Выявление ферроптотического фенотипа медуллобластомы

Ферроптоз является новым контекстуализированным, зависимым от активных форм кислорода (АФК) типом клеточной смерти¹. Помимо АФК, железо играет решающую роль в этом типе клеточной смерти, отсюда и название². Заключительным и исполнительным этапом ферроптоза является катализируемое железом накопление окислительного повреждения липидов в плазматической мембране, что в конечном итоге приводит к нарушению целостности мембраны и селективной проницаемости и, наконец, к гибели клеток в результате барботирования. Событие гидроперекисного окисления липидов является естественным явлением; Однако его распространению по всей клеточной мембране препятствует антиоксидантная защита клетки. Основным игроком в этом контексте является Se-протеин глутатионпероксидаза 4 (GPx4), которая может приближаться к мембране и превращать гидропероксиды липидов в их менее токсичные производные алкоголя³. Восстановительная способность GPx4 в основном, но не исключительно, обеспечивается глутатионом (GSH), трипептидом, состоящим из заменимых аминокислот: глицина, глутамата и цистеина. Ограничивающей скорость аминокислотой для биосинтеза GSH является цистеин⁴. Хотя цистеин классифицируется как заменимая аминокислота, его потребности могут легко превышать его внутреннее производство в клетках с высокой степенью пролиферации (например, раковых клетках). Таким образом, он был реклассифицирован в группу полузаменимых аминокислот. Необходимый импорт цистеина происходит в основном через Xc-систему, которая позволяет импортировать окисленную (доминирующую) форму цистеина (он же цистин) за^{счет экспорта} глутамата5. Xc-система состоит из Na+-независимой, Cl-зависимой транспортной субъединицы, известной как xCT, и шаперонной субъединицы, известной как CD98. До недавнего времени антиферроптозные свойства оси xCT-GSH-GPx4 считались уникальными и невоспроизводимыми⁶. Однако в 2019 году^{был описан} альтернативный антиферроптозный путь, состоящий из убихинола (Coenzyme Q10) и его регенеративного фермента – белка-супрессора ферроптоза 1 (FSP1), ^7,8. Вскоре после этого сообщалось о еще одной системе детоксикации гидропероксида липидов, включающей циклогидролазу ГТФ-1/тетрагидробиоптерин (GCH1/BH4)⁹. Тем не менее, центральная роль оси xCT-GSH-GPx4 в профилактике ферроптоза, по-видимому, не оспаривается.

За последнее десятилетие ферроптоз широко изучался при различных типах опухолей, демонстрируя большой потенциал в качестве противораковой стратегии (обзор Lei et ^al.10). Кроме того, сообщалось, что раковые клетки, проявляющие высокую устойчивость к обычным химиотерапевтическим средствам и/или склонность к метастазированию, удивительно чувствительны к индукторам ферроптоза, таким как ингибиторы GPx4 11,12,13. Однако в контексте опухолей головного мозга потенциал ферроптозных индукторов остается в значительной степени малоизученным. В то время как этот тип клеточной гибели тесно связан с церебральной ишемией-реперфузионной травмой¹⁴и нейродегенеративными заболеваниями¹⁵, его потенциал в контексте опухолей головного мозга в основном ограничен глиобластомой, наиболее распространенной злокачественной черепно-мозговой опухолью (обзор Zhuo et ^al.16). С другой стороны, чувствительность медуллобластомы, наиболее распространенной злокачественной опухоли головного мозга у детей и ведущей причины детской смертности, к индукторам ферроптоза остается в значительной степени неизученной. Насколько нам известно, существует мало рецензируемой литературы, связывающей ферроптоз и медуллобластому. Тем не менее, некоторые исследования показали, что железо играет решающую роль в выживании, пролиферации и онкогенном потенциале стволовых клеток (ОСК) медуллобластомы и глиобластомы17,18, потенциально делая их более уязвимыми к индукции ферроптоза. Это особенно важно, поскольку медуллобластома печально известна своей субпопуляцией ОСК, или клеток, инициирующих/размножающихся опухолью, которые, по-видимому, в значительной степени ответственны за химиорезистентность, диссемицию и рецидив опухоли¹⁹.

Чувствительность к индукции ферроптоза обычно исследуется путем измерения содержания/накопления гидропероксида липидов, что может привести или не привести к гибели клеток. Наиболее часто используемыми индукторами ферроптоза являются (1) эрастин, ингибитор транспортера xCT²⁰, (2) RSL3, ингибитор фермента GPx4² и/или (3) доноры железа, такие как цитрат ферроаммония (FAC)²¹. Содержание гидропероксида липидов оценивают с помощью селективного зонда BODIPY 581/591 C11²², который в восстановленном состоянии имеет максимумы возбуждения и излучения на длине волны 581/591 нм. При взаимодействии с гидропероксидами липидов и их окислении зонд смещает максимумы возбуждения и излучения до 488/510 нм. Как правило, значительное увеличение содержания гидропероксида липидов предшествует гибели ферроптозных клеток. Поскольку ферроптоз не является запрограммированной клеточной смертью, не существует молекулярного сигнального каскада, ведущего к его осуществлению. Поэтому единственным способом подтвердить это является контроль содержания гидропероксида липидов и использование специфических ингибиторов для этого типа клеточной гибели, таких как ферростатин 1²³. Ферростатин 1 является липофильным антиоксидантом, который может проникать в липидный компартмент клетки и выводить токсины гидропероксидов липидов, тем самым предотвращая ферроптозные события.

Настоящее исследование проводилось с использованием клеточных линий медуллобластомы дикого типа (WT) DAOY, которые культивировали при 37 °C с 5%_CO2 в среде DMEM с добавлением 8% FBS. Удаленную xCT клеточную линию поддерживали в тех же условиях, проводя эксперименты в средах с добавлением 1 мМ N-ацетилцистеина (NAC). Клетки регулярно проверяли на микоплазму с помощью коммерчески доступного набора для обнаружения микоплазм (см. Таблицу материалов) и культивировали до^10-го пассажа.

1. Уборка и посев клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы выполняются с использованием стерильных асептических техник в тканевом культуре ламинарного вытяжного колпака. Клетки медуллобластомы DAOY являются адгезивными, что означает, что все неприкрепленные клетки могут быть отброшены путем промывания фосфатно-соевым буфером (PBS) без Ca²⁺ и Mg²⁺.

1. Возьмите бульонную чашку (чашку Петри, диаметр 100 мм) с ячейками и удалите плавающие ячейки и среду из тарелки с помощью аспиратора.
2. Добавьте в блюдо 5-10 мл PBS, вымойте дно круговыми движениями блюда, а затем снимите PBS с тарелки с помощью аспиратора.
3. Добавьте в блюдо 1 мл трипсина (10x разведения). Инкубируйте пластину до тех пор, пока легкое постукивание по пластине не выбьет клетки. Возьмите 10 мл питательной среды DMEM с добавлением 8% FBS и механически соберите клетки с чашки.
4. Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл.
5. Возьмите 500 мкл клеточной суспензии и поместите ее в кювету для подсчета. Подсчитайте количество клеток на мл клеточной суспензии. Для этого исследования использовался автоматический счетчик клеток (см. Таблицу материалов).
6. Вычислите объем, который необходимо взять из клеточной суспензии, чтобы получилось 1 000 000 клеток.
7. Возьмите 6-луночный планшет и добавьте рассчитанный объем клеточной суспензии в каждую лунку, затем добавьте в каждую лунку питательную среду DMEM, обогащенную 8% FBS, на 2 мл.

2. Лечение клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль и лечение проводятся в трех экземплярах. Группы следующие: Контроль (ДМСО), 1 мкМ эрастина, 0,3 мкМ РСЛ3, 250 мкМ ФАК, 2 мкМ Ферростатина 1, 1 мкМ эрастина + 2 мкМ Ферростатина 1, 0,3 мкМ РСЛ3 + 2 мкМ Ферростатина 1, 250 мкМ ФАК + 2 мкМ Ферростатина 1. Для эксперимента необходимы четыре 6-луночных планшета, как указано в таблице 1). Коммерческие данные всех необходимых реагентов приведены в Таблице материалов.

1. Через 24 ч после посева добавьте соответствующую обработку в лунку с ячейками.
2. Оставьте в инкубаторе посуду при температуре 37 °C и 5%_CO2 .

3. Окрашивание обработанных клеток гидропероксидами липидов зондом BODIPY 581/591 C11

Примечание: Исходный раствор зонда, специфичного для гидропероксида липидов, готовят в ДМСО в концентрации 1 мМ. Аликвоты исходного раствора хранят при температуре -20 °С в непрозрачных пробирках. Для окрашивания приготовьте 2 мкМ рабочий раствор зонда в среде DMEM с добавлением 8% FBS.

1. Через 6 ч после обработки понаблюдайте за клетками под световым микроскопом (должны быть видны округления клеток).
2. Достаньте посуду из инкубатора и поместите ее в тканевую культуру ламинарного вытяжного колпака.
   С помощью аспиратора удалите среду и плавающие (мертвые) клетки.
3. Аккуратно добавьте 2 мл PBS в каждую лунку, промойте дно круговыми движениями 6-луночных планшетов, а затем удалите PBS из лунок с помощью аспиратора.
4. Добавьте 2 мл рабочего раствора зонда (2 мкМ конечная концентрация в DMEM с добавлением FBS).
5. Оставьте чашку в инкубаторе при температуре 37 °C и 5%_CO2 на 30 минут в темноте (пластины можно обернуть алюминиевой фольгой).

4. Анализ проточной цитометрии на содержание гидропероксида липидов в обрабатываемых клетках

ПРИМЕЧАНИЕ: Все следующие шаги выполняются в темное время суток (в колпаке ламинарного потока нет огней).

1. Достаньте посуду из инкубатора и поместите ее в колпак для культуры тканей с ламинарным потоком.
   С помощью аспиратора удалите раствор для окрашивания.
2. Аккуратно добавьте 2 мл PBS в каждую лунку, промойте дно круговыми движениями 6-луночных планшетов, а затем удалите PBS из лунок с помощью аспиратора.
3. Повторите этап промывки еще раз и отасуньте остатки PBS из лунки с помощью аспиратора.
4. Добавьте 150 мкл коммерчески доступного реагента для диссоциации клеток (см. Таблицу материалов) на дно каждой лунки и инкубируйте планшет до тех пор, пока осторожное постукивание по планшету не выбьет клетки. Возьмите 250 мкл буфера FACS (PBS, 2 мМ ЭДТА, 0,5% БСА) и механически соберите ячейки из лунок.
5. Перенесите ячейки в соответствующую (ранее маркированную) трубку FACS с крышкой фильтра. Поместите пробирку с клетками на лед в темноте до проведения анализа (анализ следует провести в течение часа после окрашивания).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка и калибровка машины FACS зависят от используемой машины (см. Таблицу материалов).
6. Создайте новый эксперимент и дайте ему название (Ферроптоз в DAOY - гидропероксиды липидов).
7. В плане эксперимента выберите лазер (488 нм) и фильтр (FITC).
8. В окне просмотра данных выберите правильный размер ячейки (>12 мкм), установите напряжения ФЭУ (популяция ячеек должна отображаться в первом квадранте точечной диаграммы SSC-H/FSC-H) и установите точечную диаграмму.
9. Добавим новый график - гистограмму, с FITC-A по оси y и логарифмической шкалой.
10. Поместите образцы в пробирку FACS, поместите их в машину FACS и загрузите образец. Запишите 10 000 синглетных событий FSC и присвойте файлу имя (например, DAOY WT CTL 6h). Экспортируйте файл в формате .fcs.

5. Окрашивание мертвых клеток йодидом пропидия (ПИ) после обработки

ПРИМЕЧАНИЕ: Схема эксперимента точно такая же, как и при измерении гидропероксида липидов (см. шаг 1 и шаг 2).

1. Через 24 ч после посева выньте посуду из инкубатора и поместите ее в колпак с ламинарным потоком.
2. Соберите среду (с мертвыми клетками) в пробирку объемом 15 мл.
3. Добавьте 1 мл PBS в каждую лунку, промойте дно круговыми движениями 6-луночных планшетов, а затем соберите PBS в пробирку с соответствующей средой.
4. Добавьте 200 мкл трипсина (10-кратное разведение) на дно каждой лунки и инкубируйте планшет до тех пор, пока легкое постукивание по планшету не выбьет клетки. Используйте соответствующую среду + PBS для забора ячеек из лунок.
5. Центрифугируйте клеточную суспензию при 180 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость с помощью аспиратора.
6. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 300 мкл буфера FACS и поместите ее на лед до анализа.
7. Непосредственно перед анализом добавьте раствор PI (см. Таблицу материалов) до конечной концентрации 2 мкг/мл.

6. Анализ мертвых клеток с помощью проточной цитометрии через 24 часа после лечения

ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка и калибровка машины FACS выполняются в соответствии с указаниями ранее (см. шаг 4).

1. Создайте новый эксперимент и дайте ему название (Ферроптоз в DAOY - клеточная смерть).
2. В плане эксперимента выберите лазер (488 нм) и фильтр (PE).
3. В окне просмотра данных выберите правильный размер ячейки (>12 мкм), установите напряжения ФЭУ (популяция клеток должна отображаться в первом квадранте точечной диаграммы SSC-H/FSC-H) и установите точечную диаграмму.
4. Добавим новый график - гистограмму, с PE-A по оси y и логарифмической шкалой.
5. Поместите образцы в пробирку FACS, поместите их в машину FACS и загрузите образец.
6. Запишите 10 000 синглетных событий FSC и присвойте файлу имя (например, DAOY WT CTL 6h). Экспортируйте файл в формате .fcs.

7. Анализ проточной цитометрии содержания гидропероксида липидов в клетках DAOY xCT-/-

Примечание: Клетки xCT-^/- были сгенерированы, как описано ранее²⁴.

1. Для этого эксперимента засейте клетки, как показано на шаге 2, но вместо обработки добавьте в среду 1 мМ NAC на ночь.
2. На следующий день поддерживайте NAC в одной группе и удаляйте его из другой.
3. Проведите анализ содержания гидропероксида липидов с помощью проточной цитометрии точно так же, как описано в шаге 6.

8. Анализ результатов проточного цитометра

1. Откройте документ .fcs в программном обеспечении FlowJo (см. Таблицу материалов).
2. Дважды щелкните по отдельному файлу , чтобы открыть все события (не только синглеты FCS), записанные в отдельном образце (точечный график SSC-A/FSC-A). Поскольку настройки таковы, что стробирование, выполненное на машине, не сохраняется, необходимо сделать ворота еще раз и назвать популяцию (например, DAOY WT).
3. Дважды щелкните по закрытому населению , чтобы открыть еще одно окно с гистограммой.
4. Измените ось Y на используемый флуоресцентный фильтр (Comp-FITC/PE-A).
5. Измените ось X на модальную (нормализуйте каждый пик до его моды, т.е. до % от максимального количества ячеек, найденных в конкретном бине).
6. Скопируйте гистограмму в редактор макетов. Повторите это для всех образцов, и каждый раз, когда новая гистограмма вставляется в редактор макета, перетаскивайте ее поверх предыдущей, чтобы гистограммы были наложены (смещены наполовину).

Клеточную линию медуллобластомы DAOY культивировали в стандартной среде DMEM с добавлением 8% FBS до достижения примерно 60% конфлюенции. В день эксперимента были собраны клетки, и 1 000 000 клеток на лунку были помещены в 6-луночные планшеты, согласно таблице 1. На следующий день клетки (в трех экземплярах) обрабатывали либо 1 мкМ эрантина, либо 0,3 мкМ RSL3, либо 250 мкМ FAC. Затем планшеты помещали в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2. Через 6 ч клетки наблюдали под микроскопом для обнаружения пузырящихся клеток, как показано стрелками на рисунке 1. Это служило показателем того, что препарат был эффективен в индуцировании ферроптоза до того, как клетки были подготовлены к окрашиванию гидропероксидом липидов и последующему анализу FACS.

Для определения содержания гидропероксида липидов использовали специфический краситель BODIPY 581/591 C11 в конечной концентрации 2 мкМ в течение 30 мин. Поскольку этот краситель чувствителен к окислительно-восстановительному потенциалу, необходимо было удалить любую обработку с клеток и промыть их предварительно подогретым PBS. После получаса окрашивания клетки дважды промывали PBS, отсоединяли с помощью раствора для отслоения клеток и готовили к анализу FACS. Данные, полученные на этом этапе, показали повышенную зеленую флуоресценцию красителя в образцах, обработанных всеми тремя препаратами (рис. 2). Тем не менее, наиболее мощный эффект наблюдался при приеме 0,3 мкМ RSL3 (рис. 2В), в то время как 1 мкМ эрастина (рис. 2А) и 250 мкМ ФАК (рис. 2В) показали несколько меньший эффект после 6 ч лечения.

Для установления того, что обнаруженное накопление гидропероксида липидов приводит к гибели клеток, в частности к ферроптозу, в течение 24 ч применяли те же методы лечения, которые приведены в таблице 1 . Для анализа мертвых клеток с помощью проточной цитометрии были собраны как клетки, так и надосадочная жидкость. Живые и мертвые клетки гранулировали центрифугированием, а затем ресуспендировали в буфере FACS для последующего анализа проточной цитометрии. Данные, представленные на рисунке 3 , показали, что все три метода лечения вызывали массовую гибель клеток, которая была полностью предотвращена за счет использования специфического для ферроптоза ингибитора ферростатина-1. Это явно подтверждает возникновение гибели ферроптозных клеток при ингибировании xCT, ингибировании GPx4 или перегрузке железом в клетках медуллобластомы.

Учитывая, что эти три препарата показали несколько различное влияние на накопление гидропероксида липидов, вероятно, из-за различий в потенции, для исследования полной активности ферроптотических индукторов был использован генетический подход. Ранее полученные клетки DAOY xCT-/- (дополнительный рисунок 1A) культивировали в той же среде, что и их аналоги WT, но с добавлением NAC. Этот положительный отбор позволил клеткам xCT-/- расти в культуре. Однако через 6 ч после удаления NAC из питательной среды клетки начали накапливать гидропероксиды липидов на том же уровне, что и клетки WT, обработанные RSL3 (рис. 4). Подобно фармакологическому ингибированию, удаление NAC из среды вызывало характерное барботирование xCT-/-клеток через 6 ч (дополнительный рисунок 1B).

Рисунок 1: Ферроптотический фенотип клеток медуллобластомы. Репрезентативные микрофотографии клеток DAOY WT, обработанных (или не обработанных) в течение 6 ч 1 мкМ эрастина (ERA), 0,3 мкМ RSL3 или 250 мкМ цитрата ферроаммония (FAC) в присутствии или без 2 мкМ ингибитора ферроптоза Ферростатин-1 (Ферро-1). Белыми стрелками обозначены круглые, «пузырящиеся» клетки, указывающие на ферроптотический фенотип, видимый под световым микроскопом. Увеличение: 20x, вставки: 40x. Масштабные линейки: 50 μм, вставки: 10 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Гидропероксид липидов как ключевой маркер ферроптоза в клетках медуллобластомы. Репрезентативные данные окрашивания гидропероксида липидов методом проточной цитометрии в клетках, обработанных в течение 6 ч (A,B) 1 мкМ эрастина (ERA), (C,D) 0,3 мкМ RSL3 или (E,F) 250 мкМ цитрата ферроаммония (FAC), в присутствии или без 2 мкМ ингибитора ферроптоза Ферростатина-1 (Ferro-1). (А,С,Е) Точечные графики зафиксированных событий; (Б,Д,Ж) Гистограмма представления содержания гидропероксида липидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Индукция гибели ферроптозных клеток фармакологическим подходом. Репрезентативные точечные диаграммы проточной цитометрии клеток, окрашенных йодидом пропидия, через 6 ч обработки 1 мкМ эрастина (ЭРА), 0,3 мкМ RSL3 или 250 мкМ цитрата ферроаммония (ФАК), в присутствии или без 2 мкМ ингибитора ферроптоза Ферростатин-1 (Ферро-1). Стробирование разделяет живые (Q4) и мертвые (Q3) популяции клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Индукция ферроптоза генетическим подходом. Репрезентативные данные окрашивания гидропероксида липидов методом проточной цитометрии в клетках DAOY WT и xCT-/- через 6 ч в присутствии или без 2 мкМ ингибитора ферроптоза Ферростатин-1 (Ферро-1). Слева представлена гистограмма содержания гидропероксида липидов. Справа расположены точечные графики записанных событий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Детали лечения контрольных и экспериментальных клеток.

Дополнительный рисунок 1: Гибель ферроптозных клеток DAOY xCT-/- . (A) Вестерн-блоттинг уровня xCT в DAOY WT и xCT-/- клетках в средах DMEM, дополненных или не дополненных 2 мкМ ферростатина-1. (B) Репрезентативные микрофотографии клеток DAOY xCT-/- в присутствии (слева) и отсутствии (справа) 1 мМ N-ацетилцистеина в течение 6 ч. Белыми стрелками обозначены круглые, «пузырящиеся» клетки, указывающие на ферроптотический фенотип, видимый под световым микроскопом. Увеличение: 40x. Масштабные линейки: 10 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Мы заявляем об отсутствии конфликта интересов в отношении исследования, представленного в настоящем документе.