Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Последовательный забор крови из нижней полой вены с последующим вскрытием воротной вены для оценки микробных метаболитов кишечника у мышей

4.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66673

⸱

21 июня 2024 г.

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco and San Francisco General Hospital

В этой статье

Краткое содержание

В протоколе продемонстрирован метод последовательного сбора крови из воротных вен и нижней полой вены у мышей для оценки производства и абсорбции микробных метаболитов кишечника.

Аннотация

Известно, что продукты кишечной микрофлоры действуют как локально в кишечнике, так и всасываются в кровоток, где их воздействие может распространяться на многочисленные отдаленные системы органов. Короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК) являются одним из классов метаболитов, вырабатываемых кишечными микробами во время ферментации неперевариваемых пищевых волокон. В настоящее время они признаны важными участниками того, как кишечный микробиом влияет на системы внекишечных органов через кишечник-легкие, кишечник-мозг и другие оси кишечник-орган по всему организму хозяина. КЦЖК всасываются из толстой кишки через кишечную ткань в воротную вену (ПВ). Затем они проходят через печень и потребляются в различных органах, таких как мозг, мышцы, жировая ткань и легкие. КЦЖК легче всего измеряются в выброшенном материале кала, однако более точные измерения были получены из внутрикишечного содержимого кала. В данной работе мы предполагаем, что отбор проб ПВ и системной циркулирующей плазмы одного субъекта может быть предпочтительным для изучения абсорбции, транспорта и системных уровней КЦЖК у мышей. Мы представляем новую методику эффективного забора крови из ЛВ и нижней полой вены (НПВ), которая позволяет собирать относительно большие объемы крови из портального и системного кровотока. Это достигается путем лигирования ФВ, что позволяет расширить или увеличить ФВ, поскольку она заполняется брыжеечными венами, которые впадают в нее. Используя этот метод, мы смогли улучшить скорость успешного сбора, а также общее количество собранной крови (до 0,3 мл из IVC и 0,5 мл из PV).

Введение

Короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК) являются основным классом метаболитов, вырабатываемых микробиотой кишечника. Их важнейшая роль во взаимодействии между микробиомом кишечника и другими отдаленными органамибыла подтверждена исследованиями, описывающими, как они модулируют воспаление, сигнализируют через специальные рецепторы и служат субстратами в клеточном метаболизме 2,3,4,5. Недавняя работа нашей группы показала, что КЦЖК являются ключевыми in vivo воспалительными регуляторами иммунного тонуса легких in vivo через ось кишечник-легкие 6,7. В дополнительных отчетах описано их функциональное влияние на метаболизм через ось кишечник-мозг 8,9. В целом, влияние КЦЖК на физиологию и патологию хозяина активно и интенсивно изучается многочисленными исследовательскими группами, охватывающими широкий спектр патологических процессов.

Ацетат (С2), пропионат (С3) и бутират (С4) являются основными КЦЖК и образуются микробиотой кишечника в результате ферментации потребляемых пищевых волокон в слепой кишке и толстой кишке. Все три КЦЖК также могут быть получены непосредственно из рациона, и только ацетат может также вырабатываться клетками млекопитающих. КЦЖК всасываются в толстой кишке и частично используются эпителиальными клетками кишечника (в качестве источника энергии, для местной тканевой иммуномодуляции и поддержания кишечного барьера). Они также транспортируются в воротную вену через брыжеечную венозную систему10. Бутират в основном потребляется кишечным эпителием, пропионат – печенью 11,12, а ацетат, как сообщается, действует на мышечные и жировые ткани после попадания в периферический кровоток13,14.

Всесторонняя оценка продукции, абсорбции и функциональной активности КЦЖК требует знания уровней КЖК в просвете толстой кишки, в портальном кровообращении и периферической крови. Это может быть достигнуто путем одновременного или последовательного забора крови из воротной вены (ВП) и системного кровообращения у одного и того же животного. Поскольку КЦЖК являются летучими15, измерение их уровней в выброшенных фекальных гранулах может не точно отражать уровни в толстой кишке. Кроме того, по сравнению с измерениями содержимого толстой кишки, уровень КЦЖК, присутствующих в ПВ, может более точно отражать чистую сумму равновесных уровней, поглощенных хозяином, по сравнению с неравномерными уровнями, производимыми кишечным микробиомом по всей длине толстой кишки11. Таким образом, эти уровни ПЦЖК могут быть более релевантными и подходящими для изучения влияния КЦЖК на физиологию и патологию хозяина, помимо местных эффектов в кишечнике.

Для выполнения скоординированного и почти одновременного сбора ЛВ и системной циркуляции крови диафрагма должна оставаться неповрежденной, чтобы поддерживать нормальное кровообращение и поддерживать спонтанное дыхание. Таким образом, нижняя полая вена (НПВ) представляет собой идеальное место для получения крови системного кровообращения при сборе крови ВП. Эта кровь НПВ также может быть использована для других целей, таких как измерение циркулирующих цитокинов для оценки системного воспаления.

В настоящее время сообщалось только о нескольких методах сбора крови как из системного кровообращения, так и из ЛВ у более крупных грызунов16,17. Традиционные методы, требующие канюляции сосудов у крыс, технически сложны для выполнения у мышей. Кроме того, максимальное количество крови, собранной этими методами, обычно составляет не более 0,3 мл18.

В этой статье мы представляем новый метод, который упрощает процесс двойного забора крови из мышиного НПВ с последующим ВП у одного и того же животного. Уникальной особенностью метода является перевязка ЛВ вблизи ворот печени непосредственно перед забором крови ЛВ. Такой подход позволяет расширить габариты ЛВ, тем самым значительно улучшив вероятность успеха, а также увеличив максимальный объем собираемой крови до 0,5 мл.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все шаги в этой процедуре, не связанной с выживанием, были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) при Калифорнийском университете в Сан-Франциско. В качестве мышей использовался пол и штамм мышей C57BL/6J мужского пола (массой тела 25-35 г и возрастом 12-15 недель). Также можно использовать самки и/или другие стандартные линии мышей.

1. Анестезия

  1. Протрите нижнюю половину брюшка мыши тампонами с 70% этанолом. Введение анестезии путем внутрибрюшинной инъекции трибромэтанола (250-400 мг/кг). Также может быть использована кетамин/ксилазин или изофлурановая анестезия. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить повреждение роговицы.
  2. Вводите бупренорфин (0,05-0,1 мг/кг) внутрибрюшинно для обезболивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Бупренорфин необходим из-за боли, связанной с процедурой лапаротомии.

2. Лапаротомия

  1. Поместите мышь под наркозом на операционную поверхность (с грелкой под ней) в положении лежа на спине. Закрепите все конечности мыши на хирургической доске скотчем. Подтвердите, что надлежащая глубина анестезии была достигнута путем защемления пальца ноги без рефлекса отмены педали.
  2. Подтяните кожу и сделайте продольный разрез рассекающими ножницами по средней линии от пупка к мечевидному отростку и каудально по направлению к основанию живота (наружного полового органа).
  3. Сделайте аналогичный разрез брюшины ножницами-препарирующими, не продырявляя и не повреждая кишечник, диафрагму или печень.
  4. Расширить операционное поле, сделав поперечный разрез по всей длине (увеличивающий ширину живота) ножницами с обеих сторон пупка.
  5. Переместите толстую и тонкую кишки на правую сторону хирурга с помощью чистой марли, смоченной в теплой PBS, чтобы обнажить НПВ, расположенный ниже.

3. Лигатурная подготовка для ПВ

  1. Аккуратно манипулируйте сегментами кишечника в операционном поле с помощью ватного тампона, чтобы найти ПВ в корне брыжейки.
  2. Используя препарирующий микроскоп для визуализации сосудов и других структур брюшной полости, осторожно проленовый шов 7-0 за ЛВ возле ворот печени (между двенадцатиперстной веной и селезеночной веной)19 , чтобы он был готов к лигированию на этапе 5 (рис. 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование микроскопа на этом этапе не является обязательным, но значительно повышает общий уровень успеха процедуры.

4. Забор крови из НПВ

  1. Введите иглу 28G 1/2 дюйма гепаринизированного инсулинового шприца объемом 1 мл в IVC. Соберите 0,2-0,3 мл образца крови.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если на этом этапе будет удалено слишком много крови, это приведет к уменьшению объемов ПВ крови, собранной на этапе 5.
  2. Оставьте иглу внутри НПВ, чтобы избежать кровотечения, которое может возникнуть при удалении.

5. Забор крови из ЛВ

  1. Аккуратно обвяжите проленовую лигатуру 7-0 вокруг PV; фотоэлектрическая батарея должна расширяться и расширяться по мере засыпки. Вставьте иглу 28G 1/2 дюйма другого гепаринизированного инсулинового шприца объемом 1cc в PV.
  2. Медленно аспирируйте до 0,3-0,5 мл крови из ЛВ. ЛВ может разрушаться, но она должна постепенно расширяться с пополнением крови из брыжеечной венозной системы.

6. Хранение образцов

  1. Извлеките иглы из НПВ и ПВ после забора крови.
  2. Переложите образцы крови из шприцев в гепаринизированные пробирки Эппендорфа объемом 1,5 мл и поместите их на лед для последующей обработки в плазму для хранения и анализа по мере необходимости.
  3. Усыпьте мышь с помощью передозировки анестетика с последующим вывихом шейки матки (в соответствии с рекомендациями, утвержденными UCSF IACUC).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя описанный выше метод, мы можем последовательно собирать образцы крови из НПВ и ПВ у одной и той же мыши с вероятностью успеха более 95%. Средний объем собранных образцов крови составляет 0,25 мл для НПВ и 0,35 мл для ПВ.

С помощью газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) мы измерили концентрацию КЦЖК в кале, крови ПВ и крови НПВ и, таким образом, смогли проследить абсорбцию и транзит ацетата (С2), пропионата (С3) и бутирата (С4) из отдела толстой кишки, где они образуются путем фер...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В данной статье описан инновационный метод in vivo для почти одновременного последовательного сбора образцов крови из НПВ и ПВ на одной и той же экспериментальной мыши. Этот метод полезен для измерения уровней продуктов, генерируемых кишечной микробиотой, таких как КЦЖК, которые проходят через портальную циркуляцию. Средний максимальный объем крови, который может быть собран во время терминальной процедуры у мышей (весом 25-30 г), составляет примерно 1 мл/мышь, что, в свою очере...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

AP финансируется за счет награды R01 от NIH/NHLBI (1R01HL146753). DM финансируется стипендией T32 от NIH и премией для стажеров/штатных пилотов от Центра медицины микробиома Бениоффа UCSF.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2,2,2 Трибромэтанол, 97% (Авертин)Sigma Aldrich T48402-25GОбезболивающее средство 
Бупренорфина гидрохлорид для инъекций 0,3 мг/млPAR Pharmaceutical NDC 42023-179-05Обезболивающее средство
Щипцы перевязочныеMiltex 6-100Вскрытие 
Щипцы GraefeRobozRS-5136Dissection 
Гепатин натрия 1000 USP единиц/млHikmaNDC 0641-0391-12Образец крови шприцы/пробирки гепаринизация
Пролен 7-0Ethicon8696GЛигатура воротной вены
НожницыF.S.T14058-11Вскрытие 
Студент Halsted-Mosquito HemostatsF.S.T 91308-12Вскрытие 
Хирургическая лента 3M Transpore1527-1Фиксация конечностей мыши
U-100 Инсулиновый шприц 28G1/2EXEL26027Сбор образцов крови 

Ссылки

  1. vander Hee, B., Wells, J. M. Microbial regulation of host physiology by short-chain fatty acids. Trends Microbiol. 29 (8), 700-712 (2021).
  2. Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. From dietary fiber to host physiology: Short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).
  3. Vinolo, M. A. R., Rodrigues, H. G., Nachbar, R. T., Curi, R. Regulation of inflammation by short chain fatty acids. Nutrients. 3 (10), 858-876 (2011).
  4. Layden, B. T., Angueira, A. R., Brodsky, M., Durai, V., Lowe, W. L. Short chain fatty acids and their receptors: new metabolic targets. Transl Res. 161 (3), 131-140 (2013).
  5. den Besten, G., et al. The role of short-chain fatty acids in the interplay between diet, gut microbiota, and host energy metabolism. J Lipid Res. 54 (9), 2325-2340 (2013).
  6. Tian, X., et al. Elevated gut microbiome-derived propionate levels are associated with reduced sterile lung inflammation and bacterial immunity in mice. Front Microbiol. 10, 159(2019).
  7. Liu, Q., Tian, X., Maruyama, D., Arjomandi, M., Prakash, A. Lung immune tone via gut-lung axis: Gut-derived LPS and short-chain fatty acids’ immunometabolic regulation of lung IL-1β, FFAR2, and FFAR3 expression. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 321 (1), L65-L78 (2021).
  8. De Vadder, F., et al. Microbiota-generated metabolites promote metabolic benefits via gut-brain neural circuits. Cell. 156 (1-2), 84-96 (2014).
  9. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota–gut–brain communication. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (8), 461-478 (2019).
  10. Sun, M., Wu, W., Liu, Z., Cong, Y. Microbiota metabolite short chain fatty acids, GPCR, and inflammatory bowel diseases. J Gastroenterol. 52 (1), 1-8 (2017).
  11. Cummings, J. H., Pomare, E. W., Branch, H. W. J., Naylor, C. P. E., MacFarlane, G. T. Short chain fatty acids in human large intestine, portal, hepatic and venous blood. Gut. 28 (10), 1221-1227 (1987).
  12. Macfarlane, G. T., Gibson, G. R., Cummings, J. H. Comparison of fermentation reactions in different regions of the human colon. J Appl Bacteriol. 72 (1), 57-64 (1992).
  13. Neis, E. P., et al. Distal versus proximal intestinal short-chain fatty acid release in man. Gut. 68 (4), 764-765 (2019).
  14. Yamashita, H., et al. Effects of acetate on lipid metabolism in muscles and adipose tissues of type 2 diabetic Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) Rats. Biosci Biotechnol Biochem. 73 (3), 570-576 (2009).
  15. Ríos-Covián, D., et al. Intestinal short chain fatty acids and their ink with diet and human health. Front Microbiol. 7, 185(2016).
  16. Jaworska, K., et al. An in vivo method for evaluating the gut-blood barrier and liver metabolism of microbiota products. J Vis Exp. (140), e58456(2018).
  17. Ashcroft, S. P., et al. Protocol to assess arteriovenous differences across the liver and hindlimb muscles in mice following treadmill exercise. STAR Protoc. 4 (1), 101985(2023).
  18. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  19. Cheever, A. W., Warren, K. S. Portal vein ligation in mice: Portal hypertension, collateral circulation, and blood flow. J Appl Physiol. 18, 405-407 (1963).
  20. Bloemen, J. G., et al. Short chain fatty acids exchange across the gut and liver in humans measured at surgery. Clin Nutr. 28 (6), 657-661 (2009).
  21. Hoyles, L., et al. Microbiome–host systems interactions: Protective effects of propionate upon the blood–brain barrier. Microbiome. 6 (1), 55(2018).
  22. Shimizu, J., et al. Propionate-producing bacteria in the intestine may associate with skewed responses of IL10-producing regulatory T cells in patients with relapsing polychondritis. PLoS One. 13 (9), e0203657(2018).
  23. Wang, J., et al. Propionate protects against lipopolysaccharide-induced mastitis in mice by restoring blood–milk barrier disruption and suppressing inflammatory response. Front Immunol. 8, 1108(2017).
  24. Lucas, S., et al. Short-chain fatty acids regulate systemic bone mass and protect from pathological bone loss. Nat Commun. 9 (1), 55(2018).
  25. Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J Vis Exp. (92), e51955(2014).
  26. Sänger, C., et al. Intrahepatic vascular anatomy in rats and mice - Variations and surgical implications. PLoS One. 10 (11), e0141798(2015).
  27. Phillips, B. J., Mirzaie, M., Turco, L. Portal Vein Injuries: A Review. J Emerg Trauma. 2 (2), 4(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Короткоцепочечные жирные кислотызабор проб из воротной венысбор крови у мышейабсорбция КЦЖКмикробиом кишечникакровь воротной венытранспорт метаболитовхирургическая техника для мышей
Последовательный забор крови из нижней полой вены с последующим вскрытием воротной вены для оценки микробных метаболитов кишечника у мышей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.