Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Внутрикамерная инъекция крысам с низким риском побочных эффектов

2.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66662

⸱

31 мая 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ophthalmology Research Laboratory, Kaplan Medical Center, 2Department of Ophthalmology, Kaplan Medical Center, Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает технику внутрикамерной инъекции крысам с использованием центрального разреза роговицы и длинного туннеля в переднюю камеру. Этот метод инъекции сводит к минимуму риск непреднамеренного повреждения тканей и тем самым повышает точность и воспроизводимость.

Аннотация

Внутрикамерная инъекция является стандартной процедурой введения в офтальмологии. Применение внутрикамерной инъекции у грызунов для исследований является сложной задачей из-за предельных размеров и анатомии глаза, включая небольшой объем водянистой влаги, кривизну хрусталика и толщину хрусталика. Потенциальное повреждение во время внутрикамерных инъекций приводит к неблагоприятным последствиям и экспериментальной вариабельности. Этот протокол описывает процедуру внутрикамерной инъекции крысам, обеспечивающую точность и воспроизводимость.

В качестве экспериментальных моделей использовались крысы Спрэг-Доули. Поскольку положение хрусталика у крыс выступает в переднюю камеру, введение с периферии, как это делается у человека, неблагоприятно. Таким образом, разрез создается в центральной области роговицы с помощью лезвия шпильки 31 калибра 0,8 мм, чтобы сформировать самогерметизирующийся туннель в переднюю камеру. Разрез под углом, близким к плоскому, позволяет создать длинный тоннель, что сводит к минимуму потерю водянистой влаги и обмеление передней камеры. Наноигла 34 калибра вводится в туннель для инъекции. Это обеспечивает проникновение с минимальным сопротивлением трению и позволяет избежать прикосновения к объективу. Введение трипан-синего позволяет визуализировать с помощью щелевой микроскопии наличие красителя в передней камере и исключить утечку. Биодоступность к эндотелиальному слою роговицы демонстрируется при введении красителя Hoechst, которым окрашиваются ядра эндотелиальных клеток роговицы после инъекции.

В заключение следует отметить, что в этом протоколе реализована процедура точной внутрикамерной инъекции крысам. Эта процедура может быть использована для внутрикамерной доставки различных лекарственных препаратов и соединений в экспериментальных моделях крыс, повышая эффективность и воспроизводимость офтальмологических исследований.

Введение

Биодоступность соединений, доставляемых при местном введении на поверхность глаза, сильно ограничена и обычно составляет <5%1. Соединения, вводимые глазными каплями, в основном устраняются за счет дренажа, индуцированного слезотечения, оборота слезной жидкости и всасывания конъюнктивы. Кроме того, проникновение соединений через поверхность глаза сильно ограничено роговично-конъюнктивным барьером 1,2,3. Роговица состоит из трех основных слоев: самого наружного эпителия, промежуточной стромы и самого внутреннего эндотелия. Поверхностный эпителий роговицы связан между собой прочными плотными соединениями и создает высокую парацеллюлярную резистентность, которая является основным барьером для проницаемости вещества. Множественные слои эпителия еще больше ограничивают проникновение гидрофильных и крупных молекул через межклеточные пространства эпителия роговицы. Следуя за эпителием, строма состоит из коллагеновых волокон и содержит водные поры. В отличие от эпителия роговицы, строма позволяет перемещаться гидрофильным препаратам; Однако он сильно непроницаем для липофильных соединений 1,2,3. Вместе эпителий роговицы и стромальные слои представляют собой основные тканевые барьеры, ограничивающие абсорбцию лекарственного средства. Считается, что эндотелий роговицы не ограничивает транспортировку лекарств.

Альтернативой роговичному пути доставки является конъюнктивальный путь. Конъюнктива представляет собой многоэпителиальный слой, который покрывает внутреннюю сторону век и переднюю часть склеры. Конъюнктива характеризуется меньшим количеством узких соединений, чем эпителий роговицы, что обеспечивает лучшую проницаемость гидрофильных препаратов. Однако васкуляризация конъюнктивы приводит к системной абсорбции большой фракции вводимых молекул, что также сильно ограничивает биодоступность доставляемых соединений в переднюю камеру 1,2. Эффективным способом обхода внешних барьеров проницаемости глаза является доставка препарата непосредственно в интересующую область. Например, интравитреальное введение является обычным для введения в стекловидное тело4. Аналогичным образом, внутрикамерная инъекция используется для доставки в переднюю камеру5. Установление эффективной концентрации в передней камере имеет решающее значение в различных клинических ситуациях, таких как лечение инфекции путем внутрикамерного введения антибиотиков и послеоперационное противовоспалительное лечение при операциях по удалению катаракты. Несмотря на преимущество улучшенной биодоступности вещества, обеспечиваемого внутрикамерным введением, существуют серьезные проблемы безопасности, которые следует учитывать. Например, внутрикамерное введение препарата может вызвать повышение внутриглазного давления, синдром токсического переднего сегмента и синдром токсического разрушения эндотелиальных клеток 5,6. Поэтому в доклинических исследованиях важно тщательно оценивать эффективность и безопасность лекарственных препаратов, вводимых в виде внутрикамерных инъекций, чтобы максимизировать эффективность лечения и свести к минимуму потенциальные побочные эффекты у пациентов.

Экспериментальные модели на животных незаменимы в доклинических исследованиях для изучения новых методов лечения. Мелкие грызуны, такие как мыши и крысы, являются наиболее часто используемыми лабораторными животными для таких целей. Эти животные демонстрируют множество сходств с анатомией и физиологией человека, предоставляя ценные сведения. Кроме того, их использование экономически выгодно благодаря небольшим размерам, простоте в уходе, быстрой беременности и способности производить большоеколичество потомства7.

Несмотря на широкое использование мелких грызунов в моделях глазных заболеваний, их уникальные размеры глаз и анатомия создают значительные проблемы при проведении экспериментальных манипуляций. Например, такие процедуры, как внутрикамерные инъекции, которые относительно просты у людей, становятся технически сложными у мышей и крыс. Проблемы возникают из-за таких факторов, как небольшой объем водянистой влаги, относительно большой и негибкий хрусталик, а также обструктивное расположение и кривизна хрусталика в глазах грызунов (рис. 1). Эти проблемы увеличивают риск повреждения во время внутрикамерных инъекций у грызунов, что приводит к потенциальным неблагоприятным эффектам и вносит экспериментальную вариабельность, которая может повлиять на достоверность выводов исследования. В наших исследованиях мы успешно разработали процедуру безопасной внутрикамерной инъекции крысам. Этот метод включает в себя создание длинного, плоского, самогерметизирующегося туннеля в роговице в переднюю камеру. Этот метод не только обеспечивает точность, но и повышает воспроизводимость экспериментов, решая проблемы, связанные с методами инъекций у мелких грызунов.

Диаграмма анатомии глаза крысы и человека; радужная оболочка, зрачок, хрусталик, роговица, сравнение передней камеры.
Рисунок 1: Схематическое изображение анатомических особенностей переднего сегмента глаз крысы и человека. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты в протоколе были одобрены Национальным комитетом по выдаче разрешений - для зоотехнии и соответствуют Заявлению ARVO об использовании животных в офтальмологических и зрительных исследованиях. Для настоящего исследования были использованы самки крыс Sprague-Dawley в возрасте 8-10 недель, которые подвергались 12-12-часовому циклу «свет-темнота». Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Подготовка животных

  1. Приготовьте смесь анестетика из кетамина (80 мг/кг массы тела в 0,8 мл) и ксилазина (4 мг/кг массы тела в 0,2 мл) и введите ее внутрибрюшинно за одну инъекцию для обезболивания крыс.
  2. Вводите анальгетик бупренорфин (0,03 мг/кг) внутрибрюшинно за одну инъекцию.
  3. Нанесите местный офтальмотерапевтический анестетик 0,4% оксибупрокаин на оба глаза.

2. Создание самогерметизирующегося роговичного тоннеля

  1. Стабилизируйте глаз, удерживая верхнюю склеру по вертикальной средней линии рядом с корнеосклеральным соединением с помощью хирургических офтальмологических щипцов.
  2. Под хирургическим микроскопом поместите стерильное лезвие шпильки 0,8 мм и плотностью 31 G в парацентральную область роговицы по вертикальной средней линии (над центром зрачка) в плоском положении под углом, максимально приближенным к горизонтальному (рис. 2).
  3. В таком положении проколите роговицу, чтобы сделать разрез и создать длинный тоннель (2-3 мм) до тех пор, пока он не проникнет в центральную область передней камеры. Не прикасайтесь к объективу (Рисунок 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Успешный туннель не вызовет утечки водянистой влаги и обмеления передней камеры.
  4. Нанесите внутрь внутрь глаз 0,3% офлоксацина и 0,1% дексаметазона.
  5. Исследовать под щелевой микроскопией можно следующим образом.
    1. Наблюдайте за глубиной передней камеры инъецируемого глаза по сравнению с неинъекционным глазом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина должна быть аналогичной.
    2. Посмотрите на хрусталик инъекционного глаза по сравнению с неинъекционным глазом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объектив должен быть прозрачным. Помутнение может отражать повреждение хрусталика во время хирургической процедуры.

Схема хирургии глаза, показывающая разрез роговицы; маркированный хрусталик, передняя камера, медицинское лезвие.
Рисунок 2: Схематическое изображение угла и положения лезвия и разреза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Вариант 1: Внутрикамерное введение трипанового синего для оценки успешности инъекции в переднюю камеру

  1. Загрузите 5 μL трипанового синего в стерильный стеклянный шприц Hamilton объемом 10 μL с тупой иглой 34 G.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция трипанового синего описывается как средство оценки успешности инъекции на этапах калибровки или настройки модели. В экспериментальных условиях шприц может быть загружен раствором выбранного соединения.
  2. Введите заряженную иглу шприца через туннель, созданный в разделе 2, в переднюю камеру.
  3. Введите и удерживайте иглу на месте после инъекции в течение 2-3 секунд, пока вся жидкость не исчезнет.
  4. Извлеките иглу, осторожно и медленно вытащив ее, чтобы избежать утечки из роговичного канала.
  5. Исследуйте под щелевой микроскопией. Оцените глубину залегания передней камеры, чтобы исключить обмеление и проверьте наличие трипанового синего в передней камере.
  6. Повторное исследование через 24 ч, 48 ч и 72 ч.

4. Вариант 2: Внутрикамерное введение Хёхста для оценки биодоступности вводимого материала в слой эндотелиальных клеток

  1. Загрузите 5 μL Hoechst в стерильный стеклянный шприц Hamilton объемом 10 μL с тупой иглой 34 G.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция Хёхста описывается как средство оценки биодоступности вводимого материала путем поглощения в слой эндотелиальных клеток и полезна на этапах калибровки или настройки модели. В экспериментальных условиях шприц может быть загружен раствором выбранного соединения.
  2. Введите заряженную иглу шприца через туннель, созданный в разделе 2, в переднюю камеру.
  3. Введите и удерживайте иглу на месте после инъекции в течение 2-3 секунд, пока вся жидкость не исчезнет.
  4. Извлеките иглу, осторожно и медленно вытащив ее, чтобы избежать утечки из разреза роговичного канала.
  5. Примерно через 15-20 минут после инъекции усыпьте крыс путем внутрибрюшинного введения 500 мг/кг пентобарбитала натрия.
  6. Энуклеируйте оба глаза и изолируйте роговицу. Соберите неинъекционную роговицу в качестве контроля.
  7. Окрашивайте обе роговицы 0,5% Ализарин Ред S в соответствии с инструкциями производителя для выявления эндотелиальных клеток.
  8. Исследуйте под световым микроскопом, чтобы получить изображение ализариново-красного окрашивания эндотелиальных клеток, и под флуоресцентным микроскопом, чтобы наблюдать окрашивание по методу Хёхста, по сравнению с неинъецированной роговицей в качестве контроля.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Крысам Sprague Dawley вводили интракамерально 5 мкл трипанового синего в соответствии с протоколом, описанным выше. Осмотр с помощью щелевой лампы сразу после инъекции показал, что камера окрашена трипановым синим, что указывает на то, что введенный материал достиг передней камеры (рис. 3). Кроме того, глубина передней камеры была неповрежденной, что позволяет предположить, что инъекция не вызвала утечку водянистой влаги и обмеление камеры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Модели доклинических исследований должны обеспечивать контролируемую и воспроизводимую среду для обеспечения надежности и применимости результатов. В офтальмологических исследованиях модели глазных инъекций обычно используются в различных исследовательских аспектах, начиная от создания моделей заболеваний, тестирования новых методов лечения и заканчивая оценкой реакций тканей и потенциальных побочных эффектов.

Интракамеральные инъекции служат распространенным ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Маркович А. Л. является владельцем патентов в компаниях Steba Biotech, Yeda Weizmann, EyeYon Medical и Mor Isum, а также консультантом в компаниях EyeYon Medical и Johnson & Johnson. У всех остальных авторов нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами Израильского научного фонда 2670/23 и 1304/20.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Ализарин Ред Alpha Aesar042040.5
Бупренорфин Рихтер Фарма102047
Дексаметазон 0,1% Fisher Pharmaceutical393102-0413
Стеклянный шприц Hamilton 10 μ Л Гамильтон Ко.
HoeschstMerckB2261
КетаминBremer pharma GMBH (medimarket)17889
Офлоксацин 0,3% глазные каплиAllerganE92170
Оксибупрокаина гидрохлорид 0,4% Fisher PharmaceuticalN/A
Пентобарбитал натрия 200 мг/мл CTSN/A
Щелевой микроскоп Haag-streit bernb-90019115
Sprague-Dawley RatsEnvigoN/A
Стилетное лезвие 31 G 0.8 мм Tecfen medical (skymed)QKN2808
Хирургический микроскопZeissOPMI-6 CFC
Trypan BlueSartorius03-102-1B
XylazineEurovet Animal Health 
721711615648

Ссылки

  1. Ramsay, E., et al. Corneal and conjunctival drug permeability: Systematic comparison and pharmacokinetic impact in the eye. Eur J Pharm Sci. 119, 83-89 (2018).
  2. Cholkar, K., Dasari, S. R., Pal, D., Mitra, A. K. Eye: Anatomy, Physiology and Barriers to Drug Delivery. Ocular Transporters and Receptors. , Elsevier, Woodhead Publishing. (2013).
  3. Prausnitz, M. R. Permeability of cornea, sclera, and conjunctiva: A literature analysis for drug delivery to the eye. J Pharm Sci. 87 (12), 1479-1488 (1998).
  4. Varela-Fernández, R., et al. Drug delivery to the posterior segment of the Eye: Biopharmaceutic and pharmacokinetic considerations. Pharmaceutics. 12 (3), 269(2020).
  5. Gautam, M., et al. Intracameral drug delivery: A Review of agents, indications, and outcomes. J Ocul Pharmacol Ther. 39 (2), 102-116 (2023).
  6. Shah, T. J., Conway, M. D., Peyman, G. A. Intracameral dexamethasone injection in the treatment of cataract surgery induced inflammation: design, development, and place in therapy. Clin Ophthalmol. 12, 2223-2235 (2018).
  7. Perlman, R. L. Mouse models of human disease: An evolutionary perspective. Evol Med Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).
  8. Chawla, S., Jena, S. The Anatomy and Physiology of Laboratory Rat.Essentials of Laboratory Animal Science: Principles and Practices. , Springer. Singapore. (2021).
  9. Lundström, M., Wejde, G., Stenevi, U., Thorburn, W., Montan, P. Endophthalmitis after cataract surgery: a nationwide prospective study evaluating incidence in relation to incision type and location. Ophthalmology. 114 (5), 866-870 (2007).
  10. Fine, I. H. Clear corneal incisions. Int Ophthalmol Clin. 34 (2), 59-72 (1994).
  11. Herretes, S., Stark, W. J., Pirouzmanesh, A., Reyes, J. M. G., McDonnell, P. J., Behrens, A. Inflow of ocular surface fluid into the anterior chamber after phacoemulsification through sutureless corneal cataract wounds. Am J Ophthalmol. 140 (4), 737-740 (2005).
  12. Masket, S., Belani, S. Proper wound construction to prevent short-term ocular hypotony after clear corneal incision cataract surgery. J Cataract Refract Surg. 33 (3), 383-386 (2007).
  13. Taban, M., Rao, B., Reznik, J., Zhang, J., Chen, Z., McDonnell, P. J. Dynamic morphology of sutureless cataract wounds - Effect of incision angle and location. Surv Ophthalmol. 49, Suppl 2 S62-S72 (2004).
  14. Belforte, N., Sande, P. H., de Zavalía, N., Dorfman, D., Rosenstein, R. E. Therapeutic benefit of radial optic neurotomy in a rat model of glaucoma. PLoS One. 7 (3), e34574(2012).
  15. Moreno, M. C., et al. A new experimental model of glaucoma in rats through intracameral injections of hyaluronic acid. Exp Eye Res. 81 (1), 71-80 (2005).
  16. Belforte, N., Sande, P., de Zavalía, N., Knepper, P., Rosenstein, R. Effect of chondroitin sulfate on intraocular pressure in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (11), 5768-5775 (2010).
  17. Matsumoto, Y., Kanamori, A., Nakamura, M., Negi, A. Rat chronic glaucoma model induced by intracameral injection of microbeads suspended in sodium sulfate-sodium hyaluronate. Jpn J Ophthalmol. 58 (3), 290-297 (2014).
  18. Liu, Y., et al. A novel rat model of ocular hypertension by a single intracameral injection of cross-linked hyaluronic acid hydrogel (Healaflow® ). Basic Clin Pharmacol Toxicol. 127 (5), 361-370 (2020).
  19. Bowen, R. C., et al. Comparative analysis of the safety and efficacy of intracameral cefuroxime, moxifloxacin and vancomycin at the end of cataract surgery: a meta-analysis. Br J Ophthalmol. 102 (9), 1268-1276 (2018).
  20. Kato, A., et al. Prophylactic antibiotics for postcataract surgery endophthalmitis: a systematic review and network meta-analysis of 6.8 million eyes. Sci Rep. 12 (1), 17416(2022).
  21. Wang, M., Liu, Y., Dong, H. Effect of cefuroxime intracameral injection antibiotic prophylactic on postoperative endophthalmitis wound post-cataract: A meta-analysis. Int Wound J. 20 (5), 1376-1383 (2023).
  22. Katz, G., et al. Intracameral cefuroxime and the incidence of post-cataract endophthalmitis: an Israeli experience. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 253 (10), 1729-1733 (2015).
  23. Lipnitzki, I., Ben Eliahu, S., Marcovitz, A. L., Ezov, N., Kleinmann, G. Intraocular concentration of moxifloxacin after intracameral injection combined with presoaked intraocular lenses. J Cataract Refract Surg. 40 (4), 639-643 (2014).
  24. Colleaux, K. M., Hamilton, W. K., Morgan, R. A. Effect of prophylactic antibiotics and incision type on the incidence of endophthalmitis after cataract surgery. Can J Ophthalmol. 35 (7), 373-378 (2000).
  25. Libre, P. E., Della-Latta, P., Chin, N. X. Intracameral antibiotic agents for endophthalmitis prophylaxis: A pharmacokinetic model. J Cataract Refract Surg. 29 (9), 1791-1794 (2003).
  26. Carino, N. S., Slomovic, A. R., Chung, F., Marcovich, A. L. Topical tetracaine versus topical tetracaine plus intracameral lidocaine for cataract surgery. J Cataract Refract Surg. 24 (12), 1602-1608 (1998).
  27. Minakaran, N., Ezra, D. G., Allan, B. D. Topical anaesthesia plus intracameral lidocaine versus topical anaesthesia alone for phacoemulsification cataract surgery in adults. Cochrane Database Syst Rev. 7 (7), CD005276 (2020).
  28. Dan-Ni, W., Li-Dian, H., Zhi-Guo, P., Qiang, W., Lei, S. Intracameral anti-VEGF injection for advanced neovascular glaucoma after vitrectomy with silicone oil tamponade. Int J Ophthalmol. 14 (3), 129-135 (2021).
  29. Bhagat, P. R., Agrawal, K. U., Tandel, D. Study of the effect of injection bevacizumab through various routes in neovascular glaucoma. J Curr Glaucoma Pract. 10 (2), 39-48 (2016).
  30. Al-Qaysi, Z. K., Beadham, I. G., Schwikkard, S. L., Bear, J. C., Al-Kinani, A. A., Alany, R. G. Sustained release ocular drug delivery systems for glaucoma therapy. Expert Opin Drug Deliv. 20 (7), 905-919 (2023).
  31. Eghrari, A. O., Gottsch, J. D. Fuchs' corneal dystrophy. Expert Rev Ophthalmol. 5 (2), 147-159 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Модель глаза крысыпередняя камерароговичный тоннельофтальмологическая хирургиящелевая микроскопияэндотелиальные клеткиинъекция трипанового синегоокрашивание Хёхстомокрашивание алызариновым красным
Внутрикамерная инъекция крысам с низким риском побочных эффектов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.