Модифицированная модель воспалительной боли для изучения обезболивающего эффекта у мышей

Краткое содержание

В данной работе мы представляем модифицированную модель воспалительной боли с инъекцией каррагинана обеими задними лапами для оценки обезболивающего эффекта.

Аннотация

Тест с горячей пластиной широко используется для оценки обезболивающего эффекта при воспалительной боли у мышей. Обычно используемая модель воспалительной боли была индуцирована внутриподошвенной инъекцией каррагинана в одну заднюю лапу. Тем не менее, результаты нашей лаборатории показали, что мыши с инъекцией каррагинана одной задней лапой поднимали лапы, чтобы избежать термической ноцицепции во время теста на горячей пластине. Из-за этой реакции предыдущий метод инъекции не может точно отражать термический болевой порог. Таким образом, мы исследовали новый метод, позволяющий избежать этой проблемы. В настоящем исследовании мы модифицировали предыдущий метод, вводя каррагинан в обе задние лапы, чтобы установить модель воспалительной боли. Результаты показали, что инъекция каррагинана обеими задними лапами была чувствительной и лучшим методом индуцирования воспалительной боли при использовании теста с горячей пластиной, чем инъекция одной задней лапой. На основе этих результатов мы разработали дальнейшие эксперименты, в которых мышам с инъекцией каррагинана в обе задние лапы или в одну заднюю лапу лечили целекоксиб внутрижелудочно (30 мг/кг). Результаты теста на горячей пластине показали, что целекоксиб увеличивал термический болевой порог у мышей при инъекции каррагинана обеими задними лапами, но не у мышей с инъекцией каррагинана в одну заднюю лапу. Таким образом, мы разработали превосходный метод индуцирования модели воспалительной боли для оценки обезболивающего эффекта.

Введение

Боль является проблемой общественного здравоохранения во всем мире. Он вызывается вредной термической, механической или химической стимуляцией. Проводить исследования боли у людей сложно из-за этических проблем. Таким образом, использование моделей боли у животных является ключевым подходом к пониманию механизмов боли и исследованию методов лечения¹. Тест с горячей пластиной широко используется для оценки термической ноцицепции и гипералгезии². В настоящее время модель воспалительной боли, используемая для теста с горячей пластиной, индуцируется внутриподошвенной инъекцией каррагинана в одну заднюю лапу. Например, для исследования антиноцицептивного эффекта микросфер, загруженных ротиготином, животная модель воспалительной боли была подготовлена путем инъекции одной задней лапы^. Для оценки влияния ингибиторов катехол-о-метилтрансферазы на термическую ноцицепцию у мышей каррагинан вводили в подошвенную область правой задней лапы⁴. Для изучения обезболивающей роли экстракта Posidonia oceanica (L.) Delile у мышей готовили модель воспалительной боли путем внутриплантарного введения каррагинана в правую заднюю лапу⁵. Тем не менее, результаты нашей лаборатории показали, что мышь с инъекцией каррагинана в одну заднюю лапу поднимает лапу, чтобы избежать термической ноцицепции, что неточно продлевает реакцию животного на тепловой стимул в тесте с горячей пластиной. Таким образом, мы предположили, что модель воспалительной боли с введением каррагинана в одну заднюю лапу не может точно отражать термический порог боли. Поэтому мы оптимизировали метод, введя каррагинан в обе задние лапы, чтобы создать модифицированную модель воспалительной боли.

Мыши, подвергшиеся инъекции каррагинана обеим задним лапам, не имели возможности избежать теплового стимула для обеих задних лап одновременно. Болевой порог определялся как время от помещения мыши на горячую плиту до облизывания мышью любой из задних лап. Результаты подтвердили, что модифицированная модель воспалительной боли больше подходит для оценки порога ноцицептивной температуры. Это может повысить эффективность теста на горячей пластине для исследований и разработки обезболивающих препаратов.

Протокол

Протокол эксперимента был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Яньтай (No. YTDX20220425). Процедуры проводились в соответствии с Рекомендациями Национальных институтов здравоохранения по использованию лабораторных животных.

1. Животные

1. Для экспериментов используйте самок мышей ICR весом 20-25 г.
2. Дайте животным акклиматизироваться к окружающей среде экспериментального помещения в течение 3 дней до начала экспериментов.
3. Поддерживайте экспериментальное помещение с 12-часовым циклом свет-темнота, а мышам предоставьте свободный доступ к воде и чау.

2. Приготовление раствора каррагинана

1. Весить 0,1 г каррагинана. Добавьте в тюбик 10 мл стерилизованного физиологического раствора.
2. Добавьте в пробирку 0,1 г каррагинана и закручивайте пробирку в течение 30 с.
3. Соберите 1% стерилизованный раствор каррагинана.
4. Приготовьте раствор каррагинана перед экспериментами.

3. Внутриподошвенное введение каррагинана

1. С помощью шприца (0,05 мл, 29 г x 1/2 дюйма, 0,33 мм × 12,7 мм) введите 1% раствор каррагинана.
2. Встряхните раствор каррагинана перед тем, как набрать его в шприц. Следите за тем, чтобы в шприце не было пузыря.
3. Продезинфицируйте место инъекции (заднюю лапу) 75% спиртом.
4. Введите 30 мкл ^{6,7 1%} раствора каррагинана подкожно в подошвенную поверхность задней лапы. Мышам контрольной группы вводят 30 мкл физиологического раствора.
   1. Вставьте иглу по диагонали вверх в подушечку задней лапы. Поддерживайте устойчивость шприца.
   2. После инъекции медленно извлеките шприц и надавите на место инъекции в течение 2 с, чтобы предотвратить утечку.

4. Испытание горячей плиты

1. Проведите тест горячей пластины через 3 ч после внутриподошвенной инъекции.
2. Очистите и продезинфицируйте поверхность конфорки.
3. Запустите нагревательную плиту аппарата. Нажмите кнопку «Температурный режим ». Нажмите кнопку КОНСТАНТА, чтобы установить температуру на 55 ± 0,2 °C.
4. Нажмите кнопку Начать эксперимент и нажмите REACH. Возьмите мышь из контейнера для размещения. Аккуратно возьмитесь за его ствол. Поместите мышь в центр конфорки. Нажмите кнопку ПУСК.
5. Наблюдайте и записывайте время облизывания левой задней лапы (для мышей с инъекцией одной задней лапы) или задней лапы (для мышей с инъекцией обеих задних лап) в ответ на тепловую стимуляцию. Нажмите на педаль конфорки, чтобы увидеть время на экране конфорки. Определите болевой порог как время от помещения мыши на горячую плиту до облизывания задней лапы.
6. Установите предел 60 с для испытания горячей плиты ^4,8,9. Запишите болевой порог в 60 с, если предел достигнут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите нагревательную пластину 75% спиртом перед установкой следующей мыши, чтобы избежать возможной предвзятости из-за остаточного запаха от предыдущей мыши.

5. Приготовление суспензии целекоксиба 1,5 мг/мл

1. Принимать по 1 капсуле, содержащей 200 мг целекоксиба. Достаньте содержимое капсулы и измельчите его в порошок.
2. Добавьте 0,5% карбоксиметилцеллюлозы натрия. Итоговый объем составляет 13,3 мл. Это магазинная суспензия целекоксиба.
3. Возьмите 1 мл магазинной суспензии целекоксиба. Добавьте 9,0 мл 0,5% карбоксиметилцеллюлозы натрия для получения 1,5 мг/мл суспензии целекоксиба.
4. Вводите мышам 0,2 мл/10 г суспензии целекоксиба внутрижелудочно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте иглу для зонда длиной 4,0-4,5 см для мышей весом 20-25 г.

6. Оценка модифицированной модели воспалительной боли

1. Случайным образом разделите самок мышей ICR на три группы: контрольную, модельную и целекоксибную группы.
2. Введите 30 мкл 1% раствора каррагинана подкожно в подошвенную поверхность задней лапы (одной задней лапой или обеими задними лапами). Мышам контрольной группы вводят 30 мкл физиологического раствора.
3. После инъекции каррагинана или обычного физиологического раствора немедленно проведите лечение. Внутрижелудочно назначают целекоксиб в дозе 30 мг/кг мышам в группе целекоксиба. Мышам контрольной и модельной групп внутрижелудочно вводили 0,5% карбоксиметилцеллюлозу натрия.
4. Проведите испытание горячей плиты (раздел 2) через 3 ч после инъекции каррагинана.

7. Статистические методы

1. Представьте результаты эксперимента в виде среднего ± стандартного отклонения. Проведите тест на нормальное распределение с помощью статистического критерия пригодности Колмогорова-Смирнова.
2. Проанализируйте сравнение между двумя группами с помощью непарного t-критерия. Выполните несколько групповых сравнений с помощью одностороннего дисперсионного анализа с последующим тестом Даннетта. Рассмотрим значение p < 0,05 статистически значимым.

Результаты

Болевой порог в моделях воспалительной боли
Болевой порог модели воспалительной боли при введении каррагинана одной задней лапой составил 32,23 ± 11,11 с, тогда как болевой порог контрольной группы составил 27,73 ± 7,08 с. По сравнению с контрольной группой, болевой порог модели инъекции одной задней лапой не показал значимого снижения (p > 0,05, рис. 1A). Болевой порог модели воспалительной боли при введении каррагинана обеими задними лапами составил 21,84 ± 5,63 с, тогда как болевой порог контрольной группы составил 28,21 ± 8,61 с. По сравнению с контрольной группой, болевой порог модели инъекции обеими задними лапами значительно снизился (p < 0,05, рис. 1B).

Обезболивающий эффект целекоксиба при различных моделях воспалительной боли
В модели воспалительной боли с инъекцией каррагинана одной задней лапой болевой порог группы целекоксиба (27,01 ± 10,98 с) не показал значимого увеличения по сравнению с модельной группой (29,77 ± 13,97 с, p > 0,05). В соответствии с приведенными выше результатами, болевой порог в модельной группе не показал значительного снижения по сравнению с контрольной группой (30,94 ± 14,54 с), что указывает на то, что инъекция каррагинана одной задней лапой не вызывала воспалительной модели боли (рис. 2A). В модели воспалительной боли с введением каррагинана обеими задними лапами болевой порог модельной группы (15,61 ± 4,85 с) значительно снизился по сравнению с контрольной группой (23,55 ± 3,96 с, p < 0,05). По сравнению с модельной группой болевой порог в группе целекоксиба (20,29 ± 3,10 с) был достоверно снижен (рис. 2В).

Рисунок 1: Болевые пороги в моделях воспалительной боли. (среднее значение ± стандартного отклонения, n = 15). (А) Болевой порог модели воспалительной боли при инъекции каррагинана одной задней лапой. (B) Болевой порог модели воспалительной боли при инъекции каррагинана обеими задними лапами (^#P<0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Обезболивающий эффект целекоксиба при различных моделях воспалительной боли (среднее ± стандартное отклонение, n = 14). (А) Обезболивающий эффект целекоксиба в модели воспалительной боли при инъекции каррагинана в одну заднюю лапу. (B) Обезболивающий эффект целекоксиба в модели воспалительной боли при инъекции каррагинана обеими задними лапами ( ^#P<0,05, *P<0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Боль — это защитная реакция, вызванная повреждением тканей или травмой. Однако это также оказывает негативное влияние на качество жизни¹⁰. Поэтому разработка эффективных анальгетиков и изучение механизмов боли остаются активными направлениями исследований. Методы оценки боли играют ключевую роль в разработке обезболивающих препаратов. Инъекция каррагинана одной задней лапой является классическим методом теста на горячей пластине. Модифицированная модель, индуцированная инъекцией каррагинана обеими задними лапами, которую мы представляем здесь, обеспечивает надежный способ исследования эффективности потенциальных терапевтических агентов для облегчения боли.

В настоящем исследовании мы обнаружили, что у мышей с инъекцией каррагинана одной задней лапой не наблюдалось снижения болевого порога. Однако в других исследованиях этот метод приводил к значительному снижению болевого порога в тесте с горячей пластиной^11,12. Расхождение в результатах между предыдущими исследованиями и настоящим исследованием может быть объяснено различными видами животных, использованными в экспериментах 13,14,15,16. Другое возможное объяснение заключается в том, что мы наблюдали, как мыши с инъекцией каррагинана одной задней лапой часто поднимали введенную лапу или слегка наступали на пластину, чтобы избежать теплового стимула. Оценка болевого порога требует наблюдения за типичной ноцицептивной реакцией на облизывание или встряхивание введенной лапы. Таким образом, мы получили отрицательный результат, свидетельствующий о том, что болевой порог модели при введении каррагинана одной задней лапой достоверно не снижался. Мыши, которым каррагинан вводили обеими задними лапами, не могли избежать теплового стимула, поднимая лапу или слегка наступая на тарелку. Болевой порог рассматривался как облизывание или тряска любой из задних лап, что отражало фактическую ноцицептивную реакцию мышей.

Чтобы проверить превосходство модифицированной модели воспалительной боли, мышам с инъекциями каррагинана одной или обеими задними лапами проводили внутрижелудочное введение целекоксиба. В соответствии с гипотезой этого исследования, целекоксиб оказывал обезболивающее действие в модифицированной модели воспалительной боли, но не показал никаких эффектов в модели с инъекцией каррагинана одной задней лапой. Это открытие показало, что модифицированная модель воспалительной боли является надежной для скрининга потенциальных анальгетиков.

В этом исследовании есть ограничения. В испытаниях горячей пластины использовалось множество различных линий мышей. Разные штаммы мышей могут по-разному реагировать на тепловые раздражители. В настоящем эксперименте для проверки гипотезы использовались только мыши ICR. Таким образом, еще предстоит определить, точно и последовательно ли модифицированный метод обнаруживает болевые пороги у других штаммов мышей в тесте с горячей пластиной. Кроме того, мы не планировали пилотный эксперимент для оценки болевого порога мышей и, таким образом, не исключили животных с высоким болевым порогом. Тем не менее, это ограничение также можно рассматривать как преимущество модифицированного метода, используемого в настоящем изобретении. Он не только упрощает процесс проведения теста на обезболивание, но и отражает диапазон ответов мышей в тесте с горячей пластиной. Кроме того, измерение объема задней лапы поможет подтвердить индукцию воспаления и проверить обезболивающий эффект нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП). Однако наш опыт показал, что измерить объем лапы мышей непросто. Лапа мыши слишком мала, чтобы получить точное значение. Таким образом, настоящее исследование не было предназначено для изучения изменения объема лапы после воспаления.

В заключение, следуя описанным выше шагам, модель воспалительной боли с инъекцией каррагинана обеими задними лапами позволяет надежно определить термоноцицептивные пороги мышей. Кроме того, при назначении анальгетиков статистически выявлялось повышение болевого порога. Модифицированная модель воспалительной боли полезна для скрининга потенциальных анальгетиков. Кроме того, этот метод может быть использован для исследований биологии боли, разработки новых лекарств и клинического лечения, а также для предоставления новых идей и решений для лечения боли.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Электронные весы AL204	Yuheng Battery Co., Ltd	YH-400A
Карбоксиметилцеллюлоза	Тяньцзинь Кемикал Ко., Лтд
Каррагинан	Сигма, Миссури, США	29H0715
Целекоксиб	Pfizer Inc.
Конфорка	UGO Ltd. Co., Италия	PB-200
Самки мышей ICR	Jinan Pengyue  Co., Ltd.
Нормальный физиологический раствор	Kelun Pharmaceutical Co., Ltd