Методическая статья

Выделение эндотелиальных клеток поджелудочной железы мыши

3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66690

⸱

21 июня 2024 г.

 ,  ,  ,  , 
1Irell and Manella Graduate School, City of Hope, 2Department of Diabetes Complications and Metabolism, City of Hope

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает выделение эндотелиальных клеток мыши из целой поджелудочной железы.

Аннотация

Поджелудочная железа является жизненно важным органом для поддержания метаболического баланса в организме, отчасти благодаря производству метаболических гормонов, таких как инсулин и глюкагон, а также пищеварительных ферментов. Поджелудочная железа также является сильно васкуляризированным органом, чему способствует сложная сеть капилляров поджелудочной железы. Эта обширная капиллярная сеть состоит из высокофенестрированных эндотелиальных клеток (ЭК), важных для развития и функционирования поджелудочной железы. Соответственно, дисфункция ЭК может способствовать дисфункции поджелудочной железы при таких заболеваниях, как диабет и рак. Таким образом, исследование функции ЭК поджелудочной железы (pECs) важно не только для понимания биологии поджелудочной железы, но и для развития ее патологий. Мышиные модели являются ценным инструментом для изучения метаболических и сердечно-сосудистых заболеваний. Тем не менее, не существует установленного протокола с достаточным подробным описанием для выделения ЭК мышей из-за относительно небольшой популяции ЭК и большого количества пищеварительных ферментов, потенциально высвобождаемых из ацинарной ткани, что может привести к повреждению клеток и, следовательно, к низкому выходу. Чтобы решить эти проблемы, мы разработали протокол обогащения и восстановления pEC мышей, сочетающий мягкую физическую и химическую диссоциацию и отбор, опосредованный антителами. Представленный здесь протокол обеспечивает надежный метод извлечения неповрежденных и жизнеспособных ЭК из всей поджелудочной железы мыши. Этот протокол подходит для нескольких последующих анализов и может быть применен к различным моделям мышей.

Введение

Поджелудочная железа, играющая ключевую роль в метаболическом контроле и гомеостазе, является сильно васкуляризированным органом. Поджелудочная железа выполняет как эндокринную, так и экзокринную функции, контролируя регуляцию уровня глюкозы в крови и пищеварительных ферментов соответственно. Эти два компартмента связаны между собой обширной сетью кровеносных сосудов поджелудочной железы, облегчающих обмен и транспортировку кислорода, гормонов и ферментов. Важно отметить, что эта плотная капиллярная сеть проникает в островок Лангерганса, скопление гормонорегулирующих клеток в поджелудочной железе, отвечающих за ее эндокринную функцию, состоящее из глюкагон-секретирующих альфа-клеток (α), инсулин-секретирующих бета-клеток (β) и соматостатин-секретирующих дельта-клеток (δ) 1,2. Хотя островки составляют всего 1-2% от массы поджелудочной железы, они получают 20% отобщего кровотока3, что подчеркивает важность сосудистой сети островков. Капилляры поджелудочной железы в основном состоят из высокофенестрированных эндотелиальных клеток (ЭК), которые окружены пристеночными перицитами. Эти капиллярные ЭК играют жизненно важную роль в развитии, созревании и (дис)функции островков и образуют тесные перекрестные связи с различными эндо- и экзокринными клетками4 (Рисунок 1).

Эндотелиальная дисфункция наблюдалась как при диабете 1, так и при диабете 2 типа, наиболее распространенных состояниях, вызванных дисфункцией островков поджелудочной железы 5,6. Плотность и морфология микрососудов островков могут быть изменены при сахарном диабете7. Кроме того, рак поджелудочной железы, высокоагрессивная опухоль, которая также может проявляться в виде сахарного диабета, характеризуется высокой микрососудистой плотностью при плохой перфузии8. Учитывая ключевую структурную и функциональную роль ЭК как в нормальной, так и в больной ткани поджелудочной железы, существует актуальная необходимость в изучении ЭК в развитии, физиологии и патологии, чтобы раскрыть механизмы, которые управляют здоровьем или болезнями.

Разработаны многочисленные протоколы для выделения ЭК у различных мышей (например, мозга 9,10, легких11, сердца12, печени13, скелетных мышц14 и жировых тканей15) и человека (например, мозга16, висцеральной жировой ткани17,18, периферических нервов19, легких 20,21,22 и брыжеечной артерии 23) тканей. Эти протоколы обычно включают использование ферментативных расщеплений (например, коллагеназой, трипсином24, диспазой 24,25 и либеразой26) с последующей стадией обогащения на основе антител. Кроме того, эти протоколы, как правило, основываются на длительной продолжительности переваривания в высоких концентрациях ферментов с энергичным перемешиванием при 37 °C (табл. 1). Из-за уникальных особенностей поджелудочной железы, в том числе из-за того, что она содержит множество эндогенных пищеварительных ферментов, эти существующие протоколы не могут быть непосредственно применены для выделения pEC. Во-первых, состав внеклеточного матрикса (ВКМ) поджелудочной железы отличается от других тканей. В то время как коллагеназа обычно используется для выделения ЭК, существует несколько подтипов с различными тканеспецифическими возможностями диссоциации, что требует оптимизации. Во-вторых, и это имеет решающее значение для выделения pEC, высвобождение и активация эндогенных ферментов поджелудочной железы может значительно замедлить процесс выделения. С этой целью необходимо соблюдать осторожность, чтобы свести к минимуму разрыв экзокринных ацинарных клеток (основного источника зимогенов, протеаз и РНКазы27), которые могут вызвать дальнейшее повреждение клеток и привести к низкой жизнеспособности клеток и общему эффекту восстановления 27,28,29.

Чтобы решить эти проблемы, мы адаптировали методы существующих протоколов изоляции КЭ и разработали новый протокол, подходящий для выделения КЭ из поджелудочной железы мыши. В частности, мы описываем здесь рабочий процесс (рис. 2) с использованием коллагеназы типа I (обычно применяемой для выделения ЭК легких), более низкой температуры пищеварения и отсутствия перемешивания (для предотвращения активации ферментов поджелудочной железы), а также добавок ДНКазы 30,31,32 (для предотвращения ДНК-индуцированного апоптоза и улучшения жизнеспособности клеток), а также антител к CD3133 (PECAM1, пан-EC маркер). В соответствии с описанным протоколом создаются популяции ЭК, выделенные из поджелудочной железы мышей, которые могут быть использованы для профилирования экспрессии генов и анализа белков.

Протокол

Выделение тканей проводилось в соответствии с утвержденным протоколом исследования #17010 Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Научно-исследовательского института Бекмана, Город надежды (Дуарте, Калифорния, США). Здесь мы используем Tie-2CreERT2; Линия мышей Rosa26-TdTomato в фоновом классе C57BL/6 в возрасте от 8 до 12 недель. В этой линии ЭК мечаются TdTomato при индуцировании тамоксифеном, как описано ранее34. Тем не менее, этот протокол может быть адаптирован для всех возрастов взрослых мышей с различными генотипами и генетическим фоном.

1. Забор тканей (ориентировочное время: 1-2 часа)

ПРИМЕЧАНИЕ: Ориентировочное время составляет 15 минут на животное, рекомендуется максимум 3 животных в одном образце диссоциации.

  1. Усыпляют животных путем передозировки углекислого газа (СО2) с последующим вторичным подтверждением смерти. Перед вскрытием распылите на все тело 70% этанол (EtOH), полностью продезинфицировав операционную зону.
  2. Вытяните и закрепите конечности с помощью булавок. С помощью хирургических ножниц сделайте небольшой разрез по средней линии через кожу и брюшину, начиная с нижней части живота и продолжая по направлению к грудному отделу.
  3. Обнажите грудную клетку, разрезав диафрагму, и поднимите грудную клетку, чтобы обнажить сердце.
  4. Введите иглу (25G-30G), соединенную со шприцем, содержащим ледяной стерильный PBS, в левый желудочек сердца.
  5. Начните перфузию с введения PBS через сердце со скоростью 5 - 10 мл/мин. Прекратите после введения 10 мл или до тех пор, пока печень и почки не обесцвечиваются.
  6. После перфузии найдите поджелудочную железу (ниже желудка и прикрепленную к двенадцатиперстной кишке)35 (рисунок 3А) и осторожно удалите ее с помощью препарирующих ножниц и щипцов.
  7. После выделения перенесите поджелудочную железу в трубку объемом 50 мл, содержащую 10 мл ледяного PBS + ингибитор трипсина 0,2 мг/мл, держите на льду (рис. 3B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поджелудочная железа максимум от 3 мышей может быть объединена на этом этапе и перенесена в 1 пробирку. Образцы можно держать на льду не более 2 часов.

2. Препарат коллагеназы (ориентировочное время: 15-30 мин)

  1. Подготовьте растворы и буферы, как описано ниже.
    1. Раствор для диссоциации: Добавьте коллагеназу типа I в пробирку объемом 50 мл до конечной концентрации 1 мг/мл в фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS 1x (Ca2+, Mg2+; см. Таблицу материалов) и 0,001 Ед/мл ДНКазы I + 0,2 мг/мл ингибитора трипсина.
    2. Раствор для остановки диссоциации: Добавьте фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS 1x, без Ca2+, Mg2+; то же самое для всех остальных PBS в этом протоколе; см. Таблицу материалов), 5% бычий сывороточный альбумин (BSA), 0,001 Ед/мл ДНКазы I или DMEM + 10% FBS + 0,001 МКМ/мл ДНКазы I.
    3. Буфер для стирки: Добавьте PBS 1x, 0,5% альбумин бычьей сыворотки (BSA), 0,001 ЕД/мл ДНКазы I + 0,05 мг/мл ингибитора трипсина.
  2. Полностью растворите буферы и отфильтруйте через фильтр 0,22 мкм. Отложите в сторону и держите на льду.

3. Пищеварение (ориентировочное время: 40 мин-1 час)

  1. Извлеките поджелудочную железу из ледяного ПБС и положите на чашку Петри поверх льда. Осторожно удалите излишки тканей (например, селезенку, жир, мусор) хирургическими ножницами и пинцетом (рисунок 3C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно удалить жир, так как избыток липидов может помешать перевариванию тканей.
  2. Перенесите обрезанную поджелудочную железу мыши в пробирку объемом 5 мл, содержащую 1 мл диссоциативного раствора.
  3. Держите трубку на льду и измельчите ткани поджелудочной железы с помощью ножниц-препараторов на мелкие кусочки, пригодные для напижевания, например, 0,5 мм или 1 мм. Перелейте лизат в пробирку объемом 50 мл и держите на льду.
  4. Добавьте дополнительную поджелудочную железу в трубку объемом 5 мл, используемую для первоначального измельчения ткани поджелудочной железы, и добавьте еще 1 мл коллагеназы. Повторите по мере необходимости для многократной подготовки поджелудочной железы.
  5. Добавьте 2 мл раствора коллагеназы в пробирку объемом 5 мл, чтобы удалить остатки ткани поджелудочной железы, и перенесите в пробирку объемом 50 мл. Общий объем коллагеназы должен составлять 5 мл для 3 поджелудочной железы или 3 мл для одной поджелудочной железы.
  6. После того, как все образцы подвергнутся механической диссоциации, перенесите 50 мл пробирок, содержащих гомогенизированные лизаты тканей, в водяную баню при температуре 37 °C и инкубируйте в течение 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не перемешивайте и не переворачивайте тканевую смесь во время этого процесса, так как это может привести к разрыву ацинарных тканей и высвобождению большого количества эндогенных ферментов и ДНК.
  7. Снимите трубки с водяной бани и аккуратно перемешайте, чтобы хорошо перемешать, и оставьте на водяной бане еще на 10 мин. (Общее время: 20 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 30 минут на водяной бане при температуре 37 °C, чтобы избежать переваривания.
  8. Поместите трубки на лед и дайте гомогенату осесть под действием силы тяжести. После отстаивания пропустите надосадочную жидкость через фильтр 70 мкм и добавьте 5 мл раствора для остановки диссоциации.
  9. Добавьте еще 1 мл диссоциативного раствора к оставшейся грануле и растирайте иглой 18G.
  10. Пропустите оставшийся гомогенат через фильтр и промойте еще 5 мл раствора для остановки диссоциации.
  11. Взвесьте спиновые ячейки при 300 x g в течение 10 мин, при 4 °C. Полностью удалите надосадочную жидкость путем аспирации и держите клеточную гранулу на льду.
  12. Суспензируйте клеточную гранулу с 1 мл промывочного буфера и переложите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  13. Возьмите небольшую аликвоту из ресуспендированной клеточной гранулы (10 μл) и смешайте с трипановым синим в соотношении 1:1, чтобы подсчитать клетки с помощью счетчика клеток и измерить жизнеспособность.

4. Обогащение эндотелиальными клетками (ЭК) (ориентировочное время: 2-3 часа)

  1. Добавьте 1 мкл антитела к CD31-биотину на каждые 1 x 107 подсчитанных клеток и инкубируйте в течение 30 мин при 4 °C на ротаторе (около 5 мкл на 3 поджелудочной железы).
  2. Добавьте 20 μL микрогранул, антибиотиновых микрогранул и инкубируйте в течение 40 минут при 4 °C на вращателе пробирки.
  3. Установите магнитную стойку с держателем сепаратора колонн и установите колонку. Уравновесьте колонку 3 мл промывочного буфера.
  4. Добавьте образец в колонку и промойте буфером для промывки 9 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если концентрация клеток высокая, разведите клетки еще 2 мл промывочного буфера в отдельной пробирке. Добавляйте по 1 мл образца за раз в колонку, чтобы предотвратить ее засорение.
  5. Снимите колонку с держателя колонки и поместите в пробирку объемом 15 мл. Добавьте в колонку 5 мл буфера для промывки. С помощью поршня нажмите на ячейки в колонке и соберите элюирование (которое содержит обогащенный EC).
  6. Отжим проточную и элюирующую фракцию при 300 x g в течение 10 мин при 4 °C. Подсчитайте клетки и измерьте жизнеспособность, как показано на шаге 3.13.
  7. Валидация ЕС-обогащения с помощью количественной ПЦР проточных и ЕС-фракций. Используйте NK6 Homeobox 1 (Nkx6.1) в качестве общего маркера эндокринных клеток и молекулу адгезии тромбоцитов и эндотелиальных клеток (Pecam1) в качестве маркера EC33. Используйте 36B4 (Rplp0, кислый рибосомальный фосфопротеин p0) в качестве внутреннего контроля для нормализации экспрессии генов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Собранные образцы могут быть использованы для анализа белка или РНК на этом этапе.

5. Культивирование pEC

  1. Приготовьте М199 средний. Добавьте М199 в средней до конечной концентрации 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 0,1% пенициллин-стрептомицина.
  2. Покройте 60 мм клеточную культуральную пластину коллагеном типа I (1 мг/мл в 0,1 М уксусной кислоте) и оставьте на 30 минут при комнатной температуре.
  3. Удалите коллаген I типа и промойте пластину 1X PBS дважды. Добавьте 2 мл подготовленной среды M199 и поместите планшет для клеточной культуры в стандартный инкубатор для клеточных культур (5% CO2, 37 °C) на 5 минут.
  4. После того, как клетки были изолированы, добавьте изолированные клетки в предварительно нагретую клеточную культуральную планшет M199. Держите клетки в культивируемых условиях примерно 14 дней и меняйте среды каждые 2-3 дня.

Результаты

Следуя этому протоколу, можно получить примерно 2 x 106 живых клеток при объединении 3 поджелудочных желез мышей и 750 000 клеток из одной поджелудочной железы мыши. Чтобы подтвердить обогащение EC, мы провели следующие анализы: 1) количественная ПЦР: по сравнению с проточными образцами (FT) (т.е. фракциями, не связанными с антителами CD31), фракции EC имели значительно более высокие уровни Pecam1 (кодирующего CD31) и Kdr (кодирующего VEGFR2), двух генов-маркеров EC33, и более низкие уровни NK6 гомеобокса 1 (Nkx6.1), транскрипционного фактора в эндокринных клетках поджелудочной железы (рисунок 4A); 2) вестерн-блоттинг: обогащенные ЕС образцы из трех препаратов (pEC-1-3) показали сильные сигналы CD31 при ожидаемом размере (~130 кДа). Для сравнения, выборки на входе и FT показали минимальный сигнал CD31. В качестве положительного контроля лизаты клеток MS1, клеточной линии pEC, также показали сильный сигнал CD31 (рис. 4B); 3) окрашивание трипановым синим: мы обнаружили, что жизнеспособность изолированных клеток составляет около 50% (рисунок 4C); 4) проточная цитометрия в соответствии с опубликованным протоколом15 : с помощью гейтинга на популяции живых клеток (рисунок 4D) мы обнаружили, что клетки CD31+ были на 88%, а клетки TdTomato+ были на уровне 76%. Следует отметить, что большинство выделенных клеток совместно экспрессируют CD31 и TdTomato (рисунок 4E). В качестве отрицательного контроля, неокрашенные клетки MS1 и MS1, инкубированные с IgG, не показали живых клеток, помеченных CD31. В качестве положительного контроля, т.е. клетки MS1, окрашенные на CD31, показали почти 100% живых CD31+ клеток (рис. 4F). Мы также культивировали выделенные клетки, выполнили иммунофлуоресцентное окрашивание PECAM1 в соответствии с опубликованным протоколом36 и визуализировали TdTomato, который показал устойчивые сигналы обоих маркеров в выделенных клетках, что указывает на наличие EC (рис. 4G).

Диаграмма поджелудочной железы, иллюстрирующая внутриостровковые ЭК для изучения структуры сосудов и анализа клеточного взаимодействия.
Рисунок 1: Иллюстрация васкуляризации поджелудочной железы и островков поджелудочной железы. Графическое изображение эндотелиальных клеток поджелудочной железы (ЭК) и внутриостровковых ЭК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Схема подготовки одноклеточной поджелудочной железы; центрифугирование, мечение CD31-биотином, проточный анализ.
Рисунок 2: Обзор рабочего процесса. 1) Вскрытие поджелудочной железы, 2) механическое расщепление, 3) инкубация ферментов, 4) центрифугирование, 5а) удаление надосадочной жидкости и 5б) вторичное коллагеназное расщепление клеточных гранул с растиранием для фильтрации в 6), 7) и 8) восстановление гранул и связывание антител, 9) инкубация микрогранул, 10) обогащение колонки MACS, 11) подсчет клеток на жизнеспособность и 12) последующий анализ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Вскрытие тканей, показывающее процесс забора, выделения и обрезки поджелудочной железы в биологических исследованиях.
Рисунок 3: Этапы обработки тканей. Изображения (А) брюшной полости, (В) изолированной поджелудочной железы мыши и (В) обрезанной поджелудочной железы мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Экспрессия генов, анализ CD31, DAPI, сортировка клеток, флуоресценция и результаты проточной цитометрии.
Рисунок 4: Валидация выделенных фракций EC из поджелудочной железы мыши. (A) qPCR образцов FT и обогащенной EC-фракции CD31 для обогащения. Pecam1 (CD31), Kdr (VEGFR2) и Nkx6.1 (специфический фактор транскрипции β-клеток поджелудочной железы)33. * обозначает p <0,05 по сравнению с FT на основе t-тестов . n = 3-4 объединенных образца, состоящих из 3 мышей в каждой. (B) Западный блоттинг CD31. pEC-1-3 указывают на обогащенные ЭК из 3 отдельных объединенных образцов мышей. На каждую дорожку загружали клеточные лизаты в дозе 30 мг с последующим окрашиванием по Понсо. (C) Подсчет клеток и окрашивание обогащенных pEC трипановым синим цветом для анализа жизнеспособности. (D) Стратегия гейтирования проточной цитометрии для pEC мышей, окрашенных антителами 4', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и CD31. (E) Гистограммы проточной цитометрии неокрашенного MS1 (вверху слева), MS1, окрашенного вторичным антителом AlexaFluor-488 (контроль IgG; вверху справа), MS1, окрашенного CD31 (внизу слева), и выделенных мышиных pECs, окрашенных CD31 (внизу справа). (F) Процентное содержание живых клеток, количественно выраженное с помощью проточной цитометрии. (G) Иммунофлюоресценция экспрессии CD31 (зеленый) с противостоящим окрашиванием DAPI (синий) и эндогенным флуоресцентным репортером TdTomato (красный). Масштабная линейка = 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Иммунофлуоресцентная микроскопия CD31/CD144/DAPI, анализ экспрессии генов UMAP Cdh5, Pecam1.
Рисунок 5: Специфичность CD31 и CD144 в поджелудочной железе мыши. (A) Иммунофлюоресценция поджелудочной железы мыши с CD31 (пурпурный) и CD144 (голубой), с противостойным окрашиванием DAPI. Изображение снято с помощью 10-кратного объектива под широкопольным флуоресцентным инвертированным микроскопом. Масштабная линейка = 100 мкм. Пунктирными линиями обозначена территория островков. (B) Равномерная аппроксимация и проекция многообразия (UMAP), показывающая экспрессию Cdh5 и Pecam1 в островковых EC мышей C57BL6, обнаруженных с помощью scRNA-seq (GSE128565)37. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

ФерментИспользованиеТемпература и времяСсылка
Коллагеназа IДиссоциация одиночных клеток, ЭК-обогащение всей поджелудочной железы37 °C, 20 минЭтот протокол
Коллагеназа IVВыделение островков и неферментативная диссоциация37 °C, 20 мин46
Коллагеназа + ТрипсинИсследование протоковых клеток поджелудочной железы мышей37 °C, 30 мин47
Коллагеназа ВОдноклеточная суспензия поджелудочной железы37 °C, 30 мин48
Коллагеназа NBIИзоляция островков37 °C, 30 мин49
КоллагеназаАцинар жизнеспособная суспензия37 °C, 15 мин45
Коллагеназа XIИзоляция островков37 °C, 15 мин35
ДиспайзСуспензия одиночных ячеек37 °C, 45 мин24
ЛиберасеСуспензия одиночных ячеек37 °C, 10 мин25, 48
ТрипсинОдноклеточная диссоциация, вся поджелудочная железа4 °C, O/N28

Таблица 1: Краткое изложение различных протоколов, используемых для обработки образцов поджелудочной железы мыши.

Обсуждение

В этой статье мы представляем протокол обогащения и изоляции pEC. Подобно предыдущим протоколам выделения КЭ из других тканей или органов, этот протокол состоит из трех основных процессов, а именно: физической диссоциации, ферментативного переваривания и обогащения ЭК на основе антител. Чтобы решить уникальные проблемы, связанные с обработкой поджелудочной железы, мы внедрили несколько ключевых адаптаций и критических этапов в рамках нашего протокола: 1) щадящее одноэтапное переваривание коллагеназы с коротким временем инкубации, 2) добавление более высокой концентрации ДНКазы и ингибитора трипсина для минимизации загрязнения ДНК и расщепления эндогенных ферментов, которые могут препятствовать связыванию антител и, таким образом, снижать обогащение и жизнеспособность ЕС, и 3) подсчет клеток после этапа переваривания для корректировки того, как в образец добавляют большое количество антител для оптимизации обогащения EC. В процессе оптимизации этого протокола мы протестировали другие ферменты, использованные в предыдущих исследованиях, например, трипсин28, коллагеназу типа IV31, и другие температуры пищеварения, например, 4 °C, а также различное время инкубации (Таблица 1). Мы обнаружили, что коллагеназа I типа, 20 мин, при 37 °C является оптимальным условием для выделения pEC у мышей и использовали его здесь. В то время как добавление антикоагулянта во время перфузии может улучшить общую жизнеспособность клеток, типичный антикоагулянт, например, ЭДТА или гепарин, может влиять на активность некоторых ферментов, например, коллагеназы для диссоциации клеток и обратной транскриптазы, используемой в количественной ПЦР. Для предотвращения неожиданного/нежелательного эффекта этих антикоагулянтов используется PBS (без Ca+ и Mg2+) для перфузии.

Мы сосредоточились на разработке протокола для обогащения популяции ЭК из целых поджелудочных желез мышей, который включал бы как внутриостровковые ЭК, так и ЭК в экзокринных тканях, что привело бы к более высокому выходу. В текущем протоколе мы объединили 3 животных на этапе диссоциации и в среднем получили суспензию одиночных клеток с примерно 2,0 x 106 жизнеспособными клетками. Мы также протестировали образцы из поджелудочной железы одной мыши, и удалось получить около 750 000 клеток. Стоит отметить, что при адаптации к обработке одного животного следует использовать меньше раствора диссоциации (3 мл диссоциации на поджелудочную железу). Важным шагом в протоколе является полная обрезка и удаление любого остаточного жира, который прикреплен к поджелудочной железе (Рисунок 3B). Контаминация жировой ткани при расщеплении коллагеназы будет препятствовать стадии диссоциации одиночных клеток поджелудочной железы, снижая жизнеспособность клеток на последующих стадиях обогащения38. Кроме того, для обогащения pEC мы использовали поверхностный маркер pan-EC PECAM1/CD31. Используя антитела PECAM1/CD31, мы смогли значительно обогатить фракции EC, о чем свидетельствует анализ экспрессии генов. При разработке этого протокола мы также проверили полезность антител к CD144, которые также обычно используются для выделенияЭК-13. Тем не менее, нам не удалось обогатить pEC (данные не показаны). Интересно, что иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что в то время как CD31 экспрессируется во всех ЭК в ткани поджелудочной железы, антитела к CD144, по-видимому, окрашивают только внутриостровковые ЭК (рис. 5A). Кроме того, мы проанализировали общедоступные данные секвенирования РНК одиночных клеток от островков, выделенных от мышей C57BL/6 (GSE128565)37 , и обнаружили, что примерно 50% островковых EC демонстрируют экспрессию как Cdh5 (VE-Cad), так и Pecam1, но остальные островковые EC экспрессируют только Cdh5 или Pecam1 (рис. 5B). Таким образом, мы предполагаем, что антитела к CD31 более подходят для выделения pEC, и полезность антител CD144 для этой цели требует будущих исследований. Кроме того, существуют коммерчески доступные анти-CD31 конъюгированные с магнитными шариками, которые могут упростить двухступенчатый этап связывания антител до одного шага.

Как показано, мы выполнили кПЦР, иммуноблоттинг, проточную цитометрию и иммунофлуоресцентное окрашивание для валидации выделенной фракции ЭК. Можно предположить, что эти фракции могут быть подвергнуты другим анализам, таким как (sc)РНК-секвенирование и масс-спектрометрия. Ограничением этого протокола является то, что мы не смогли достичь устойчивой субкультуры и выполнить функциональные анализы. Учитывая, что субкультура изолированных мышиных ЭК оказалась сложной задачей, эта область требует дальнейших усилий. Одним из способов решения этой проблемы может быть введение большого Т-антигена, который был использован для увековечивания первичныхклеток.

Последние достижения и применение секвенирования скРНК позволили проводить профилирование с высоким разрешением клеток поджелудочной железы40 и особенно островковых клеток41. Тем не менее, большинство существующих исследований были сосредоточены на популяциях эндокринных клеток и использовали протоколы диссоциации тканей, которые не эффективно удерживают ЭК. В результате фракции ЭК часто оказываются дефицитными, составляя всего 3-5% от всех захваченных клеточных популяций 42,43,44. В недавнем протоколе используется двухступенчатое ферментативное расщепление и деактивация, а также этап сортировки флуоресцентно активированных клеток, в результате чего ЭК извлекаются в 12% отвсей популяции клеток поджелудочной железы. В дополнение к этому протоколу наш протокол обеспечивает упрощенный рабочий процесс, который может быть более экономичным и менее технически сложным, если в центре исследования находятся ЭК. Хотя этот протокол был протестирован только на поджелудочной железе мышей, он может быть масштабирован и адаптирован для выделения ЭК из других организмов, включая поджелудочную железу человека.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят доктора Брайана Армстронга из «Города надежды» и Минди Родригес из Калифорнийского университета в Риверсайде за техническую помощь. Это исследование было частично профинансировано грантами от NIH (R01 HL145170 к ZBC), Фонда Эллы Фицджеральд (к ZBC), City of Hope (премия Артура Риггса за инновации в области метаболизма диабета и исследований) и гранта Калифорнийского института регенеративной медицины EDU4-12772 (к AT). Исследования, представленные в этой публикации, включали работу, выполненную в области световой микроскопии и цифровой визуализации при поддержке Национального института рака NIH под номером P30CA033572. Рисунок 1 и Рисунок 2 были сделаны с помощью BioRender.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл eppendorfСША Scientific1615-5500
10 см тарелкаGenesee Scientific25-202
25G иглыBD305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ712-03-AA
5 мл eppendorfThermo Fisher 
6-луночный планшетGreiner Bio-One07-000-208
70 &микро; m ситечкоFisher22-363-548
Anti-CD31-биотинMiltenyi BiotechREA784
Бычья сыворотка альбумин термический шок обработанныйFisherBP1600-100
CaCl2FisherBP510
ЦентрифугаEppendorf
Collagen Type 1, из телячьей кожиSigma Aldrich& НБСП;C9791Реагент для присоединения в протоколе
Коллагеназа Тип 1 Worthington BioLS004197
Countess Автоматический счетчик ячеекThermo Fisher 
DAPIThermo Fisher D1306иммунофлуоресцентные
одноразовые безопасные скальпелиMyco Instrumentation6008TR-10
DNAse I Roche260913 
D-PBS (Ca2+,Mg2+)Thermo Fisher 
ЭтанолFisherBP2818-4
Фетальная бычья сывороткаFisher10437028
инкубаторKept at 37 ° C 5% CO2
LS КолонкиMiltenyi Biotech130-042-401
M199SigmaM2520-1L
MACS MultiStand с сепаратором QuadroMACS Miltenyi Biotech130-042-303
Medium 199Sigma Aldrich M2520-10X
Микрогранулы антибиотинMiltenyi Biotech130-090-485
МикроскопLeicaДля оценки морфологии клеток
Молекулярная водаCorning46-000-CM
NaClFisherS271-1
Нью-Брансуик Innova 44/44R Орбитальный шейкерEppendorf
PECAM1 (CD31) АнтителоAbcamab56299иммунофлюоресцентное
PECAM1 (CD31)Антитело R& D SystemsAF3628
Фосфатный буферный физиологический раствор (10X) (без Ca2+, без Mg2+)Genesee Scientific25-507-XB
Primer 36B4 Forward mouseIDTAGATTCGGGATATGCTGTTGGC
Primer 36B4 Revese mouse IDTTCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
Primer Kdr Forward mouse IDTTCCAGAATCCTCTTCCATGC
Primer Kdr Обратная мышьIDTAAACCTCCTGCAAGCAAATG
Primer Nkx6.1 Обратная мышь IDTCACGGCGGACTCTGCATCACTC
Primer Nxk6.1 Forward mouseIDTCTCTACTTTAGCCCCAGCG
Primer PECAM1 Forward mouseIDTACGCTGGTGCTCTATGCAAG
Primer PECAM1 Reversemouse IDTTCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAPThermo Fisher AM9780
РНКаза воднаяTakaraRR036B
Стерильные 12" длинные щипцыF.S.T91100-16
Стерильные тонкие щипцыF.S.T11050-10
Стерильные тонкие ножницыF.S.T14061-11
Чашки для культуры тканей 2 смGenesee Scientific25-260
Реагент тризолаFisher
Trypan BlueCorningMT25900CI
Roche10109886001
Tween-20
VE-кадгерин антителоAbcamab33168иммунофлуоресцентная
водяная баня
1428230014080055 Ингибитор трипсина 15596018

Ссылки

  1. Ballian, N., Brunicardi, F. C. Islet vasculature as a regulator of endocrine pancreas function. World J Surg. 31 (4), 705-714 (2007).
  2. Almaca, J., Weitz, J., Rodriguez-Diaz, R., Pereira, E., Caicedo, A. The pericyte of the pancreatic islet regulates capillary diameter and local blood flow. Cell Metab. 27 (3), 630-644 (2018).
  3. Lifson, N., Lassa, C. V., Dixit, P. K. Relation between blood flow and morphology in islet organ of rat pancreas. Am J Physiol. 249, 1 Pt 1 E43-E48 (1985).
  4. Burganova, G., Bridges, C., Thorn, P., Landsman, L. The role of vascular cells in pancreatic beta-cell function. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 667170(2021).
  5. Hadi, H. A., Suwaidi, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus. Vasc Health Risk Manag. 3 (6), 853-876 (2007).
  6. Granlund, L., Hedin, A., Korsgren, O., Skog, O., Lundberg, M. Altered microvasculature in pancreatic islets from subjects with type 1 diabetes. PLoS One. 17 (10), e0276942(2022).
  7. Dai, C., et al. Pancreatic islet vasculature adapts to insulin resistance through dilation and not angiogenesis. Diabetes. 62 (12), 4144-4153 (2013).
  8. Nishikawa, Y., Tsuji, Y., Isoda, H., Kodama, Y., Chiba, T. Perfusion in the tissue surrounding pancreatic cancer and the patient's prognosis. Biomed Res Int. 2014, 648021(2014).
  9. Conchinha, N. V., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: Brain, chord, lung, and muscle. STAR Protoc. 2 (3), 100508(2021).
  10. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  11. Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Sci Rep. 9 (1), 1458(2019).
  12. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: Small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protoc. 2 (2), 100489(2021).
  13. Guo, Q., Furuta, K., Aly, A., Ibrahim, S. H. Isolation and characterization of mouse primary liver sinusoidal endothelial cells. J Vis Exp. (178), e63062(2021).
  14. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753(2008).
  15. Tang, X., et al. Suppression of endothelial ago1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
  16. Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nat Protoc. 8 (9), 1680-1693 (2013).
  17. Chaurasiya, V., et al. Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication. Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).
  18. Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: Differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
  19. Domer, P., et al. Rapid and efficient immunomagnetic isolation of endothelial cells from human peripheral nerves. Sci Rep. 11 (1), 1951(2021).
  20. Comhair, S. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. Am J Respir Cell Mol Biol. 46 (6), 723-730 (2012).
  21. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: Isolation, culture, and characterization. Microvasc Res. 46 (1), 89-102 (1993).
  22. Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulm Circ. 7 (1), 108-116 (2017).
  23. Malhi, N. K., et al. Isolation and profiling of human primary mesenteric arterial endothelial cells at the transcriptome level. J Vis Exp. (181), e63307(2022).
  24. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  25. Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of liberase hi and collagenase nb1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19 (1), 3-8 (2010).
  26. Waise, S., et al. An optimised tissue disaggregation and data processing pipeline for characterising fibroblast phenotypes using single-cell rna sequencing. Sci Rep. 9 (1), 9580(2019).
  27. Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Studies on dispersed pancreatic exocrine cells. I. Dissociation technique and morphologic characteristics of separated cells. J Cell Biol. 63 (3), 1037-1056 (1974).
  28. Li, D., et al. Complete disassociation of adult pancreas into viable single cells through cold trypsin-edta digestion. J Zhejiang Univ Sci B. 14 (7), 596-603 (2013).
  29. Ji, B., Gaiser, S., Chen, X., Ernst, S. A., Logsdon, C. D. Intracellular trypsin induces pancreatic acinar cell death but not nf-kappab activation. J Biol Chem. 284 (26), 17488-17498 (2009).
  30. Mao, X., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the mouse pancreas: Characteristic features of pancreatic ductal cells in chronic pancreatitis. Genes (Basel). 13 (6), 1015(2022).
  31. Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell rna sequencing. STAR Protoc. 1 (3), 100144(2020).
  32. Schlesinger, Y., et al. Single-cell transcriptomes of pancreatic preinvasive lesions and cancer reveal acinar metaplastic cells' heterogeneity. Nat Commun. 11 (1), 4516(2020).
  33. Park, S., Dimaio, T. A., Scheef, E. A., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Pecam-1 regulates proangiogenic properties of endothelial cells through modulation of cell-cell and cell-matrix interactions. Am J Physiol Cell Physiol. 299 (6), C1468-C1484 (2010).
  34. Kim, Y. W., et al. Integration of single-cell transcriptomes and biological function reveals distinct behavioral patterns in bone marrow endothelium. Nat Commun. 13 (1), 7235(2022).
  35. Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4 (11), 1649-1652 (2009).
  36. Malhi, N. K., et al. Serine-arginine-rich protein kinase-1 inhibition for the treatment of diabetic retinopathy. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 322 (6), H1014-H1027 (2022).
  37. Sachs, S., et al. Targeted pharmacological therapy restores beta-cell function for diabetes remission. Nat Metab. 2 (2), 192-209 (2020).
  38. Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plast Reconstr Surg. 136 (2), 189-199 (2015).
  39. Arbiser, J. L., et al. Oncogenic h-ras stimulates tumor angiogenesis by two distinct pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (3), 861-866 (1997).
  40. Muraro, M. J., et al. A single-cell transcriptome atlas of the human pancreas. Cell Syst. 3 (4), 385-394 (2016).
  41. Segerstolpe, A., et al. Single-cell transcriptome profiling of human pancreatic islets in health and type 2 diabetes. Cell Metab. 24 (4), 593-607 (2016).
  42. Kang, R. B., et al. Single-nucleus rna sequencing of human pancreatic islets identifies novel gene sets and distinguishes beta-cell subpopulations with dynamic transcriptome profiles. Genome Med. 15 (1), 30(2023).
  43. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Res. 27 (2), 208-222 (2017).
  44. Fasolino, M., et al. Single-cell multi-omics analysis of human pancreatic islets reveals novel cellular states in type 1 diabetes. Nat Metab. 4 (2), 284-299 (2022).
  45. Yosefov-Levi, O., Tornovsky, S., Parnas, O. Pancreatic tissue dissection to isolate viable single cells. J Vis Exp. (195), e64871(2023).
  46. Castillo, J. J., et al. Islet amyloid polypeptide aggregation exerts cytotoxic and proinflammatory effects on the islet vasculature in mice. Diabetologia. 65 (10), 1687-1700 (2022).
  47. Tremblay, J. R., et al. Rare, tightly-bound, multi-cellular clusters in the pancreatic ducts of adult mice function like progenitor cells and survive and proliferate after acinar cell injury. Stem Cells. 42 (4), 385-401 (2024).
  48. Zook, H. N., et al. Activation of ductal progenitor-like cells from adult human pancreas requires extracellular matrix protein signaling. iScience. 27 (3), 109237(2024).
  49. Sordi, V., et al. Establishment, characterization and long-term culture of human endocrine pancreas-derived microvascular endothelial cells. Cytotherapy. 19 (1), 141-152 (2017).

Перепечатки и разрешения

Теги

Поджелудочная железа мышивыделение эндотелиальных клетокмагнитная сепарация клетокмягкая диссоциациямаркеры клеточной поверхностисеквенирование единичных клетоксосудистая сеть поджелудочной железыантитело к CD31вестерн-блоттинг
Выделение эндотелиальных клеток поджелудочной железы мыши
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.