Методическая статья

Генерация и функциональная верификация чувствительных к гипоксии химерных антигенных рецептор-Т-клеток

1.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66697

⸱

14 июня 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, 2Clinical Center of Biotherapy at Zhongshan Hospital, Fudan University, 3Department of Oncology and Bio-therapeutic Center, Shenzhen Third People's Hospital, Southern University of Science and Technology, 4Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе представлен протокол генерации и функциональной верификации чувствительных к гипоксии химерных антигенных рецепторов (CAR)-Т-клеток. В этом протоколе представлено поколение чувствительных к гипоксии CAR-T-клеток на основе лентивируса и их характеристика, включая валидацию гипоксически-зависимой экспрессии CAR и селективной цитотоксичности.

Аннотация

Обширные исследования доказали перспективность терапии химерными антигенными рецепторами T (CAR-T) клетками в лечении гематологических злокачественных новообразований. Тем не менее, лечение солидных опухолей остается сложной задачей, о чем свидетельствуют опасения по поводу безопасности, которые возникают, когда CAR-T-клетки атакуют нормальные клетки, экспрессирующие целевые антигены. Исследователи изучили различные подходы к повышению селективности опухоли при терапии CAR-T-клетками. Одной из типичных стратегий в этом направлении является конструирование чувствительных к гипоксии CAR-T-клеток, которые сконструированы путем слияния кислород-зависимого домена деградации с CAR-фрагментом и разработаны для достижения высокой экспрессии CAR только в гипоксической среде — опухолевом микроокружении (TME). В данной работе представлен протокол генерации таких CAR-T-клеток и их функциональная характеристика, включая методы анализа изменений экспрессии CAR-клеток и убивающей способности в ответ на различные уровни кислорода, установленные в камере мобильного инкубатора. Ожидается, что сконструированные CAR-T-клетки будут демонстрировать экспрессию CAR и цитотоксичность чувствительным к кислороду образом, тем самым поддерживая их способность различать гипоксические TME и нормоксические нормальные ткани для селективной активации.

Введение

Терапия химерными антигенными рецепторами Т-клеток (CAR-T) представляет собой значительный прорыв в лечении рака. С тех пор как в 2017 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило первую CAR-T-терапию для лечения прогрессирующей/резистентной лимфомы и острого лимфобластного лейкоза, 1,2,3, 10 CAR-T-терапий, нацеленных на CD19 или антиген созревания B-клеток (BCMA), получили одобрение во всем мире4. Однако, несмотря на обширные исследования, воспроизведение замечательной эффективности CAR-T-терапии в лечении гематологических злокачественных новообразований остается сложной задачей для ее применения к солидным опухолям 5,6,7,8.

Иммуносупрессивное микроокружение опухоли (ТМЭ) является основным фактором низкой эффективности CAR-T в условиях солидных опухолей. TME препятствует активности и выживанию CAR-T-клеток из-за недостатка питательных веществ, гипоксии, кислого pH и накопления метаболических отходов 9,10,11,12. Дальнейшая враждебность возникает при инфильтрации иммуносупрессивных клеток, таких как регуляторные Т-клетки (Tregs), миелоидные супрессорные клетки (MDSC) и опухолеассоциированные макрофаги (TAM), которые, наряду с опухолевыми клетками, секретируют иммуносупрессивные цитокины, вызывающие дополнительное ингибирование CAR-T-клеток при попадании в опухоль13,14.

Помимо неудовлетворительной терапевтической эффективности, вопросы безопасности являются еще одной ахиллесовой пятой CAR-T-клеток при работе с солидными опухолями15,16. Опасения по поводу безопасности возникают из-за того, что ни один из выявленных до сих пор опухолеспецифических антигенов (TSA) строго не ограничен опухолевыми клетками. Другими словами, опухолеассоциированные антигены (TAA), выбранные в качестве мишени для CAR, хотя и демонстрируют более высокую экспрессию в опухолевых клетках, часто также экспрессируются нормальнымитканями17. Таким образом, мишенные, внеопухолевые эффекты могут возникать в результате неожиданной активации CAR-T-клеток при эффективном распознавании CAR нормальных тканей, что приводит к синдрому высвобождения цитокинов (CRS), синдрому CAR-T-связанной энцефалопатии (CRES)18 и другим неблагоприятнымисходам.

Для предотвращения таких эффектов было изучено множество стратегий, в том числе снижение аффинности CAR, чтобы позволить CAR-T-клеткам отличать опухолевые клетки от нормальных клеток на основе уровней экспрессии целевой TAA; оснащение CAR-T-клеток выключателем, таким как ген самоубийства или маркер элиминации, чтобы способствовать их элиминации при неожиданной активации; разделение CD3ζ и костимулирующих сигналов на две CAR-группы, одновременное участие которых, следовательно, необходимо для эффективной активации CAR-T-клеток; использование схемы на основе синтетического Notch (synNotch), которая ограничивает активность CAR-T-клеток клетками-мишенями, совместно экспрессирующими два различных TAA; и инженерия CAR-T-клеток для достижения чувствительности TME путем реализации механизма настройки экспрессии CAR в соответствии с изменяющимися сигналами окружающей среды 20,21,22,23,24,25,26.

Ключевым фактором при выборе чувствительности ТМЭ, описанном выше, является низкий уровень кислорода в ТМЭ из-за быстрой пролиферации опухолевых клеток. Приспособление опухолевых клеток к гипоксии зависит от активации индуцируемого гипоксией фактора-1 (HIF-1), гетеродимерного транскрипционного фактора, состоящего из индуцируемой субъединицы HIF-1α и конститутивно экспрессируемой субъединицы HIF-1β27. В нормоксических условиях белок HIF-1α подвергается убиквитинации и быстрой протеасомной деградации в зависимости от его кислородзависимого домена деградации (ODD)28. Когда поступление кислорода в клетки становится ограниченным, HIF-1 стабилизируется и активирует транскрипцию своих нижестоящих генов-мишеней путем связывания с элементами, реагирующими на гипоксию (HREs)29. Учитывая природу ОВР и HRE как чувствительных к кислороду элементов, они были исследованы для реализации условной экспрессии CAR в гипоксической TME30. В данной работе мы представляем протокол, посвященный методам фенотипической и функциональной характеристики чувствительных к гипоксии CAR-T-клеток, которому предшествует краткое описание конструкции CAR и процедур подготовки этих клеток. Этот протокол призван предоставить полезное руководство по использованию чувствительного к гипоксии CAR для получения CAR-T-клеток с ограниченной внеопухолевой токсичностью.

Протокол

В этом исследовании HER2-BBz-ODD, чувствительный к гипоксии CAR, нацеленный на HER2 (Gene ID: 2064), сравнивался со своим обычным аналогом, HER2-BBz. Схемы двух CAR проиллюстрированы на рисунке 1A, который показывает, что HER2-BBz-ODD является производным от HER2-BBz путем добавления последовательности ODD к C-концу CD3ξ. Построение лентивирусных векторов, экспрессирующих два CAR, и генерация соответствующего лентивируса путем трансфекции 293Т-клеток были описаны ранее31.

1. Генерация чувствительных к гипоксии CAR-T-клеток путем лентивирусной инфекции

  1. Быстро разморозьте криоконсервированные мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC) при 37 °C на водяной бане. Перенесите размороженные PBMC в пробирку объемом 15 мл, содержащую 9 мл бессывороточной питательной среды лимфоцитов с добавлением 400 МЕ IL-2, 5 нг/мл IL-7 и 10 нг/мл IL-15 (среда для роста Т-клеток человека, далее именуемая TGM ).
  2. После приема аликвоты для подсчета клеток центрифугируйте пробирку при 300 × г в течение 5 мин. Повторно суспендируйте гранулированные PBMC с TGM при плотности 4 × 106 клеток/мл и перенесите суспензию в 6-луночный планшет.
  3. Приготовьте иммуногранулы, покрытые анти-hCD3/hCD28.
    1. Переложите 100 мкл магнитных шариков IgG мыши в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и промойте их 2 раза с помощью магнитной подставки с PBS.
    2. Повторно суспендируйте шарики в 100 мкл PBS и добавьте 0,2 мкг мышиного антитела к человеческому CD3 и 2 мкг мышиного антитела к человеческому CD28. Аккуратно перемешайте смесь с помощью пипетки и покачивайте в течение ночи при температуре 4 °C.
    3. Промойте бусины 2 раза с помощью магнитной подставки с PBS и повторно суспендируйте их в 100 мкл PBS.
  4. Добавьте иммуногранулы, покрытые анти-hCD3/hCD28, на планшет на шаге 1.2 в соотношении гранул к клеткам 1:1. Поместите планшет во влажный инкубатор с 5%CO2 при температуре 37 °C.
  5. После 48 ч инкубации перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл, аккуратно перемешав клетки пипеткой. Поместите трубку на магнитную подставку на 3 минуты, затем осторожно перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 15 мл для удаления иммуногранул из PBMC.
  6. Возьмите аликвоту для подсчета клеток, затем засейте PBMC в 5 × 105 клеток/лунку в 300 мкл TGM в 48-луночный плоский планшет. Добавьте 200 мкл лентивирусного запаса в соответствующие лунки и добавьте сульфат протамина до конечной концентрации 10 мкг/мл.
  7. Центрифугируйте планшет при 1000 × г при 32 °C в течение 1,5 ч и осторожно удалите и выбросьте 300 мкл надосадочной жидкости из каждой лунки с помощью пипетки. Затем добавьте 1 мл свежего TGM с помощью пипетки и поместите планшет в увлажненный инкубатор с 5%CO2 при температуре 37 °C.
  8. Добавляйте свежий TGM для регулировки плотности клеток до 0,5-2 ×10 6 клеток/мл каждые 2-3 дня. Начните с переноса ячеек сначала на 12-луночный планшет, а затем на 6-луночный планшет. Продолжайте культивировать клетки до тех пор, пока общее количество не достигнет 6 × 106 в объеме 4 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параллельно проведите CAR-трансдукцию Т-клеток Jurkat, следуя тем же процедурам, описанным выше, за исключением того, что ТГМ заменяется средой RPMI1640 содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).

2. Оценка кислородзависимой экспрессии CAR в CAR-T-клетках с помощью проточной цитометрии

  1. Тарьминируют CAR-трансдуцированные Т-клетки со стадии 1,8 в два 12-луночных планшета с плотностью 2,5 ×10 6 клеток/лунку в 2 мл TGM. Поместите одну пластину непосредственно в увлажненный инкубатор с 5%CO2 при 37 °C (нормоксическое состояние, так как стандартное условие для культивирования клеток имеет 21%O2), а другую пластину поместите в мобильную камеру инкубатора CO2/O2/N2 с заданным уровнем O2 на уровне 1% (гипоксическое состояние), а затем держите камеру во увлажненном состоянии, 5% CO2/94% N2 инкубатор при 37 °C.
  2. Каждые 24 ч собирать 5 × 105 клеток из планшетов в гипоксических или нормоксических условиях в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Центрифугируйте пробирки при давлении 500 × г в течение 5 минут, удалите надосадочную жидкость и аккуратно ресуспендируйте клетки в 1 мл PBS с помощью пипетирования. Повторите промывку PBS еще раз.
  3. Ресуспендируйте гранулированные клетки в 50 мкл буфера FACS (PBS с добавлением 2% FBS) в каждой пробирке. Добавьте 50 μL в разведении 1:100 PE-конъюгированного анти-Флагового антитела (0,2 μг/мл) и тщательно перемешайте с помощью пипетирования. Выдерживать в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут.
  4. В конце инкубации добавьте 1 мл буфера FACS в каждую пробирку. Тщательно перемешайте с помощью пипетирования, затем центрифугируйте при 500 × г в течение 5 минут.
  5. Осторожно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки и повторите шаг 2.4 еще раз.
  6. Осторожно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки. Повторно суспендируйте клетки в 200 мкл буфера FACS, затем перенесите полученную клеточную суспензию в проточные трубки объемом 5 мл.
  7. Выполните проточную цитометрию клеточной суспензии на шаге 2.6 для определения поверхностной экспрессии CAR. Включите нетрансфицированные Т-клетки в качестве отрицательного контроля.
    1. Используйте вентили FSC/SSC и FSC-A/FSC-H для скрининга живых одиночных клеток. Соберите 1 × 104 живых одиночных события для каждого образца. Гейт клеток с положительным на EGFP (конститутивный маркер, переносимый в лентивирусном векторе в качестве индикатора успешно трансдуцированных Т-клеток), а затем с клетками, положительными на фикоэритрин (ПЭ) (CAR-экспрессирующие клетки) для измерения положительности ТЭЛА и медианы интенсивности флуоресценции (MFI).

3. Анализ кислородозависимости экспрессии CAR в CAR-модифицированных Jurkat Т-клетках методом вестерн-блоттинга

  1. Тарелируют CAR-трансдуцированные Т-клетки Jurkat из секции 1 в два 48-луночных планшета с плотностью 5 ×10 5 клеток на лунку (объем культуры 500 мкл) в RPMI1640 среде с 10% FBS.
  2. Для одной пластины добавьте CoCl2 в экспериментальные лунки до конечной концентрации 0 μМ, 50 μМ или 200 μМ. Затем поместите планшет во увлажненный инкубатор с 5% содержаниемCO2 при температуре 37 °C (нормоксическое состояние). Для другой пластины не добавляйте CoCl2 и поместите его в мобильную камеру инкубатора CO2/O2/N2 с предустановленным уровнем O2 на уровне 1% (гипоксическое состояние) перед переносом в тот же инкубатор.
  3. После 24 ч инкубации перенесите клеточные суспензии в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Центрифугируйте пробирки при 500 × г в течение 5 минут. Сначала полностью удалите и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1 мл, затем пипетки объемом 100 мкл и повторно суспендируйте гранулы клеток в 50 мкл 1x буфера для образцов SDS-PAGE.
  4. Нагрейте образцы на кипящей водяной бане в течение 10 минут. Немедленно поместите пробирку на лед на 30 с, затем центрифугируйте при 16 000 × г в течение 30 с.
  5. Загрузите по 30 мкл очищенных образцов в каждую ячейку 10-луночного 10% геля SDS PAGE толщиной 1,5 мм. Запустите гель при напряжении 80 В в течение 30 минут, затем увеличьте напряжение до 100 В и проведите 1,5 часа.
  6. В конце электрофореза перенос белков из геля на мембрану PVDF с использованием стандартного метода мокрого переноса, при этом ток и продолжительность установлены на уровне 400 мА и 1 ч соответственно.
  7. Заблокируйте мембрану в блокирующем буфере (5% молока (w/v) в PBST (PBS + 0,05% Tween-20)) на 1 ч при комнатной температуре. Затем вырежьте участок между 30 кД и 40 кДа для детектирования управления нагрузкой GAPDH и кусок между 50 кД и 70 кД для детектирования молекул CAR.
  8. Инкубируйте кусочки 30-40 кД и 50-70 кД с мышиным антителом против GAPDH (разведение 1:2000) и мышиным антителом против Flag (разведение 1:2000), соответственно, в 3 мл блокирующего буфера либо при комнатной температуре в течение 2 ч, либо при 4°С в течение ночи.
  9. Промыть мембраны PBST при комнатной температуре на платформе-коромысле в течение 3 х 5 минут.
  10. Инкубируйте мембраны с HRP-конъюгированными антителами козьего антимышиного типа (разведение 1:5000) в 3 мл блокирующего буфера при комнатной температуре в течение 1 ч; затем промойте мембрану PBST в течение 5 x 10 минут.
  11. Развивайте мембраны с помощью инкубации с подложкой HRP, а затем визуализируйте обнаруженные белковые полосы с помощью люминесцентного анализатора изображений.

4. Оценка in vitro кислородной зависимости цитотоксичности, опосредованной чувствительными к гипоксии CAR-T-клетками

  1. В день 0 затравили 1 × 104 клеток-мишеней (клетки SKOV3-Luc) в экспериментальную лунку в 200 мкл DMEM, содержащего 10% FBS, в двух черных плоскодонных 96-луночных тканевых культуральных планшетах.
  2. В день 1 осторожно удалите 100 мкл надосадочной жидкости с верхней части каждой лунки. Добавьте CAR-T-клетки или нетрансдуцированные Т-клетки в соотношении эффекторов к мишеням 1:1, 2:1 и 4:1 в 100 мкл среды DMEM, содержащей 10% FBS.
  3. Поместите одну тарелку в атмосферу с концентрацией 21%O2, а другую — в атмосферу с концентрацией 1%O2 с помощью мобильной камеры инкубатора CO2/O2/N2 , как описано в шаге 2.1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если мобильная камера инкубатора CO2/O2/N2 недоступна, добавление CoCl2 в питательную среду может быть использовано для имитации гипоксического состояния.
  4. На 2-й день, после 24 ч совместного культивирования, осторожно перенесите всю надосадочную жидкость (примерно 150-200 мкл) в новую 96-луночную пластину с U-образным дном с помощью пипетки. Хранить при температуре -20 °C для последующего обнаружения цитокинов, следуя процедурам, описанным в разделе 5.
  5. Добавьте 60 мкл 1x буфера пассивного лизиса в каждую экспериментальную лунку черных 96-луночных планшетов с плоским дном, начиная с шага 4.4. Затем поместите пластины на шейкер и встряхивайте в течение 30 минут, чтобы обеспечить эффективный лизис клеток.
  6. Добавьте 60 мкл субстрата люциферазы светлячков в каждую экспериментальную лунку и немедленно измерьте активность люциферазы с помощью считывателя микропланшетов.
  7. Рассчитайте нормированную цитотоксичность (%) с помощью уравнения (1):
    Нормализованная цитотоксичность (%) = 100 - figure-protocol-1 ×100 (1)

5. Обнаружение секреции IL-2 и ИФН-γ чувствительными к гипоксии CAR-T-клетками

  1. В день 0 приготовьте разведение антитела захвата IL-2 или ИФН-γ в масштабе 1:250 в буфере для покрытия. Добавьте 100 мкл разведенного антитела в каждую лунку 96-луночного планшета для ИФА и инкубируйте планшет при 4 °C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для покрытия изготавливается путем растворения 7,13 г NaHCO3 и 1,59г Na2CO3 в 1 л дистиллированной воды и регулировки pH до 9,5.
  2. В день 1 удалите неадсорбированное антитело захвата, энергично перевернув планшет вверх дном, затем промойте лунки 3 раза 200 мкл промывочного буфера (PBS, содержащего 0,05% Tween 20).
  3. Добавьте в каждую лунку по 200 μл разбавителя анализа (PBS, содержащего 10% FBS) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа.
  4. Выбросьте раствор, энергично перевернув тарелку вверх дном; затем промойте лунки 3 раза 200 μл промывочного буфера.
  5. Разморозьте замороженные образцы надосадочной жидкости/планшет из шага 4.4 при комнатной температуре. После полного размораживания разбавьте образцы и стандарты разбавлением для анализа разбавителем. Добавьте по 100 мкл разбавленных образцов или стандартов в каждую лунку планшета с покрытием ИФА и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обнаружения IL-2 рекомендуется 10-кратное разведение, в то время как для обнаружения ИФН-γ предпочтительно 50-кратное разведение.
  6. Удалите образцы и стандарты, энергично перевернув пластину вверх дном, затем промойте лунки 5 раз 200 μл буфера для промывки на лунку.
  7. Приготовьте рабочий детектирующий раствор путем разведения антитела для обнаружения IL-2 или антитела для обнаружения ИФН-γ/стрептавидина-HRP (SAv-HRP) в соотношении 1:250 в разбавителе анализа. Добавьте по 100 мкл рабочего раствора для детектирования в каждую лунку и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 1 ч с легким встряхиванием.
  8. Слейте раствор и промойте лунки 7 раз 200 мкл промывочного буфера.
  9. Добавьте по 100 мкл реагента Substrate в каждую лунку и инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте.
  10. Добавьте в каждую лунку по 50 μл раствора для остановки (1 М Н2SO4). Немедленно считайте поглощение на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов.

Результаты

Слияние домена ODD HIF-1α с фрагментом CAR представляет собой основную стратегию для создания чувствительного к гипоксии CAR. Чувствительный к гипоксии HER2-нацеленный на CAR, проанализированный в этом исследовании, названный HER2-BBz-ODD, был сконструирован с использованием этой стратегии путем интеграции последовательности ODD в его обычный HER2-BBz (рис. 1A). В этом исследовании мы использовали лентивирусную трансдукцию для экспрессии HER2-BBz-ODD CAR или HER2-BBz CAR и впоследствии изучили их чувствительность к кислороду в двух типах клеток: человеческих PBMC и Jurkat T-клетках.

Первым исследованием является экспрессия CAR в условиях гипоксии по сравнению с нормоксическими условиями, которое проводилось как в CAR-трансдуцированных PBMC-Т-клетках методом проточной цитометрии, так и в CAR-трансдуцированных Jurkat T-клетках методом вестерн-блоттинга. В условиях CAR-трансдуцированных PBMC-Т-клеток мы обнаружили, что HER2-BBz-ODD CAR имеет значительно более высокую экспрессию при 1%O2 , чем при 21%O2 как с точки зрения процента CAR-положительных клеток, так и медианы интенсивности флуоресценции (MFI) (рис. 1B). Иммуноблоттинг-анализ CAR-трансдуцированных Т-клеток Jurkat также подтвердил гипоксию-зависимую индукцию HER2-BBz-ODD.

Стоит отметить, что в этом контексте гипоксическое состояние может быть удобно имитировано путем добавления в культуральную среду CoCl2, химического индуктора гипоксии. Как показано на рисунке 1C, наши результаты иммуноблоттинга показали, что воздействие 50 или 200 мкМ CoCl2 повторяет эффект воздействия 1%O2, заметно индуцируя экспрессию HER2-BBz-ODD CAR, но не экспрессию HER2-BBz CAR. Функциональная характеристика чувствительного к гипоксии CAR проводилась с использованием CAR-T-клеток, полученных из PBMC. В исследовании в качестве целевой клеточной линии использовалась клеточная линия SKOV-3, несущая люциферазу-светлячок. Эта установка позволила нам измерить активность люциферазы, ассоциированной с клетками-мишенями, в качестве прокси для оценки цитотоксичности, опосредованной совместно культивируемыми CAR-T-клетками.

Как показано на рисунке 1D, измерения показали, что CAR-T-клетки HER2-BBz эффективно убивают клетки-мишени, независимо от того, была ли атмосфера нормоксической или гипоксической. Напротив, HER2-BBz-ODD CAR-T-клетки показали значительно более слабую цитотоксичность в нормоксических условиях для всех трех исследованных соотношений E:T. Тем не менее, их цитотоксичность значительно повышалась при воздействии гипоксических условий. Уровни надосадочной жидкости IL-2 и ИФН-γ также измеряли с помощью иммуноферментного анализа после совместного культивирования CAR-T-клеток с клетками-мишенями в течение 24 ч. Для обоих цитокинов наблюдалась более высокая секреция ниже 1%О2 по сравнению с 21%О2 для клеток HER2-BBz-ODD CAR-T, что согласуется с данными цитотоксичности. Напротив, CAR-T-клетки HER2-BBz показали более низкую секрецию двух цитокинов ниже 1%O2 по сравнению с 21%O2, что указывает на неблагоприятное влияние гипоксии на клеточную активность (рис. 1E). В совокупности эти результаты убедительно подтвердили чувствительную к гипоксии природу HER2-BBz-ODD CAR.

figure-results-1
Рисунок 1: Построение и характеристика чувствительных к гипоксии CAR-T-клеток. (A) Схематическое изображение конструкций чувствительного к гипоксии CAR, HER2-BBz-ODD, и его обычного аналога, HER2-BBz. Оба CAR состоят из N-концевого сигнального пептида CD8α, метки FLAG, человеческого scFv, нацеленного на HER2, шарнира CD8 и трансмембранного домена, а также внутриклеточной части, состоящей из костимулирующего домена из 4-1BB, сигнального домена CD3ξ, IRES и EGFP. HER2-BBz-ODD отличается от HER2-BBz слиянием домена ODD с С-концом сигнального домена CD3ξ, что обеспечивает его гипоксическо-зависимую экспрессию путем стимулирования его убиквитин-зависимой деградации в нормоксических условиях. (В,В) Оценка кислородзависимой экспрессии HER2-BBz-ODD CAR. (B) Одну оценку проводили с CAR-T-клетками, полученными из PBMC человека, после культивирования ниже 1% или 21%O2 в течение 24, 48 или 72 ч с использованием проточной цитометрии. (C) Другая оценка проводилась с CAR-трансдуцированными Jurkat T-клетками, в которых клеточные лизаты собирали через 24 ч после культивирования с содержанием ниже 21%O2, 50 или 200 мкМ CoCl2 или 1%O2 и анализировали экспрессию CAR с использованием вестерн-блоттинга, включая HER2-BBz CAR-трансдуцированные клетки в качестве контроля. (Д,Э) Цитотоксичность in vitro и секреция цитокинов CAR-T-клеток при различных кислородных условиях. (D) CAR-T-клетки культивировали совместно с клетками SKOV3, экспрессирующими люциферазу светлячков, при указанном соотношении E:T ниже 1% или 21%O2. После 24 ч совместного культивирования эффективность уничтожения клеток-мишеней определяли путем измерения изменения активности люциферазы, связанной с клетками, по сравнению с активностью нетрансдуцированных Т-клеток. (E) Надосадочные жидкости собирали для обнаружения секретируемых IL-2 и IFN-γ. Результаты отображаются в виде среднего значения ± SEM (n = 3 здоровых донора) (****p < 0,0001). Сокращения: scFv = одноцепочечная переменная фрагмента; CAR = химерный антигенный рецептор. Панели C и D адаптированы из Liao et al.31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Проблемы безопасности являются важными вопросами, которые должны быть решены для того, чтобы любая терапия CAR-T-клетками продвинулась в клиническое применение. Использование уникальных свойств опухолевых клеток или ТМЭ стало основным направлением исследований, направленным на разработку CAR-T-клеток, которые избирательно воздействуют на опухолевые ткани. Разработка чувствительного к гипоксии CAR-T является привлекательной стратегией в этом направлении, при этом изучается несколько подходов, в том числе представленный в этом исследовании — слияние CAR-фрагмента с естественным доменом белка ODD, чувствительным к гипоксии. Альтернативный подход включает в себя замену конститутивного промотора, обычно используемого для управления экспрессией CAR, на элемент ответа на гипоксию (HRE), который показал многообещающие результаты в предыдущих исследованиях. Считается, что сочетание элементов HRE и ODD (дикого типа или инженерных версий, которые обеспечивают более жесткий контроль экспрессии) представляет собой оптимальную конструкцию для CAR, индуцируемого гипоксией.

В этом протоколе изложены экспериментальные процедуры для создания и валидации чувствительных к гипоксии CAR-T-клеток. Реализация этого протокола включает в себя несколько ключевых соображений. Основным соображением является создание гипоксических условий. Между этими двумя подходами, добавление CoCl2 в культуральную среду широко использовалось в предыдущих исследованиях, связанных с гипоксией, в основном благодаря его удобству32,33. Тем не менее, невозможно измерить степень гипоксии, имитируемую таким подходом. В отличие от этого, использование мобильной инкубационной камеры CO2/O2/N2 является преимуществом в том смысле, что уровни O2 могут быть точно установлены и, таким образом, пригодны для тонкого анализа чувствительности к гипоксии CAR-T-клеток. В этом отношении уровень гипоксии в опухолях варьирует в зависимости от типа солидных опухолей и разных периодов прогрессирования опухоли34, в то время как в протоколе указан только 1%О2. Оптимальной практикой для исследователей является корректировка уровня кислорода в соответствии с фактическими потребностями. Если метод CoCl2 является единственным доступным подходом, мы рекомендуем включить в анализ диапазон концентраций CoCl2 для моделирования различных уровней кислорода.

Выбор подходящего метода для изучения гипоксии-зависимой экспрессии CAR является еще одним ключевым фактором. В то время как иммуноблоттинг-анализ CAR-трансдуцированных Jurkat T-клеток является удобным вариантом при оптимизации CAR-конструкта, анализ влияния уровня кислорода на поверхностную экспрессию CAR в CAR-трансдуцированных человеческих PBMC с помощью проточной цитометрии служит окончательной валидацией. Оптимальным является изучение динамики экспрессии CAR в ответ на переход от гипоксических к нормоксическим состояниям, как мы это делали ранее с усовершенствованной версией гипоксически-чувствительного CAR, а именно HiTA-CAR35. Это еще раз продемонстрирует ограниченную гипоксией экспрессию CAR.

Для функциональной верификации чувствительных к гипоксии CAR-T-клеток анализ цитотоксичности, описанный в протоколе, включает использование клеток-мишеней, несущих люциферазу светлячков. Этот репортерный анализ может быть заменен другими методами оценки убийства, такими как метод CCK8 и метод клеточного анализа в реальном времени (RTCA), где можно использовать немодифицированные опухолевые клетки. Анализ RTCA также полезен для измерения кинетики уничтожения CAR-T-клеток в режиме реального времени. Для измерения специфической цитотоксичности, вызванной CAR-T-клетками, в качестве контроля следует включать нетрансдуцированные PBMC. Высокая эффективность трансдукции PBMC желательна, чтобы избежать опасений, что различия в обнаруженной цитотоксичности между экспериментальной и контрольной группами возникают из-за неспецифического киллинга, опосредованного различными количествами добавленных эффекторных клеток.

В этом протоколе есть несколько ограничений. Гипоксические условия могут влиять на жизнеспособность как клеток-мишеней, так и Т-клеток36,37, что вызывает обеспокоенность тем, что гибель клеток, не связанная с цитотоксичностью, опосредованной CAR-T-клетками, может затруднить интерпретацию результатов анализа. Обеспечение того, чтобы как CAR-T-клетки, так и клетки-мишени имели превосходную жизнеспособность непосредственно перед проведением анализа, чтобы избежать или свести к минимуму такие проблемы. Следует также отметить, что валидация in vitro не гарантирует успешного перевода in vivo. Оценки in vivo всегда необходимы, чтобы подтвердить, может ли чувствительный к гипоксии кандидат CAR-T избежать нацеливания на нормальные ткани, экспрессирующие целевой антиген

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2016YFC1303402), Национального мегапроекта по ключевым инфекционным заболеваниям (2017ZX10202102, 2017ZX10304402-002-007) и Общей программы Шанхайской муниципальной комиссии здравоохранения (201740194).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл Центрифужная пробиркаQSP509-GRD-QНадосадочная жидкость и клетки целлекция
Протокол Шаг 2,3,4
10% ExpressCast PAGENCM biotechP2012Иммуноблоттинг
Протокол Шаг 3
10x PBSNCM биотехнологический20220812Клеточная культура
Протокол Этап 4
пипетка 10 мл ПипеткаYueyibioYB-25HПипетка
Протокол Шаг 1
10xTRIS-Glycine-SDS Электрофорез БуферEpizyme3673020Иммуноблоттинг
Протокол Шаг 3
15 мл Центрифужная пробиркаThermo Scientific339650Надосадочная жидкость и клетки целлекции
Протокол Шаг 1
25 см2 EasYFlaskThermo Scientific156367 Cell culture
Протокол Шаг 3,4
4x Protein SDS PAGE Buffer BufferTakara9173Immunoblotting
Протокол Шаг 3
6-луночные планшеты для культуры тканей с плоским дномThermo Scientific140675T Cells culture
Протокол Шаг 1
96-луночный черный планшет для культуры тканей с плоским дномGreiner655090Анализ цитотоксичности
Протокол Шаг 4
96-луночные планшеты для ИФАCorning3590ELISA
Protocol Step 5
96-луночный шейкерQILINBEIERMH-2Shake
Protocol Step 4
96-луночные U-образные планшеты для культивирования тканейThermo Scientific268200Supernatants cellection
Protocol Step 4,5
anti-FLAG антителоSigmaF1804-50UGImmunoblotting
Protocol Step 3
КарбинолSinopharm10010061Immunoblotting
Протокол Шаг 3
Инкубатор углекислого газаThermo Scientific360Клеточная культура
Протокол Шаг 1,2,3,4
Пластина для подсчета клетокHausser scientific1492Подсчет клеток
Протокол Шаг 1,3,4
CELLection Pan Mouse IgG KitThermo Scientific11531DМышь IgG магнитные шарики
Протокол Step 1
CentrifugeThermo Scientific75002432Cell Culture
Протокол Step 1,3,4
Система визуализации гелевого хемилюминесцентного геляBIO-RAD12003154Immunoblotting
Протокол Step 3
Раствор хлорида кобальта (0,5 M)биопрыгунBR4000203Гипоксическое состояние
Протокол Step 2,3,4
DMEMCorning10-103- Культура клеток сердечно-сосудистой системы
Протокол Шаг 4
Электронные весыSartoriusPRACTUM612-1CNвес
Протокол Шаг 5
FBSBI04-001-1ACSКультура клеток
Протокол Шаг 3,4
GAPDH Мышиный mAbABclonalAC002Иммуноблоттинг
Протокол Этап 3
Аппарат для гелевого электрофорезаBIO-RAD1645070Иммуноблоттинг
Протокол Шаг 3
Считыватели микропланшетовPromegaGM3000Измерение активности люциферазы
Протокол Шаг 4
Козий антимышиный IgG (H+L)YeasenP1126151Иммуноблоттинг
Протокол Шаг 3
Высокоскоростная микрофризирующая центрифугаeppendorf5810  RCell culture
Протокол Шаг 1
ИФН и гамма человека; ИФА НаборBD555142протокол ИФА<бр/> Шаг 5<бр/> Пункты: рекомбинантный ИФН человека и гамма; Лиофилизированный стандарт, обнаружение антител биотина против человеческого ИФН-&гамма; , Антитело захвата очищенное против ИФН-&гамма человека, ферментный реагент стрептавидин-пероксидаза хрена конъюгат (SAv-HRP)
Набор ИФА IL-2 человекаBD555190ИФА<бр/> протокол Этап 5<бр/> Элементы: рекомбинантный лиофилизированный стандарт IL-2 человека, антитело обнаружения биотина против IL-2 человека, антитело захвата очищенное против человека IL-2, ферментный реагент стрептавидин-пероксидаза конъюгата (SAv-HRP)
IL-15НИР D systemsP40933Т-клетки Культура
Протокол Этап 1
IL-21НовопротеинGMP-CC45Т-клетки Культура
Протокол Этап 1
IL-7R& D systemsP13232Т-клетки Культура
Протокол Шаг 1
Инвертированный микроскопOlympusCKX41Клеточная культура
Протокол Шаг 1,3,4
JurkatATCCTIB-152CAR-Jurkat construction
Протокол Шаг 3
LSRFortessaBDLSRFortessaПроточная цитометрия
Протокол Шаг 2
Системаанализа люциферазыPromegaE1501люциферазный репортерный анализ
Протокол Шаг 4
Элементы: Буфер пассивного лизиса, субстрат люциферазы светлячков
Микропланшетный ридерBioTekHTXELISA
Протокол Шаг 5
мобильный CO2/O2/N2 Инкубаторная камера ChinaInnovation Instrument Co., ООО.Smartor118Гипоксическое состояние
Протокол Шаг 2, 3, 4
Мышиный антигекса-гистидиновый тегSigmaSAB2702218Иммуноблоттинг
Протокол Шаг 3
NcmBlot Rapid Transfer BufferNCM biotechWB4600Иммуноблоттинг
NcmECL UltraNCM biotechP10300Иммуноблоттинг
Протокол Шаг 3
Элементы: Реагент NcmECL ультралюминол/усилитель (A), Ультрастабилизированный реагент перекиси NcmECL (B)  
48-луночные плоские планшеты, покрытые НовоНектином,НовопротеинGMP-CH38CAR-T клетки построение
Протокол Шаг 1 Набор
таблеток OPD (о-фенилендиаминдигидрохлорид) SigmaP9187Субстрат Реагент
Протокол Этап 5
Предметы: таблетка OPD (серебряная фольга), таблетка перекиси водорода мочевины (золотая фольга)
PE-конъюгированный анти-DYKDDDDKBiolegend637310Проточная цитометрия
Протокол Этап 2
Сульфат протаминаSigmaP3369-1OGЛентивирусная инфекция
Протокол Этап 1
Белковый маркер 10 Kda-250 KDaEpizymeWJ102Иммуноблоттинг
Протокол Этап 3
  Очищенный NA/LE мышиный античеловеческий CD3BD566685Т-клетки Культура
Протокол Этап 1
Очищенный NA/LE Мышиный античеловеческий CD28BD555725Т-клетки Культура
Протокол Этап 1
Мембрана PVDFМиллипоры168627Иммуноблоттинг
Протокол Этап 3
RPMI 1640Corning10-040-CVRCКлеточная культура
Протокол Этап 3
Сухое обезжиренное молокоYeasenS9129060Иммуноблоттинг
Протокол Этап 3
SKOV3-LucATCCHTB-77Анализ цитотоксичности
Протокол Шаг 4
Trypsin-EDTANCM biotechC125C1Клеточная культура
Протокол Этап 4
Tween 20Sinopharm30189328Иммуноблоттинг
Протокол Шаг 3
Водяная баняkeelreinNB014467Отопление
протокол Step 1
X-VIVO 15 LONZA04-418QБессывороточная среда для культивирования лимфоцитов
Протокол Этап 1

Ссылки

  1. Boardman, A. P., Salles, G. CAR T-cell therapy in large B cell lymphoma. Hematol Oncol. 41 (S1), 112-118 (2023).
  2. Chen, Y. -J., Abila, B., Mostafa Kamel, Y. CAR-T: What is next. Cancers. 15 (3), 663(2023).
  3. Barsan, V., et al. Tisagenlecleucel utilisation and outcomes across refractory, first relapse and multiply relapsed B-cell acute lymphoblastic leukemia: A retrospective analysis of real-world patterns. eClinicalMedicine. 65, 102268(2023).
  4. Liu, Y., et al. Oncolytic herpes simplex virus delivery of dual CAR targets of CD19 and BCMA as well as immunomodulators to enhance therapeutic efficacy in solid tumors combined with CAR-T cell therapy. Front Oncol. 12, 1037934(2022).
  5. Liu, C., Qi, T., Milner, J. J., Lu, Y., Cao, Y. Speed and location both matter: Antigen stimulus dynamics controls CAR-T cell response. Front Immunol. 12, 748768(2021).
  6. Li, N., et al. Improving the anti-solid tumor efficacy of CAR-T cells by inhibiting adenosine signaling pathway. Oncoimmunology. 9 (1), 1824643(2020).
  7. Derenzo, C., Gottschalk, S. Genetic modification strategies to enhance CAR T cell persistence for patients with solid tumors. Front Immunol. 10, 218(2019).
  8. Fu, R., et al. Delivery techniques for enhancing CAR T cell therapy against solid tumors. Advanced Functional Materials. 31 (44), 2009489(2021).
  9. Johnson, A., Townsend, M., O'Neill, K. Tumor microenvironment immunosuppression: A roadblock to CAR T-cell advancement in solid tumors. Cells. 11 (22), 3626(2022).
  10. Liu, Z., et al. Immunosuppression in tumor immune microenvironment and its optimization from CAR-T cell therapy. Theranostics. 12 (14), 6273-6290 (2022).
  11. Luo, Z., et al. Modulating tumor physical microenvironment for fueling CAR-T cell therapy. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114301(2022).
  12. Martinez, M., Moon, E. K. CAR T cells for solid tumors: New strategies for finding, infiltrating, and surviving in the tumor microenvironment. Front Immunol. 10, 128(2019).
  13. Zhang, X., et al. The immunosuppressive microenvironment and immunotherapy in human glioblastoma. Front Immunol. 13, 1003651(2022).
  14. Tie, Y., Tang, F., Wei, Y. Q., Wei, X. W. Immunosuppressive cells in cancer: Mechanisms and potential therapeutic targets. J Hematol Oncol. 15 (1), 61(2022).
  15. Wu, Y., et al. Engineering CAR T cells for enhanced efficacy and safety. APL Bioeng. 6 (1), 011502(2022).
  16. Al-Haideri, M., et al. cell combination therapy: The next revolution in cancer treatment. Cancer Cell Int. 22 (1), 365(2022).
  17. Fuca, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. Enhancing chimeric antigen receptor T-cell efficacy in solid tumors. Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).
  18. Neelapu, S. S., et al. Chimeric antigen receptor T-cell therapy - assessment and management of toxicities. Nat Rev Clin Oncol. 15 (1), 47-62 (2018).
  19. Mi, J., Ye, Q., Min, Y. Advances in nanotechnology development to overcome current roadblocks in CAR-T therapy for solid tumors. Front Immunol. 13, 849759(2022).
  20. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: Current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  21. Yu, S., Yi, M., Qin, S., Wu, K. Next generation chimeric antigen receptor T cells: Safety strategies to overcome toxicity. Mol Cancer. 18 (1), 125(2019).
  22. Dana, H., et al. CAR-T cells: Early successes in blood cancer and challenges in solid tumors. Acta Pharm Sin B. 11 (5), 1129-1147 (2021).
  23. Van Der Schans, J. J., Van De Donk, N., Mutis, T. Dual targeting to overcome current challenges in multiple myeloma CAR T-cell treatment. Front Oncol. 10, 1362(2020).
  24. Andrea, A. E., Chiron, A., Bessoles, S., Hacein-Bey-Abina, S. Engineering next-generation car-t cells for better toxicity management. Int J Mol Sci. 21 (22), 8620(2020).
  25. Flugel, C. L., et al. Overcoming on-target, off-tumour toxicity of CAR T cell therapy for solid tumours. Nat Rev Clin Oncol. 20 (1), 49-62 (2023).
  26. Rababah, F., et al. Chimeric antigen receptor T cells therapy in solid tumors. Clin Transl Oncol. 25 (8), 2279-2296 (2023).
  27. Masoud, G. N., Li, W. Hif-1alpha pathway: Role, regulation and intervention for cancer therapy. Acta Pharm Sin B. 5 (5), 378-389 (2015).
  28. Semenza, G. L. Targeting hif-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 3 (10), 721-732 (2003).
  29. Harris, A. L. Hypoxia--a key regulatory factor in tumour growth. Nat Rev Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).
  30. Juillerat, A., et al. An oxygen sensitive self-decision making engineered CAR T-cell. Sci Rep. 7, 39833(2017).
  31. Liao, Q., et al. Engineering T cells with hypoxia-inducible chimeric antigen receptor (HiCAR) for selective tumor killing. Biomark Res. 8 (1), 56(2020).
  32. Ivan, M., et al. Hifα targeted for vhl-mediated destruction by proline hydroxylation: Implications for o2 sensing. Science. 292 (5516), 464-468 (2001).
  33. Wang, G. L., Semenza, G. L. Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 270 (3), 1230-1237 (1995).
  34. D'alonzo, R. A., et al. In vivo noninvasive preclinical tumor hypoxia imaging methods: A review. Int J Radiat Biol. 97 (5), 593-631 (2021).
  35. He, H., et al. Conditioned car-t cells by hypoxia-inducible transcription amplification (hita) system significantly enhances systemic safety and retains antitumor efficacy. J Immunother Cancer. 9 (10), e002755(2021).
  36. Barsoum, I. B., Smallwood, C. A., Siemens, D. R., Graham, C. H. A mechanism of hypoxia-mediated escape from adaptive immunity in cancer cells. Cancer Res. 74 (3), 665-674 (2014).
  37. Kroemer, G., Pouyssegur, J. Tumor cell metabolism: Cancer's achilles' heel. Cancer Cell. 13 (6), 472-482 (2008).

Перепечатки и разрешения

Теги

CAR-T-клеткигипоксия-чувствительный CARопухолевое микроокружениесолидные опухолииммунотерапия ракакислород-зависимая деградацияэкспрессия CARанализ цитотоксичностимодель гипоксииопухолевая селективность
Генерация и функциональная верификация чувствительных к гипоксии химерных антигенных рецептор-Т-клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.