В данной работе представлен протокол генерации и функциональной верификации чувствительных к гипоксии химерных антигенных рецепторов (CAR)-Т-клеток. В этом протоколе представлено поколение чувствительных к гипоксии CAR-T-клеток на основе лентивируса и их характеристика, включая валидацию гипоксически-зависимой экспрессии CAR и селективной цитотоксичности.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Генерация и функциональная верификация чувствительных к гипоксии химерных антигенных рецептор-Т-клеток
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Обширные исследования доказали перспективность терапии химерными антигенными рецепторами T (CAR-T) клетками в лечении гематологических злокачественных новообразований. Тем не менее, лечение солидных опухолей остается сложной задачей, о чем свидетельствуют опасения по поводу безопасности, которые возникают, когда CAR-T-клетки атакуют нормальные клетки, экспрессирующие целевые антигены. Исследователи изучили различные подходы к повышению селективности опухоли при терапии CAR-T-клетками. Одной из типичных стратегий в этом направлении является конструирование чувствительных к гипоксии CAR-T-клеток, которые сконструированы путем слияния кислород-зависимого домена деградации с CAR-фрагментом и разработаны для достижения высокой экспрессии CAR только в гипоксической среде — опухолевом микроокружении (TME). В данной работе представлен протокол генерации таких CAR-T-клеток и их функциональная характеристика, включая методы анализа изменений экспрессии CAR-клеток и убивающей способности в ответ на различные уровни кислорода, установленные в камере мобильного инкубатора. Ожидается, что сконструированные CAR-T-клетки будут демонстрировать экспрессию CAR и цитотоксичность чувствительным к кислороду образом, тем самым поддерживая их способность различать гипоксические TME и нормоксические нормальные ткани для селективной активации.
Введение
Терапия химерными антигенными рецепторами Т-клеток (CAR-T) представляет собой значительный прорыв в лечении рака. С тех пор как в 2017 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило первую CAR-T-терапию для лечения прогрессирующей/резистентной лимфомы и острого лимфобластного лейкоза, 1,2,3, 10 CAR-T-терапий, нацеленных на CD19 или антиген созревания B-клеток (BCMA), получили одобрение во всем мире4. Однако, несмотря на обширные исследования, воспроизведение замечательной эффективности CAR-T-терапии в лечении гематологических злокачественных новообразований остается сложной задачей для ее применения к солидным опухолям 5,6,7,8.
Иммуносупрессивное микроокружение опухоли (ТМЭ) является основным фактором низкой эффективности CAR-T в условиях солидных опухолей. TME препятствует активности и выживанию CAR-T-клеток из-за недостатка питательных веществ, гипоксии, кислого pH и накопления метаболических отходов 9,10,11,12. Дальнейшая враждебность возникает при инфильтрации иммуносупрессивных клеток, таких как регуляторные Т-клетки (Tregs), миелоидные супрессорные клетки (MDSC) и опухолеассоциированные макрофаги (TAM), которые, наряду с опухолевыми клетками, секретируют иммуносупрессивные цитокины, вызывающие дополнительное ингибирование CAR-T-клеток при попадании в опухоль13,14.
Помимо неудовлетворительной терапевтической эффективности, вопросы безопасности являются еще одной ахиллесовой пятой CAR-T-клеток при работе с солидными опухолями15,16. Опасения по поводу безопасности возникают из-за того, что ни один из выявленных до сих пор опухолеспецифических антигенов (TSA) строго не ограничен опухолевыми клетками. Другими словами, опухолеассоциированные антигены (TAA), выбранные в качестве мишени для CAR, хотя и демонстрируют более высокую экспрессию в опухолевых клетках, часто также экспрессируются нормальнымитканями17. Таким образом, мишенные, внеопухолевые эффекты могут возникать в результате неожиданной активации CAR-T-клеток при эффективном распознавании CAR нормальных тканей, что приводит к синдрому высвобождения цитокинов (CRS), синдрому CAR-T-связанной энцефалопатии (CRES)18 и другим неблагоприятнымисходам.
Для предотвращения таких эффектов было изучено множество стратегий, в том числе снижение аффинности CAR, чтобы позволить CAR-T-клеткам отличать опухолевые клетки от нормальных клеток на основе уровней экспрессии целевой TAA; оснащение CAR-T-клеток выключателем, таким как ген самоубийства или маркер элиминации, чтобы способствовать их элиминации при неожиданной активации; разделение CD3ζ и костимулирующих сигналов на две CAR-группы, одновременное участие которых, следовательно, необходимо для эффективной активации CAR-T-клеток; использование схемы на основе синтетического Notch (synNotch), которая ограничивает активность CAR-T-клеток клетками-мишенями, совместно экспрессирующими два различных TAA; и инженерия CAR-T-клеток для достижения чувствительности TME путем реализации механизма настройки экспрессии CAR в соответствии с изменяющимися сигналами окружающей среды 20,21,22,23,24,25,26.
Ключевым фактором при выборе чувствительности ТМЭ, описанном выше, является низкий уровень кислорода в ТМЭ из-за быстрой пролиферации опухолевых клеток. Приспособление опухолевых клеток к гипоксии зависит от активации индуцируемого гипоксией фактора-1 (HIF-1), гетеродимерного транскрипционного фактора, состоящего из индуцируемой субъединицы HIF-1α и конститутивно экспрессируемой субъединицы HIF-1β27. В нормоксических условиях белок HIF-1α подвергается убиквитинации и быстрой протеасомной деградации в зависимости от его кислородзависимого домена деградации (ODD)28. Когда поступление кислорода в клетки становится ограниченным, HIF-1 стабилизируется и активирует транскрипцию своих нижестоящих генов-мишеней путем связывания с элементами, реагирующими на гипоксию (HREs)29. Учитывая природу ОВР и HRE как чувствительных к кислороду элементов, они были исследованы для реализации условной экспрессии CAR в гипоксической TME30. В данной работе мы представляем протокол, посвященный методам фенотипической и функциональной характеристики чувствительных к гипоксии CAR-T-клеток, которому предшествует краткое описание конструкции CAR и процедур подготовки этих клеток. Этот протокол призван предоставить полезное руководство по использованию чувствительного к гипоксии CAR для получения CAR-T-клеток с ограниченной внеопухолевой токсичностью.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
В этом исследовании HER2-BBz-ODD, чувствительный к гипоксии CAR, нацеленный на HER2 (Gene ID: 2064), сравнивался со своим обычным аналогом, HER2-BBz. Схемы двух CAR проиллюстрированы на рисунке 1A, который показывает, что HER2-BBz-ODD является производным от HER2-BBz путем добавления последовательности ODD к C-концу CD3ξ. Построение лентивирусных векторов, экспрессирующих два CAR, и генерация соответствующего лентивируса путем трансфекции 293Т-клеток были описаны ранее31.
1. Генерация чувствительных к гипоксии CAR-T-клеток путем лентивирусной инфекции
- Быстро разморозьте криоконсервированные мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC) при 37 °C на водяной бане. Перенесите размороженные PBMC в пробирку объемом 15 мл, содержащую 9 мл бессывороточной питательной среды лимфоцитов с добавлением 400 МЕ IL-2, 5 нг/мл IL-7 и 10 нг/мл IL-15 (среда для роста Т-клеток человека, далее именуемая TGM ).
- После приема аликвоты для подсчета клеток центрифугируйте пробирку при 300 × г в течение 5 мин. Повторно суспендируйте гранулированные PBMC с TGM при плотности 4 × 106 клеток/мл и перенесите суспензию в 6-луночный планшет.
- Приготовьте иммуногранулы, покрытые анти-hCD3/hCD28.
- Переложите 100 мкл магнитных шариков IgG мыши в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и промойте их 2 раза с помощью магнитной подставки с PBS.
- Повторно суспендируйте шарики в 100 мкл PBS и добавьте 0,2 мкг мышиного антитела к человеческому CD3 и 2 мкг мышиного антитела к человеческому CD28. Аккуратно перемешайте смесь с помощью пипетки и покачивайте в течение ночи при температуре 4 °C.
- Промойте бусины 2 раза с помощью магнитной подставки с PBS и повторно суспендируйте их в 100 мкл PBS.
- Добавьте иммуногранулы, покрытые анти-hCD3/hCD28, на планшет на шаге 1.2 в соотношении гранул к клеткам 1:1. Поместите планшет во влажный инкубатор с 5%CO2 при температуре 37 °C.
- После 48 ч инкубации перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл, аккуратно перемешав клетки пипеткой. Поместите трубку на магнитную подставку на 3 минуты, затем осторожно перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 15 мл для удаления иммуногранул из PBMC.
- Возьмите аликвоту для подсчета клеток, затем засейте PBMC в 5 × 105 клеток/лунку в 300 мкл TGM в 48-луночный плоский планшет. Добавьте 200 мкл лентивирусного запаса в соответствующие лунки и добавьте сульфат протамина до конечной концентрации 10 мкг/мл.
- Центрифугируйте планшет при 1000 × г при 32 °C в течение 1,5 ч и осторожно удалите и выбросьте 300 мкл надосадочной жидкости из каждой лунки с помощью пипетки. Затем добавьте 1 мл свежего TGM с помощью пипетки и поместите планшет в увлажненный инкубатор с 5%CO2 при температуре 37 °C.
- Добавляйте свежий TGM для регулировки плотности клеток до 0,5-2 ×10 6 клеток/мл каждые 2-3 дня. Начните с переноса ячеек сначала на 12-луночный планшет, а затем на 6-луночный планшет. Продолжайте культивировать клетки до тех пор, пока общее количество не достигнет 6 × 106 в объеме 4 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параллельно проведите CAR-трансдукцию Т-клеток Jurkat, следуя тем же процедурам, описанным выше, за исключением того, что ТГМ заменяется средой RPMI1640 содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
2. Оценка кислородзависимой экспрессии CAR в CAR-T-клетках с помощью проточной цитометрии
- Тарьминируют CAR-трансдуцированные Т-клетки со стадии 1,8 в два 12-луночных планшета с плотностью 2,5 ×10 6 клеток/лунку в 2 мл TGM. Поместите одну пластину непосредственно в увлажненный инкубатор с 5%CO2 при 37 °C (нормоксическое состояние, так как стандартное условие для культивирования клеток имеет 21%O2), а другую пластину поместите в мобильную камеру инкубатора CO2/O2/N2 с заданным уровнем O2 на уровне 1% (гипоксическое состояние), а затем держите камеру во увлажненном состоянии, 5% CO2/94% N2 инкубатор при 37 °C.
- Каждые 24 ч собирать 5 × 105 клеток из планшетов в гипоксических или нормоксических условиях в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Центрифугируйте пробирки при давлении 500 × г в течение 5 минут, удалите надосадочную жидкость и аккуратно ресуспендируйте клетки в 1 мл PBS с помощью пипетирования. Повторите промывку PBS еще раз.
- Ресуспендируйте гранулированные клетки в 50 мкл буфера FACS (PBS с добавлением 2% FBS) в каждой пробирке. Добавьте 50 μL в разведении 1:100 PE-конъюгированного анти-Флагового антитела (0,2 μг/мл) и тщательно перемешайте с помощью пипетирования. Выдерживать в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут.
- В конце инкубации добавьте 1 мл буфера FACS в каждую пробирку. Тщательно перемешайте с помощью пипетирования, затем центрифугируйте при 500 × г в течение 5 минут.
- Осторожно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки и повторите шаг 2.4 еще раз.
- Осторожно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки. Повторно суспендируйте клетки в 200 мкл буфера FACS, затем перенесите полученную клеточную суспензию в проточные трубки объемом 5 мл.
- Выполните проточную цитометрию клеточной суспензии на шаге 2.6 для определения поверхностной экспрессии CAR. Включите нетрансфицированные Т-клетки в качестве отрицательного контроля.
- Используйте вентили FSC/SSC и FSC-A/FSC-H для скрининга живых одиночных клеток. Соберите 1 × 104 живых одиночных события для каждого образца. Гейт клеток с положительным на EGFP (конститутивный маркер, переносимый в лентивирусном векторе в качестве индикатора успешно трансдуцированных Т-клеток), а затем с клетками, положительными на фикоэритрин (ПЭ) (CAR-экспрессирующие клетки) для измерения положительности ТЭЛА и медианы интенсивности флуоресценции (MFI).
3. Анализ кислородозависимости экспрессии CAR в CAR-модифицированных Jurkat Т-клетках методом вестерн-блоттинга
- Тарелируют CAR-трансдуцированные Т-клетки Jurkat из секции 1 в два 48-луночных планшета с плотностью 5 ×10 5 клеток на лунку (объем культуры 500 мкл) в RPMI1640 среде с 10% FBS.
- Для одной пластины добавьте CoCl2 в экспериментальные лунки до конечной концентрации 0 μМ, 50 μМ или 200 μМ. Затем поместите планшет во увлажненный инкубатор с 5% содержаниемCO2 при температуре 37 °C (нормоксическое состояние). Для другой пластины не добавляйте CoCl2 и поместите его в мобильную камеру инкубатора CO2/O2/N2 с предустановленным уровнем O2 на уровне 1% (гипоксическое состояние) перед переносом в тот же инкубатор.
- После 24 ч инкубации перенесите клеточные суспензии в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Центрифугируйте пробирки при 500 × г в течение 5 минут. Сначала полностью удалите и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1 мл, затем пипетки объемом 100 мкл и повторно суспендируйте гранулы клеток в 50 мкл 1x буфера для образцов SDS-PAGE.
- Нагрейте образцы на кипящей водяной бане в течение 10 минут. Немедленно поместите пробирку на лед на 30 с, затем центрифугируйте при 16 000 × г в течение 30 с.
- Загрузите по 30 мкл очищенных образцов в каждую ячейку 10-луночного 10% геля SDS PAGE толщиной 1,5 мм. Запустите гель при напряжении 80 В в течение 30 минут, затем увеличьте напряжение до 100 В и проведите 1,5 часа.
- В конце электрофореза перенос белков из геля на мембрану PVDF с использованием стандартного метода мокрого переноса, при этом ток и продолжительность установлены на уровне 400 мА и 1 ч соответственно.
- Заблокируйте мембрану в блокирующем буфере (5% молока (w/v) в PBST (PBS + 0,05% Tween-20)) на 1 ч при комнатной температуре. Затем вырежьте участок между 30 кД и 40 кДа для детектирования управления нагрузкой GAPDH и кусок между 50 кД и 70 кД для детектирования молекул CAR.
- Инкубируйте кусочки 30-40 кД и 50-70 кД с мышиным антителом против GAPDH (разведение 1:2000) и мышиным антителом против Flag (разведение 1:2000), соответственно, в 3 мл блокирующего буфера либо при комнатной температуре в течение 2 ч, либо при 4°С в течение ночи.
- Промыть мембраны PBST при комнатной температуре на платформе-коромысле в течение 3 х 5 минут.
- Инкубируйте мембраны с HRP-конъюгированными антителами козьего антимышиного типа (разведение 1:5000) в 3 мл блокирующего буфера при комнатной температуре в течение 1 ч; затем промойте мембрану PBST в течение 5 x 10 минут.
- Развивайте мембраны с помощью инкубации с подложкой HRP, а затем визуализируйте обнаруженные белковые полосы с помощью люминесцентного анализатора изображений.
4. Оценка in vitro кислородной зависимости цитотоксичности, опосредованной чувствительными к гипоксии CAR-T-клетками
- В день 0 затравили 1 × 104 клеток-мишеней (клетки SKOV3-Luc) в экспериментальную лунку в 200 мкл DMEM, содержащего 10% FBS, в двух черных плоскодонных 96-луночных тканевых культуральных планшетах.
- В день 1 осторожно удалите 100 мкл надосадочной жидкости с верхней части каждой лунки. Добавьте CAR-T-клетки или нетрансдуцированные Т-клетки в соотношении эффекторов к мишеням 1:1, 2:1 и 4:1 в 100 мкл среды DMEM, содержащей 10% FBS.
- Поместите одну тарелку в атмосферу с концентрацией 21%O2, а другую — в атмосферу с концентрацией 1%O2 с помощью мобильной камеры инкубатора CO2/O2/N2 , как описано в шаге 2.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если мобильная камера инкубатора CO2/O2/N2 недоступна, добавление CoCl2 в питательную среду может быть использовано для имитации гипоксического состояния. - На 2-й день, после 24 ч совместного культивирования, осторожно перенесите всю надосадочную жидкость (примерно 150-200 мкл) в новую 96-луночную пластину с U-образным дном с помощью пипетки. Хранить при температуре -20 °C для последующего обнаружения цитокинов, следуя процедурам, описанным в разделе 5.
- Добавьте 60 мкл 1x буфера пассивного лизиса в каждую экспериментальную лунку черных 96-луночных планшетов с плоским дном, начиная с шага 4.4. Затем поместите пластины на шейкер и встряхивайте в течение 30 минут, чтобы обеспечить эффективный лизис клеток.
- Добавьте 60 мкл субстрата люциферазы светлячков в каждую экспериментальную лунку и немедленно измерьте активность люциферазы с помощью считывателя микропланшетов.
- Рассчитайте нормированную цитотоксичность (%) с помощью уравнения (1):
Нормализованная цитотоксичность (%) = 100 -
×100 (1)
5. Обнаружение секреции IL-2 и ИФН-γ чувствительными к гипоксии CAR-T-клетками
- В день 0 приготовьте разведение антитела захвата IL-2 или ИФН-γ в масштабе 1:250 в буфере для покрытия. Добавьте 100 мкл разведенного антитела в каждую лунку 96-луночного планшета для ИФА и инкубируйте планшет при 4 °C в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для покрытия изготавливается путем растворения 7,13 г NaHCO3 и 1,59г Na2CO3 в 1 л дистиллированной воды и регулировки pH до 9,5. - В день 1 удалите неадсорбированное антитело захвата, энергично перевернув планшет вверх дном, затем промойте лунки 3 раза 200 мкл промывочного буфера (PBS, содержащего 0,05% Tween 20).
- Добавьте в каждую лунку по 200 μл разбавителя анализа (PBS, содержащего 10% FBS) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Выбросьте раствор, энергично перевернув тарелку вверх дном; затем промойте лунки 3 раза 200 μл промывочного буфера.
- Разморозьте замороженные образцы надосадочной жидкости/планшет из шага 4.4 при комнатной температуре. После полного размораживания разбавьте образцы и стандарты разбавлением для анализа разбавителем. Добавьте по 100 мкл разбавленных образцов или стандартов в каждую лунку планшета с покрытием ИФА и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для обнаружения IL-2 рекомендуется 10-кратное разведение, в то время как для обнаружения ИФН-γ предпочтительно 50-кратное разведение. - Удалите образцы и стандарты, энергично перевернув пластину вверх дном, затем промойте лунки 5 раз 200 μл буфера для промывки на лунку.
- Приготовьте рабочий детектирующий раствор путем разведения антитела для обнаружения IL-2 или антитела для обнаружения ИФН-γ/стрептавидина-HRP (SAv-HRP) в соотношении 1:250 в разбавителе анализа. Добавьте по 100 мкл рабочего раствора для детектирования в каждую лунку и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 1 ч с легким встряхиванием.
- Слейте раствор и промойте лунки 7 раз 200 мкл промывочного буфера.
- Добавьте по 100 мкл реагента Substrate в каждую лунку и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте.
- Добавьте в каждую лунку по 50 μл раствора для остановки (1 М Н2SO4). Немедленно считайте поглощение на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Слияние домена ODD HIF-1α с фрагментом CAR представляет собой основную стратегию для создания чувствительного к гипоксии CAR. Чувствительный к гипоксии HER2-нацеленный на CAR, проанализированный в этом исследовании, названный HER2-BBz-ODD, был сконструирован с использованием этой стратегии путем интеграции последовательности ODD в его обычный HER2-BBz (рис. 1A). В этом исследовании мы использовали лентивирусную трансдукцию для экспрессии HER2-BBz-ODD CAR или HER2-BBz CAR и впоследствии изучи...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Проблемы безопасности являются важными вопросами, которые должны быть решены для того, чтобы любая терапия CAR-T-клетками продвинулась в клиническое применение. Использование уникальных свойств опухолевых клеток или ТМЭ стало основным направлением исследований, направленным на разработку CAR-T-клеток, которые избирательно воздействуют на опухолевые ткани. Разработка чувствительного к гипоксии CAR-T является привлекательной стратегией в этом направлении, при этом изучается несколько подхо...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2016YFC1303402), Национального мегапроекта по ключевым инфекционным заболеваниям (2017ZX10202102, 2017ZX10304402-002-007) и Общей программы Шанхайской муниципальной комиссии здравоохранения (201740194).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1,5 мл Центрифужная пробирка | QSP | 509-GRD-Q | Надосадочная жидкость и клетки целлекция Протокол Шаг 2,3,4 |
| 10% ExpressCast PAGE | NCM biotech | P2012 | Иммуноблоттинг Протокол Шаг 3 |
| 10x PBS | NCM биотехнологический | 20220812 | Клеточная культура Протокол Этап 4 |
| пипетка 10 мл Пипетка | Yueyibio | YB-25H | Пипетка Протокол Шаг 1 |
| 10xTRIS-Glycine-SDS Электрофорез Буфер | Epizyme | 3673020 | Иммуноблоттинг Протокол Шаг 3 |
| 15 мл Центрифужная пробирка | Thermo Scientific | 339650 | Надосадочная жидкость и клетки целлекции Протокол Шаг 1 |
| 25 см2 EasYFlask | Thermo Scientific | 156367 Cell culture Протокол Шаг 3,4 | |
| 4x Protein SDS PAGE Buffer Buffer | Takara | 9173 | Immunoblotting Протокол Шаг 3 |
| 6-луночные планшеты для культуры тканей с плоским дном | Thermo Scientific | 140675 | T Cells culture Протокол Шаг 1 |
| 96-луночный черный планшет для культуры тканей с плоским дном | Greiner | 655090 | Анализ цитотоксичности Протокол Шаг 4 |
| 96-луночные планшеты для ИФА | Corning | 3590 | ELISA Protocol Step 5 |
| 96-луночный шейкер | QILINBEIER | MH-2 | Shake Protocol Step 4 |
| 96-луночные U-образные планшеты для культивирования тканей | Thermo Scientific | 268200 | Supernatants cellection Protocol Step 4,5 |
| anti-FLAG антитело | Sigma | F1804-50UG | Immunoblotting Protocol Step 3 |
| Карбинол | Sinopharm | 10010061 | Immunoblotting Протокол Шаг 3 |
| Инкубатор углекислого газа | Thermo Scientific | 360 | Клеточная культура Протокол Шаг 1,2,3,4 |
| Пластина для подсчета клеток | Hausser scientific | 1492 | Подсчет клеток Протокол Шаг 1,3,4 |
| CELLection Pan Mouse IgG Kit | Thermo Scientific | 11531D | Мышь IgG магнитные шарики Протокол Step 1 |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75002432 | Cell Culture Протокол Step 1,3,4 |
| Система визуализации гелевого хемилюминесцентного геля | BIO-RAD | 12003154 | Immunoblotting Протокол Step 3 |
| Раствор хлорида кобальта (0,5 M) | биопрыгун | BR4000203 | Гипоксическое состояние Протокол Step 2,3,4 |
| DMEM | Corning | 10-103- Культура клеток сердечно-сосудистой системы | Протокол Шаг 4 |
| Электронные весы | Sartorius | PRACTUM612-1CN | вес Протокол Шаг 5 |
| FBS | BI | 04-001-1ACS | Культура клеток Протокол Шаг 3,4 |
| GAPDH Мышиный mAb | ABclonal | AC002 | Иммуноблоттинг Протокол Этап 3 |
| Аппарат для гелевого электрофореза | BIO-RAD | 1645070 | Иммуноблоттинг Протокол Шаг 3 |
| Считыватели микропланшетов | Promega | GM3000 | Измерение активности люциферазы Протокол Шаг 4 |
| Козий антимышиный IgG (H+L) | Yeasen | P1126151 | Иммуноблоттинг Протокол Шаг 3 |
| Высокоскоростная микрофризирующая центрифуга | eppendorf | 5810 R | Cell culture Протокол Шаг 1 |
| ИФН и гамма человека; ИФА Набор | BD | 555142 | протокол ИФА<бр/> Шаг 5<бр/> Пункты: рекомбинантный ИФН человека и гамма; Лиофилизированный стандарт, обнаружение антител биотина против человеческого ИФН-&гамма; , Антитело захвата очищенное против ИФН-&гамма человека, ферментный реагент стрептавидин-пероксидаза хрена конъюгат (SAv-HRP) |
| Набор ИФА IL-2 человека | BD | 555190 | ИФА<бр/> протокол Этап 5<бр/> Элементы: рекомбинантный лиофилизированный стандарт IL-2 человека, антитело обнаружения биотина против IL-2 человека, антитело захвата очищенное против человека IL-2, ферментный реагент стрептавидин-пероксидаза конъюгата (SAv-HRP) |
| IL-15 | НИР D systems | P40933 | Т-клетки Культура Протокол Этап 1 |
| IL-21 | Новопротеин | GMP-CC45 | Т-клетки Культура Протокол Этап 1 |
| IL-7 | R& D systems | P13232 | Т-клетки Культура Протокол Шаг 1 |
| Инвертированный микроскоп | Olympus | CKX41 | Клеточная культура Протокол Шаг 1,3,4 |
| Jurkat | ATCC | TIB-152 | CAR-Jurkat construction Протокол Шаг 3 |
| LSRFortessa | BD | LSRFortessa | Проточная цитометрия Протокол Шаг 2 |
| Система | анализа люциферазыPromega | E1501 | люциферазный репортерный анализ Протокол Шаг 4 Элементы: Буфер пассивного лизиса, субстрат люциферазы светлячков |
| Микропланшетный ридер | BioTek | HTX | ELISA Протокол Шаг 5 |
| мобильный CO2/O2/N2 Инкубаторная камера China | Innovation Instrument Co., ООО. | Smartor118 | Гипоксическое состояние Протокол Шаг 2, 3, 4 |
| Мышиный антигекса-гистидиновый тег | Sigma | SAB2702218 | Иммуноблоттинг Протокол Шаг 3 |
| NcmBlot Rapid Transfer Buffer | NCM biotech | WB4600 | Иммуноблоттинг |
| NcmECL Ultra | NCM biotech | P10300 | Иммуноблоттинг Протокол Шаг 3 Элементы: Реагент NcmECL ультралюминол/усилитель (A), Ультрастабилизированный реагент перекиси NcmECL (B) |
| 48-луночные плоские планшеты, покрытые НовоНектином, | Новопротеин | GMP-CH38 | CAR-T клетки построение Протокол Шаг 1 Набор |
| таблеток OPD (о-фенилендиаминдигидрохлорид) Sigma | P9187 | Субстрат Реагент Протокол Этап 5 Предметы: таблетка OPD (серебряная фольга), таблетка перекиси водорода мочевины (золотая фольга) | |
| PE-конъюгированный анти-DYKDDDDK | Biolegend | 637310 | Проточная цитометрия Протокол Этап 2 |
| Сульфат протамина | Sigma | P3369-1OG | Лентивирусная инфекция Протокол Этап 1 |
| Белковый маркер 10 Kda-250 KDa | Epizyme | WJ102 | Иммуноблоттинг Протокол Этап 3 |
| Очищенный NA/LE мышиный античеловеческий CD3 | BD | 566685 | Т-клетки Культура Протокол Этап 1 |
| Очищенный NA/LE Мышиный античеловеческий CD28 | BD | 555725 | Т-клетки Культура Протокол Этап 1 |
| Мембрана PVDF | Миллипоры | 168627 | Иммуноблоттинг Протокол Этап 3 |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVRC | Клеточная культура Протокол Этап 3 |
| Сухое обезжиренное молоко | Yeasen | S9129060 | Иммуноблоттинг Протокол Этап 3 |
| SKOV3-Luc | ATCC | HTB-77 | Анализ цитотоксичности Протокол Шаг 4 |
| Trypsin-EDTA | NCM biotech | C125C1 | Клеточная культура Протокол Этап 4 |
| Tween 20 | Sinopharm | 30189328 | Иммуноблоттинг Протокол Шаг 3 |
| Водяная баня | keelrein | NB014467 | Отопление протокол Step 1 |
| X-VIVO 15 | LONZA | 04-418Q | Бессывороточная среда для культивирования лимфоцитов Протокол Этап 1 |
Ссылки
- Boardman, A. P., Salles, G. CAR T-cell therapy in large B cell lymphoma. Hematol Oncol. 41 (S1), 112-118 (2023).
- Chen, Y. -J., Abila, B., Mostafa Kamel, Y. CAR-T: What is next. Cancers. 15 (3), 663(2023).
- Barsan, V., et al. Tisagenlecleucel utilisation and outcomes across refractory, first relapse and multiply relapsed B-cell acute lymphoblastic leukemia: A retrospective analysis of real-world patterns. eClinicalMedicine. 65, 102268(2023).
- Liu, Y., et al. Oncolytic herpes simplex virus delivery of dual CAR targets of CD19 and BCMA as well as immunomodulators to enhance therapeutic efficacy in solid tumors combined with CAR-T cell therapy. Front Oncol. 12, 1037934(2022).
- Liu, C., Qi, T., Milner, J. J., Lu, Y., Cao, Y. Speed and location both matter: Antigen stimulus dynamics controls CAR-T cell response. Front Immunol. 12, 748768(2021).
- Li, N., et al. Improving the anti-solid tumor efficacy of CAR-T cells by inhibiting adenosine signaling pathway. Oncoimmunology. 9 (1), 1824643(2020).
- Derenzo, C., Gottschalk, S. Genetic modification strategies to enhance CAR T cell persistence for patients with solid tumors. Front Immunol. 10, 218(2019).
- Fu, R., et al. Delivery techniques for enhancing CAR T cell therapy against solid tumors. Advanced Functional Materials. 31 (44), 2009489(2021).
- Johnson, A., Townsend, M., O'Neill, K. Tumor microenvironment immunosuppression: A roadblock to CAR T-cell advancement in solid tumors. Cells. 11 (22), 3626(2022).
- Liu, Z., et al. Immunosuppression in tumor immune microenvironment and its optimization from CAR-T cell therapy. Theranostics. 12 (14), 6273-6290 (2022).
- Luo, Z., et al. Modulating tumor physical microenvironment for fueling CAR-T cell therapy. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114301(2022).
- Martinez, M., Moon, E. K. CAR T cells for solid tumors: New strategies for finding, infiltrating, and surviving in the tumor microenvironment. Front Immunol. 10, 128(2019).
- Zhang, X., et al. The immunosuppressive microenvironment and immunotherapy in human glioblastoma. Front Immunol. 13, 1003651(2022).
- Tie, Y., Tang, F., Wei, Y. Q., Wei, X. W. Immunosuppressive cells in cancer: Mechanisms and potential therapeutic targets. J Hematol Oncol. 15 (1), 61(2022).
- Wu, Y., et al. Engineering CAR T cells for enhanced efficacy and safety. APL Bioeng. 6 (1), 011502(2022).
- Al-Haideri, M., et al. cell combination therapy: The next revolution in cancer treatment. Cancer Cell Int. 22 (1), 365(2022).
- Fuca, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. Enhancing chimeric antigen receptor T-cell efficacy in solid tumors. Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).
- Neelapu, S. S., et al. Chimeric antigen receptor T-cell therapy - assessment and management of toxicities. Nat Rev Clin Oncol. 15 (1), 47-62 (2018).
- Mi, J., Ye, Q., Min, Y. Advances in nanotechnology development to overcome current roadblocks in CAR-T therapy for solid tumors. Front Immunol. 13, 849759(2022).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: Current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
- Yu, S., Yi, M., Qin, S., Wu, K. Next generation chimeric antigen receptor T cells: Safety strategies to overcome toxicity. Mol Cancer. 18 (1), 125(2019).
- Dana, H., et al. CAR-T cells: Early successes in blood cancer and challenges in solid tumors. Acta Pharm Sin B. 11 (5), 1129-1147 (2021).
- Van Der Schans, J. J., Van De Donk, N., Mutis, T. Dual targeting to overcome current challenges in multiple myeloma CAR T-cell treatment. Front Oncol. 10, 1362(2020).
- Andrea, A. E., Chiron, A., Bessoles, S., Hacein-Bey-Abina, S. Engineering next-generation car-t cells for better toxicity management. Int J Mol Sci. 21 (22), 8620(2020).
- Flugel, C. L., et al. Overcoming on-target, off-tumour toxicity of CAR T cell therapy for solid tumours. Nat Rev Clin Oncol. 20 (1), 49-62 (2023).
- Rababah, F., et al. Chimeric antigen receptor T cells therapy in solid tumors. Clin Transl Oncol. 25 (8), 2279-2296 (2023).
- Masoud, G. N., Li, W. Hif-1alpha pathway: Role, regulation and intervention for cancer therapy. Acta Pharm Sin B. 5 (5), 378-389 (2015).
- Semenza, G. L. Targeting hif-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 3 (10), 721-732 (2003).
- Harris, A. L. Hypoxia--a key regulatory factor in tumour growth. Nat Rev Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).
- Juillerat, A., et al. An oxygen sensitive self-decision making engineered CAR T-cell. Sci Rep. 7, 39833(2017).
- Liao, Q., et al. Engineering T cells with hypoxia-inducible chimeric antigen receptor (HiCAR) for selective tumor killing. Biomark Res. 8 (1), 56(2020).
- Ivan, M., et al. Hifα targeted for vhl-mediated destruction by proline hydroxylation: Implications for o2 sensing. Science. 292 (5516), 464-468 (2001).
- Wang, G. L., Semenza, G. L. Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 270 (3), 1230-1237 (1995).
- D'alonzo, R. A., et al. In vivo noninvasive preclinical tumor hypoxia imaging methods: A review. Int J Radiat Biol. 97 (5), 593-631 (2021).
- He, H., et al. Conditioned car-t cells by hypoxia-inducible transcription amplification (hita) system significantly enhances systemic safety and retains antitumor efficacy. J Immunother Cancer. 9 (10), e002755(2021).
- Barsoum, I. B., Smallwood, C. A., Siemens, D. R., Graham, C. H. A mechanism of hypoxia-mediated escape from adaptive immunity in cancer cells. Cancer Res. 74 (3), 665-674 (2014).
- Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor cell metabolism: Cancer's achilles' heel. Cancer Cell. 13 (6), 472-482 (2008).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
