Методическая статья

Альтернативные методы определения образования супероксид-анионов в тромбоцитах

DOI:

10.3791/66647

⸱

29 марта 2024 г.

 ,  ,  , 
1Medicines and Healthcare Regulatory Agency, South Mimms laboratories, 2Hull York Medical School, University of Hull

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Образование супероксид-аниона имеет важное значение для стимуляции тромбоцитов и, в случае его нерегуляции, имеет решающее значение для тромботических заболеваний. В данной работе мы представляем три протокола для селективного детектирования супероксид-анионов и изучения редокс-зависимой регуляции тромбоцитов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Активные формы кислорода (АФК) представляют собой крайне нестабильные молекулы, содержащие кислород. Их химическая нестабильность делает их чрезвычайно реактивными и дает им способность реагировать с важными биологическими молекулами, такими как белки, нуклеиновые кислоты и липиды. Супероксидные анионы являются важными АФК, образующимися при восстановлении молекулярного восстановления кислорода (т.е. приобретении одного электрона). Несмотря на то, что первоначально они участвовали исключительно в старении, дегенеративных и патогенных процессах, в последнее время их участие в важных физиологических реакциях стало очевидным. Было показано, что в сосудистой системе супероксид-анионы модулируют дифференцировку и функцию гладкомышечных клеток сосудов, пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток сосудов в ангиогенезе, иммунный ответ и активацию тромбоцитов в гемостазе. Роль супероксид-анионов особенно важна в нарушении регуляции тромбоцитов и сердечно-сосудистых осложнениях, связанных с множеством заболеваний, включая рак, инфекции, воспаления, диабет и ожирение. Таким образом, в сердечно-сосудистых исследованиях стало чрезвычайно актуальным иметь возможность эффективно измерять образование супероксид-анионов тромбоцитами человека, понимать редокс-зависимые механизмы, регулирующие баланс между гемостазом и тромбозом, и, в конечном итоге, идентифицировать новые фармакологические инструменты для модуляции тромбоцитарных реакций, ведущих к тромбозу и сердечно-сосудистым осложнениям. В данном исследовании представлены три экспериментальных протокола, успешно принятых для обнаружения супероксид-анионов в тромбоцитах и изучения редокс-зависимых механизмов, регулирующих гемостаз и тромбоз: 1) обнаружение супероксид-анионов на основе дигидроэтидия (ДГЭ) методом проточной цитометрии; 2) Визуализация и анализ супероксид-анионов на основе ДГЭ с помощью визуализации одиночных тромбоцитов; и 3) количественное определение выхода супероксид-анионов в тромбоцитах с помощью электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) на основе спинового зонда.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Супероксид-анион (O2•-) является наиболее функционально значимым АФК, образующимся в тромбоцитах1. O2•- является продуктом восстановления молекулярного кислорода и предшественником многих различных АФК 2. Дисмутация O2•- приводит к образованию перекиси водорода (H2O2) в результате спонтанных реакций в водном растворе или реакций, катализируемых супероксиддисмутазами (SODs3). Несмотря на то, что были предложены различные ферментативные источники (например, ксантиноксидаза4, липоксигеназа5, циклооксигеназа6 и синтаза оксида азота7), митохондриальное дыхание 8,9 и никотинамидадениндинуклеотидфосфатоксидаза (NOXs)10 являются наиболее заметными источниками супероксид-аниона в эукариотических клетках. То же самое, по-видимому, имеет место и в отношении тромбоцитов, где утечка электронов из митохондриального дыхания11,12 и ферментативная активность NOXs13,14 были описаны как основные факторы, влияющие на выброс супероксид-анионов.

Хотя несколько исследований были сосредоточены на регуляции тромбоцитов с помощью O2•-, нет единого мнения относительно молекулярных механизмов, ответственных за это. Предложена модуляция активности поверхностных рецепторов путем прямого окисления и образования дисульфидных связей для различных рецепторов тромбоцитов. Предполагается положительная регуляция интегрина αIIbβ3 АФК путем прямого окисления остатков цистеина 15,16,17. Аналогичным образом, поскольку реакция тромбоцитов на коллаген зависит от дисульфид-зависимой димеризации и последующей димеризации гликопротеина VI (GPVI)18, было предложено потенцирование активности рецептора путем АФК-зависимого окисления19, хотя это и не было полностью доказано экспериментально. Наконец, было показано, что индуцированное АФК окисление сульфгидрильных групп гликопротеина Ib (GPIb) способствует адгезии тромбоцитов и взаимодействию тромбоцитов с лейкоцитами во время воспаления20. И наоборот, как возможное следствие снижения окисления сульфгидрильных групп и активации рецепторов, выделение эктодомена как GPVI, так и GPIb уменьшается при редуцировании условий21.

Также предложены способы действия, не зависящие от прямого окисления поверхностных рецепторов тромбоцитов. Было показано, что АФК, включая O2•-, положительно модулируют коллагеновый рецептор GPVI за счет ослабления активности области гомологии Src 2, содержащей протеинтирозинфосфатазу 2 (SHP-2), которая отрицательно регулирует сигнальный каскад этого рецептора22. Кроме того, O2•- может образовывать ONOO- (пероксинитрит) путем быстрой реакции с оксидом азота (NO), который в норме ингибирует тромбоциты через NO-чувствительную гуанилилциклазу (NO-GC) и генерацию отрицательного регулятора тромбоцитов циклической GMP (cGMP)23,24. Возникающее в результате снижение уровня NO может привести к потенцированию тромбоцитов. В качестве альтернативы, предполагается, что образование O2•- с помощью NOX2 способствует перекисному окислению липидов и образованию изопростана, что имеет важное значение для активации тромбоцитов и адгезии. Наконец, митоген-активируемая протеинкиназа (MAPK) внеклеточная сигнал-регулируемая киназа 5 (ERK5), протеинкиназа, предлагаемая в качестве датчика редокс-стресса в тромбоцитах26, активируетсяO2•- и индуцирует фенотип прокоагулянта в тромбоцитах (что оценивается с помощью измерения экстернализации фосфатидилсерина на основе проточной цитометрии)27.

Нарушение регуляции образования O2•- и других АФК в тромбоцитах было связано с преувеличенной гемостатической реакцией, приводящей к тромботическим сердечно-сосудистым осложнениям, связанным с атеросклерозом, сахарным диабетом, гипертонией, ожирением и раком28,29. В этих патологических условиях выход АФК тромбоцитами увеличивается, что приводит к потенцированию их адгезивных и агрегационных реакций. В дополнение к влиянию на реакцию тромбоцитов, выход свободных радикалов тромбоцитов может иметь последствия для других клеток крови и сосудистых структур, что является плохо изученной и недостаточно изученной областью сердечно-сосудистого здоровья. Несмотря на наше ограниченное понимание молекулярных механизмов, связывающих окислительный стресс с тромботическими состояниями, клиническая значимость антиоксидантов для защиты от сердечно-сосудистых заболеваний привлекла значительное внимание. Было показано, что уровни антиоксидантов в плазме обратно коррелируют с риском развития сердечно-сосудистых заболеваний, а потребление антиоксидантов с пищей защищает от ишемической болезни сердца31,32. Следовательно, использование пищевых антиоксидантов было рекомендовано как многообещающий подход к профилактике сердечно-сосудистых заболеваний 33,34,35. Среди эффектов образования АФК в тромбоцитах увеличение апоптоза может иметь важные патофизиологические эффекты36,37. В целом, надежные протоколы для обнаружения и количественного определения выхода O2•- из тромбоцитов становятся все более актуальными в исследованиях сердечно-сосудистых заболеваний.

В настоящее время доступные методы обнаружения АФК имеют существенные ограничения специфичности (т.е. химическая природа обнаруженных молекул окислителя неизвестна) и надежности (т.е. нежелательное взаимодействие с биологическими молекулами и экспериментальными реагентами приводит к смещенным нефизиологическим результатам)38,39. Наиболее часто используемый подход к выявлению АФК в тромбоцитах основан на использовании дихлордигидрофлуоресцеина диацетата (DCFDA), который превращается в дихлордигидрофлуоресцеин (DCFH) посредством внутриклеточных эстераз и, следовательно, в высокофлуоресцентный дихлорфлуоресцеин (DCF) клеточными окислителями, включая гидроксильные радикалы и промежуточные соединения пероксидазы-H2O2 40,41. Несмотря на его широкое использование, были подняты серьезные вопросы относительно надежности этого подхода для измерения внутриклеточного АФК38. Окисление DCFH до DCF может быть, фактически, индуцировано ионами переходных металлов (например, Fe2+) или ферментами, содержащими гем (например, цитохромами) вместо ROS42. Кроме того, DCFDA превращается клеточными пероксидазами в свою свободнорадикальную форму семихинона (DCF•-), которая, в свою очередь, окисляется до DCF в результате реакции с молекулярным кислородом (O2) с выделением O2•-, что приводит к искусственной амплификации окислительных реакций 41,43,44. Таким образом, обнаружение внутриклеточных АФК с помощью DCFDA полезно для получения первоначальных представлений, но требует тщательного рассмотрения и обширного экспериментального контроля38,39.

В данном исследовании представлены три альтернативных метода обнаружения и измерения ключевого регулятора функции тромбоцитов O2•-1. Первый метод заключается в обнаружении с помощью DHE и проточной цитометрии, что дает преимущества надежности и специфичности по сравнению с DCFDA. Второй предложенный здесь метод также использует DHE, но метод детектирования представляет собой флуоресцентную визуализацию живых тромбоцитов, которая позволяет изучать генерацию сигналов O2•-на тромбоцитах с быстрой кинетикой и разрешением отдельных клеток. Наконец, протокол, основанный на использовании гидроксиламинового спинового зонда 1-гидрокси-3-метоксикарбонил-2,2,5,5-тетраметилпирролидина (CMH) в экспериментах по резонансу ЭПР, дает возможность количественно оценить скорость образования O2•- тромбоцитами и сравнить ее в различных условиях.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Забор периферической крови у добровольцев по обоюдному согласию одобрен местным Комитетом по этике и Национальным управлением по исследованиям в области здравоохранения Национальной службы здравоохранения (ссылка REC: 21/SC/0215; IRAS ID: 283854).

1. Метод 1: Обнаружение супероксид-анионов с помощью DHE методом проточной цитометрии

  1. Предварительно подогрейте (37 °C) раствор цитрата натрия (4% по объему) и используйте его в качестве антикоагулянта, добавляя его непосредственно в кровь во время венепункции в соотношении 1:7 (0,5% по сравнению с объемом).
  2. Забор периферической крови человека у здоровых добровольцев методом венепункции срединной кубитальной вены.
  3. Получить обогащенную тромбоцитами плазму (PRP) из цельной крови путем начальной стадии центрифугирования при 200 x g в течение 20 минут.
  4. Центрифуга PRP при 500 x g в течение 10 мин с обратимыми ингибиторами тромбоцитов индометацином (10 мкМ) и PGE1 (40 нг/мл).
  5. Ресуспендировать полученную тромбоцитарную гранулу в модифицированный буфер Тироде (145 мМ NaCl, 2,9 мМ KCl, 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазиэтан сульфоновой кислоты (HEPES), 1 мМ MgCl2, 5 мМ глюкозы, pH 7,3) (37 °C) при плотности 2 x 108 тромбоцитов/мл.
  6. После выделения отдохните тромбоциты в течение 30 минут при температуре 37 °C.
  7. Готовят ДГЭ в диметилсульфоксиде (ДМСО) при исходной концентрации 5 мМ.
  8. Добавьте DHE в суспензию тромбоцитов в конечную концентрацию 5 мкМ (разбавьте исходный раствор от 1 до 1000, с конечной концентрацией ДМСО 0,1% v/v) и инкубируйте в течение 15 мин при 37 °C.
  9. Обрабатывайте тромбоциты фармакологическими препаратами и/или поглотителями АФК в течение 15 минут до стимуляции желаемыми физиологическими стимулами и концентрациями (например, 0,1 ЕД/мл тромбина или 3 мкг/мл коллагена).
  10. После стимуляции разбавьте суспензии тромбоцитов от 1 до 10 в ледяном модифицированном буфере HEPES.
  11. Для проточной цитометрии установите усиление бокового рассеяния (SSC) и прямого рассеяния (FSC) на 40 мВ и 220 мВ соответственно, а также используйте графики рассеяния логарифмического масштаба для визуализации популяции частиц в суспензии (пример на рисунке 1A).
  12. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Иммуноокрашивание одной аликвоты тромбоцитарной суспензии с использованием анти-CD41-антитела для идентификации популяции событий, соответствующих тромбоцитам (пример на рисунке 1B).
  13. Анализ образцов методом проточной цитометрии с использованием возбуждения на длине волны 405 нм (фиолетовый лазер) и излучения на длине волны 580 нм, что позволяет избирательно детектировать супероксид-анион-специфичный продукт 2-гидроксиэтидий (2OH-Et+) (рис. 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация параформальдегидом и длительное хранение образца не рекомендуются.

2. Метод 2: Детектирование супероксид-анионов с помощью DHE с помощью флуоресцентной визуализации одного тромбоцитарного

  1. Покрыть 8-луночный μ-слайд в день эксперимента 0,1 мг/мл фибриллярного коллагена I из сухожилий лошадей (коллаген Хорма), 0,2 мг/мл фибриногена или 1 мг/мл поли-L-лизина (ФАПЧ) в модифицированном буфере Тиродеса в течение 2 ч при 37 °С.
  2. Дважды промойте модифицированным буфером Tyrode's (по 10 мин каждый).
  3. Гашить неспецифическую адгезию путем инкубации в модифицированном буфере Тироде плюс 5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение минимум 30 мин (или до начала эксперимента).
  4. Предварительно подогрейте (37 °C) раствор цитрата натрия (4% по объему) и используйте его в качестве антикоагулянта, добавляя его непосредственно в кровь во время венепункции в соотношении 1:7 (0,5% по сравнению с объемом).
  5. Забор периферической крови человека у здоровых добровольцев методом венепункции срединной кубитальной вены.
  6. Получить обогащенную тромбоцитами плазму (PRP) из цельной крови путем начальной стадии центрифугирования при 200 x g в течение 20 минут.
  7. Центрифуга PRP при 500 x g в течение 10 мин с обратимыми ингибиторами тромбоцитов индометацином (10 мкМ) и PGE1 (40 нг/мл).
  8. Ресуспендировать полученную тромбоцитарную гранулу в модифицированный буфер Тироде (145 мМ NaCl, 2,9 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 1 мМ MgCl2, 5 мМ глюкоза, pH 7,3) (37 °C) при плотности 4 x 107 тромбоцитов/мл.
  9. После выделения отдохните тромбоциты в течение 30 минут при температуре 37 °C.
  10. Приготовьте DHE в диметилсульфоксиде (ДМСО) в исходной концентрации 10 мМ.
  11. Добавьте DHE в конечной концентрации 10 мкМ к суспензии тромбоцитов (разбавьте исходный раствор 1 к 1000, с конечной концентрацией ДМСО 0,1% v/v) и инкубируйте в течение 1 мин (37 °C).
  12. После 1 минуты инкубации с помощью ДГЭ удалите блокирующий раствор из выбранных лунок, поместите μ-слайд на предметный столик микроскопа, готовый к визуализации, и аккуратно выдайте тромбоциты.
  13. Контролируйте преобразование DHE в 2OH-Et+ с помощью инвертированной конфокальной визуализации в течение 10 минут (405/580 нм экс/эм), при этом изображения собираются каждые 10 с с помощью 40-кратной масляной иммерсионной линзы.
  14. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Для лунок, покрытых ФАПЧ, контролируют генерацию супероксид-аниона в ответ на растворимый агонист (например, 0,1 ЕД/мл тромбина или 3 мкг/мл коллагена) путем добавления агониста через 10 мин после дозирования тромбоцитов и сбора флуоресцентного изображения в течение следующих 10 мин, как описано в шаге 2.13.
  15. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) При необходимости добавьте поглотители супероксиданионов или селективные ингибиторы (например, ингибитор NOX) путем осторожного дозирования на стенку лунки в течение определенного времени и соберите флуоресцентные изображения, как описано в пункте 2.13, в течение еще 10 минут.
  16. Количественная оценка флуоресцентного анализа одиночных клеток путем выбора области интереса (ROI), содержащей репрезентативные одиночные тромбоциты, и анализа интенсивности флуоресценции в различных кадрах с помощью инструмента «Измерение » пакета визуализации ImageJ 1.53t.

3. Метод 3: Детектирование супероксид-аниона тромбоцитами с помощью электронного парамагнитного резонанса (ЭПР)

  1. Предварительно подогрейте (37 °C) раствор цитрата натрия (4% по объему) и используйте его в качестве антикоагулянта, добавляя его непосредственно в кровь во время венепункции в соотношении 1:7 (0,5% по сравнению с объемом).
  2. Забор периферической крови человека у здоровых добровольцев методом венепункции срединной кубитальной вены.
  3. Получить обогащенную тромбоцитами плазму (PRP) из цельной крови путем начальной стадии центрифугирования при 200 x g в течение 20 минут.
  4. Центрифуга PRP при 500 x g в течение 10 мин с обратимыми ингибиторами тромбоцитов индометацином (10 мкМ) и PGE1 (40 нг/мл).
  5. Ресуспендировать полученную тромбоцитарную гранулу в модифицированный буфер Тироде (145 мМ NaCl, 2,9 мМ KCl, 10 мМ HEPES, 1 мМ MgCl2, 5 мМ глюкоза, pH 7,3) (37 °C) при плотности 2 x 108 тромбоцитов/мл.
  6. После выделения отдохните тромбоциты в течение 30 минут при температуре 37 °C.
  7. Добавьте в суспензию тромбоцитов 5 мкМ диэтилдитиокарбамата (DETC) и 25 мкМ дефероксамина.
  8. Без инкубации добавить 200 мкМ 1-гидрокси-3-метоксикарбонил-2,2,5,5-тетраметилпирролидина (КМГ).
  9. Загрузите образцы на агрегатометр в кюветы агрегации (включая магниты с тефлоновым покрытием).
  10. Через 1 минуту добавьте стимулы в желаемой концентрации (например, 1 единица/мл тромбина или 3 μг/мл коллагена). Выдерживать в течение 10 минут.
  11. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Получите генерацию супероксид-аниона в разные моменты времени, перейдя к шагу 3.12 в нужное время.
  12. Перенесите суспензию тромбоцитов из агрегационной кюветы в микроцентрифужную пробирку и быстро открутите при 6 000 x g в течение 10 с.
  13. Загрузите 50 мкл надосадочной жидкости в капиллярные микропипетки и запечатайте сургучом EPR.
  14. Перенесите образцы на сканер ЭПР.
  15. Настройте сканер ЭПР следующим образом: центральное поле 3 492,5 G, развертка по полю 60 G, амплитуда модуляции 2 G, время развертки 10 с, количество сканирований 10, частота СВЧ 9,39 ГГц, мощность СВЧ 20 мВт, время преобразования 327,68 мс, постоянная времени 5242,88 мс.
  16. Оцените окисление CMH до CM● как площадь под кривой (AUC) пиков ЭПР, зарегистрированных с использованием указанных выше параметров.
  17. Постройте калибровочную кривую, отображающую интенсивность ЭПР, измеренную, как описано в шаге 3.16, по оси Y и концентрации коммерчески доступного CM● по оси x (например, 0, 0,3, 1, 3, 10 и 30 мкМ).
  18. Исходя из концентрации CM● в образцах, получите количество супероксид-аниона, генерируемого тромбоцитами в образцах, используя формулы, описанные в разделе «Репрезентативные результаты».

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для определения флуоресценции DHE с помощью проточной цитометрии мы показываем репрезентативные результаты для тромбоцитов, находящихся либо в состоянии покоя (рис. 3A), либо стимулированных тромбином 0,1 ЕД/мл (рис. 3B). Выход O2•- количественно определяли как среднюю интенсивность флуоресценции тромбоцитов (MFI), как показано при стимуляции тромбином 0,1 ЕД/мл (рис. 3C) или 3 мкг/мл коллаген-ассоциированного пептида (СРБ) (рис. 3D). В результате стимуляции тромбоцитов наблюдалось двух/трехкратное увеличение окрашивания DHE. Для подтверждения того, что O2•- измеряется, мы предлагаем использовать проницаемую для клеток O2•- поглотитель пегилированную супероксиддисмутазу (PEG-SOD, 100 ед./мл), в то время как для идентификации источника O2•- мы использовали ингибитор NOX VAS2870 (10 мкМ). Как для коллагена, так и для тромбина, PEG-SOD и VAS2870 устранили увеличение флуоресценции DHE, вызванное активацией тромбоцитов, подтвердив, что измерение специфично для O2•- и что их источниками в этих условиях являются ферменты NOX.

Для визуализационного детектирования флуоресценции DHE мы представляем данные экспериментов по оценке генерации O2•- в момент адгезии к коллагену или фибриногену (и в течение следующих 10 минут) (Рисунок 4A) или из экспериментов, направленных на оценку генерации O2•- из тромбоцитов, ранее адгезивших к ФАПЧ после стимуляции тромбином (Рисунок 4B). Как и ожидалось, адгезия к ФАПЧ не вызывает устойчивой продукции O2•-. Скорее всего, потому, что эта форма адгезии зависит от электростатического взаимодействия без инициирования какого-либо сигнального отклика45, что делает данный подход подходящим для измерения выхода O2•- в ответ на добавление растворимых агонистов. Чтобы подтвердить, что этот протокол позволяет обнаруживать O2•-, можно использовать либо поглотители, либо селективные ингибиторы. В предыдущих исследованиях мы показали, что N-ацетилцистеин (NAC) может поглощать O2•- и устранять флуоресценцию тромбоцитов в этих экспериментах46. Здесь мы показываем, что селективный ингибитор NOx VAS2870 эффективно и мгновенно ослабляет флуоресценцию в тромбоцитах, адгезирующих коллаген или фибриноген (Рисунок 4A) или реагирующих на тромбин (Рисунок 4B). Это говорит о том, что NOX являются источником O2•- в этих экспериментальных условиях. Репрезентативные фильмы для флуоресценции ДГЭ (возбуждение 405 нм) в ответ на адгезию к коллагену или фибриногену или стимуляцию тромбином тромбоцитов, адгезивных к ФАПЧ, включены в Дополнительный файл 1, Дополнительный файл 2 и Дополнительный файл 3 соответственно. Следует отметить, что PEG-SOD, который был успешно использован в других экспериментальных установках в качествеO2•- поглотителя, не эффективен в экспериментах этого типа. На данный момент у нас нет внятного объяснения этому. Мы можем предположить, что PEG-SOD достигает клеточных компартментов, в которых O2•- индуцирует повышенную флуоресценцию в анализах, основанных на визуализации, либо с низкой эффективностью, либо с медленной кинетикой. Для прояснения этого момента могут потребоваться дальнейшие целенаправленные исследования.

Мы применили измерение O2•- по ЭПР в тромбоцитах в различных ранее опубликованных исследованиях 1,13,47,48,49,50. Важнейшим этапом для этого метода является подготовка калибровочной кривой с использованием коммерчески доступной CM● (т.е. продукта реакции между спиновым зондом CMH и O2•- и резонирующими веществами, измеренными с помощью ЭПР). Реакция CMH и O2•- показана на рисунке 5A, а репрезентативные примеры сигнала EPR, индуцированного различными концентрациями CM●, приведены на рисунке 5B. На основе данных о различных концентрациях CM● была построена калибровочная кривая, описывающая линейную корреляцию между количеством окисленного CMH и интенсивностью сигнала ЭПР в образцах (рис. 5C). Приведенное ниже уравнение описывает корреляцию между концентрацией CM● и интенсивностью сигнала ЭПР и является отправной точкой для расчета калибровочной кривой для экспериментов в данном исследовании (уравнение 1):

figure-results-1

Поскольку обе концентрации CM● и соответствующая им интенсивность ЭПР были получены экспериментальным путем, можно рассчитать наклон и пересечение по оси Y калибровочной кривой. В примере, показанном на рисунке 5C, Slope = 1 002 169 и Intercept = 596 383. Таким образом, уравнение для калибровочной кривой можно переписать следующим образом:

figure-results-2

Переставляя приведенное выше уравнение, можно рассчитать концентрацию CM● для разных образцов на основе значений их интенсивности ЭПР (уравнение 2):

figure-results-3

После того, как концентрация CM● в образцах известна, можно рассчитать скорость его образования на тромбоцит и единицу времени с помощью уравнения ниже (уравнение 3):

figure-results-4

Используя Уравнение 2, Уравнение 3 можно переписать как (Уравнение 4):

figure-results-5

Который в примере, показанном на рисунке 5C , может быть перезаписан как:

figure-results-6

Скорость окисления CMH будет выражаться в аттомолах CM●, генерируемых на тромбоцит в минуту. Это значение можно использовать для сравнения скорости генерации O2•- между экспериментами и донорами, что невозможно при использовании флуоресцентных зондов, таких как DHE (или DCFDA). Флуоресцентные зонды обычно позволяют оценить влияние различных условий на генерацию O2•- только как изменения интенсивности флуоресценции в рамках одного эксперимента. Как и для всех описанных в данной статье методик, специфичность детектирования была подтверждена с помощью поглотителей АФК (например, PEG-SOD, NAC) или селективных ингибиторов ферментов, генерирующих супероксид-анион (например, VAS2870 для ингибирования NOXов). Здесь мы представляем данные по стимуляции тромбоцитов (рис. 6) тромбином (рис. 6A,C,E) или коллагеном (рис. 6B,D,F). Для обоих агонистов ПЭГ-СОД был использован для подтверждения того, что O2•- детектируется, в то время как отсутствие эффекта для пегилированной-каталазы (PEG-Cat.) позволяет предположить, что перекись водорода не обнаруживается этим методом (рис. 6C, D, соответственно). VAS2870 отменяет тромбин- (рисунок 6E) и индуцированные коллагеном (рисунок 6F) сигналы ЭПР, предполагая, что NOX являются основным источником тромбоцитовO2•- в ответ на оба этих агониста.

figure-results-7
Рисунок 1: анализ суспензий тромбоцитов с помощью проточной цитометрии. (A) Типичное представление графиков прямого (FSC) и бокового рассеяния (SSC) для изолированных тромбоцитов. (B) Иммуноокрашивание суспензии тромбоцитов антителом к CD41 подтверждает >98% частиц в препарате в виде тромбоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-8
Рисунок 2: Химическая реакция ДГЭ с супероксид-анионом и другими АФК и спектральные свойства продуктов его переработки. Структура и спектральные свойства ДГЭ и двух продуктов его окисления 2-гидрокси-этидия (2OH-Et+), образующегося в результате реакции с супероксидными анионами, и этидия (Et+), образующегося в результате реакции с другими типами АФК (например, гидроксильным радикалом и перекисью водорода). Пик возбуждения на длине волны 405 нм, выделенный на рисунке пунктирным синим прямоугольником, специфичен для 2OH-Et+ и, следовательно, может быть использован для обнаружения/измерения O2•-. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-9
Рисунок 3: Тромбин- и коллаген-зависимая генерация супероксид-анионов, обнаруженная с помощью DHE и проточной цитометрии. Репрезентативные гистограммы для окрашивания DHE тромбоцитов (А) в покое и (В) тромбин-стимулированных. В столбике указаны значения окрашивания DHE ниже 500, что составляет 70,7% и 16,1% для тромбоцитов в состоянии покоя и тромбин-стимулированных соответственно. Этот метод был использован для оценки образования супероксид-анионов в тромбине (C) 0,1 ед/мл и (D) 3 мкг/мл тромбоцитах, стимулированных коллагеном. PEG-SOD (100 ед./мл) был использован для подтверждения того, что в этом эксперименте измеряются супероксидные анионы, в то время как 10 мкМ VAS2870 был использован для идентификации ферментов NOX в качестве источника супероксидных анионов. Каждая точка данных была рассчитана как средняя интенсивность флуоресценции (MFI) из 50 000 тромбоцитов, и каждый эксперимент был повторен пять независимых раз (n = 5), при этом среднее ±значение SEM было показано на графиках. Статистическую значимость оценивали с помощью одностороннего ANOVA с пост-тестом Тьюки для попарных сравнений (** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-10
Рисунок 4: Коллаген-, фибриноген- и тромбин-зависимая генерация супероксид-анионов, обнаруженная с помощью флуоресцентной визуализации DHE. (A) Кинетика генерации супероксид-анионов была оценена для тромбоцитов, адгезирующих либо к коллагену, либо к фибриногену. Тромбоциты выдавались на покрытых μ-слайдах через 1 мин после начала визуализации, в то время как 10 мкМ VAS2870 добавляли через 5 мин после начала сбора изображений. (B) Кинетика генерации супероксидных анионов для тромбоцитов при стимуляции тромбином. Тромбоцитам давали прилипнуть к μ-стеклам с покрытием PLL в течение 10 мин до начала сбора изображений. Через 2 мин добавляли 0,1 ЕД/мл тромбина, а еще через 5 мин добавляли 10 мкМ VAS2870 (т.е. через 7 мин от начала визуализации). Экспериментальная схема представлена в верхней части панелей, в то время как репрезентативные изображения от 0 мин, 1 мин, 3 мин, 6 мин и 9 мин показаны в середине панелей. Количественное определение флуоресценции одиночных тромбоцитарных DHE показано в нижней части панелей и было получено путем анализа интенсивности флуоресценции с использованием ImageJ. Данные представляют собой среднее значение ± SEM от 8-12 тромбоцитов на состояние в 4 независимых экспериментах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-11
Рисунок 5: Калибровочная кривая и расчеты скорости окисления CMH. (A) Химическая структура и EPR свойства CMH и CM●. (B) Репрезентативные примеры данных ЭПР для различных концентраций CM● (от 100 нМ до 10 мкМ). (C) Калибровочная кривая зависимости интенсивности ЭПР от концентрации CM● . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-12
Рисунок 6: Обнаружение продукции супероксид-анионов тромбоцитами при стимуляции тромбином или коллагеном. Выход супероксид-анионов измеряли с помощью ЭПР с помощью спинового зонда CMH в тромбоцитах, стимулированных либо (А) 0,1 ЕД/мл тромбина, либо (В) 3 мкг/мл коллагена. (С, Г) Концентрация 100 ЕД/мл супероксид-аниона-поглотителя PEG-SOD или 100 ЕД/мл поглотителя перекиси водорода пегилированной каталазы (PEG-Cat.) была включена в условия, тестируемые для обоих агонистов. Источник супероксид-аниона исследовали путем совместной инкубации с ингибитором NOX VAS2870 (10 мкМ). Как (E)тромбин, так и (F)коллаген зависят от активности NOX для образования супероксид-аниона. На рисунке скорость реакции CMH/супероксид-анион была рассчитана по следам ЭПР, как описано в рукописи (уравнение 4). Данные представляют собой среднее значение ± SEM из 5 (C,D) и 4 независимых экспериментов (E,F). Статистическую значимость оценивали с помощью одностороннего ANOVA с пост-тестом Тьюки для попарных сравнений (** = p < 0,01, *** = p < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный файл 1: Репрезентативный фильм для флуоресценции DHE (возбуждение 405 нм) в ответ на адгезию к коллагену. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Репрезентативный фильм для флуоресценции DHE (возбуждение 405 нм) в ответ на фибриноген адгезии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 3: Репрезентативный фильм для флуоресценции DHE (возбуждение 405 нм) в ответ на стимуляцию тромбином тромбоцитов, адгезирующих ФАПЧ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой рукописи мы представляем три различных метода, которые могут расширить возможности исследования редокс-зависимой регуляции функции тромбоцитов посредством селективного обнаружения O2•-. Первые два метода являются улучшением существующих методов из-за использования окислительно-восстановительного зонда (DHE вместо более распространенного, но менее надежного DCFDA). Таким образом, эти методы легко доступны, и большинство лабораторий могут эффективно применять их без специального оборудования или затрат на обучение. Третья методика основана на использовании специализированного оборудования для анализа окисления спинового зонда CMH методом ЭПР. Эта методика требует приобретения специализированного оборудования и реагентов, а также специального обучения пользователя лаборатории. Следовательно, он представляется подходящим для лабораторий, специально специализирующихся на изучении редокс-зависимых событий в тромбоцитах (или других клетках).

Для методов, использующих DHE, выбор длины волны для возбуждения имеет решающее значение для получения специфического детектирования O2•-. 2-гидроксиэтидий (2OH-Et+), образующийся в результате реакции DHE с O2•-, возбуждается при длине волны 405 нм, в то время как этидий (Et+), образующийся в результате общей реакции DHE с АФК (например, гидроксильным радикалом и перекисью водорода), имеет пик возбуждения около 520 нм, но не возбуждает при длине волны 405 нм (рис. 1)51. Использование DHE вместо DCFDA защищает от артефактов, вызванных прямой реакцией этого зонда с клеточными компонентами, такими как пероксидазы, другие гемсодержащие ферменты и восстановители ионов металлов 42,43,44. ДГЭ был предложен в качестве более безопасного инструмента для исследований клеточного окислительно-восстановительного потенциала38,39. Здесь мы предлагаем использовать DHE с двумя различными методами считывания: 1) проточной цитометрией и 2) флуоресцентной визуализацией.

Проточная цитометрия, как правило, представляет собой метод, который позволяет одновременно обрабатывать несколько образцов с низкой и средней пропускнойспособностью52. К сожалению, подход, использованный в данном исследовании, не позволяет зафиксировать образец. Несмотря на то, что разбавление образцов ледяным модифицированным буфером Тироде стабилизирует флуоресценцию в образцах на срок до 30 минут, анализ всех образцов должен быть выполнен в эти сроки. Это существенно ограничивает количество образцов в одном эксперименте. Возможны многократные внутренне контролируемые экспериментальные запуски в течение одного дня и с использованием одного и того же препарата тромбоцитов, хотя результаты должны быть нормализованы для контроля и не рассматриваться как независимые эксперименты. Эта методика была использована авторами данной рукописи для того, чтобы подчеркнуть роль редокс-зависимой модуляции тромбоцитов в ответах на различные агонисты и модуляторы46,50. Этот метод может быть модифицирован путем использования химически модифицированной версии DHE, которая позволяет нацеливаться на митохондрии (т.е. Mitosox)53, который использовался для исследований тромбоцитов, сосредоточенных на NOX254. Это интересная возможность, которой наши лаборатории еще не воспользовались.

Предложенный здесь метод флуоресцентной визуализации с использованием DHE имеет то преимущество, что он определяет временной ход генерации O2•- в тромбоцитах при адгезии (агонисты, абсорбированные на поверхности лунки для визуализации) или стимуляции (агонисты в суспензии). Это позволяет интерпретировать взаимодействие различных фаз процесса активации тромбоцитов и оценить вклад различных источниковO2•- (например, различных ферментов, генерирующих АФК, например, NOXs). Ни одна из существующих методик не позволяет проводить такого рода исследования. Это связано с затратами с точки зрения производительности анализа, при этом каждое тестируемое условие занимает 30 минут (что включает в себя настройку μ предметного стекла, фокусировку и выбор поля, визуализацию и сохранение данных). Таким образом, этот метод позволяет тестировать небольшое количество условий в течение рабочего дня (т.е. менее 10). Несмотря на то, что для приведенных здесь данных использовался конфокальный микроскоп, мы подтвердили, что столь же хорошие результаты могут быть получены и с помощью эпифлуоресцентного микроскопа с возможностью возбуждения 405 нм. Это снижает потребность в дорогостоящих установках для конфокальной микроскопии и делает этот метод более доступным.

Протокол ЭПР был разработан на основе предыдущих исследований на различных типах клеток55. Этот метод широко признан наиболее надежным инструментом для изучения генерации АФК и исследования редокс-зависимых событий в клетках38. В дополнение к превосходной надежности по сравнению с другими методами благодаря специфичности реакции гидроксиламиновых спиновых зондов со свободными радикаламикислорода 56, ЭПР позволяет количественно оценить скорость генерацииO2•- и сравнить ее между различными индивидуумами и экспериментами. Это невозможно с помощью методов, основанных на флуоресценции, которые позволяют оценить влияние выбранных условий на интенсивность флуоресценции только в рамках одного эксперимента и получения тромбоцитов. Несмотря на то, что протокол ЭПР был разработан в качестве метода комбинации с агрегацией тромбоцитов для параллельного мониторинга активации тромбоцитови O2•- генерации1, эти эксперименты могут быть выполнены без параллельного анализа агрегации. Даже без параллельного анализа агрегации тромбоцитов мы предлагаем проводить инкубацию в агрегатометре, чтобы гарантировать эффективную стимуляцию тромбоцитов, для которой требуется напряжение сдвига, обеспечиваемое непрерывным перемешиванием. Если эксперименты необходимо проводить в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл без перемешивания, уровни образования O2•- будут значительно ниже. Поэтому, если выбран этот экспериментальный подход, мы предлагаем проводить инкубацию CMH на вращающемся колесе и с более плотно концентрированными тромбоцитами (т.е. 1 x 109/мл), что приводит к сигналу, достаточно сильному для детектирования спектрометром ЭПР.

Подводя итог, мы представляем три валидированных метода обнаружения O2•- в тромбоцитах. Они обладают различными преимуществами и могут быть выбраны в соответствии с экспериментальными целями и приоритетами. Первый метод, основанный на использовании ДГЭ методом проточной цитометрии, является наименее трудоемким и трудоемким и поэтому может быть выбран в качестве анализа начального уровня. Второй метод, основанный на использовании DHE с помощью флуоресцентной микроскопии, позволяет оценить быструю кинетику генерацииO2•- и изучить, как различные сигнальные каскады могут влиять на окислительный ответ в секундном масштабе времени (в то время как другие методы позволяют исследовать только конечные точки событий, происходящих в течение нескольких минут после стимуляции). Наконец, ЭПР позволяет количественно оценить скорость генерации O2•- и сравнить ее между экспериментами и индивидуумами. По этой причине последний метод особенно полезен для клинических исследований, направленных на характеристику окислительной реакции тромбоцитов у разных людей (например, сравнение между пациентами или пациентами со здоровой контрольной группой). В целом, эти три метода имеют значительные преимущества по сравнению с существующими методами и представляют собой значительный прогресс в имеющихся в нашем распоряжении экспериментальных инструментах для изучения редокс-зависимых событий в тромбоцитах.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа финансировалась грантами Британского фонда сердца (PG/15/40/31522), Alzheimer Research UK (ARUK-PG2017A-3) и Европейского исследовательского совета (#10102507).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1-гидрокси-3-метоксикарбонил-2,2,5,5-тетраметилпирролидин (CMH)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgРеагент для ЭПР (спинового зонда)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NAПроточный цитометр
Бычья сыворотка АльбуминMerck/SigmaA7030Для μ-скользящего покрытия
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH  NOX-E.11-BES ЭПР-спектрометр
Каталаза– полиэтиленгликоль (PEG-Cat.)Merck/SigmaC4963Поглотитель перекиси водорода (контроль специфичности)
ChronoLog Model 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometer
CM radicalNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg Реагент для ЭПР (калибровочный контроль)
Дефероксамин Noxygen Science трасфер и диагностика GmbHNOX-09.1-100mg Реагент для ЭПР
диэтилдитиокарбамат (DETC) Noxygen Science Trasfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g Реагент для ЭПР
ДигидроэтидийThermo Fisher ScientificsD11347Супероксидный анионный зонд
ДиметилсульфоксидMerck/Sigma34869Для приготовления стокового раствора 
Пластины для сургуча EPRNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMРасходные материалы для воды класса EPR
EPRNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L Реагент для ЭПР
Фибриноген из плазмы крови человекаMerck/SigmaF4883Для μ-скользящего покрытия
FITC античеловеческий CD41 АнтителоBioLegend303704Тромбоцитарное специфическое окрашивание для проточной цитометрии
Стеклянные кюветы Labmedics/ChronologP/N 312Расходные материалы для инкубации в агрегатометре
Horm CollagenLabmedics/ChronologP/N 385Для стимуляции тромбоцитов
ImageJ Национальные институты здравоохранения (NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
ИндометацинMerck/SigmaI7378Для выделения тромбоцитов
Микропипетки DURAN 50µ lNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50&микро; LРасходные материалы для ЭПР
Поли-L-лизина гидрохлоридMerck/SigmaP2658Для покрытия μ-слайдов
Простагландин E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515Для выделения тромбоцитов
Цитрат натрия (4% w/v раствор)Merck/SigmaS5770Для изоляции тромбоцитов
Мешалки (с тефлоновым покрытием)Labmedics/ChronologP/N 313Расходный материал для инкубации в агрегатометре
Супероксиддисмутаза; полиэтиленгликоль (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549Супероксид-анион поглотитель (контроль специфичности)
Тромбин из человеческой плазмыMerck/SigmaT6884Для стимуляции тромбоцитов и покрытия μ-предметного стекла
VAS2870Enzo Life ScienceBML-EI395Ингибитор NOX
Zeiss 510 LSM Конфокальный микроскопZeissNAКонфокальный микроскоп
Zeiss NA

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vara, D., Cifuentes-Pagano, E., Pagano, P. J., Pula, G. A novel combinatorial technique for simultaneous quantification of oxygen radicals and aggregation reveals unexpected redox patterns in the activation of platelets by different physiopathological stimuli. Haematologica. 104 (9), 1879-1891 (2019).
  2. Fridovich, I. Superoxide radical: An endogenous toxicant. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 239-257 (1983).
  3. Keele, B. B., Mccord, J. M., Fridovich, I. Superoxide dismutase from Escherichia coli B. A new manganese-containing enzyme. J Biol Chem. 245 (22), 6176-6181 (1970).
  4. Berry, C. E., Hare, J. M. Xanthine oxidoreductase and cardiovascular disease: Molecular mechanisms and pathophysiological implications. J Physiol. 555, Pt 3 589-606 (2004).
  5. Kim, C., Kim, J. Y., Kim, J. H. Cytosolic phospholipase a(2), lipoxygenase metabolites, and reactive oxygen species. BMB Rep. 41 (2), 555-559 (2008).
  6. Armstead, W. M., Mirro, R., Busija, D. W., Leffler, C. W. Postischemic generation of superoxide anion by newborn pig brain. Am J Physiol. 255 (2), Pt 2 H401-H403 (1988).
  7. Mayer, B., et al. Nitric oxide synthase-catalyzed activation of oxygen and reduction of cytochromes: Reaction mechanisms and possible physiological implications. J Cardiovasc Pharmacol. 20, Suppl 12 S54-S56 (1992).
  8. Du, G., Mouithys-Mickalad, A., Sluse, F. E. Generation of superoxide anion by mitochondria and impairment of their functions during anoxia and reoxygenation in vitro. Free Radic Biol Med. 25 (9), 1066-1074 (1998).
  9. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. J Physiol. 552, Pt 2 335-344 (2003).
  10. Jiang, F., Zhang, Y., Dusting, G. J. Nadph oxidase-mediated redox signaling: Roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol Rev. 63 (1), 218-242 (2011).
  11. Wang, Z., et al. The role of mitochondria-derived reactive oxygen species in hyperthermia-induced platelet apoptosis. PLoS One. 8 (9), e75044(2013).
  12. Wachowicz, B., Olas, B., Zbikowska, H. M., Buczynski, A. Generation of reactive oxygen species in blood platelets. Platelets. 13 (3), 175-182 (2002).
  13. Vara, D., et al. Nadph oxidases are required for full platelet activation in vitro and thrombosis in vivo but dispensable for plasma coagulation and hemostasis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 41 (2), 683-697 (2021).
  14. Violi, F., Pignatelli, P. Platelet nox, a novel target for anti-thrombotic treatment. Thromb Haemost. 111 (5), 817-823 (2014).
  15. Begonja, A. J., et al. Platelet NAD(P)H-oxidase-generated ros production regulates alphaiibbeta3-integrin activation independent of the NO/CGMP pathway. Blood. 106 (8), 2757-2760 (2005).
  16. Vara, D. S., et al. Autocrine amplification of integrin αIIbβ3 activation and platelet adhesive responses by deoxyribose-1-phosphate. Thromb Haemost. 109 (6), 1108-1119 (2013).
  17. Essex, D. W. The role of thiols and disulfides in platelet function. Antioxid Redox Signal. 6 (4), 736-746 (2004).
  18. Arthur, J. F., et al. Ligand binding rapidly induces disulfide-dependent dimerization of glycoprotein vi on the platelet plasma membrane. J Biol Chem. 282 (42), 30434-30441 (2007).
  19. Arthur, J. F., Gardiner, E. E., Kenny, D., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Platelet receptor redox regulation. Platelets. 19 (1), 1-8 (2008).
  20. Kim, K., Li, J., Tseng, A., Andrews, R. K., Cho, J. Nox2 is critical for heterotypic neutrophil-platelet interactions during vascular inflammation. Blood. 126 (16), 1952-1964 (2015).
  21. Hosseini, E., Solouki, A., Roudsari, Z. O., Kargar, F., Ghasemzadeh, M. Reducing state attenuates ectodomain shedding of GPVI while restoring adhesion capacities of stored platelets: Evidence addressing the controversy around the effects of redox condition on thrombosis. J Thromb Thrombolysis. 50 (1), 123-134 (2020).
  22. Jang, J. Y., et al. Reactive oxygen species play a critical role in collagen-induced platelet activation via SHP-2 oxidation. Antioxid Redox Signal. 20 (16), 2528-2540 (2014).
  23. Beckman, J. S., Koppenol, W. H. Nitric oxide, superoxide, and peroxynitrite: The good, the bad, and ugly. Am J Physiol. 271 (5), Pt 1 C1424-C1437 (1996).
  24. Koppenol, W. H., Kissner, R., Beckman, J. S. Syntheses of peroxynitrite: To go with the flow or on solid grounds. Methods Enzymol. 269, 296-302 (1996).
  25. Cammisotto, V., et al. Nox2-mediated platelet activation by glycoprotein (GP) VI: Effect of rivaroxaban alone and in combination with aspirin. Biochem Pharmacol. 163, 111-118 (2019).
  26. Yang, M., et al. Platelet CD36 promotes thrombosis by activating redox sensor ERK5 in hyperlipidemic conditions. Blood. 129 (21), 2917-2927 (2017).
  27. Yang, M., et al. Platelet CD36 signaling through ERK5 promotes caspase-dependent procoagulant activity and fibrin deposition in vivo. Blood Adv. 2 (21), 2848-2861 (2018).
  28. Freedman, J. E. Oxidative stress and platelets. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (3), s11-s16 (2008).
  29. Masselli, E., et al. ROS in platelet biology: Functional aspects and methodological insights. Int J Mol Sci. 21 (14), 4866(2020).
  30. Madamanchi, N. R., Vendrov, A., Runge, M. S. Oxidative stress and vascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (1), 29-38 (2005).
  31. Riemersma, R. A., et al. Risk of angina pectoris and plasma concentrations of vitamins a, c, and e and carotene. Lancet. 337 (8732), 1-5 (1991).
  32. Rimm, E. B., et al. Vitamin E consumption and the risk of coronary heart disease in men. N Engl J Med. 328 (20), 1450-1456 (1993).
  33. Zhang, W., Zheng, Y., Yan, F., Dong, M., Ren, Y. Research progress of quercetin in cardiovascular disease. Front Cardiovasc Med. 10, 1203713(2023).
  34. Russell, C., Keshavamurthy, S., Saha, S. Nutraceuticals in the management of cardiovascular risk factors: Where is the evidence. Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets. 21 (3), 150-161 (2021).
  35. Rotariu, D., et al. Oxidative stress - complex pathological issues concerning the hallmark of cardiovascular and metabolic disorders. Biomed Pharmacother. 152, 113238(2022).
  36. Hosseini, E., Ghasemzadeh, M., Atashibarg, M., Haghshenas, M. R. O. S. scavenger, n-acetyl-l-cysteine and NOX specific inhibitor, VAS2870 reduce platelets apoptosis while enhancing their viability during storage. Transfusion. 59 (4), 1333-1343 (2019).
  37. Hosseini, E., Nodeh, F. K., Ghasemzadeh, M. Gamma irradiation induces a pro-apoptotic state in longer stored platelets, without progressing to an overt apoptosis by day 7 of storage. Apoptosis. 28 (7-8), 1141-1153 (2023).
  38. Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: A scientific statement from the American heart association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
  39. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
  40. Hempel, S. L., Buettner, G. R., O'malley, Y. Q., Wessels, D. A., Flaherty, D. M. Dihydrofluorescein diacetate is superior for detecting intracellular oxidants: Comparison with 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, 5(and 6)-carboxy-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, and dihydrorhodamine 123. Free Radic Biol Med. 27 (1-2), 146-159 (1999).
  41. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: Challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
  42. Burkitt, M. J., Wardman, P. Cytochrome c is a potent catalyst of dichlorofluorescin oxidation: Implications for the role of reactive oxygen species in apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 282 (1), 329-333 (2001).
  43. Rota, C., Fann, Y. C., Mason, R. P. Phenoxyl free radical formation during the oxidation of the fluorescent dye 2',7'-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase. Possible consequences for oxidative stress measurements. J Biol Chem. 274 (40), 28161-28168 (1999).
  44. Rota, C., Chignell, C. F., Mason, R. P. Evidence for free radical formation during the oxidation of 2'-7'-dichlorofluorescin to the fluorescent dye 2'-7'-dichlorofluorescein by horseradish peroxidase: Possible implications for oxidative stress measurements. Free Radic Biol Med. 27 (7-8), 873-881 (1999).
  45. Rodig, S. J. Attaching suspension cells to slides for staining. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (12), (2020).
  46. Abubaker, A. A., Vara, D., Eggleston, I., Canobbio, I., Pula, G. A novel flow cytometry assay using dihydroethidium as redox-sensitive probe reveals NADPH oxidase-dependent generation of superoxide anion in human platelets exposed to amyloid peptide beta. Platelets. 30 (2), 181-189 (2019).
  47. Gaspar, R. S., et al. Protein disulphide isomerase and NADPH oxidase 1 cooperate to control platelet function and are associated with cardiometabolic disease risk factors. Antioxidants (Basel). 10 (3), 497(2021).
  48. Gaspar, R. S., Ferreira, P. M., Mitchell, J. L., Pula, G., Gibbins, J. M. Platelet-derived extracellular vesicles express NADPH oxidase-1 (NOX-1), generate superoxide and modulate platelet function. Free Radic Biol Med. 165, 395-400 (2021).
  49. Vara, D., et al. NADPH oxidase 1 is a novel pharmacological target for the development of an antiplatelet drug without bleeding side effects. FASEB J. 34 (10), 13959-13977 (2020).
  50. Lopes-Pires, M. E., et al. Zinc regulates reactive oxygen species generation in platelets. Platelets. 32 (3), 368-377 (2021).
  51. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and mitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: Another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
  52. Linden, M. D. Platelet flow cytometry. Methods Mol Biol. 992, 241-262 (2013).
  53. Kauffman, M. E., et al. MitoSOX-based flow cytometry for detecting mitochondrial ROS. React Oxyg Species (Apex). 2 (5), 361-370 (2016).
  54. Sonkar, V. K., et al. NOX2 NADPH oxidase is dispensable for platelet activation or arterial thrombosis in mice. Blood Adv. 3 (8), 1272-1284 (2019).
  55. Dikalov, S. I., Kirilyuk, I. A., Voinov, M., Grigor'ev, I. A. EPR detection of cellular and mitochondrial superoxide using cyclic hydroxylamines. Free Radic Res. 45 (4), 417-430 (2011).
  56. Dikalov, S. I., Polienko, Y. F., Kirilyuk, I. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Superoxide Anion DetectionPlatelet FunctionReactive Oxygen SpeciesFlow CytometryDihydroethidium ImagingElectron Paramagnetic ResonancePlatelet Rich PlasmaSpin Probe QuantificationPlatelet AdhesionNADPH Oxidases

Похожие статьи