Методическая статья

Дрожжи деления как платформа для антибактериального скрининга лекарств, нацеленных на белки цитоскелета бактерий

1.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66657

⸱

26 апреля 2024 г.

 ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, National Institute of Science Education and Research, 2Homi Bhabha National Institutes

В этой статье

Краткое содержание

Дрожжи деления используются здесь в качестве гетерологичного хозяина для экспрессии бактериальных цитоскелетных белков, таких как FtsZ и MreB, в качестве трансляционных гибридных белков с GFP для визуализации их полимеризации. Кроме того, соединения, влияющие на полимеризацию, идентифицируются с помощью визуализации с помощью флуоресцентного микроскопа.

Аннотация

Бактериальные цитоскелетные белки, такие как FtsZ и MreB, выполняют важные функции, такие как деление клеток и поддержание их формы. Кроме того, FtsZ и MreB стали важными мишенями для открытия новых противомикробных препаратов. Было разработано несколько анализов для идентификации соединений, нацеленных на связывание нуклеотидов и полимеризацию этих белков цитоскелета, в первую очередь ориентированных на FtsZ. Более того, многие из анализов являются либо трудоемкими, либо дорогостоящими, и выяснение того, являются ли эти белки клеточной мишенью препарата, часто требует нескольких методов. Наконец, токсичность препаратов для эукариотических клеток также представляет проблему. Здесь мы описываем одноэтапный клеточный анализ для обнаружения новых молекул, нацеленных на бактериальный цитоскелет, и минимизации попаданий, которые могут быть потенциально токсичными для эукариотических клеток. Дрожжи деления поддаются высокопроизводительному скринингу, основанному на микроскопии, и визуальный экран может легко идентифицировать любую молекулу, которая изменяет полимеризацию FtsZ или MreB. В нашем анализе используется стандартный 96-луночный планшет, и он полагается на способность бактериальных цитоскелетных белков полимеризоваться в эукариотической клетке, такой как дрожжи деления. Хотя описанные здесь протоколы предназначены для дрожжей деления и используют FtsZ из золотистого стафилококка и MreB из кишечной палочки, они легко адаптируются к другим бактериальным белкам цитоскелета, которые легко собираются в полимеры в любых эукариотических экспрессирующих хозяевах. Описанный здесь метод должен помочь в дальнейшем открытии новых противомикробных препаратов, нацеленных на бактериальные цитоскелетные белки.

Введение

Широко распространенная устойчивость почти ко всем антибиотикам, используемым в настоящее время для борьбы с бактериальными инфекциями, создала немедленную потребность в новых категориях антибиотиков. В отчете за 2019 год указано, что устойчивые к антибиотикам инфекции привели к потере 1,27 миллиона жизней, что в общей сложности составило 4,95 миллиона смертей, если учитывать осложнения от резистентных бактериальных инфекций1. Несмотря на то, что антибиотики по-прежнему эффективны в клинической практике, они преимущественно нацелены на узкий спектр клеточных процессов, в первую очередь фокусируясь на клеточной стенке, ДНК и синтезе белка. За последние полвека менее 30 белков были коммерчески использованы в качестве мишеней для разработки новыхантибактериальных 2,3. Этот ограниченный диапазон жизнеспособных мишеней значительно ограничивает открытие новых антибиотиков или их производных для борьбы с устойчивыми к антибиотикам бактериями. Таким образом, для преодоления возникающей проблемы устойчивости к антибиотикам существует необходимость в разработке новых антибиотиков с новыми мишенями и механизмами действия.

Антибактериальная мишень в идеале должна быть важным компонентом роста бактериальных клеток, сохраняться у филогенетически разнообразных видов, демонстрировать наименьшую эукариотическую гомологию и быть доступной дляантибиотиков. С момента открытия бактериальных белков цитоскелета, участвующих в делении и поддержании клеточной формы, они стали многообещающим центром для разработкиантибактериальных соединений. Эти белки необходимы для жизнеспособности бактерий и играют ключевую роль в поддержании формы клеток (MreB, CreS), делении (FtsZ, FtsA) и сегрегации ДНК (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), сродни цитоскелету в эукариотических клетках. Примечательно, что FtsZ демонстрирует удивительно высокий уровень сохранения в широком спектре прокариотических организмов, в то время как MreB обнаружен почти во всех палочковидных бактериях. Такое широкое распространение и значимость для жизнеспособности клеток делают эти белки увлекательной мишенью в исследованиях антибиотиков 5,6,7.

Крайне важно принять многосторонний подход, который сочетает в себе наблюдения in vivo, взаимодействия in vitro и ферментативные эксперименты для тщательной проверки белков цитоскелета бактерий в качестве основной мишени потенциального ингибитора7. Трудоемкие процедуры или значительные затраты затрудняют многие доступные анализы для этой цели. Это заметные препятствия для их широкого использования в скрининге соединений свинца, которые могут повлиять на цитоскелет бактерий. Среди них микроскопия выделяется как исключительно эффективный и быстрый метод оценки эффективности соединений путем непосредственного изучения изменений в морфологии клеток. Тем не менее, гетероассоциация белка-мишени с другими комплексами цитоскелета, косвенные эффекты из-за нецелевого связывания и изменений мембранного потенциала, трудности в эффективном проникновении в клетку и наличие насосов оттока, особенно у грамотрицательных бактерий, в совокупности затрудняют точное определение причины деформации бактериальной клетки 8,9,10.

Schizosaccharomyces pombe, или дрожжи деления, как их обычно называют, представляют собой палочковидный одноклеточный эукариотический организм. Дрожжи деления широко используются в качестве модельного организма в клеточной и молекулярной биологии из-за необычайного сохранения в клеточных процессах, таких как клеточный цикл и деление, клеточная организация и репликация хромосом с высшими эукариотами, включая человека11,12. Кроме того, Эррингтон и коллеги экспрессировали локализованный на полюсе бактериальный цитоскелетный белок DivIVA в дрожжах деления, чтобы продемонстрировать, что DivIVA накапливается на отрицательно изогнутых поверхностях13. Опять же, Баласубраманиан и его коллеги впервые установили дрожжи деления в качестве клеточной модельной системы, чтобы по-новому взглянуть на механизм, сборку и динамику белка цитоскелета актина E. coli, такого как MreB14 и гомолог тубулина FtsZ15. Они также демонстрируют способность A22 эффективно препятствовать полимеризации MreB с помощью эпифлуоресцентной микроскопии при экспрессии в дрожжах14. После этого другие группы также успешно использовали дрожжи деления для изучения свойств сборки белков хлоропластов FtsZ1 и FtsZ216. Совсем недавно мы установили доказательство жизнеспособности использования дрожжей деления в качестве клеточной платформы для специфического скрининга бактериальных ингибиторов цитоскелета, проведя всестороннюю оценку воздействия трех известных ингибиторов FtsZ — сангвинарина, берберина и PC190723 — на белки FtsZ, полученные из двух патогенных бактерий, а именно Staphylococcus aureus и Helicobacter pylori17. Кроме того, этот одноэтапный клеточный анализ играет важную роль в минимизации риска выявления соединений, которые могут быть потенциально токсичными для эукариотических клеток.

В этом отчете, используя систему деления дрожжей, мы предлагаем систематический рабочий процесс с использованием стандартного 96-луночного планшета для полуавтоматического скрининга и количественной оценки эффекта низкомолекулярных ингибиторов, нацеленных на FtsZ из Staphylococcus aureus и MreB из Escherichia coli. Здесь мы настраиваем и оптимизируем полуавтоматический рабочий процесс с использованием установленных ингибиторов PC190723 и A22, которые специально нацелены на FtsZ и MreB соответственно. В этом рабочем процессе используется эпифлуоресцентный микроскоп, оснащенный моторизованным высокоточным столиком, и автоматический сбор изображений в стандартном 96-луночном планшете для улучшения текущей стандартизации. Следовательно, его можно применять как для средних, так и для высокопроизводительных экранов библиотек синтетических химических веществ и обходит некоторые из перечисленных выше проблем.

Протокол

1. Экспрессия GFP-меченых белков бактериального цитоскелета у S. pombe

ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, смотрите Таблицу 1 для получения информации обо всех плазмидах и штаммах, используемых здесь. Пожалуйста, смотрите Таблицу 2 для всех медиа-композиций.

  1. Клонирование E. coli MreB с N-концевым слиянием GFP (GFP-MreB) и S. aureus FtsZ, несущим C-концевой GFP (SaFtsZ-GFP), в вектор экспрессии S. pombe, pREP42 с тиамино-репрессируемым промотором средней силы, nmt4118,19, как описано ранее14,15. Поддерживайте, амплифицируйте и изолируйте плазмиды из штаммов E. coli (DH10β), как описано в20,21.
    Другие штаммы E. coli , такие как DH5α, XL1Blue, TOP10 и т.д., или другие коммерчески доступные компетентные клетки, обычно используемые для молекулярного клонирования, также могут быть использованы.
  2. Трансформация плазмид pREP42-GFP-EcMreB и pREP42-SaFtsZ-GFP в S. pombe
    1. Преобразовать плазмиды pCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) и pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) в штамм S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18) с использованием метода22 ацетата лития, как указано в следующих шагах.
    2. День 1 - Первичная культура: Инокулируйте полную петлю свежеочищенной культуры S. pombe в 3 мл автоклавного дрожжевого экстракта и бульона добавок (YES). Инкубируйте его в орбитальном шейкере при 30 °C в течение ночи (O/N).
    3. День 2:
      1. Вторичная культура: Добавьте около 500 μл первичной культуры к 30 мл автоклавного бульона YES. Выдерживают при 30 °C в течение 3 - 4 ч с встряхиванием до достижения наружного диаметра600 0,4 - 0,6.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого преобразования используется 30 мл.
      2. Гранулируйте 30 мл культуры при 2 500 х г в течение 6-8 мин при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте клетки 50 мл стерильной дистиллированной воды (D/W). Снова вылейте гранулы и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 1 мл стерильного D/W и перенесите его в центрифужную пробирку объемом 2 мл. Центрифуга, как указано выше, и выбросьте надосадочную жидкость.
      3. Добавьте 1 мл 0,1 М ацетата лития, раствор Tris-EDTA (LiAc-TE) и центрифугу, как указано выше. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте в 1 мл 0,1 М LiAc-TE. Центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость, оставив 100 μл раствора.
      4. Добавьте 10 - 20 мкг ДНК-носителя (ДНК спермы лосося; денатурированная и охлажденная на льду) и 2 - 3 мкг плазмидной ДНК, которую необходимо трансформировать. Аккуратно перемешайте. Выдерживать при комнатной температуре в течение 10 мин.
      5. Добавьте 260 μл 40 % PEG/LiAc-TE; Аккуратно перемешайте. Выдерживать в течение 60 минут в шейкере или термомиксере при температуре 30 °C при бережном перемешивании. Добавить 43 μл ДМСО; Аккуратно перемешайте.
      6. Тепловой шок при 42 °C в течение 10 минут в термомиксере. Гранулы при 2 500 х г в течение 6-8 мин и выбросьте надосадочную жидкость. Промойте гранулу 1 мл стерильного D/W.
      7. Гранулы, удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать гранулу в 200 мкл стерильного D/W. Планшет 100 мкл на планшетах Edinburgh minimal medium (EMM), содержащих 5 мкг/мл тиамина (для подавления промотора nmt41 ) и аминокислотных добавок аденина (0,225 мг/мл), гистидина (0,225 мг/мл) и лейцина (0,225 мг/мл), но без урацила (маркер отбора для плазмиды pREP42).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Поочередно пластины 70 μL и 130 μL в двух разных планшетах. Два разных объема (70 мкл и 130 мкл) покрываются для получения изолированных колоний по крайней мере на одном из планшетов в зависимости от эффективности трансформации, которая может варьироваться от эксперимента к эксперименту.
      8. Инкубируйте планшеты при 30 °C в течение 2-3 дней до появления колоний. Смешайте одну колонию со 100 мкл стерильного D/W и разложите на свежей чашке EMM, содержащей тиамин, но без урацила, как описано выше.
      9. Выдерживают при 30 °C в течение 2-3 дней, пока не появится полноценный газон. Выросшую лужайку клеток измельчите с помощью инокуляционной петли и повторно суспендируйте в 1 мл среды YES, содержащей 30% глицерина, в криофлаконе.
      10. Мгновенно заморозьте криопробирку в жидком азоте и храните при температуре -80 °C, чтобы сохранить замороженные запасы дрожжей.
  3. Экспрессия белков цитоскелета бактерий в дрожжах деления
    1. Асептически нанесите пластырь из глицеринового бульона на свежую дрожжевую пластину, чтобы получить достаточно культуры для дальнейших экспериментов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае pREP42 мы использовали агаровую пластину EMM (минимальная среда), содержащую аденин, гистидин и лейцин (как при использовании штамма S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18)) без урацила (урацил, присутствующий в pREP42 в качестве маркера отбора). Мы добавляем 15 - 20 мкМ тиамина в агаровые пластины (так как pREP42 имеет тиаминовый репрессируемый промотор nmt41 ), чтобы подавить экспрессию интересующего гена при росте на пластине.
    2. Инокулируйте небольшую петлю инокулята из полосчатого участка в 5 мл дрожжеспецифичной среды EMM, в которой отсутствует тиамин, и инкубируйте в течение 10-12 ч при 30 °C.
      Экспрессия FtsZ и MreB у различных видов под промотором nmt41 у S. pombe может варьировать, обычно от 16 до 30 ч. Оптимальное время экспрессии белков GFP-EcMreB и SaFtsZ-GFP в S. pombe составляет 20 - 24 ч и 16 - 20 ч при 30 °С, соответственно, без тиамина.

2. Обработка культур S. pombe , экспрессирующих GFP-меченые бактериальные цитоскелетные белки

ПРИМЕЧАНИЕ: Ряд различных молекул лекарственного препарата тестируется на культуре дрожжей, выращенной за ночь, в 96-луночном планшете.

  1. Инокулировать свежую культуру путем переноса 50 мкл ночной культуры в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего 150 мкл свежей дрожжевой среды EMM, с помощью полуавтоматического 96-луночного многоканального пипетирования.
  2. Во время пипетирования внутрь и наружу для правильного смешивания с помощью полуавтоматической 96-луночной многоканальной пипетки медленно вводите различные возрастающие концентрации лекарственных препаратов в растущую культуру, каждая из которых выполняется в трех экземплярах, как показано на схеме на рисунке 1.
  3. В качестве положительного контроля используют уже известные препараты, PC190723 для (S. aureus FtsZ) и А22 (для E. coli MreB) в двух экземплярах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как сообщалось ранее, PC190723 и А22 использовали в концентрации 56,2мкМ17 и 72,6 мкМ 14,17 соответственно. Между тем, лечение A22 SaFtsZ и лечение PC190723 EcMreB служили отрицательным контролем соответственно.
  4. Используйте ДМСО в качестве растворителя в трех различных концентрациях в соответствии с самой низкой и самой высокой концентрацией лекарств.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Растворитель, в котором растворяются лекарственные средства, используется в качестве средства контроля растворителя.
  5. Инкубируют контрольную и обработанную культуры при 30 °С в течение 6-10 ч (до тех пор, пока клетки не проявят экспрессию бактериальных флуоресцентных белков), а затем визуализируют с помощью эпифлуоресцентной микроскопии.

3. Визуализация полимеров

  1. Нанесите покрытие из 20 мкл конканавалина А 1 мг/мл на каждую лунку 96-луночного планшета с оптически прозрачным дном (с черными стенками для флуоресцентной визуализации) и инкубируйте в течение 20 мин при комнатной температуре. Аспирируйте жидкость и дайте ей высохнуть на воздухе в течение 10 минут.
  2. Перенесите 20 μл клеток из культивального планшета в каждую соответствующую лунку и оставьте на 10 минут. Промойте ячейку 3x-4x стерильным средой EMM.
  3. Установив объектив, который будет использоваться (см. шаг 3.6), используйте режим навигатора на панели сбора данных программного обеспечения для получения изображений для выравнивания 96-луночных планшетов и покрытия лунок. Выровняйте кромки колодцев в навигаторе.
  4. Затем выберите параметры покрытия скважины, которые включают в себя многопозиционный выбор интересующей области в скважине, и используйте адаптивное управление автофокусировкой с режимом по требованию, чтобы образец оставался в фокусе во время визуализации.
  5. Получение изображений с помощью дифференциального интерференционного контраста (DIC) и флуоресценции. Установите фильтры возбуждения и излучения с длиной волны 475/28 нм и 525/48 нм соответственно для визуализации бактериальных белков, меченных GFP, экспрессируемых в дрожжах. Получение Z-стеков с шагом 0,2 мкм по толщине дрожжевых клеток (5 мкм).
  6. Получение изображений с помощью инвертированного эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного 100-кратным масляным иммерсионным объективом 1,4 NA и камерой 2 000 x 2 000 sCMOS (размер пикселя 6,5 μм x 6,5 μм). Используйте светодиодную систему подсветки для возбуждения флуорофора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подойдет любая система эпифлуоресцентного микроскопа, имеющая моторизованный предметный столик для 96-луночного планшета с точным многоточечным позиционированием. Получите все изображения клеток контрольной и обработанной лекарственными препаратами с одинаковым временем экспозиции (обычно в диапазоне 0,3 - 0,5 с) при группировании 1 x 1 и освещенности 15% - 20%, чтобы свести к минимуму экспериментальные переменные и сохранить согласованность.

4. Количественная оценка изображений с помощью ImageJ

  1. Обработка изображений клеток и измерение количества пятен на ячейку и плотности для FtsZ17. В случае MreB измеряют плотность и анизотропию23 и сравнивают контрольные и обработанные клетки с помощью Fiji (v2.0.0-rc-69/1.52p)24.
  2. Используя изображения из канала DIC, сначала обведите отдельные дрожжевые клетки с помощью инструмента рисования от руки и сохраните как область интереса (ROI) в менеджере ROI. Этот шаг еще не автоматизирован, но недавно разработанные инструменты с использованием машинного обучения25,26 могут быть опробованы и внедрены в ближайшем будущем.
  3. Замаскируйте внешнюю область ячейки и залейте ее черным цветом, как описано впункте 27.
  4. Используйте макрос анализа порога OPS IJ1, встроенную функцию на Фиджи, чтобы подсчитать количество пятен24.
  5. Используйте метод оцу для автоматического порогирования и маскируйте сегментированные частицы. Запустите плагин для анализа частиц с помощью макроса.
  6. Для измерения плотности полимера (количества цитоскелета на единицу площади в клетке) обрабатывают изображения, как описано, включая стадии маскирования и скелетирования27,28. Используйте Lpx 2Dfilter в плагине lpx для скелетирования изображений.
  7. Для получения подробной информации ознакомьтесь с этой недавней публикацией17. Выполните количественное определение полимера EcMreB, как ранее упоминалось впункте 23, используйте анизотропию для количественного определения пространственной организации с помощью инструмента FibrilTool29 , как описано ранеев пункте 23.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти методы анализа могут быть использованы для количественного определения любых других бактериальных белков цитоскелета, которые обрабатываются или не обрабатываются препаратами.

Результаты

Установка 96-луночного планшета для скрининга лекарств
Использование S. pombe для экспрессии C-концевого GFP-меченного S. aureus FtsZ из вектора (pREP42), содержащего тиаминовый репрессируемый промотор nmt41средней концентрации, было установлено ранее17, и аналогичным образом MreB E. coli, меченный N-концевым GFP, также экспрессировался у S. pombe14. Мы также показали, что PC190723, специфический ингибитор SaFtsZ, и A22, ингибитор MreB, могут оказывать свое действие на соответствующие бактериальные цитоскелетные белки специфическим образом при экспрессии в дрожжах14,17.

Здесь мы предлагаем использовать систему экспрессии дрожжей для разработки средне- или высокопроизводительного скрининга антибактериальных препаратов, нацеленных на белки цитоскелета бактерий. Эпифлуоресцентный микроскоп с моторизованным предметным столиком может быть автоматизирован для получения изображений 96-луночного планшета, а коммерческие библиотеки лекарств также легко доступны в форматах 96-луночных планшетов. Поэтому мы предпочитаем использовать 96-луночный планшет для предлагаемого скрининга лекарств. Пластины устанавливаются, как показано на рисунке 1. Первый ряд (рис. 1A) состоит из SaFtsZ-GFP, экспрессирующих дрожжевую культуру. Второй ряд (рис. 1B) состоит из культур дрожжей, экспрессирующих GFP-EcMreB. Первые два столбца первых двух строк (A1:B2) заданы как пустые. Следующие шесть столбцов первых двух строк (А3:В12) установлены в качестве контроля ДМСО с тремя различными концентрациями в соответствии с разведениями препарата в двух экземплярах. Затем PC190723 (56,2 мкМ) и А22 (72,6 мкМ) добавляют к дрожжевым клеткам, экспрессирующим SaFtsZ-GFP или GFP-EcMreB. PC190723 и A22 служат положительным контролем для FtsZ и MreB соответственно. Все остальные лунки (C1:F12) используют для добавления различных лекарственных препаратов (в трех различных концентрациях и в двух экземплярах), используемых в скрининге для идентификации эффекторов белков цитоскелета бактерий, SaFtsZ или EcMreB. Культуры дрожжей, экспрессирующие помеченные GFP SaFtsZ или MreB, дозируют в эти 96-луночные планшеты и выращивают до тех пор, пока не будет визуализировано влияние лекарств на сборку полимеров.

Оценка влияния роста на дрожжевые клетки
После инкубации 96-луночных субкультивируемых клеток при 30 °C в течение 6–10 ч оптическую плотность (OD) культуры дрожжей измеряют с помощью считывателя микропланшетов. Измерение OD помогает оценить любое ингибиторное действие препаратов против эукариотических дрожжевых клеток и, возможно, вредное воздействие на клетки человека. Таким образом, этот анализ может быть использован для скрининга нескольких лекарств на основе их токсичности в дрожжевой системе. Однако ни PC190723, ни A22 не проявляют каких-либо эффектов роста или токсичности для дрожжевых клеток, и OD600 культур, экспрессирующих SaFtsZ-GFP, обработанных DMSO, PC190723 или A22, составлял 0,38 ± 0,03, 0,44 ± 0,02 и 0,43 ± 0,06 (N≥4), соответственно. Аналогичным образом, ОР600 культур, экспрессирующих GFP-EcMreB и обработанных ДМСО, PC190723 или А22, составлял 0,38 ± 0,04, 0,44 ± 0,07 и 0,41 ± 0,08 (N≥4), соответственно.

Визуализация влияния препаратов на полимерные структуры, собранные SaFtsZ и EcMreB, экспрессируемые у S. pombe
Для оценки влияния лекарственных средств на полимеризацию SaFtsZ или EcMreB аликвоту дрожжевых клеток из вышеупомянутого 96-луночного планшета, содержащего лекарственные средства, переносят на другой 96-луночный планшет с оптически прозрачным дном 96-лунки, пригодный для флуоресцентной визуализации. Этот 96-луночный планшет также покрыт конканавалином А, чтобы обеспечить адгезию дрожжевых клеток, экспрессирующих помеченные GFP SaFtsZ или EcMreB. 96-луночный планшет визуализируется с помощью эпифлуоресцентного микроскопа, охватывающего все 96 лунок планшета в заданных положениях, контролируемых программным обеспечением для получения изображений (рис. 2). В контрольных лунках (обработанных ДМСО) дрожжевые клетки, экспрессирующие SaFtsZ-GFP, показали полимерные структуры в виде пятен или участков, распределенных по клеткам, через 16-18 ч роста в отсутствие тиамина. Однако через 10-12 ч после роста при недостатке тиамина клетки демонстрировали только диффузную флуоресценцию или небольшое количество участков, что позволяет предположить, что экспрессия FtsZ-GFP не достигла критической концентрации, необходимой для полимеризации (рис. 3A). Напротив, стабилизирующий препарат FtsZ, PC190723, показал значительное увеличение полимерных структур (пятен или участков) SaFtsZ-GFP по сравнению с контролем ДМСО через 12 ч роста (рис. 3B), выступая в качестве положительного контроля. Напротив, клетки, обработанные A22, не показали различий в собранных структурах SaFtsZ-GFP (рис. 3C). Однако, в отличие от культур, обработанных PC190723, SaFtsZ-GFP собирался в участки в необработанных культурах только при индуцировании в течение более длительных периодов времени, показывая, что PC190723 действует на снижение критической концентрации полимеризации SaFtsZ (рисунок 3D). Аналогичным образом, GFP-EcMreB, выраженный в S. pombe, образует линейные массивы длинных нитей вдоль продольной оси делящихся дрожжей (рисунок 4A). В то время как было обнаружено, что PC190723 не оказывает влияния на полимеризацию EcMreB (рис. 4B), обработка клеток A22 привела к диффузной флуоресценции по всей цитоплазме дрожжевых клеток (рис. 4C). Изображения с остальных 96-луночных планшетов визуально проверяются на предмет любых стабилизирующих или ингибирующих эффектов препаратов на SaFtsZ или EcMreB, в зависимости от обстоятельств.

Влияние препаратов на сборку бактериальных цитоскелетных белков может быть затем количественно оценено с помощью инструментов анализа изображений и плагинов в ImageJ или на Фиджи, как сообщалось ранее для SaFtsZ17 и EcMreB21. Автоматическое получение изображений в формате 96-луночных планшетов и реализация пользовательских макросов и сценариев для обработки изображений могут ускорить время визуализации и количественной оценки эффектов лекарств. Таким образом, используя одноклеточные эукариотические дрожжи S. pombe в качестве системы-хозяина, мы предполагаем, что можно успешно провести скрининг малых молекул, нацеленных на бактериальные цитоскелетные белки, что в конечном итоге приведет к открытию новых антибиотиков.

figure-results-1
Рисунок 1: Схема, показывающая использование дрожжевых клеток деления для скрининга лекарств, нацеленных на сборку бактериальных цитоскелетных белков SaFtsZ или EcMreB. FtsZ из S. aureus и MreB из E. coli были клонированы в вектор экспрессии дрожжей, pREP42 имел метку GFP на C- и N-концах соответственно, и трансформировались в S. pombe для фенотипического и лекарственного исследования. Культуры выращивали в течение 8 - 12 ч. Впоследствии культуры субкультивировали в 96-луночных планшетах с соответствующим контролем и различными скрининговыми препаратами. Далее планшет инкубировали при 30 °С в течение 6-8 ч до тех пор, пока наружный диаметр600 не достигнет 0,5-0,6, а оптическую плотность измеряли с помощью считывателя микропланшетов для оценки токсичности лекарственных препаратов для дрожжевых клеток. Другой 96-луночный планшет с оптически прозрачным стеклянным дном был предварительно покрыт конканавалином А для приклеивания дрожжевых клеток. Этот 96-луночный планшет использовался для визуализации и получения изображений с помощью эпифлуоресцентного микроскопа. Затем полученные изображения были проанализированы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Схема программного обеспечения для получения изображений для автоматизированной визуализации 96-луночного планшета. С помощью навигатора в программном обеспечении для получения изображений 96-луночный планшет был выровнен путем маркировки краев. Параметры охвата скважины, такие как количество изображений, которые необходимо сделать из каждой скважины, и ее местоположение (случайное или из центра скважины), были выбраны по желанию. Наконец, параметры изображения, такие как используемый фильтр (DIC и FITC-фильтр; Были установлены Ex 475/28 нм и Em 525/48 нм), процент интенсивности освещения, освещенности, освещенности, автофокус и время экспозиции для захвата изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Визуализация влияния препаратов PC190723 и A22 на SaFtsZ-GFP, экспрессируемую в S. pombe. Культуру S. pombe, экспрессирующую SaFtsZ-GFP, выращивали в отсутствие тиамина в течение 8-9 ч при 30 °C перед ДМСО и медикаментозным лечением. В дальнейшем культуру выращивали в 96-луночном планшете в течение 7-9 ч при 30 °С в присутствии или отсутствии лекарств. (А) В контроле ДМСО, где было добавлено эквивалентное количество ДМСО, клетки демонстрировали несколько полимерных структур. (B) В присутствии PC190723 (56,2 мкМ) SaFtsZ экспрессирует дрожжевые клетки, демонстрируя значительное увеличение полимерных структур, чем у контроля ДМСО. (C) Ингибитор MreB, A22 (72,6 мкМ), не влиял на структуры SaFtsZ-GFP. (D) Для сборки SaFtsZ-GFP в отсутствие PC190723 необходимы более длительные часы экспрессии белка, и, следовательно, контрольные культуры, выращенные при 30°С в течение 12-15 ч после субкультивирования в 96-луночном планшете, содержащем ДМСО, также демонстрируют полимеры FtsZ. Масштабная линейка составляет 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Визуализация влияния препаратов PC190723 и А22 на GFP-EcMreB, экспрессируемый в S. pombe. Культуру S. pombe, экспрессирующую GFP-EcMreB, выращивали в отсутствие тиамина в течение 9-11 ч при 30 °C перед добавлением ДМСО или препаратов (А22 или PC190723). В дальнейшем культуру выращивали в 96-луночном планшете в течение 8-10 ч при 30 °С с лекарственными препаратами в качестве контроля и без них. (А) В культурах, где эквивалентное количество ДМСО было добавлено в качестве контроля, клетки демонстрировали линейные нити EcMreB, ориентированные вдоль продольной оси дрожжевых клеток. (B) Сборка GFP-EcMreB не влияла в культурах, обработанных PC190723 (56,2 мкМ). (C) Малая молекула A22 (72,6 μM), известный ингибитор полимеризации MreB, предотвращает сборку GFP-EcMreB в дрожжевых клетках деления. Масштабная линейка составляет 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Штаммы и плазмиды, использованные в этом исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Таблица 2: Состав среды и буферов, использованных в данном исследовании. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Обсуждение

Устойчивость к противомикробным препаратам (УПП) представляет собой серьезную глобальную угрозу здоровью, и существует острая потребность в новых антибиотиках с новыми мишенями. Бактериальный цитоскелет стал привлекательной мишенью для разработки новых антибиотиков, с низкомолекулярными ингибиторами белка клеточного деления FtsZ, такими как TXA709, уже в фазе Iклинических испытаний. Разработано несколько методов идентификации ингибиторов полимеризации FtsZ 7,31. Недавно мы использовали эукариотические дрожжи деления в клеточном анализе, чтобы показать, что стабилизирующий препарат FtsZ, PC190723, может быть нацелен на HpFtsZ17. Более того, мы также показали, что, хотя такие препараты, как берберин и сангвинарин, влияют на полимеризацию FtsZ, они также влияют на морфологию дрожжевых клеток. Вдохновленные этими исследованиями и наблюдениями, мы решили разработать одноэтапный клеточный анализ для скрининга низкомолекулярных модуляторов бактериального цитоскелета с использованием платформы экспрессии делящихся дрожжей. Поскольку скрининг основан на ингибировании сборки GFP-меченых белков цитоскелета, малые молекулы, обладающие аналогичными свойствами флуорофора, могут привести к ложноположительным результатам. Отказ от фильтров с длинными фильтрами и выбор фильтров с узкой полосой пропускания может помочь уменьшить количество ложных срабатываний, возникающих из-за флуоресцентных малых молекул. Здесь мы показываем шаги, связанные с настройкой скрининга средней пропускной способности с использованием эпифлуоресцентного микроскопа, оснащенного 96-луночным держателем планшетного предметного столика, который можно использовать для скрининга лекарств, нацеленных на SaFtsZ или EcMreB. Рабочий процесс включает в себя полуавтоматический сбор и анализ изображений, которые в будущем могут быть легко масштабированы до высокопроизводительных экранов с помощью роботизированных систем работы с жидкостями и конвейеров обработки изображений.

Кроме того, скрининг должен быть полезен для других бактериальных цитоскелетных белков, таких как актин-складка, содержащая плазмидный поддерживающий белок ParM32, и против любого белка, который собирается в полимерные структуры в дрожжах деления. Однако оптимальные уровни экспрессии для каждого интересующего белка должны быть стандартизированы перед использованием в любых скринингах лекарственных средств. В то время как для FtsZs мы обнаружили, что nmt41 является оптимальным промотором, для других белков, представляющих интерес, более сильной или слабой версией промотора nmt1 (сила промотора (и негерметичность): nmt1 > nmt41 > nmt81) или других конститутивных промоторов, таких как дрожжи adh1 или act118,33 могут быть предприняты попытки получения оптимальных уровней экспрессии и сборки полимерных структур. Более того, при использовании эписомальных плазмид вариации числа копий от клетки к клетке также создают проблемы для однородной экспрессии генов. Чтобы обойти эти проблемы, недавнобыло разработано несколько векторов, которые могут быть интегрированы в геном делящихся дрожжей (SIV для векторов стабильной интеграции), несущих промоторы различной силы. Использование этих векторов может дать более однородные и количественные результаты по сравнению с эписомальными векторами, используемыми в данном исследовании. Использование SIV может избежать большой гетерогенности в уровнях экспрессии, рассматриваемой как изменение интенсивности флуоресценции в клетках, и должно лучше подходить для высокопроизводительных скринингов.

Кроме того, такие препараты, как PC190723, стабилизируют полимеры FtsZ, что приводит к более ранней сборке нитей FtsZ по сравнению с необработанными клетками. В то время как скрининг подходит для скрининга препаратов, ингибирующих полимеризацию бактериальных цитоскелетных белков, из-за визуальной оценки диффузной флуоресценции в конечной точке, скрининг препаратов, стабилизирующих полимеры FtsZ, требует дальнейшей оптимизации уровней экспрессии белков и времени, необходимого для достижения максимального числа клеток, имеющих полимеры. Таким образом, крайне важно иметь разумную оценку времени, необходимого для экспрессии белка для достижения критической концентрации, необходимой для сборки, и соответствующим образом определить конечную точку для анализа. В случае лекарственных препаратов, которые могут снижать критическую концентрацию, необходимую для полимеризации белка, выбор конечной точки, как правило, будет временем, в течение которого значительная популяция необработанных клеток проявляет диффузную флуоресценцию, но культуры, обработанные лекарственными препаратами, будут демонстрировать полимерные сборки.

Одним из ограничений, которое также является трудоемким этапом рабочего процесса, является необходимость идентификации и сегментации отдельных клеток для количественного анализа изображений. В настоящее время в предлагаемой схеме это ручной шаг для идентификации отдельных дрожжевых клеток и назначения области интереса (ROI) для количественной оценки эффекта препаратов. Однако мы предполагаем, что недавно разработанные алгоритмы машинного обучения с использованием обучающих наборов, подобных тем, которые реализованы в ilastik35 , должны свести к минимуму необходимость ручного вмешательства.

Хотя наш подход с использованием дрожжевой платформы полезен для выявления попаданий и потенциальных малых молекул, нацеленных на бактериальный цитоскелет, в конечном итоге необходимо будет проверить их антибактериальную активность с помощью стандартных тестов минимальной ингибирующей концентрации и эффективность на животных моделях. Тем не менее, самая большая проблема для глобального роста устойчивости к противомикробным препаратам (УПП) по-прежнему заключается в проницаемости внешней мембраны грамотрицательных бактерий и многочисленных насосах оттока у многих патогенных видов бактерий. Кроме того, оттоковые насосы в дрожжах деления также могут создавать аналогичные проблемы, и для процесса скрининга могут потребоваться более высокие концентрации лекарственного средства. В качестве альтернативы, штаммы дрожжей деления, которые являются сверхчувствительными к лекарственным препаратам (S. pombe MDR-supML), в результате делеции семи генов множественной лекарственной устойчивости, включая четыре гена транспортера и фактор транскрипции, могут быть использованы в качестве хозяев для скрининга32,33. Для борьбы с растущей устойчивостью к противомикробным препаратам потребуются будущие разработки в области технологий, которые сочетают в себе целенаправленное открытие антибактериальных препаратов и устранение резистентности к общим явлениям, таким как проницаемость мембран.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

SMP, SR и AKS признают стипендии, полученные от Национального института научного образования и исследований, Департамент атомной энергии. RS признает внутреннюю финансовую поддержку со стороны Департамента атомной энергии, и эта работа поддерживается за счет исследовательского гранта RS (BT/PR42977/MED/29/1603/2022) от Департамента биотехнологии (DBT). Авторы также выражают признательность В. Бадиринатху Конкималле за его комментарии, предложения и обсуждения на протяжении всей разработки протокола.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
96 Well CC2 Оптический CVG стерильный, с крышкой. Черная Термо Научная и торговля;
96-луночный планшетCorning  
А22 гидрохлоридсигма SML0471Растворен в ДМСО
АденинFormediumTMDOC0229225 мг/л среды 
Concanavalin A Сигма C5275-5MG
ДМСОСигма 
Эдинбургский минималистичный медиум (EMM Agar или EMM Broth)FormediumTMPMD0210Состав
EDTA Сигма EDS-500G
epMotion® 96 с 2-позиционным слайдеромEppendorf5069000101
HistidineFormediumTMDOC0144225 мг/л среды 
Leica DMi8 инвертированный флуоресцентный микроскопLeica Microsystemsнемецкой компании
LeucineFormediumTMDOC0157225 мг/л среды 
Ацетат лития Сигма 517992-100G
PC190723Merck 344580Растворенный в ДМСО
полиэтиленгликоль (ПЭГ)Sigma 
ТиаминСигмаТ4625Фильтр стерилизованный
Трис-гидрохлоридМП194855
УрацилФормедиумDOC0214225 мг/л среды, Хранить раствор при температуре 36°С; C
YES (Дрожжевой экстракт + добавки) AgarFormediumTMPCM0410Смотрите ниже состав
YES (Дрожжевой экстракт + добавки) BrothFormediumTMPCM0310Смотрите ниже состав
Дрожжи (S. pombe) media 
Дрожжевой экстракт + добавки (YES)
Составg/L
Экстракт дрожжей5
Декстроза30
Агар17
Аденин0,05
L-гистидин0,05
L-лейцин0,05
L-лизин HCl0,05
урацил0,05
><сильный эдинбургский минимальный средний (EMM)
<сильный>Состав<сильный>г/л<сильный>концентрация
фталлат калия 314,7 мМ
Na2HPO4 2.215.5 мМ
NH4Cl 593,5 мМ
глюкозы2% (w/v) или 20 г/л  111 мМ
Соли (запас х 50)20 мл/л (по объему)
Витамины (запас х 1000)1 мл/л (по объему)
Минералы (запас х 10 000)0,1 мл/л (по объему)
<сильно>Соли х х 50  52,5 г/л MgCl2,6H20 (0,26 M) 52,50,26 М
0,735 мг/л CaCl2,2H20 (4,99 мМ) 0,0007354,99 мМ
50 г/л KCl (0,67 М) 500,67 М
2 г/л Na2SO4 (14 л мМ)214,1 мМ
<сильный>Витамины x 1000  1 г/л пантотеновой кислоты 14,20 мМ
10 г/л никотиновой кислоты 1081,2 мМ
10 г/л инозитола 1055,5 мМ
10 мг/л биотина 0,0140,8 & микро; М
<стронг>минералы x 10 000  >борная кислота580,9 мМ
MnSO4   423,7 мМ
ZnSO4,7H2O413,9 мМ
FeCl2,6H2O   27,40 мМ
молибдоновой кислоты 0,42,47 мМ
КИ&нбсп;16,02 мМ
CuSO4,5H2O 0,41,60 мМ
лимонной кислоты 1047,6 мм<
сильный>штаммы/ плазмиды
<сильный>штаммы<сильный>Описание<сильный>Ссылка
CCD190Escherichia coli DH10&бета;  Инвитроген
CCDY4 MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreBSrinivasan et al., 2007
CCDY340CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFPSharma et al., 2023
CCDY346MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3pREP42-GFP-EcMreBSrinivasan et al., 2007
pCCD713pREP42-SaFtsZ-GFPSharma et al., 2023
160376CLS3370317275 смотрите ниже;202398

Ссылки

  1. Antimicrobial Resistance Collaborators. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019: a systematic analysis. Lancet. 399 (10325), 629-655 (2022).
  2. Haselbeck, R., et al. Comprehensive essential gene identification as a platform for novel anti-infective drug discovery. Curr Pharma Des. 8 (13), 1155-1172 (2002).
  3. Wang, J., et al. Discovery of a small molecule that inhibits cell division by blocking FtsZ, a novel therapeutic target of antibiotics. J Biol Chem. 278 (45), 44424-44428 (2003).
  4. Sanchez, S., Demain, A. L. Antibiotics: current innovations and future trends. , Caister Academic Press. (2015).
  5. Vollmer, W. The prokaryotic cytoskeleton: a putative target for inhibitors and antibiotics. Appl Microbiol Biotechnol. 73 (1), 37-47 (2006).
  6. Vollmer, W. Targeting the bacterial Z-ring. Chem Biol. 15 (2), 93-94 (2008).
  7. Kusuma, K. D., Payne, M., Ung, A. T., Bottomley, A. L., Harry, E. J. FtsZ as an antibacterial target: status and guidelines for progressing this avenue. ACS Infect Dis. 5 (8), 1279-1294 (2019).
  8. Kaul, M., Zhang, Y., Parhi, A. K., Lavoie, E. J., Pilch, D. S. Inhibition of RND-type efflux pumps confers the FtsZ-directed prodrug TXY436 with activity against Gram-negative bacteria. Biochem Pharmacol. 89 (3), 321-328 (2014).
  9. Casiraghi, A., Suigo, L., Valoti, E., Straniero, V. Targeting bacterial cell division: A binding site-centered approach to the most promising inhibitors of the essential protein FtsZ. Antibiotics. 9 (2), 69(2020).
  10. Piddock, L. J. V. Multidrug-resistance efflux pumps - not just for resistance. Nat Rev. Microbiol. 4 (8), 629-636 (2006).
  11. Käufer, N. F., Simanis, V., Nurse, P. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe correctly excises a mammalian RNA transcript intervening sequence. Nature. 318 (6041), 78-80 (1985).
  12. Vyas, A., Freitas, A. V., Ralston, Z. A., Tang, Z. Fission yeast Schizosaccharomyces pombe: A unicellular micromammal model organism. Curr Prot. 1 (6), e151(2021).
  13. Edwards, D. H., Thomaides, H. B., Errington, J. Promiscuous targeting of Bacillus subtilis cell division protein DivIVA to division sites in Escherichia coli and fission yeast. EMBO J. 19 (11), 2719-2727 (2000).
  14. Srinivasan, R., Mishra, M., Murata-Hori, M., Balasubramanian, M. K. Filament formation of the Escherichia coli actin-related protein, MreB, in fission yeast. Curr Biol. 17 (3), 266-272 (2007).
  15. Srinivasan, R., Mishra, M., Wu, L., Yin, Z., Balasubramanian, M. K. The bacterial cell division protein FtsZ assembles into cytoplasmic rings in fission yeast. Gene Dev. 22 (13), 1741-1746 (2008).
  16. TerBush, A. D., Osteryoung, K. W. Distinct functions of chloroplast FtsZ1 and FtsZ2 in Z-ring structure and remodeling. J Cell Biol. 199 (4), 623-637 (2012).
  17. Sharma, A. K., et al. A mechanism of salt bridge-mediated resistance to FtsZ inhibitor PC190723 revealed by a cell-based screen. Mol Biol Cell. 34 (3), ar16(2023).
  18. Basi, G., Schmid, E., Maundrell, K. TATA box mutations in the Schizosaccharomyces pombe nmt1 promoter affect transcription efficiency but not the transcription start point or thiamine repressibility. Gene. 123 (1), 131-136 (1993).
  19. Moreno, M. B., Durán, A., Carlos Ribas, J. A family of multifunctional thiamine-repressible expression vectors for fission yeast. Yeast. 16 (9), 861-872 (2000).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Caring for Escherichia coli. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
  21. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation and quantification of DNA. Cold Spring Harb Protoc. , (2018).
  22. Bähler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
  23. Pande, V., Mitra, N., Bagde, S. R., Srinivasan, R., Gayathri, P. Filament organization of the bacterial actin MreB is dependent on the nucleotide state. J Cell Biol. 221 (5), e202106092(2022).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Zhang, L. Machine learning for enumeration of cell colony forming units. Vis Comput Ind Biomed Art. 5 (1), 26(2022).
  26. Moen, E., et al. Deep learning for cellular image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1233-1246 (2019).
  27. Higaki, T. Quantitative evaluation of cytoskeletal organizations by microscopic image analysis. Plant Morphol. 29 (1), 15-21 (2017).
  28. Henty-Ridilla, J. L., Li, J., Day, B., Staiger, C. J. ACTIN DEPOLYMERIZING FACTOR4 regulates actin dynamics during innate immune signaling in Arabidopsis. Plant Cell. 26 (1), 340-352 (2014).
  29. Boudaoud, A., et al. an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images. Nat Protoc. 9 (2), 457-463 (2014).
  30. Butler, M. S., Paterson, D. L. Antibiotics in the clinical pipeline in October 2019. J Antibio. 73 (6), 329-364 (2019).
  31. Andreu, J. M., Huecas, S., Araújo-Bazán, L., Vázquez-Villa, H., Martín-Fontecha, M. The search for antibacterial inhibitors targeting cell division protein ftsz at its nucleotide and allosteric binding sites. Biomedicines. 10 (8), 1825(2022).
  32. Vještica, A., et al. A toolbox of stable integration vectors in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J Cell Sci. 133 (1), jcs240754(2020).
  33. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Meth. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  34. Shaevitz, J. W., Gitai, Z. The structure and function of bacterial actin homologs. Cold Spring Harb Pers Biol. 2 (9), a000364(2010).
  35. Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
  36. Aoi, Y., et al. Dissecting the first and the second meiotic divisions using a marker-less drug-hypersensitive fission yeast. Cell Cycle. 13 (8), 1327-1334 (2014).
  37. Zhang, J., et al. Improving drug sensitivity of HIV-1 protease inhibitors by restriction of cellular efflux system in a fission yeast model. Pathogens. 11 (7), 804(2022).

Перепечатки и разрешения

Теги

Скрининги на fission-дрожжахпоиск антибактериальных препаратовполимеризация FtsZполимеризация MreBклеточный анализвысокопроизводительный скринингфлуоресцентная микроскопия96-луночный планшетэукариотическая экспрессионная система
Дрожжи деления как платформа для антибактериального скрининга лекарств, нацеленных на белки цитоскелета бактерий
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.