Методическая статья

Визуализация в реальном времени для количественной оценки клеточной радиочувствительности в опухолевых органоидах, полученных от пациента

DOI:

10.3791/66680

⸱

5 апреля 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, Weill Cornell Medical College, 2Sandra and Edward Meyer Cancer Center, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, 4Caryl and Israel Englander Institute for Precision Medicine, 5Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medical College

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы подробно описываем простой подход к визуализации в реальном времени для количественной оценки чувствительности опухолевых органоидов пациента к ионизирующему излучению.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лучевая терапия (ЛТ) является одним из основных элементов современного клинического лечения рака. Тем не менее, не все типы рака одинаково чувствительны к облучению, часто (но не всегда) из-за различий в способности злокачественных клеток восстанавливать окислительные повреждения ДНК, вызванные ионизирующими лучами. Клоногенные анализы использовались на протяжении десятилетий для оценки чувствительности культивируемых раковых клеток к ионизирующему облучению, в основном потому, что облученные раковые клетки часто умирают с задержкой, которую трудно количественно оценить с помощью методов краткосрочной проточной цитометрии или микроскопии. К сожалению, клоногенные анализы не могут быть использованы как таковые для более сложных моделей опухолей, таких как опухолевые органоиды (PDTO), полученные от пациента. Действительно, облучение укоренившихся PDTO не обязательно может привести к прекращению их роста как многоклеточных единиц, если их стеблевидный компартмент не будет полностью уничтожен. Кроме того, облучение суспензий одиночных клеток, полученных из PDTO, может не отражать должным образом чувствительность злокачественных клеток к ОТ в контексте установленных PDTO. В данной статье мы подробно описываем адаптацию традиционных клоногенных анализов, которая включает в себя воздействие ионизирующего излучения на устоявшиеся PDTO с последующей диссоциацией одиночных клеток, повторным покрытием в подходящих условиях культивирования и визуализацией в реальном времени. Необлученные (контрольные) стволовые клетки, полученные из PDTO, реформируют растущие PDTO с PDTO-специфической эффективностью, на которую отрицательно влияет облучение дозозависимым образом. В этих условиях эффективность и скорость роста PDTO могут быть количественно оценены как мера радиочувствительности на покадровых изображениях, собранных до тех пор, пока контрольные PDTO не достигнут заданного пространства заполнения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дистанционная лучевая терапия (ЛТ) является одним из столпов современной онкологии, отражая не только выраженную противоопухолевую активность, связанную с четко определенным спектром в целом управляемых побочных эффектов1, но и исключительно широкую клиническую доступность (большинство онкологических центров в развитых странах оснащены современными линейными ускорителями для дистанционной лучевой лучевой терапии)2. В соответствии с этим представлением, ЛТ успешно применяется во всем мире как в целях лечения, как правило, в контексте ранних стадий заболевания3,4, так и в качестве паллиативного применения для сдерживания симптомов (например, боли) метастатических опухолей5. Тем не менее, не все злокачественные новообразования одинаково чувствительны к ЛТ, отражая ряд внутренних и микроэкологических особенностей раковых клеток 6,7,8,9. В качестве отдельного примера можно привести различные связанные с раком генетические и эпигенетические изменения, влияющие на репарацию ДНК и окислительно-восстановительный гомеостаз, которые были связаны с повышением или понижением внутренней радиочувствительности, в значительной степени отражающей способность ОТ убивать раковые клетки, вызывая прямое и зависимое повреждение ДНК и других макромолекул 10,11,12,13.

В течение последних десятилетий для оценки радиочувствительности культивируемых раковых клеток человека и мышей регулярно применялись клоногенные анализы 14,15,16. Действительно, в то время как химиотерапевтические препараты и другие стрессоры часто убивают злокачественные клетки довольно быстрым образом, ЛТ, применяемые в клинически значимых дозах, чаще всего вызывают отсроченную форму гибели клеток, которую невозможно просто количественно измерить с помощью методов кратковременной проточной цитометрии или микроскопии, таких как измерение поглощения клетками жизненно важных красителей (которые избирательно окрашивают мертвые клетки) через 24-72 часа после воздействия цитотоксическогостимула. Помимо того, что клоногенные анализы просты и основаны на довольно недорогих реагентах, они особенно удобны, поскольку они позволяют реализовать так называемую «линейную квадратичную» модель, которая является достаточно простым математическим инструментом для количественного анализа реакции на дозу ОТ18,19. Аналогичным образом, культивируемые раковые клетки (включая установленные клеточные линии, а также первичные клетки, полученные от пациента) обеспечили удобную платформу для тестирования различных аспектов биологии рака, включая (но не ограничиваясь) чувствительность к лечению довольно простым, но упрощенным способом, одним из основных ограничений является отсутствие структурированного микроокружения опухоли (TME)20. 21. Действительно, двумерные культуры раковых клеток по своей природе неспособны повторять межклеточные коммуникации и взаимодействия с внеклеточным матриксом, как это происходит при раке22,23. Опухолевые органоиды (PDTO), полученные от пациентов, появились в качестве моделей опухолей, которые, по крайней мере, частично обходят это ограничение 24,25,26.

К сожалению, обычные клоногенные анализы не могут быть использованы для оценки радиочувствительности PDTO. С одной стороны, облучение укоренившихся PDTO не обязательно может поставить под угрозу их рост как многоклеточной единицы, если не будет полностью уничтожен их стволовой компартмент, который отвечает за образование и созревание PDTO, но демонстрирует повышенную устойчивость к повреждению ДНК по сравнению с более дифференцированными клетками, композиционирующимиPDTO27. С другой стороны, облучение суспензий одиночных клеток, полученных из PDTO, не может должным образом компенсировать радиочувствительность PDTO-компонующих (в том числе стволовых) клеток, как это проявляется в контексте сформированных PDTO. В этой статье мы подробно описываем метод, который использует визуализацию PDTO рака молочной железы в реальном времени для мониторинга эффективности PDTO-образования и скорости роста клеток, полученных из PDTO, ранее подвергшихся ионизирующему облучению, по сравнению с их необлученными аналогами. С учетом требуемых вариаций, в значительной степени отражающих дифференциальную биологию отдельных PDTO (например, потребности в питательных средах, скорость роста), мы ожидаем, что этот протокол будет подходящим для изучения радиочувствительности в широкой группе PTDO как молочного, так и немолочного происхождения.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Реагенты и оборудование, использованные в исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Органоидная культура

ПРИМЕЧАНИЕ: TNBC#1 PDTO были созданы в нашей лаборатории на основе опухолевой ткани, удаленной хирургическим путем у пациента с трижды негативным раком молочной железы (TNBC), который дал информированное согласие на участие в протоколе биобанкинга (IRB21-06023682). После валидации с помощью гистологии и секвенирования РНК (RNAseq) PDTO TNBC#1 культивируют в 66% каплях матрицы (так называемых «куполах») в обогащенной культуральной среде DMEM/F12 (Таблица 1) и пассажируют каждые 2-3 недели в соотношении 1:2-1:1028.

  1. Засейте PDTO в соотношении 1:2-1:10 примерно за 2 недели до облучения в отдельных, неадгезивных 6-луночных планшетах, по одному на каждую тестируемую дозу облучения (плюс отрицательный контроль, который будет обеспечен PDTO, не подвергшимися воздействию ионизирующего излучения).
  2. Добавляйте 3 мл свежей обогащенной питательной среды DMEM/F12 в PDTO каждые 3-4 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Условия посева и культивирования могут потребовать некоторой адаптации, чтобы предотвратить приобретение PDTO очень узнаваемого, кольцеобразного вида, который указывает на некроз ядра под микроскопом, и обеспечить оптимальную жизнеспособность при облучении.

2. Радиация

  1. PDTO готовы к облучению, как только они достигнут среднего размера (около 100 мкм, что предварительно определено с помощью микроскопии в светлом поле с эталонным масштабом) и заполняемости купола (около 80%). Пройдите PDTO на этом этапе, чтобы избежать переполненности.
  2. Облучайте купола, содержащие PDTO, с помощью облучателя Small Animal Research Radition Platform (SARRP) (или альтернативного облучателя для применения in vitro или in vivo ) в режиме открытого поля (без коллиматора), подавая однократные дозы 2 Гр, 4 Гр, 6 Гр, 8 Гр и 10 Гр. Необлученные PDTO обеспечивают соответствующие негативные условия контроля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Калибровка дозиметрических испытаний должна проводиться перед каждым экспериментом, чтобы гарантировать, что PDTO, заключенные в Matrigel, получают запланированную дозу облучения. Эти дозы были выбраны на основе предварительных оценок радиочувствительности PDTO TNBC#1 и, следовательно, могут потребовать коррекции для других PDTO.

3. Диссоциация

  1. Сразу после облучения промойте каждый PDTO-содержащий купол матрицы 2 мл обогащенной питательной среды DMEM/F12 и повторно суспендируйте их в 1-3 мл TrypL-E с помощью микропипетки p1000. Повторите около 30 раз для каждой лунки.
  2. Соберите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 50 мл и инкубируйте в течение ~5 минут на водяной бане при 37 °C.
  3. Гранулируйте ячейки, центрифугируя их при 800 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
  4. Удалите избыток TrypL-E, чтобы оставить ~1 мл в пробирке, и добавьте в 3 раза больше исходного объема фермента (см. шаг 3.1) обогащенной среды DMEM/F12 для промывания клеток.
  5. Отфильтруйте суспензию ячейки с помощью сетчатого фильтра 40 мкм. Этот шаг гарантирует, что при покрытии не останется кластеров ячеек и что каждый новый PDTO происходит из одной клетки.
  6. Подсчитайте клетки в автоматическом счетчике клеток после окрашивания 10% трипанового синего в PBS и ресуспендируйте их до 800 клеток в 50 мкл обогащенной среды DMEM/F12 плюс 66% матригеля при 4 °C (условия для 1 купола).
  7. Нанесите пластины на каждый купол в отдельной лунке с помощью 48-луночного планшета, совместимого с системой динамической визуализации, избегая при этом образования пузырьков. Рекомендуются технические тройные значения для каждой дозы облучения.
  8. Поместите планшеты в инкубатор для клеточных культур (37 °C, 5%CO2) на 30 минут для затвердевания матрицы.
  9. Добавьте 0,5-1 мл обогащенной среды DMEM/F12, удалите потенциальные пузырьки и поместите планшеты в систему визуализации в реальном времени внутри инкубатора для культивирования клеток. Дайте планшету уравновеситься до заданной температуры в течение примерно 30 минут перед визуализацией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Матригель затвердевает при температуре >4 °C, что означает, что эта температура должна сохраняться до тех пор, пока не потребуется затвердевание.

4. Живая визуализация

  1. В программном обеспечении Incucyte выберите Schedule to Aquire.
  2. Нажмите на знак плюса в левом верхнем углу кнопки «Запустить и добавить судно».
  3. Чтобы выполнить повторное или однократное сканирование, выберите «Сканировать по расписанию», а затем нажмите «Далее».
  4. Чтобы создать или восстановить сосуд, выберите «Создать новое судно», а затем нажмите «Далее».
  5. Чтобы выбрать тип сканирования, выберите «Органоид», а затем нажмите «Далее».
  6. Настройки сканирования: Выберите QC < ' Фаза + Каналы светлого поля. Автоматически выбирается «4x Цель». Затем нажмите « Далее».
  7. Выбор судна: Выберите подходящую номерную знак, проверенную программным обеспечением, в соответствии с каталожным номером.
  8. Местонахождение судна: Выберите расположение пластины на инструменте в соответствии с раскладкой, а затем нажмите на кнопку «Далее».
  9. Шаблон сканирования: Выберите скважины в соответствии с расположением пластин, затем нажмите « Далее».
  10. Записная книжка для судна: Табличка с именем (Необязательно: Тип ячейки и Проход). Создайте карту табличек, нажав на знак плюса в правом верхнем углу макета таблички «Создать карту табличек».
  11. В Редакторе карт пластин укажите тип ячейки, нажав на значок «Создать новую ячейку » в разделе «Ячейки », примените к соответствующим скважинам, нажав на значок плюса , и выберите подходящие скважины. Дополнительно: Может быть указано количество засеянных ячеек и проходов. Повторите для каждой клеточной линии.
  12. Укажите обработку, нажав на значок «Создать новую ячейку » в разделе «Условия роста », примените к соответствующим скважинам, нажав на значок плюса , и выберите подходящие лунки. Повторите для каждого условия эксперимента. Далее нажмите на Ok > Next.
  13. Настройка анализа: "Отложить анализ на потом" выбирается автоматически; нажмите « Далее».
  14. Расписание сканирования: Выберите сканирование два раза в день, на неопределенный срок. Нажмите на кнопку «Далее». Отслеживайте темноту управляющих PDTO для идеальной конечной точки, так как они имеют тенденцию разрушаться при зарастании.
  15. Сводка: Проверьте сводку и нажмите « Добавить в расписание».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Свойства сканирования могут быть визуализированы, а график может быть отредактирован при необходимости, щелкнув правой кнопкой мыши на временной шкале сканирования.

5. Анализ

  1. В совместимом программном обеспечении выберите Вид. Им также можно управлять с компьютера, подключенного к системе через интранет.
  2. Выберите нужный эксперимент, дважды кликнув по нему.
  3. Выберите значок «Запустить анализ ».
  4. Выберите Create New Analysis Definition (Создать новое определение анализа) и нажмите кнопку Next (Далее).
  5. Тип анализа: Выберите Organoid и нажмите Далее.
  6. Каналы изображения: По умолчанию выбран параметр «Фаза + Яркое поле», нажмите «Далее».
  7. Выберите набор репрезентативных изображений для анализа. Нажмите на кнопку «Далее». Рекомендуется выбирать ранние и поздние временные точки и различные условия лечения, например, контроль и различные дозы облучения.
  8. Выполните определение анализа для TNBC#1, выполнив следующие действия:
    1. На изображении: выберите «Предварительный просмотр текущего » или «Предварительный просмотр всех», чтобы визуализировать маску по умолчанию для текущих или выбранных изображений. Повторите эти действия, так как параметры анализа изменяются для обновления маски.
    2. Сегментация: установите Радиус на 300, Фон чувствительности на 80, Разделение краев на ВКЛ, а Чувствительность краев на 70.
    3. Очистка: Установите Заполнение отверстий на 5E+05 μм2 и Установите размер на 0 пикселей.
    4. Фильтры: Установите no min or max Area, min Eccentricity установите значение 0.19 и не установите max Excentricity. Нажмите на кнопку «Далее».
  9. Время сканирования и лунки: Выберите все нужные временные точки и лунки сканирования. Нажмите на кнопку «Далее». Необязательно: Выберите «Анализировать будущие сканирования».
  10. Сохраните и примените определение анализа: Введите имя определения и нажмите кнопку Далее.
  11. Визуализируйте резюме и нажмите « Готово».
  12. Появляется всплывающее окно, информирующее пользователя о том, что анализ попал в очередь анализа. Нажмите « ОК». Как только откроется окно «Очередь анализа», можно визуализировать оставшиеся задачи.
  13. При необходимости получите завершенный анализ в Виде , выбрав синюю стрелку в столбце «Анализы » рядом с названием судна и щелкнув правой кнопкой мыши по имени определения анализа. Затем либо визуализируйте необработанные данные в программном обеспечении, нажав на «Метрики анализа графиков», либо экспортируйте для дальнейшего анализа, выбрав «Экспорт определения анализа».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экспорт необработанных данных можно настроить в окне Метрики анализа графиков . Количество органоидов, общая площадь, средний эксцентриситет и темнота могут быть экспортированы отдельно, а данные организованы в раскрывающемся меню « Выбрать группировку », если щелкнуть « Нет», «Столбцы», «Строки» или «Репликация карты пластин». Для TNBC#1 для экспорта необработанных данных, метрик анализа графиков и для опции свертывания Выбрать группировку был выбран вариант Нет . Эти параметры импорта были выбраны на основе предварительных оценок с помощью PDTO TNBC#1. Следовательно, они могут потребовать корректировки для других PDTO, что возможно в программном обеспечении, основанном на функциях «Предварительного просмотра». Мы рекомендуем адаптировать параметры импорта для (1) ранних изображений, которые в основном содержат одиночные клетки или небольшие PDTO, и (2) изображений, собранных в поздние моменты времени, чтобы гарантировать, что большие PDTO также будут получены как в контрольных, так и в обработанных условиях.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TNBC#1 PDTO подвергались воздействию однократной дозы облучения 0 (необлученный контроль), 2 Гр, 4 Гр, 6 Гр, 8 Гр или 10 Гр в день 0. Сразу после этого PDTO диссоциировали для получения одноклеточной суспензии для каждого экспериментального условия. Затем клетки, полученные из PDTO, были засеяны в 48-луночные планшеты в 66% матригелевых куполах (50 мкл каждый), отложенных в центре лунок, по 3 технических повторения в каждом состоянии. Планшеты были помещены в систему визуализации в реальном времени и визуализировались каждые 6 часов с использованием объектива органоидного модуля 4X в течение 30 дней. Облучение PDTO TNBC#1 методом РТ в однократной дозе 2 Гр значительно замедляло восстановление PDTO, в то время как завершенные дозы облучения ≥4 Гр (до 10 Гр) предотвращали регенерацию растущих PDTO (рис. 1).

figure-results-1
Рисунок 1: Визуализация опухолевых органоидов (PDTO) пациента в режиме реального времени. Опухолевые органоиды (PDTO) рака молочной железы TNBC#1, полученные от пациента, не лечили или подвергали воздействию указанной дозы облучения, после чего вскоре проводили диссоциацию, реплайнирование и визуализацию с помощью системы визуализации живых клеток. Представлены репрезентативные изображения после корректировки контраста (А) и количественных оценок (В, среднее значение ± SEM). Масштаб изображения: 1,19 x 1,16 мм (1,38 мм2). Масштабная линейка: 400 μм; вставки: 200 мкм. ****p < 0,001 (двусторонний ANOVA, по сравнению с 0 Гр); ####p < 0,001 (двусторонний ANOVA, по сравнению с 2 Гр). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

КомпонентКонцентрация
DMEM F/12В 1 раз
ГлутаМаксВ 1 раз
Хепес10 мМ
ПенСтрептококк100 Ед/мл
В27В 1 раз
нАк1,25 мМ
Никотинамид10 мМ
Ингибитор рецептора TGFbeta A83-010,5 мкМ
Ингибитор p38 MAP p38i SB2021901 мкМ
Башка10%
Рспондин Медиа10%
ФГФ1020 нг/мл
ФГФ75 нг/мл
НР (Херегулин)5 нМ
Примоцин100 мкг/мл
Y-27632 (РоКи)5 мкМ
Эпидермальный фактор роста hEGF5 нг/мл

Таблица 1: Состав питательной среды PDTO.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы описываем адаптацию традиционных клоногенных анализов, которая использует PDTO рака молочной железы и визуализацию в реальном времени для количественной оценки радиочувствительности PDTO на основе (1) стойкости PTDO-образующих стволовых клеток при облучении PDTO in vitro и (2) скорости роста PDTO, которые эти клетки (могут) генерировать. Важнейшие этапы этого протокола включают в себя: (1) установление ФДТО до уровня купола, обеспечивающего хорошую жизнеспособность, (2) воздействие ФДТО ионизирующим облучением в различных дозах, включая имитационные условия облучения в контрольных условиях; (3) диссоциация PDTO на отдельные клетки; (4) повторное осаждение одиночных клеток, полученных из PDTO; и (5) визуализация в реальном времени до заданной занятости купола в контрольных условиях.

С минимальными модификациями, в основном связанными с эффективностью формирования PDTO и скоростью роста PDTO в контрольных условиях (которые, вероятно, будут значительно варьироваться в зависимости от разных PDTO), мы ожидаем, что этот протокол будет адаптирован к нескольким коммерчески доступным платформам визуализации в реальном времени, а также к многочисленным PDTO, как молочного, так и немолочного происхождения. С одной стороны, ожидается, что исходная эффективность PDTO-образования при диспергировании одиночных клеток будет влиять на количество одиночных клеток, подлежащих повторному посеву для получения новых PDTO с плотностью, позволяющей не только количественное определение PDTO на основе изображений, но и нормальный рост необработанных PDTO. С другой стороны, ожидается, что скорость роста PDTO повлияет на продолжительность анализа, поскольку следует избегать слияния смежных PDTO для сохранения оптимальных аналитических возможностей. Таким образом, определение PDTO-образующей эффективности и скорости роста PDTO в контрольных условиях для каждого отдельного PDTO имеет решающее значение для корректной реализации данного протокола.

Хотя этот метод считается довольно простым, он имеет некоторые ограничения. Во-первых, чрезмерно малое количество PDTO-образующих клеток может нарушить регенерацию нормально растущих PDTO при диссоциации одиночных клеток. Действительно, в то время как рутинное пассирование PDTO может быть достигнуто путем неполной диссоциации, количественные оценки, предлагаемые этим протоколом, основаны на генерации суспензии одной клетки (что может быть визуально подтверждено во время подсчета). Во-вторых, чрезмерно медленный темп роста может значительно увеличить продолжительность анализа и потенциально привести к неточной оценке радиочувствительности. Вполне возможно, что увеличенное время культивирования, необходимое для достижения медленно растущими PDTO размера, совместимого с конечной точкой, может дать дополнительные шансы сублетально облученным PDTO-образующим клеткам восстановиться от стресса и восстановить обнаруживаемые (хотя и медленно растущие) PDTO. Наконец, ожидается, что диссоциация PDTO вскоре после облучения создаст дополнительную нагрузку на PDTO-образующие клетки, потенциально повышая радиочувствительность в результате изменения межклеточных коммуникаций на ранних стадиях восстановления. Отсрочка диссоциации на 24-72 ч может дать представление об относительном вкладе сохраненных межклеточных коммуникаций в способность PDTO-образующих клеток восстанавливаться после макромолекулярных повреждений, вызванных РТ.

В то время как платформы визуализации в реальном времени предлагают удобный метод мониторинга образования и роста PDTO в продольном направлении, изображения с одной конечной точкой также могут использоваться для той же цели. В этом случае следует обратить внимание на то, чтобы соседние PDTO не сливались до получения изображений, а скорость роста может быть оценена как функция размера PDTO, нормализованной к продолжительности анализа.

В эпоху персонализированной медицины рака оценка чувствительности отдельных опухолей к лечению имеет первостепенное значение, поскольку она дает некоторые подсказки для разработки индивидуальных терапевтических стратегий с повышенной эффективностью. Описанный здесь протокол вписывается в эту задачу, обеспечивая удобный подход к оценке клеточной чувствительности отдельных PDTO к ионизирующему излучению (отдельно или в сочетании с другими терапевтическими модальностями). Тем не менее, позволяет ли измерение радиочувствительности раковых клеток от PDTO точно предсказывать реакцию отдельных пациентов с раком на фокальную ЛТ, еще предстоит продемонстрировать. Корреляция радиочувствительности отдельных PDTO к облучению с клинической реакцией на ЛТ их соответствующих доноров позволит получить важное представление об этой возможности.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Независимо от этой работы, SCF заключает контракты на проведение исследований с компаниями Merck, Varian, Bristol Myers Squibb, Celldex, Regeneron, Eisai и Eli-Lilly, а также получает гонорары за консультационные услуги от компаний Bayer, Bristol Myers Squibb, Varian, Elekta, Regeneron, Eisai, AstraZeneca, MedImmune, Merck US, EMD Serono, Accuray, Boehringer Ingelheim, Roche, Genentech, AstraZeneca, View Ray и Nanobiotix. Не связанная с этой работой, SD получала гонорары за консультационные услуги от Lytix Biopharma, EMD Serono, Ono Pharmaceutical, Genentech и Johnson & Johnson Enterprise Innovation Inc., а также имеет контракты на проведение исследований с Lytix Biopharma, Nanobiotix и Boehringer-Ingelheim. Не связанная с этой работой, LG заключает контракты на исследования с Lytix Biopharma, Promontory и Onxeo, получает гонорары за консультационные услуги от Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, OmniSEQ, Onxeo, The Longevity Labs, Inzen, Imvax, Sotio, Promontory, Noxopharm, EduCom и Luke Heller TECPR2 Foundation, а также владеет опционами на акции Promontory.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Раймонда Брионеса и Вэнь Х. Шена (Weill Cornell Medical College, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, США) за помощь в разработке данного протокола. Эта работа была поддержана грантом Консорциума по трансформационному раку молочной железы от BCRP Министерства обороны США (#W81XWH2120034, PI: Formenti).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
40 & микро; m сетчатый фильтрThomas Scientific1164H35
B27Invitrogen17504-044
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell CounterNexcelom
DMEM F/12Corning 12634-010
Эпидермальный фактор роста hEGFPeprotechAF-100-15
EVOS FL Цифровой инвертированный флуоресцентный микроскоп Thermo Fisher Scientific12-563-460
FGF10Peprotech100-26
FGF7Peprotech 100-19
GlutaMaxInvitrogen 
HepesInvitrogen 15630-080
Программное обеспечение IncuCyte 2021AВерсия Sartorius: 2021A
Incucyte SX1Sartoriusмодель SX1
Incucyte валидированная 48-луночная пластинаCorning 3548
MatrigelDiscovery Лабораторная посуда354230
nAcSigma Aldrich A9165-5G
НикотинамидSigma-AldrichN0636
NogginПриобретен в Институте точной медицины Ингландера, Вейл Корнелл, Нью-Йорк, США
Необработанный 6-луночный планшетCellstar657 185
NR (Heregulin)Peprotech100-03
p38 MAP ингибитор p38i SB202190Sigma Aldrich S7067
PBSCorning 21-040-CV
PenStrepInvitrogen15140-122
PrimocinInvivogenant-pm-1
Rspondin MediaПриобретено в Институте точной медицины Ингландера, Вейл Корнелл, штат Нью-Йорк, США
Исследовательская платформа радиационного излучения для мелких животных (SARRP) Xstrahl Ltd
Ингибитор рецепторов TGFbeta A83-01Tocris2939
Трипановый синий краситель (0,4%)Gibco15250-61
TrypLEGibco112605-028
Y-27632 (RhoKi)SelleckS1049
35050061

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Ruysscher, D., et al. Radiotherapy toxicity. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 13(2019).
  2. Bates, J. E., Sanders, T., Arnone, A., Elmore, S. N. C., Royce, T. J. Geographic density of linear accelerators and receipt of radiation therapy for prostate cancer. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 111, 3, Supplement e351-e352 (2021).
  3. Harmenberg, U., Hamdy, F. C., Widmark, A., Lennernäs, B., Nilsson, S. Curative radiation therapy in prostate cancer. Acta Oncol. 50, Suppl 1 98-103 (2011).
  4. Nakano, T., Ohno, T., Ishikawa, H., Suzuki, Y., Takahashi, T. Current advancement in radiation therapy for uterine cervical cancer. J Radiat Res. 51 (1), 1-8 (2010).
  5. Spencer, K., Parrish, R., Barton, R., Henry, A. Palliative radiotherapy. BMJ. 360, k821(2018).
  6. Price, J. M., Prabhakaran, A., West, C. M. L. Predicting tumour radiosensitivity to deliver precision radiotherapy. Nat Rev Clin Oncol. 20 (2), 83-98 (2023).
  7. McLaughlin, M., et al. Inflammatory microenvironment remodelling by tumour cells after radiotherapy. Nat Rev Cancer. 20 (4), 203-217 (2020).
  8. Rodriguez-Ruiz, M. E., Vitale, I., Harrington, K. J., Melero, I., Galluzzi, L. Immunological impact of cell death signaling driven by radiation on the tumor microenvironment. Nat Immunol. 21 (2), 120-134 (2020).
  9. Cytlak, U. M., et al. Immunomodulation by radiotherapy in tumour control and normal tissue toxicity. Nat Rev Immunol. 22 (2), 124-138 (2022).
  10. Hanahan, D. Hallmarks of Cancer: New Dimensions. Cancer Discov. 12 (1), 31-46 (2022).
  11. Groelly, F. J., Fawkes, M., Dagg, R. A., Blackford, A. N., Tarsounas, M. Targeting DNA damage response pathways in cancer. Nat Rev Cancer. 23 (2), 78-94 (2023).
  12. Renaudin, X. Reactive oxygen species and DNA damage response in cancer. Int Rev Cell Mol Biol. 364, 139-161 (2021).
  13. Klapp, V., et al. The DNA damage response and inflammation in cancer. Cancer Discov. 13 (7), 1521-1545 (2023).
  14. Constanzo, J., Garcia-Prada, C. D., Pouget, J. P. Clonogenic assay to measure bystander cytotoxicity of targeted alpha-particle therapy. Methods Cell Biol. 174, 137-149 (2023).
  15. Serrano-Mendioroz, I., Garate-Soraluze, E., Rodriguez-Ruiz, M. E. A simple method to assess clonogenic survival of irradiated cancer cells. Methods Cell Biol. 174, 127-136 (2023).
  16. Petroni, G., et al. Radiotherapy delivered before CDK4/6 inhibitors mediates superior therapeutic effects in ER(+) breast cancer. Clin Cancer Res. 27 (7), 1855-1863 (2021).
  17. Alvarez-Abril, B., et al. Cytofluorometric assessment of acute cell death responses driven by radiation therapy. Methods Cell Biol. 172, 17-36 (2022).
  18. Bodey, R. K., Evans, P. M., Flux, G. D. Application of the linear-quadratic model to combined modality radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 59 (1), 228-241 (2004).
  19. Unkel, S., Belka, C., Lauber, K. On the analysis of clonogenic survival data: Statistical alternatives to the linear-quadratic model. Radiat Oncol. 11, 11(2016).
  20. Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. Mouse models in oncoimmunology. Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).
  21. Buqué, A., Galluzzi, L. Modeling Tumor immunology and immunotherapy in mice. Trends Cancer. 4 (9), 599-601 (2018).
  22. Lee, S. Y., Bissell, M. J. A Functionally robust phenotypic screen that identifies drug resistance-associated genes using 3D cell culture. Bio Protoc. 8 (22), e3083(2018).
  23. Mina, J. Bissell: Context Matters. Trends Cancer. 1 (1), 6-8 (2015).
  24. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nat Rev Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  25. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: Model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  26. van Renterghem, A. W. J., van de Haar, J., Voest, E. E. Functional precision oncology using patient-derived assays: Bridging genotype and phenotype. Nat Rev Clin Oncol. 20 (5), 305-317 (2023).
  27. Vitale, I., Manic, G., De Maria, R., Kroemer, G., Galluzzi, L. DNA damage in stem cells. Mol Cell. 66 (3), 306-319 (2017).
  28. Sachs, N., et al. A Living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  29. Zhou, Z., et al. Harnessing 3D in vitro systems to model immune responses to solid tumours: A step towards improving and creating personalized immunotherapies. Nat Rev Immunol. 24, 18-32 (2024).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Clonogenic AssayRadiation TherapyPatient Derived OrganoidsIonizing IrradiationOrganoid Growth RateStem Like CellsPersonalized Medicine

Похожие статьи