Содержание гидропероксида липидов является наиболее часто используемым индикатором гибели ферроптозных клеток. В данной статье представлен пошаговый анализ содержания гидропероксида липидов в клетках с помощью проточной цитометрии при индукции ферроптоза.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выявление ферроптотического фенотипа медуллобластомы
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Взаимодействие железа и кислорода является неотъемлемой частью развития жизни на Земле. Тем не менее, эта уникальная химия продолжает очаровывать и озадачивать, приводя к новым биологическим предприятиям. В 2012 году группа из Колумбийского университета признала это взаимодействие центральным событием, ведущим к новому типу регулируемой клеточной смерти, названному «ферроптозом». Основной особенностью ферроптоза является накопление гидропероксидов липидов вследствие (1) дисфункциональной антиоксидантной защиты и/или (2) подавляющего окислительного стресса, который чаще всего совпадает с повышенным содержанием свободного лабильного железа в клетке. Обычно это предотвращается канонической антиферроптозной осью, содержащей транспортер цистина xCT, глутатион (GSH) и пероксидазу GSH 4 (GPx4). Поскольку ферроптоз не является запрограммированным типом клеточной смерти, он не включает в себя сигнальные пути, характерные для апоптоза. Наиболее распространенным способом доказать этот тип клеточной смерти является использование липофильных антиоксидантов (витамин Е, ферростатин-1 и т.д.) для ее предотвращения. Эти молекулы могут приближаться к окислительному повреждению плазматической мембраны и выводить его из токсина. Другим важным аспектом в выявлении ферроптотического фенотипа является обнаружение предшествующего накопления гидропероксидов липидов, для чего используется специфический краситель BODIPY C11. В настоящей рукописи будет показано, как ферроптоз может быть индуцирован в клетках медуллобластомы дикого типа с помощью различных индукторов: эрантина, RSL3 и донора железа. Аналогичным образом, будут использоваться клетки xCT-KO, которые растут в присутствии NAC и которые подвергаются ферроптозу после удаления NAC. Характерный «пузырчатый» фенотип виден под световым микроскопом в течение 12-16 ч с момента запуска ферроптоза. Кроме того, будет использовано окрашивание BODIPY C11 с последующим анализом FACS, чтобы показать накопление гидропероксидов липидов и последующую гибель клеток с использованием метода окрашивания PI. Чтобы доказать ферроптотическую природу клеточной гибели, ферростатин-1 будет использоваться в качестве специфического средства, предотвращающего ферроптоз.
Введение
Ферроптоз является новым контекстуализированным, зависимым от активных форм кислорода (АФК) типом клеточной смерти1. Помимо АФК, железо играет решающую роль в этом типе клеточной смерти, отсюда и название2. Заключительным и исполнительным этапом ферроптоза является катализируемое железом накопление окислительного повреждения липидов в плазматической мембране, что в конечном итоге приводит к нарушению целостности мембраны и селективной проницаемости и, наконец, к гибели клеток в результате барботирования. Событие гидроперекисного окисления липидов является естественным явлением; Однако его распространению по всей клеточно....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Настоящее исследование проводилось с использованием клеточных линий медуллобластомы дикого типа (WT) DAOY, которые культивировали при 37 °C с 5%CO2 в среде DMEM с добавлением 8% FBS. Удаленную xCT клеточную линию поддерживали в тех же условиях, проводя эксперименты в средах с добавлением 1 мМ N-ацетилцистеина (NAC). Клетки регулярно проверяли на микоплазму с помощью коммерчески доступного набора для обнаружения микоплазм (см. Таблицу материалов) и культивировали до10-го пассажа.
1. Уборка и посев клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы выполняются с использованием стерил....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Клеточную линию медуллобластомы DAOY культивировали в стандартной среде DMEM с добавлением 8% FBS до достижения примерно 60% конфлюенции. В день эксперимента были собраны клетки, и 1 000 000 клеток на лунку были помещены в 6-луночные планшеты, согласно таблице 1. На следующий день клетки (в трех экземплярах) обрабатывали либо 1 мкМ эрантина, либо 0,3 мкМ RSL3, либо 250 мкМ FAC. Затем планшеты помещали в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2. Через 6 ч клетки наблюдали под микроскопом для обн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Основным признаком гибели ферроптозных клеток является неконтролируемое накопление гидропероксидов липидов в плазматической мембране. Это окислительное повреждение может происходить ферментативным или неферментативным способом, но в любом случае реакция является железозависимой/катализируемой, что объясняет название этого типа клеточной смерти. Гидроперекисное окисление липидов часто косвенно оценивается путем измерения продуктов распада гидроперокисления липидов, таких как 4-гидрокси-2,3-транс-ноненаль (4-HNE) или малон.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Мы заявляем об отсутствии конфликта интересов в отношении исследования, представленного в настоящем документе.
Благодарности
Эта работа была поддержана правительством Княжества Монако, а также организацией «Le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer» (GEMLUC) и фондом Flavien, который предоставил средства для покупки BD FACS Melody.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| BODIPY 581/591 C11 | Thermo Fisher | D3861 | |
| Счетчик ячеек | Beckman | Coulter Z1 | |
| DMEM medium | Gibco | 10569010 | |
| Erastin | Sigma-Aldrich | E7781-5MG | |
| Цитрат ферроамминиума | Acros Organics | 211842500 | |
| Ферростатин-1 | Sigma-Aldrich | SML0583-25MG | |
| Фетальная бытивая сыворотка (FBS) | Dominique Dutcher | 500105N1N | |
| Проточный цитометр | BD Biosciences | FACS Melody | |
| Gibco StemPro Accutase Реагент для диссоциации клеток | Thermo Fisher | 11599686 | |
| N-ацетилцистеин | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| PlasmoTest Набор для обнаружения микоплазмы | InvivoGen | rep-pt1 | |
| пропидия йодид | Invitrogen | P3566 | |
| RSL3 | Sigma-Aldrich | SML2234-25MG | |
| Трипсин - ЭДТА 10X - 100 мл | Dominique Dutcher | X0930-100 |
Ссылки
- Dixon, S. J., et al. Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death. Cell. 149, 1060-1072 (2012).
- Yang, W. S., Stockwell, B. R. Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-depende....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
