Методическая статья

Микроинъекция эмбриона для трансгенеза у дрозофилы

4.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66679

⸱

7 июня 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 2Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, 3Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 4Department of Neurology, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье в качестве примера берется интегразо-опосредованный трансгенез phiC31 у дрозофил и представлен оптимизированный протокол микроинъекции эмбриона, что является важным шагом для создания трансгенных мух.

Аннотация

Трансгенез у дрозофил является важным подходом к изучению функции генов на уровне организма. Микроинъекция эмбриона является важным этапом для создания трансгенных мух. Для микроинъекции требуются некоторые виды оборудования, в том числе микроинъектор, микроманипулятор, инвертированный микроскоп и стереомикроскоп. Плазмиды, выделенные с помощью набора для мини-подготовки плазмид, подходят для микроинъекций. Эмбрионы на стадии пребластодермы или синцитиальной бластодермы, где ядра имеют общую цитоплазму, подвергаются микроинъекции. Клеточный фильтр облегчает процесс дехорионизации эмбрионов. Оптимальное время для дехорионации и высыхания эмбрионов необходимо определить экспериментальным путем. Чтобы повысить эффективность микроинъекции эмбриона, иглы, подготовленные пуллером, должны быть скошены игольчатой машиной. В процессе шлифовки игл мы используем ножной воздушный насос с манометром, чтобы избежать капиллярного эффекта кончика иглы. Мы обычно вводим 120-140 эмбрионов для каждой плазмиды и получаем по крайней мере одну трансгенную линию примерно для 85% плазмид. В данной статье в качестве примера берется интегразо-опосредованный трансгенез phiC31 у дрозофил и представлен подробный протокол микроинъекции эмбриона для трансгенеза у дрозофилы.

Введение

Плодовая муха Drosophila melanogaster чрезвычайно поддается генетическим манипуляциям и генетическому анализу. Трансгенные плодовые мушки широко используются в биологических исследованиях. С момента своего появления в начале 1980-х годов транспозон-опосредованный P-элементами транспозон-опосредованный был незаменимдля исследований дрозофил. В некоторых сценариях другие транспозоны, такие как piggyBac и Minos, также использовались для трансгенеза у дрозофил 2. Трансгены через транспозон случайным образом встраиваются в геном дрозофилы, и уровни экспрессии трансгенов в разных геномных локусах могут варьироваться из-за позиционных эффектов и поэтому немогут быть сравнены. Эти недостатки были преодолены с помощью phiC31-опосредованного сайт-специфического трансгенеза3. Ген бактериофага phiC31 кодирует интегразу, которая опосредует последовательно-специфическую рекомбинацию между сайтами attB и attP у дрозофилы 3. Многие стыковочные площадки attP были охарактеризованы и доступны в Bloomington Drosophila Stock Center 3,4,5,6,7,8,9.

Система трансгенеза phiC31 для дрозофилы широко используется сообществом мух. Среди сайтов стыковки attP attP18 на Х-хромосоме, attP40 на второй хромосоме и attP2 на третьей хромосоме обычно являются предпочтительными сайтами для интеграции трансгенов на каждой хромосоме, поскольку трансгены в трех сайтах демонстрируют высокие уровни индуцируемой экспрессии при низких уровнях базальнойэкспрессии5. Однако недавно ван дер Грааф и его коллеги обнаружили, что сайт attP40, близкий к локусу гена Msp300, и трансгены, интегрированные в attP40, вызывают кластеризацию ядра личиночных мышц у дрозофилы10. В другом недавнем исследовании Дуан и его коллеги обнаружили, что гомозиготная хромосома attP40 нарушает нормальную клубочковую организацию класса нейронов обонятельных рецепторов Or47b у дрозофилы11. Эти результаты свидетельствуют о том, что при планировании экспериментов и интерпретации данных следует учитывать строгий контроль.

Дрозофила является идеальным модельным организмом для исследования функции генов in vivo благодаря своему короткому жизненному циклу, низкой стоимости и простоте обслуживания. Полногеномный генетический скрининг основан на построении полногеномных трансгенных библиотек у дрозофил 12,13,14,15. Ранее мы создали 5551 конструкцию UAS-кДНК/ORF на основе бинарной системы GAL4/восходящей активирующей последовательности (GAL4/UAS), охватывающей 83% генов дрозофилы, сохраненных у человека в Золотой коллекции Центра геномики дрозофилы (DGRC)Gold Collection 16. Плазмиды UAS-кДНК/ORF могут быть использованы для создания трансгенной библиотеки UAS-кДНК/ORF у дрозофил. Эффективная технология микроинъекций эмбрионов может ускорить создание трансгенных библиотек мух.

При микроинъекции эмбриона кончик иглы обычно ломается о покровное стекло17. Таким образом, иглы часто засоряются или вызывают утечку большого количества цитоплазмы, и когда возникают эти проблемы, необходимо использовать новые иглы. Несмотря на то, что иглы для снятия фаски могут повысить эффективность микровпрыска, измельчающий раствор попадает на скошенный наконечник в процессе шлифования. Шлифовальный раствор в скошенном наконечнике не испаряется быстро естественным путем; Поэтому иглы нельзя использовать для микроинъекций сразу после снятия фаски. Эти факторы снижают эффективность процедур микроинъекций эмбрионов. Здесь, используя в качестве примера phiC31-опосредованный сайт-специфический трансгенез у дрозофилы , мы представляем протокол микроинъекции эмбриона для трансгенеза у дрозофилы. Чтобы предотвратить попадание шлифовального раствора в иглу, мы используем воздушный насос для создания давления воздуха внутри иглы, тем самым предотвращая попадание шлифовального раствора на скошенный кончик. Скошенные иглы готовы к загрузке образца и микровпрыску сразу после снятия фаски.

Протокол

1. Подготовка плазмид

  1. Выделите плазмиды из 4 мл бактериальных культур в течение ночи с помощью набора для мини-подготовки плазмид. Элюируйте 40 мкл элюирующего буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение плазмид с помощью набора midi-prep для плазмид не требуется. Набор для мини-подготовки плазмид может полностью удовлетворить экспериментальные требования к микроинъекции эмбрионов. В этом протоколе подготовленные плазмиды UAS-кДНК/ORF содержат десять копий UAS, минимальный промотор Hsp70, сайт attB, ген мини-белого цвета и ген, представляющий интерес.
  2. Определите концентрацию плазмидной ДНК с помощью спектрофотометра и храните при температуре -80 °C в морозильной камере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация плазмид не является критичной для успешной микроинъекции эмбриона, так как концентрации плазмид в диапазоне от 20 нг/л до 1683 нг/мкл хорошо подходят для трансгенеза у дрозофил (дополнительная таблица 1).
  3. Непосредственно перед микроинъекцией разморозьте плазмиды и центрифугируйте при 13000 x g в течение 5 минут.
  4. Перенесите по 10 мкл каждой плазмиды из верхнего слоя жидкости в новую пробирку объемом 1,5 мл.

2. Вытягивание игл

  1. Включите съемник игл с выбранными настройками (Нагрев: 500, Вытягивание: 50, Вел: 60, Задержка: 90, Давление: 200, Испытание на рампе: 510).
  2. Вставьте капилляр из боросиликатного стекла (внешний диаметр 1,0 мм, внутренний диаметр 0,75 мм, длина 10 см) в игольчатый съемник и закройте крышку.
  3. Нажмите кнопку Pull . Каждый стеклянный капилляр делает две иглы.

3. Шлифовальные иглы (Рисунок 1)

  1. Используйте игольчатую машину, установленную на соответствующей абразивной пластине (для размера наконечника 0,7-2,0 мкм) игольчатой машины.
  2. Смочите ткань (контрольную проволоку) растирающим раствором (100 мл дистиллированной воды с 0,9 г NaCl, 1 мл смачивающего средства) и зафиксируйте ткань.
  3. Включите игольчатую машинку и продолжайте вращать шлифовальную пластину.
  4. Подключите иглу к ножному воздушному насосу с манометром через силиконовую капиллярную трубку, а затем установите иглу на иглодержатель иглошлифовального станка. Отрегулируйте угол наклона иглы относительно шлифовальной пластины до 35° (рисунок 1А, В).
  5. Отрегулируйте положение кончика иглы чуть выше поверхности шлифовальной пластины с помощью ручки грубого управления под микроскопом (рис. 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вытягиваемые иглы, полученные в разделе 2, имеют конус 6-8 мм и наконечник менее 1 мкм (рис. 1D), как описано в руководстве пользователя съемника.
  6. Поддерживайте внутреннее давление иглы на уровне 40 фунтов на квадратный дюйм с помощью ножного воздушного насоса. Отрегулируйте положение кончика иглы с помощью ручки точного управления под микроскопом и сделайте так, чтобы кончик иглы касался шлифовальной пластины.
  7. Измельчаем в течение 3-5 с. Когда из кончика иглы выйдут крошечные пузырьки воздуха, разрядите иглу (рисунок 1E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В процессе измельчения использование воздушного насоса предотвращает сифонирование измельчаемого раствора.
  8. Положите измельченные иголки в чехол для хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте как можно больше свежеизмельченных игл, хотя измельченные иглы можно хранить в футляре для хранения, по крайней мере, несколько недель перед микроинъекцией.

4. Подготовка пипеток к загрузке плазмид

  1. Нагрейте пипетку объемом 200 мкл с помощью внешнего пламени спиртовой горелки.
  2. Как только он начнет плавиться, растяните пипетку.
  3. Отрежьте запечатанный конец растянутой пипетки ножницами, и после этого растянутая пипетка готова к загрузке ДНК в измельченную иглу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы в продаже имеются очень длинные и тонкие наконечники для заполнения шлифованных игл.
  4. Поместите эти пипетки в автоклавный пластиковый ящик.

5. Сбор эмбрионов

  1. Соберите мух (vas-phiC31; + ; attP2), экспрессирующих интегразу phiC31 и несущих место стыковки attP2 через 3 дня после вылупления из 50 флаконов, и перенесите их в клетку (φ 90 мм х 150 мм). Добавьте немного свежей дрожжевой пасты в центр каждой пластины виноградного агара18.
  2. Подготовьте 2-4 клетки с мухами. Держите клетки и пластины при температуре 25 °C и меняйте пластины каждый день в течение 2-4 дней.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании трансген vas-phiC31 (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) на первой хромосоме и трансген attP2 (Stock # 36313, Bloomington Drosophila Stock Center) на третьей хромосоме. Полученный запас (vas-phiC31; + ; attP2) используется в этом протоколе. Дрожжевую пасту нужно готовить ежедневно, а свежую дрожжевую пасту нужно скармливать мухам. Замененные клетки необходимо очистить и высушить, чтобы избавиться от оставшихся в клетках эмбрионов.
  3. В день микроинъекции утром меняйте кейджи и планшеты. Затем меняйте пластины каждые 30 минут и собирайте эмбрионы из этих пластин. Замените все клетки и пластины при комнатной температуре (RT), а затем поддерживайте температуру в клетках и пластинах при температуре 25 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые протоколы предпочитают инкубировать клетки и планшеты при температуре 18 °C для откладывания яиц. Это зависит от количества эмбрионов, необходимых для микроинъекций.

6. Дехорионизирующие эмбрионы

  1. Приготовьте 30% отбеливатель, смешав 60 мл отбеливателя (с содержанием активного хлора 34-46 г/л) и 140 мл воды двойной дистилляции.
  2. Удалите оставшихся мух на виноградном соке агаровыми пластинами с помощью щетки или щипцов, а зародыши промойте в ячейке ситечка с двойной дистиллированной водой.
  3. Высушите клеточное ситечко, содержащее эмбрионы, папиросной бумагой.
  4. Поместите его в чашку Петри, содержащую 30% отбеливателя, и поворачивайте сетчатое фильтр вручную или с помощью горизонтального шейкера в течение 1,5 минут при 60 оборотах в минуту.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полоскание является критически важным этапом. Если время промывания будет недостаточно длительным, оболочка эмбриона не сойдет полностью. Если время полоскания будет слишком долгим, это приведет к тому, что эмбрион станет мягким и легко сломается. Сетчатое фильтр должно быть полностью погружено в 30% отбеливатель. Наденьте резиновые перчатки и лабораторный халат, чтобы избежать травм, вызванных отбеливателем.
  5. Промойте эмбрионы в течение 2 минут двойной дистиллированной водой, хранящейся в лабораторной пластиковой бутылке для мытья, чтобы удалить остатки отбеливателя. Выберите плавающие эмбрионы для состава.

7. Выстраивание эмбрионов в линию

  1. Твердый виноградный сок агара нарезать длинными полосками с помощью лезвия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте фиолетовый виноградный сок, чтобы облегчить выравнивание белых эмбрионов.
  2. Перенесите эмбрионы на длинную полоску с помощью кисти.
  3. Выровняйте около 60 эмбрионов с помощью препарирующей иглы вдоль края длинной полоски так, чтобы их задние части были обращены к внешней стороне полоски. Выстройте в линию около 60 эмбрионов в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микропил представляет собой конусообразный выступ на переднем полюсе эмбриона, через который сперматозоид проникает для оплодотворения ооцита (Рисунок 2А). Поэтому по конусообразному выступу на переднем полюсе эмбриона легко определить заднюю часть дехорионированного эмбриона.
  4. Поместите двустороннюю ленту диаметром 18 мм вдоль края покровного стекла (18 мм x 18 мм) и снимите бумажную подложку. Аккуратно прижмите покровную крышку к выровненным эмбрионам. Убедитесь, что эмбрионы приклеены к центру ленты.

8. Высиживание эмбрионов

  1. Поместите покровную крышку с выстроенными в линию эмбрионами в коробку с влагопоглотителем. Время сушки варьируется в зависимости от температуры и влажности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время сушки имеет решающее значение для микровпрыска и должно быть определено экспериментально. Время сушки обычно составляет 9-10 минут летом и 17-18 минут зимой.
  2. Накройте эмбрионы галоидоуглеродным маслом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не капайте слишком много масла на эмбрионы, так как лишнее масло может перелить клей. Объемное соотношение галоидоуглеродного масла 700 и галоидоуглеродного масла 27 составляет 1:3.

9. Микроинъекции эмбрионов

  1. Загрузите 2 мкл ДНК в иглу с помощью растянутой пипетки. Следите за тем, чтобы в игле не было пузырьков. Поместите иглу в иглодержатель микроманипулятора.
  2. Поместите выровненные эмбрионы, покрытые галоидоуглеродным маслом, под перевернутый микроскоп. Следите за тем, чтобы задние концы эмбрионов были обращены к игле.
  3. С помощью микроманипулятора приблизьте иглу к эмбрионам. Очистите иглу. Убедитесь, что капля жидкости, выходящая из иглы, видна. Начиная с давления впрыска 300 гПа и равновесного давления 20 гПа, отрегулируйте давление впрыска и равновесное давление, чтобы обеспечить оптимальный размер капли жидкости.
  4. С помощью микроманипулятора введите иглу в задние концы эмбрионов, а с помощью ножного регулятора, подключенного к микроинъектору, введите ДНК (Рисунок 2). Если виден небольшой ореол, ДНК успешно вводится в эмбрион.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите многоядерные эмбрионы для инъекции и убейте более старые эмбрионы с помощью кнопки «очистить». Если после инъекции вытекает большое количество цитоплазмы, эмбрионы недосушиваются. Если после инъекции утекает лишь небольшое количество цитоплазмы или ее отсутствие, инъекции считаются успешными. Если более чем у одной трети эмбрионов после инъекции вытекает цитоплазма, продлите время сушки на 1-2 минуты. Если более трети эмбрионов пересушены, сократите время сушки на 1-2 минуты.
  5. Извлеките иглу из эмбриона. Переместите иглу к заднему концу следующего эмбриона. Повторите описанные выше действия.
  6. Поместите введенные эмбрионы в агаровую пластину. Поставьте тарелку в комнату при температуре 18-20 °C. На следующий день перенесите планшет в инкубатор при температуре 25 °Cи влажности 50%-60%, и выдержите 1 сутки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После инъекции держите эмбрионы при температуре 18-20 °C, чтобы замедлить их развитие, облегчить интеграцию плазмидной ДНК в геном дрозофилы и повысить выживаемость введенных эмбрионов.

10. Сбор личинок

  1. С помощью иглы для пресечения соскрестите и разрыхлите пищу во флаконе. Снабдите еду несколькими каплями дистиллированной воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте дистиллированной воде впитаться в пищу, чтобы предотвратить утопление личинок.
  2. Достаньте тарелки из инкубатора.
  3. Соберите вылупившихся личинок кистью под стереомикроскопом и перенесите их во флакон.
  4. Поместите флакон в инкубатор при температуре 25 °Cи влажности50%-60%.

11. Получение трансгенных мух

  1. Соберите вылупившихся мух после инкубации флакона при температуре 25 °Cв течение 10 дней.
  2. Скрестите одну самку с тремя девственными самками балансиров TM2/TM6C Sb1 Tb1 и скрестите одну самку с тремя самцами балансиров TM2/TM6C Sb1 Tb1 .
  3. Поместите кроссы в инкубатор при температуре 25 °C и влажности 50%-60%.
  4. Проверяйте потомство на наличие мух с оранжевыми глазами. Это трансгенные мухи (рис. 3A-C).
    Примечание: Мухи, несущие копию трансгена в месте стыковки attP2, имеют оранжевые глаза.
  5. Скрестите одну оранжевоглазую муху с тремя девственными самками балансиров TM2/TM6C Sb1 Tb1 , чтобы создать поголовье.
    Примечание: Необходимо создать более одного поколения скрещиваний для того, чтобы вычеркнуть трансген phiC31 на первой хромосоме.

Результаты

Кончик инъекционной иглы скошен с помощью игольчатого станка (Рисунок 1). За час можно скосить 50-60 спиц. ДНК микроинъецируется в заднюю часть эмбриона на стадии пребластодермы или синцитиальной бластодермы, где ядра имеют общую цитоплазму (рис. 2A). Задняя часть эмбриона может быть легко локализована на основе микропилы в передней части эмбриона (рисунок 2A). Эмбрионы на стадиях клеточной бластодермы и гаструляции не могут быть использованы для инъекций, так как каждое ядро на этих стадиях окружено клеточной мембраной, и тем самым шанс получения трансгенных мух практически равен нулю (рис. 2В). Пересушенные эмбрионы деформируются при проколе и не могут быть использованы для микроинъекций (рисунок 2В). Недосушенные эмбрионы могут выдавливать большое количество цитоплазмы при проколе иглой (Рисунок 2D), что приводит к снижению выживаемости эмбрионов. Эмбрионы, которые были надлежащим образом высушены, могут вытекать или не вытекать из небольшого количества цитоплазмы при введении (рисунок 2E).

Линия дрозофилы, экспрессирующая интегразу phiC31 и несущая сайт стыковки attP2, который используется для микроинъекции эмбриона в этом протоколе, имеет белые глаза (рисунок 3A), а возрастные мухи этого генотипа имеют розовые глаза, образующиеся в результате накопленного красного флуоресцентного белка, экспрессируемого специфически в глазу (рисунок 3B). Мы используем ген мини-белого цвета в качестве селективного маркера трансгенеза у дрозофил, а трансгенные мухи идентифицируются по цвету глаз от светло-желтого до красного. Трансгенные мухи, несущие трансген в месте стыковки attP2, имеют оранжевые глаза (рис. 3C), которые можно легко отличить от мух, не несущих трансгенов.

figure-results-1
Рисунок 1: Шлифовка игл. (A) Ножной воздушный насос с манометром используется для подачи давления воздуха на иглу. (В) Игла устанавливается на игольчатый станок под углом 35° к поверхности шлифовальной пластины. (C) Используйте ручку грубой регулировки, чтобы расположить кончик иглы прямо над поверхностью шлифовальной пластины, затем используйте ручку точной регулировки, чтобы начать снятие фаски с наконечника. (D) Кончик вытянутой иглы находится под микроскопом. Масштабные линейки = 10 мкм. (E) Скошенная игла находится под микроскопом. Скошенный кончик иглы обозначается стрелкой. Масштабные линейки = 10 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Эмбрионы дрозофилы, пригодные для микроинъекций. (A) Эмбрион дрозофилы на стадии до бластодермы или синцитиальной бластодермы может быть введен в задний полюс эмбриона, обозначенный красным эллипсом. Микропила на переднем полюсе эмбриона обозначается стрелкой. (B) Эмбрион дрозофилы на стадии клеточной бластодермы не может быть использован для микроинъекций. (C) Эмбрион, который чрезмерно высушен, выглядит деформированным. (D) Недостаточная десикация эмбриона приводит к большой цитоплазматической утечке после инъекции. (E) Для успешной инъекции может вытекать небольшое количество цитоплазмы. Масштабные линейки = 50 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Цвет глаз трансгенной дрозофилы , несущей трансген в месте стыковки attP2. (A) Инъекционная линия attP2, экспрессирующая интегразу phiC31 (vas-phiC31; + ; attP2), имеет белый глаз. RFP, специфически экспрессируемый в глазу, используется в качестве селективного маркера для трансгена phiC31. (B) Состаренная инъекционная линия attP2, экспрессирующая интегразу phiC31, имеет розовый глаз, образующийся в результате накопления белка RFP в глазу. (C) Мухи, несущие трансген, интегрированный в стыковочный узел attP2, имеют оранжевый глаз. Масштабные линейки = 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительная таблица 1: Трансгенез у дрозофил в результате микроинъекции эмбриона 100 различных плазмид. В общей сложности 100 различных плазмид различных концентраций в диапазоне от 20 нг/л до 1683 нг/л были введены в эмбрионы, а трансгенные мухи были получены для 85 из 100 плазмид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 2: Эффективность микроинъекции эмбриона для трансгенеза у дрозофил. В общей сложности 120 различных плазмид были введены в эмбрионы, а трансгенные мухи были получены для 101 из 120 плазмид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Здесь мы представляем протокол микроинъекции эмбриона для трансгенеза у дрозофилы. Для phiC31-опосредованного сайт-специфического трансгенеза мы вводили 120-140 эмбрионов в каждую плазмиду и получали, по крайней мере, одну трансгенную линию примерно для 85% плазмид (дополнительная таблица 2). По нашему опыту, плазмидная ДНК, выделенная с помощью набора для мини-подготовки плазмид, достаточна для трансгенеза у дрозофил. Концентрации плазмидной ДНК в диапазоне от 20 нг/л до 1683 нг/л могут не оказывать видимого влияния на успешность трансгенеза, поскольку большинство из них могут производить трансгенных мух (Дополнительная таблица 1).

Подготовка инъекционных игл имеет решающее значение для эффективной микроинъекции эмбриона. Инъекционная игла закрывается после того, как ее вытягивает иглосъемник. При рутинном phiC31-опосредованном трансгенезе у дрозофил кончик иглы обычно ломается покровным стеклом17. Тем не менее, случайно сломанные иглы часто не очень хорошо подходят для микроинъекций эмбриона, так как они могут блокироваться или вызывать утечку большого количества цитоплазмы и, таким образом, должны быть заменены новой во время инъекции. Инъекционные иглы, кончики которых скошены шлифовальной машиной, обычно не блокируются и не вызывают большой цитоплазматической утечки, что снижает частоту замены игл. Мы заметили, что шлифовальный раствор может попасть на скошенный кончик иглы, как только кончик открывается во время шлифования. Попав в иглу, растирающий раствор не будет быстро высыхать естественным путем. Чтобы предотвратить сифонирование измельчающего раствора, мы подключаем инъекционную иглу к ножному воздушному насосу с манометром. Во время шлифовки кончика иглы мы используем воздушный насос для подачи давления воздуха на иглу, благодаря чему шлифовальный раствор не попадает на скошенный кончик, что позволяет немедленно использовать скошенную иглу. Вместе ножной воздушный насос с манометром должны помочь ускорить трансгенез у дрозофил, особенно для большого количества плазмид.

Идентификация эмбрионов на стадии до бластодермы или синцитиальной бластодермы имеет решающее значение для микроинъекций19,20, поскольку инъекция эмбрионов на более поздних стадиях практически не производит трансгенных мух. Мухи в возрасте менее 10 дней используются для кладки яиц, так как они, как правило, откладывают больше яиц, чем более старые. В процессе дехорионизации эмбрионов используется клеточный фильтр для упрощения обработки отбеливателем и промывки эмбрионов двойной дистиллированной водой. После промывки эмбрионов плавающие эмбрионы указывают на то, что яичная скорлупа была хорошо обработана и может быть использована для последующей микроинъекции. Как дехорионация, так и время сушки эмбрионов имеют решающее значение для микроинъекций и должны быть оптимизированы экспериментально, поскольку длительное время дехорионации или сушки может убить эмбрионы. Время дехорионации и сушки зависит от температуры и влажности, которые меняются от места к месту и время от времени и должны быть соответствующим образом скорректированы в зависимости от скорости вылупления эмбриона.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Фонда научных исследований талантов высокого уровня Университета Южного Китая.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
100 μ m Сетчатый фильтрNEST258367
3M Двусторонний клей3M415
Боросиликатное стеклоSUTTERB100-75-10
Алмазная абразивная пластинаSUTTER104E
FLAMING/BROWN Съемник микропипетокSUTTERP-1000
Ножной воздушный насос с манометромShenfengSF8705D
Галогаминовое масло 27SigmaH8773
Галокарбоновое масло 700SigmaH8898
Инвертированный микроскопNikonECLIPSE Ts2R
Микроинжекционный насосeppendorfFemtoJet 4i
МикроманипуляторeppendorfTransferMan 4r
Микропипетка BevelerSUTTERЗащитные стекла для микроскопа BV-10
(18 мм x 18 мм)CITOLAS10211818C
Предметные стекла для микроскопа (25 мм x 75 мм)CITOLAS188105W
чашка Петри (90 мм x 15 мм)LAIBOER4190152
Photo-Flo 200Kodak1026269
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106
Stereo МикроскопNikonSMZ745

Ссылки

  1. Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
  2. Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster. Development. 134 (20), 3571-3584 (2007).
  3. Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phic31. Genetics. 166 (4), 1775-1782 (2004).
  4. Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phic31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (9), 3312-3317 (2007).
  5. Markstein, M., Pitsouli, C., Villalta, C., Celniker, S. E., Perrimon, N. Exploiting position effects and the gypsy retrovirus insulator to engineer precisely expressed transgenes. Nat Genet. 40 (4), 476-483 (2008).
  6. Bateman, J. R., Lee, A. M., Wu, C. T. Site-specific transformation of Drosophila via phic31 integrase-mediated cassette exchange. Genetics. 173 (2), 769-777 (2006).
  7. Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. P[acman]: A BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster. Science. 314 (5806), 1747-1751 (2006).
  8. Szabad, J., Bellen, H. J., Venken, K. J. An assay to detect in vivo Y chromosome loss in Drosophila wing disc cells. G3. 2 (9), Bethesda. 1095-1102 (2012).
  9. Ringrose, L. Transgenesis in Drosophila melanogaster. Methods Mol Biol. 561, 3-19 (2009).
  10. Van Der Graaf, K., Srivastav, S., Singh, P., Mcnew, J. A., Stern, M. The Drosophila melanogaster attp40 docking site and derivatives are insertion mutations of msp-300. PLoS One. 17 (12), e0278598(2022).
  11. Duan, Q., Estrella, R., Carson, A., Chen, Y., Volkan, P. C. The effect of Drosophila attp40 background on the glomerular organization of or47b olfactory receptor neurons. G3. 13 (4), Bethesda. 022(2023).
  12. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  13. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  14. Bellen, H. J., et al. The Drosophila gene disruption project: Progress using transposons with distinctive site specificities. Genetics. 188 (3), 731-743 (2011).
  15. Zirin, J., et al. Large-scale transgenic drosophila resource collections for loss- and gain-of-function studies. Genetics. 214 (4), 755-767 (2020).
  16. Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
  17. Fish, M. P., Groth, A. C., Calos, M. P., Nusse, R. Creating transgenic Drosophila by microinjecting the site-specific phic31 integrase mRNA and a transgene-containing donor plasmid. Nat Protoc. 2 (10), 2325-2331 (2007).
  18. Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bejsovec, A., Weir, M. Production of transgenic Drosophila. Methods Mol Biol. 136, 353-363 (2000).
  19. Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (6), 2199-2203 (1995).
  20. Carmo, C., Araujo, M., Oliveira, R. A. Microinjection techniques in fly embryos to study the function and dynamics of SMC complexes. Methods Mol Biol. 2004, 251-268 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DrosophilaPhiC31

Похожие статьи