секретируемых белков имеет отношение к научному вопросу.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Графические изображения, созданные с использованием BioRender.com. Это исследование было поддержано грантом Национальных институтов здравоохранения (www.NIH.gov) R01AI119082.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 мл шприц с наконечником Luer-LokBD301029
10x SDS Running Buffer Домашняя0,25 М Трис основа, 1,92 М Глицин, 1% SDS в объеме 1 л
12,5% SDS-Page ГельДомашняя культура
15 мл Пробирки для культурыFalcon352059Для начальной ночи 
15 мл пробирок FalconFalcom352196Для сбора надосадочной жидкости
250 мл колбыдля культур Belco251000250
500 мл Фильтрующая системаCorning431097
6 Н раствор соляной кислотыFisher Scientific7732185
АцетонFisher ChemicalA949-44 л
Bio Rad ChemiDoc MP Imaging СистемаBio RadНомер модели: Универсальная вытяжка III
Пробирки для культивирования боросиликатного стеклаFisherbrand14-961-34Для анаэробного культивирования
Chelex 100 СмолаBio Rad142-1253
Chelex M9 +0,9% Глюкоза средадомашнего производства6 г/л Na2HPO4, 3 г/л KH2PO4, 0,5 г/л NaCl, 1 г/л NH4Cl, 1% казаминокислот, <сильная>0,9% декстроза, 0,0005% тиамин, 5 г/л смолы Chelex 100. Перемешайте среду в течение 18 часов при комнатной температуре, отфильтруйте с помощью фильтрующего устройства Corning объемом 500 мл, затем добавьте MgSO4 для получения 1 мМ MgSO4 final solution
Final Sample Buffer (FSB)Домашнее производство0,1 M Tris-HCl, 4% SDS, 20% глицерина, 0,2% бромофенола Blue
FSB: Решение DTTДомашнееFSB+0,2M
DTT Image Lab программное обеспечениеBio Radhttps://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8Zпрограммное обеспечение
Isotemp Heat BlockFisher Scientific88860021
LB Agar PlatesHome made10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 15 г агара в общем объеме 1 л. Автоклавный
M9+0,2% глюкозный медиатордомашний производства6 г/л Na2HPO4, 3 г/л KH2PO4, 0,5 г/л NaCl, 1 г/л NH4Cl, 1 мМ MgSO4, 1 мг/л FeSO47H2O, 1% казаминокислоты, <сильная>0,2% декстроза, 0,0005% тиамина 
Millex-GP PES 0,22 мкм фильтр для шприцаMilliporeSLGPR33RSДля фильтрации FeSO47H2O
Millex-GV PVDF 0,22 мкм фильтр для шприцаMilliporeSLGVR33RSДля надосадочной жидкости
Precision Plus Protein Unstained StandardBio Rad1610363
SDS-PAGE Gel ApparatusBio RadНомер модели: Mini PROTEAN Tetra Cell
SilverXpress Набор для окрашивания серебра InvitrogenLC6100
The BellyDancer ShakerIBI ScientificBDRAA1155
раствор трихлоруксусной кислоты 6.1NSigma AldrichT0699
Виниловая анаэробная камераCoy Lab Продуктыhttps://coylab.com/products/anaerobic-chambers/vinyl-anaerobic-chambers/#details
qPCR Праймерные последовательности 
yfeA forward - CAC AGT CAG CAG ACC TTA TCT T
yfeA reverse - GGC AGA CGG GAC ATT aat a
bfd forward - ccagcatcagccccatacag
bfd reverse - tggcttgtcggatgcacttc
yopE forward - CCATAAACCGGTGGTGAC
yopE reverse - CTTGGCATTGAGTGATACTG

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deng, W., et al. Assembly, structure, function regulation of type III secretion systems. Nat Rev Microbiol. 15 (6), 323-337 (2017).
  2. Springer International Publishing. Bacterial Type III Protein Secretion Systems. 427, Springer International Publishing. Cham. (2020).
  3. Schubert, K. A., Xu, Y., Shao, F., Auerbuch, V. The Yersinia type III secretion system as a tool for studying cytosolic innate immune surveillance. Annu Rev Microbiol. 74, 221-245 (2020).
  4. Cassat, J. E., Skaar, E. P. Iron in infection and immunity. Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).
  5. Singhal, R., Shah, Y. M. Oxygen battle in the gut: Hypoxia and hypoxia-inducible factors in metabolic and inflammatory responses in the intestine. J Biol Chem. 295 (30), 10493-10505 (2020).
  6. Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).
  7. Rakin, A., Schneider, L., Podladchikova, O. Hunger for iron: the alternative siderophore iron scavenging systems in highly virulent Yersinia. Front Cell Infect Microbiol. 2, (2012).
  8. Lesic, B., Carniel, E. Horizontal Transfer of the high-pathogenicity island of Yersinia pseudotuberculosis. J Bacteriol. 187 (10), 3352-3358 (2005).
  9. Green, E. R., et al. Fis is essential for Yersinia pseudotuberculosis virulence and protects against reactive oxygen species produced by phagocytic cells during infection. PLOS Pathog. 12 (9), e1005898(2016).
  10. Cornelis, G. R. The Yersinia Ysc-Yop "Type III" weaponry. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 742-753 (2002).
  11. Cheng, L. W., Anderson, D. M., Schneewind, O. Two independent type III secretion mechanisms for YopE in Yersinia enterocolitica. Mol Microbiol. 24 (4), 757-765 (1997).
  12. Straley, S. C. The low-Ca2+ response virulence regulon of human-pathogenic yersiniae. Microbial Pathog. 10 (2), 87-91 (1991).
  13. Balada-Llasat, J. -M., Mecsas, J. Yersinia has a tropism for B and T cell zones of lymph nodes that is independent of the type III secretion system. PLoS Pathog. 2 (9), e86(2006).
  14. Adams, W., Morgan, J., Kwuan, L., Auerbuch, V. Yersinia pseudotuberculosis YopD mutants that genetically separate effector protein translocation from host membrane disruption: YopD central region promotes Yop translocation. Mol Microbiol. 96 (4), 764-778 (2015).
  15. Hooker-Romero, D., et al. Iron availability and oxygen tension regulate the Yersinia Ysc type III secretion system to enable disseminated infection. PLOS Pathog. 15 (12), e1008001(2019).
  16. Balderas, D., et al. Genome scale analysis reveals IscR directly and indirectly regulates virulence factor genes in pathogenic Yersinia. mBio. 12 (3), e00633-00721 (2021).
  17. Bearden, S. W., Perry, R. D. The Yfe system of Yersinia pestis transports iron and manganese and is required for full virulence of plague. Mol Microbiol. 32 (2), 403-414 (1999).
  18. Zhou, D., et al. Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis: Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis. FEMS Microbiol Lett. 258 (1), 9-17 (2006).
  19. Wijerathne, H., et al. a new class of [2Fe-2S] protein that functions in bacterial iron homeostasis, requires a structural anion binding site. Biochemistry. 57 (38), 5533-5543 (2018).
  20. Bearden, S. W., Staggs, T. M., Perry, R. D. An ABC transporter system of Yersinia pestis allows utilization of chelated iron by Escherichia coli SAB11. J Bacteriol. 180 (5), 1135-1147 (1998).
  21. Miller, H. K., et al. IscR is essential for Yersinia pseudotuberculosis type III secretion and virulence. PLoS Pathog. 10 (6), e1004194(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Type III SecretionYersinia PseudotuberculosisIron StarvationAnaerobic GrowthEffector Protein SecretionSDS PAGE AnalysisSilver StainingOxygen AvailabilityProtein PrecipitationBacterial Virulence

Related Articles